具有血小板生成素活性的蛋白质的制作方法

专利名称：具有血小板生成素活性的蛋白质的制作方法
本申请是现今未决的1995年1月31日提交的美国专利申请(申请号未知)的部分连续申请，后一申请是现今未决的1994年12月22日提交的美国专利申请No.08/361,811的部分连续申请，后一申请是现今未决的1994年10月11日提交的美国专利申请No.08/320,300的部分连续申请，后一申请是现今未决的1994年7月20日提交的美国专利申请No.08/278,083的部分连续申请，后一申请是现已放弃的1994年4月1日提交的美国专利申请No.08/221,020的部分连续申请，后一申请是现已放弃的1994年3月14日提交的美国专利申请No.08/212,164的部分连续申请。发明领域本发明涉及具有以特定方式在体内刺激或增加血小板生成或增强巨核细胞祖细胞增生和分化之活性的新蛋白质、编码所说蛋白质的DNA序列及其制备方法。发明背景巨核细胞是胞体较大、富含胞浆的多核细胞，它能产生血小板，主要见于骨髓中。巨核细胞起源于骨髓中的多能造血干细胞。原始的多能干细胞在某种程序内分化成巨核细胞祖细胞，后者定型为巨核细胞系。巨核细胞祖细胞增生和分成成巨核细胞。巨核细胞进一步进行多倍体和细胞质成熟，最后将其无核胞质碎片(即血小板)释放到循环中。一个成熟的巨核细胞平均形成2,000-4,000个血小板。尽管血小板的形成机理在一些细节上尚不清楚，但据认为，巨核细胞典型地是位于骨髓窦腔内皮的白蛋白(albuminal)表面，它产生延及窦状隙的胞浆处理过程，籍此巨核细胞进行血小板的碎片化。
有关产生血小板的机理还存在许多疑点，尽管认为有可能巨核细胞存在于骨髓静脉窦皮层，胞质穿过皮层，在静脉内壁上产生索样凸起，籍此，血小板被释放。
据认为，对于巨核细胞造血血小板产生的生成及调控中存在一种特定功能。在健康人类和动物中，虽然已知给例如健康动物施用抗血小板抗体后，血小板数迅速减少，然后开始暂升至高于平常，但最后回复至正常水平，所以有效血小板的数量被维持在一定水平。同样，已知在临床中血小板数减少(血小板减少症)或血小板数增加(血小板增多症)甚至见于红细胞和血细胞数处于正常水平时。
顺便提一句，血小板最重要的功能是在止血机理中形成血栓。如果止血机理由于血小板数减少而不能正常发挥作用，则将导致出血趋势。
已证明了有关巨核细胞生成和血小板生成中存在特定的调节机理。血小板在健康人体内和正常的动物中维持着有效数量。然而，已知当抗血小板抗体被施用于动物时，血小板数只在短期内迅速减少，之后开始回升并暂时超过正常水平，最终回复至正常水平。在临床领域中还了解到，血小板数减少(血小板减少症)或血小板数增加(血小板增多症)甚至见于红细胞和白细胞数正常的情况下。但是，至今尚无成功分离和鉴定涉及血小板产生的特定调节因子(例如，象红细胞形成过程中的促红细胞生成素)的报道。
血小板最重要的功能是在止血机理中形成血凝块。当止血机理的正常功能因血小板减少而遭破坏时，则会发生出血趋势。在癌症的放疗和化疗领域中，由骨髓抑制所致的血小板减少是致死的并发症；给这类患者输注血小板以防止出血趋势。血小板输注也应用于骨髓移植后的患者或再生障碍性贫血的患者。
用于这类血小板输注的血小板可通过血小板除去法由健康血供体的血液中制备，但用于输注的这类血小板的半衰期短，并有可能产生细菌污染。血小板输注还可能因输注用的血小板中污染了淋巴细胞而存在使患者接触有害病毒(如人类免疫缺陷病毒HIV或各种肝炎病毒)、诱导对输注血小板的主要组织相容性抗原(HLA)有特异性的抗体或导致移植物抗宿主疾病(GVHD)的危险。
因此，如果能在血小板减少的患者体内刺激固有的血小板形成，并同时减少血小板输注的依赖性，这将是非常有益的。另外，如果能够纠正或预防进行放疗或化疗的癌症患者的血小板减少，就可以使这类治疗更加安全，有可能增加治疗的强度并进一步改善所期望的抗癌效果。
由于上述种种原因，人们对分离和鉴定涉及调节巨核细胞和血小板生成的特异性调节因子进行了大量的研究。根据体外研究结果，控制巨核细胞生成的调节因子大致分成下面两种因子(参见Williams etal.，J.Cell.Physiol.，vol.110，p101-104，1982)。巨核细胞集落刺激因子(Meg-CSF)是在半固体培养基中刺激CFU-MK增生和分化以形成巨核细胞集落的调节因子。另一种称为巨核细胞增效因子(Meg-Pot)、巨核细胞刺激因子、血小板生成刺激因子等的调节因子主要作用于未成熟或成熟的巨核细胞，籍此增强其分化与成熟。在某些情况下，Meg-Pot可与Meg-CSF一起被检测到。另外，因为当将由实验诱导的血小板减少动物收集的血清或血浆施用于另外的正常动物时血小板计数增高，所以表明存在一种能够在体内促进血小板生成的促进因子，称为血小板生成素(TPO)。
近年来，检查了一些其基因已被克隆的细胞因子刺激巨核细胞生成和血小板生成的能力。人IL-3刺激人巨核细胞集落的形成(Brunoet al.，Exp.Hamatol.，vol.16，p371-377，1988)，并至少升高猴的血小板计数(Donahue et al.，Science，vol.241，p1820，1988)。然而，因为IL-3对所有造血细胞的增生和分化都起作用，所以它不同于控制巨核细胞生成和血小板生成的特异性调节因子。人IL-6没有表现出Meg-CSF活性，但它作用于未成熟的巨核细胞，并促进其分化为成熟的巨核细胞(Williams et al.，Exp.Hamatol.，vol.18，p.69，1990)。体内施用IL-6能诱导血小板生成，促进灵长目骨髓巨核细胞的成熟和向更高倍性升迁，但也产生一些副作用，如体重减轻、诱生急性期蛋白质(Asano et al.，Blood，vol.75，p1602-1605，1990；Stahl et al.，Blood，vol.78，p1467-1475，1991)。人IL-11无Meg-CSF活性，但有Meg-Pot活性，并促进小鼠的血小板生成(Neben et al.，Blood，vol.81，p901-908，1993)。另外，人LIF显著地提高灵长目的血小板数(Mayer et al.，Blood，vol.81，p2226-3233，1993)，但其在体外对巨核细胞的作用很微弱(Burstein et al.，J.Cell.Physiol.，vol.153，p305-312，1992)。
尽管希望将这些细胞因子作为血小板增效因子应用于临床，但其功能对巨核细胞系并非特异，并且它们能引起副作用。因此，在临床上需要开发一种既对巨核细胞-血小板系统具有特异性又能引起较少副作用的血小板增加因子。
已发现在血小板减少的患者或动物的血清、血浆或尿液中或在某些被培养的人细胞系的培养物上清液中存在Meg-CSF、Meg-Pot或TPO活性。然而，目前仍不清楚这些活性是否因为存在单种因子或几种因子的共同存在造成，也不清楚这些因子与已知的细胞因子是否不同。
Hoffman等人发现，再生障碍性贫血和无巨核细胞性血小板减少性紫癜患者的血清含有Meg-CSF活性，它显著地增加巨核细胞集落的形成(Hoffman et al.，N.Eng.J.Med.，vol.305，p533-538，1981)。此后，Mazur等人又报道，存在于再生障碍性贫血患者血清中的Meg-CSF活性不同于IL-3和GM-CSF(Mazur et al.，Blood，vol.76，p290-297，1990)。类似的Meg-CSF活性已见于接受广泛的细胞毒性化疗的癌症患者和骨髓移植患者的血清中(Mazuret al.，Exp.Hematol.，vol.12，p624-628，1984；de Alarconand Schinieder，Prog.Clin.Bio.Res.，vol.215，p335-340，1986)。据Hoffman等人报道，已由低巨核细胞性血小板减少患者的血清中纯化了Meg-CSF，其表观分子量为46,000(Hoffman etal.，J.Clin.Invest.，vol.75，p1174-1182，1985)，但进一步的研究发现所说物质并非以能进行精确氨基酸测序的纯度水平存在(Hoffman Blood，vol.74，p1196-1212，1989)。从血小板减少患者的血浆或特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者的尿液中部分纯化了具有TPO样活性的物质，它能增强75Se-硒蛋氨酸掺入小鼠新形成的血小板中，所测定的血浆来源因子的表观分子量为40,000(Grossi et al.，Hematologica，vol.72，p291-295，1987；Vannucchi et al.，Leukemia，vol.2，p236-240，1988)。
Meg-CSF活性和TPO样活性也已在再生障碍性贫血和重症ITP患者的尿样中检测到(Kawakita et al.，Br.J.Haemtol.，vol.48，p609-615，1981；Kawakita et al.，Blood，vol.556-560，1983)。Kawakita等人进一步报道，在再生障碍贫血患者尿提取物中所见的Meg-CSF活性，于离解条件下经凝胶过滤表明其表观分子量为45,000(Kawakita et al.，Br.J.Haematol.，vol 62，p715-722，1986)。Erikson-Miller等人也报道了从类似的尿样中纯化Meg-CSF，但没有提供有关其结构的信息(Erikson-Miller etal.，“Blook Cell Growth Factorstheir Present andfuture use in hematology and oncology”ed.by Murphy，AlphaMed Press，Dayton，Ohio，p204-220，1992)。Turner等人已从骨髓移植患者的尿液中纯化了具Meg-CSF活性的巨核细胞刺激因子(MSF)并克隆其基因(Turner et al.，Blood，vol.78，p1106-279a，1991，(abstr.，supple.1))。该MSF的分子量为28,000-35,000。该因子与至今已在血小板减少患者的血清和血浆样品中检测到的Meg-CSF的一致性及其血小板增加活性仍然有待于阐明。
人们还从人胚肾来源的细胞系(HEK细胞)的培养物上清液中纯化了具TPO样活性、分子量为32,000的物质，并对其生物学及生化学特性作了广泛的检测，但其结构尚不清楚(McDonald et al.，J.Lab.Clin.Med.，vol.106，p162-174，1985；McDonald，Int.J.Cell Cloning，vol.7，p139-155，1989)。相反，据其它的研究人员报道，在HEK细胞的条件培养基中产生的离体增强巨核细胞成熟过程的主要活性，是由于已知的细胞因子，即IL-6和EPO引起的(Withy et al.，J.Cell.Physiol.，vol.15，p362-372，1992)。
Evatt等人报道了有关动物来源的因子，他们在经抗血小板血清注射所诱导的血小板减少兔血浆中发现了能在兔中促进75Se-硒蛋氨酸掺入新形成的血小板中的TPO样活性(Evatt et al.，J.Lab.Clin.Med.，vol.83，p364-371，1974)。除此之外，从60年代到70年代报道了大量的类似研究结果(例如，Odell et al.，Proc.Soc.Biol.Med.，vol.108，P428-431，1961；Evatt andLevin，J.Clin.Invest.，vol.48，p1615-1626，1969；Harker，Am.J.Physiol.，vol.218，p1376-1380，1970；Shreiner andLevin，J.Clin.Invest.，vol.49，p1709-1713，1970；Penington，Br.Med.J.vol.1，p606-608，1970)。Evatl等人及Hill和Levin已从血小板减少兔血浆中部分纯化了TPO样活性(Evatl et al.，Blood，vol.54，p377-388，1979；Hill andLevin，Exp.Hematol.，vol.14，p752-759，1986)。在此之后，继续进行了对该因子的纯化工作，监测其在体外促进巨核细胞分化和成熟之活性(即Meg-Pot活性)表明，当用凝胶过滤进行检测时，该活性的表观分子量为40,000-46,000(Keller et al.，Exp.Hematol.，vol.16，p262-267，1988；Hill et al.，Exp.Hematol.，vol.20，p354-360，1992)。既然IL-6活性在经施用抗血小板血清而诱发重症急性血小板减少兔子的血浆中检测不到，因而表明该TPO样活性是产生于IL-6之外的一种因子(Hill et al.，Blood，vol.80，p346-351，1992)。
Tayrien和Rosenberg也已从血小板减少兔血浆和HEK细胞的培养物上清液中纯化了一种表观分子量为15,000的因子，它能刺激大鼠巨核细胞的细胞系产生血小板因子4，但他们未曾提供有关其结构的信息(Tayrien and Rosenberg.J.Biol.Chem.，vol.262，p3262-3268，1987)。
另外，Nakeff在经施用抗血小板血清诱发的血小板减少小鼠血清中发现了Meg-CSF活性(Nakeff，“Experimental HematologyToday”ed.by Baum and Ledney，Springer-Verlag，NY，p111-123，1977)。另一方面，血小板减少的兔血清能促进巨核细胞成熟(keller et al.，Exp.Hematol.，vol.16，p262-267，1988；Hill et al.，Exp.Hematol.，vol.17，p903-907，1989)，并刺激巨核细施的形态变化为血小板(Leven and Yee，Blood，vol.69，p1046-1052，1989)，但未有可测的Meg-CSF活性。
Miura等人在经亚致死性整体辐射所提供的血小板减少的兔血浆中检测到了Meg-CSF活性(Miura et al.，Blood，vol.63，p1060-1066，1984)，这说明在体内诱导Meg-CSF活性与巨核细胞减少有关，而与血小板减少无关，因为在输注血小板后并不改变该活性(Miura et al.，Exp.Hemotol.，vol.16，p139-144，1988)。Mazur和South在经亚致死性辐射的狗血清中已检测到Meg-CSF活性，并报道该因子经凝胶过滤测得表观分子量为175,000(Mazur andSouth，Exp.Hematol.，vol.13，p1164-1172，1985)。除此之外，其它的研究人员(如Straneva et al.，Exp.Hematol.，vol.15，p657-663，1987)也已报道了血清、血浆及尿来源的因子。
因此，如上所述，已在取自血小板减少患者和动物的生物样品中发现了刺激巨核细胞生成和血小板生成的各种活性，但因为其在天然来源(如血和尿)中含量甚微，故而还未能完成对这些因子的分离、生化和生物学鉴定及特征描述。发明概述本发明的目的是从天然来源分离TPO蛋白质并鉴定之，该TPO蛋白质具有体内刺激或增加血小板生成和/或促进巨核细胞祖细胞的增生和分化的活性(下文称作“TPO活性”)；本发明的目的还要分离编码该TPO蛋白质的基因，并提供用重组DNA技术均质和大量生产所说蛋白质的方法。成功地达到上述目的将会替代现行的血小板输注或降低血小板输注的使用频率；所说的新蛋白质也将用于治疗和诊断血小板紊乱。
因此，本发明涉及(i)纯化和分离的编码具有TPO活性蛋白质的DNA序列，它选自下列序列(a)SEQ ID NO 194、195和196所示DNA序列或其互补链；和(b)在严格条件下与(a)中所定义的DNA序列杂交的DNA序列或其片段；和(c)倘若没有遗传密码的简并性就将会与(a)和(b)中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。
(ii)生产具有TPO活性蛋白质的方法，它包括下列步骤在适宜的营养条件下，培养以能够表达所说蛋白质的方式用所说DNA序列转化或转染的原核或真核宿主细胞；分离通过表达所说DNA序列所得的目的蛋白质产物，(iii)在原核或真核宿主细胞中通过表达所说DNA序列所得的蛋白质产物。
本发明进一步涉及含有效量具有TPO活性之所说蛋白质的药物组合物和治疗血小板紊乱(尤其是血小板减少)的方法，包括给有上述紊乱的患者施用所说的蛋白质。附图的简要描述

图1表示来源于XRP的Phenyl Sepharose 6FF/LSF2的Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析。
图2表示YMC-pack CN-AP TPO活性级分的Capcell Pak C1反相层析，所说级分来源于XRP的低分子量TPO样品(SephacrylS-200HR F3)。
图3表示来源于XRP低分子量TPO样品的Capcell Pak C1 TPO活性级分(FA)的SDS-PAGE分析。
图4表示用SDS-PAGE分离的大鼠的TPO在C18反相HPLC上的肽图谱。所示肽片段是经三种蛋白酶彻底水解而得。
图5表示大鼠CFU-MK测定系统中来源于XRP的TPO活性。
图6表示表达载体pEF18S的构建。
图7表示在大鼠CFU-MK测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pEF18S-A2X被引入COS1细胞中。
图8表示在大鼠CFU-MK测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pEF18S-HL34被引入COS1细胞中。
图9表示在大鼠CFU-MK测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pHT1-231被引入COS1细胞中。
图10a表示在大鼠CFU-MK测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pHTF1被引入COS1细胞中。
图10b表示在M-07e测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pHTF1被引入COS1细胞中。
图11表示λHGT1克隆的限制性图谱和pHGT1与pEFHGTE的构建。
(EEcoRI，HHindIII，SSalI)图12a表示在大鼠CFU-MK测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pEFHGTE被引入COS1细胞中。
图12b表示在M-07e测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pEFHGTE被引入COS1细胞中。
图13a表示在大鼠CFU-MK测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pHT1-211#1、pHT1-191#1或pHT1-171#2被引入COS1细胞中。
图13b表示在大鼠CFU-MK测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pHT1-163#2被引入COS1细胞中。
图14表示在M-07e测定系统中，COS1细胞的培养物上清液中的TPO活性，其中pHT1-211#1、pHT1-191#1、pHT1-171#2或pHT1-163#2被引入COS1细胞中。
图15表示用于从CHO细胞的培养物上清液中纯化人TPO的反相色谱(Vydac C4柱)的色谱图，其中的CHO细胞被导入了pDEF202-hTPO-P1，以使TPO能被表达。
图16是表明用SDS-PAGE分离由CHO细胞的培养物上清液纯化的人TPO的图片，其中的CHO细胞已被导入了pDEF202-hTPO-P1，以使TPO能被表达。
图17是用于从E.coli纯化人TPO的反相色谱的色谱图，其中的E.coli已被导入了pCFM536/h6T(1-163)，以使能表达TPO。
图18是用SDS-PAGE分离从E.coli分离和纯化的人TPO变异体h6T(1-163)的图片，其中的E.coli已被导入了pCFM536/h6T(1-163)，以使能表达TPO。
图19表示在Superdex 75pg柱上纯化得自培养物上清液的hTPO163的洗脱图型，作为起始物，它由将人TPO表达质粒pDEF202-hTPO163转染至CHO细胞而制备。于220nm处检测蛋白质含量。
图20表示在从培养物上清液纯化hTPO163后经Superdex 75pg柱洗脱的标准hTPO163的SDS-PAGE分析，作为起始物，它通过将人TPO表达质粒pDEF202-hTPO163转染至CHO细胞而制备，hTPO163在凝胶上用银染。
图21表示表达载体pSMT201的结构。
图22表示在COS7细胞的培养物上清液中经M-07e测定法检测的TPO活性，其中的COS7细胞中已被导入了βGL-TPO、N3/TPO或09/TPO，然后表达之。
图23表示在COS7细胞的培养物上清液中经M-07e测定法检测的TPO活性，其中的COS7细胞已被导入并表达了人TPO的插入或缺失衍生物。
图24表示经静脉和皮下注射TPO后小鼠的血小板数升高。
图25表示皮下注射TPO后，小鼠的血小板数呈剂量依赖性升高。
图26表示在用5-FU处理小鼠以诱发血小板减少之后，TPO能诱导血小板数升高。
图27表示用盐酸嘧啶亚硝脲处理小鼠诱发血小板减少后，TPO能诱导血小板数升高。
图28表示TPO能诱导骨髓移植后血小板减少之小鼠中的血小板数升高。
图29表示在用X线照射小鼠致血小板减少后，TPO能诱导血小板数升高。
图30表示在施用被截短的TPO(SEQ ID NO6中的氨基酸1-163)后血小板数呈剂量依赖性升高。
图31表示在施用盐酸嘧啶亚硝脲诱导血小板减少后，再用截短的TPO(SEQ ID NO6中的氨基酸1-163)会引起血小板数升高。
图32表示提高加入人巨核细胞培养物体系中的Mpl-X浓度将增加对巨核细胞发育的阻断。
图33描绘了在E.coli中表达的TPO衍生物[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg133]TPO(1-163)、[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Pro143]TPO(1-163)和[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg115]TPO(1-163)的TPO活性，该活性由M-07e测定法检测。
图34描绘了在E.coli中表达的TPO衍生物[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg129]TPO(1-163)、[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg143]TPO(1-163)、[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Leu82]TPO(1-163)、Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Leu146]TPO(1-163)和[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg59]TPO(1-163)的TPO活性，该活性由M-07e测定法检测。发明的详细描述确切地说本发明提供了具有特异性刺激或增加血小板生成的生物活性、并含有SFQ ID NO6氨基酸序列的1-332血小板生成素(TPO)多肽或其衍生物。举例说明的多肽包括由下列氨基酸序列组成的那些多肽SEQ ID NO6氨基酸序列的1-163；SEQ ID NO6氨基酸序列的1-232；SEQ ID NO6氨基酸序列的1-151；SEQ IDNO2、4和6的成熟氨基酸序列包括缺失1-6个N-末端氨基酸的那些多肽。本发明另外举例说明的多肽包括[Thr33，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO，[Asn25，Lys231，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO，[Asn25]TPO和[Thr33]TPO.本发明的其它多肽还包括TPO多肽的衍生物[ΔHis33]TPO(1-163)，[ΔArg117]TPO(1-163)，[ΔGly116]TPO(1-163)，[His33，Thr33′，Pro34]TPO(1-163)，[His33，Ala33′，Pro34]TPO(1-163)，[His33，Gly33′，Pro34，Ser38]TPO(1-163)，[Gly116，Asn116′，Arg117]TPO(1-163)，[Gly116，Ala116′，Arg117]TPO(1-163)，[Gly116，Gly116′，Arg117]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg129]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg133]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg143]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Leu82]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Leu146]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Pro148]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg59]TPO(1-163)，and[Ala1，Val3，Arg115]TPO(1-163).
本发明的TPO多肽还包括那些与聚合物(最好是聚乙二醇)共价相连的。本发明的TPO多肽进一步可包括氨基酸[Met-2-Lys-1]、[Met-1]或[Gly-1]。本发明提供的DNA包括那样编码上述TPO多肽和衍生物的DNA，并以cDNA、基因组DNA和生产的DNA形式适当的提供。
本发明还提供了生产上述TPO多肽的方法，其步骤包括在适宜的宿主中表达由本发明DNA编码的多肽，分离所说的TPO多肽。在被表达的TPO多肽是Met-2-Lys-1多肽情况下，所说的方法进一步能包括从所说分离的TPO多肽裂解Met-2-Lys-1的步骤。
本发明还提供生产如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合多肽的的TPO多肽的方法。将编码N末端GST多肽、凝血酶识别肽和TPO多肽的DNA导入适宜的宿主，分离融合多肽，并经凝血酶处理以除去GST部分。所得TPO多肽具有[G1y-1]结构。
本发明另外提供的是用本发明的DNA序列转化或转染的原核或真核宿主细胞，其转染或转化是以能够在所说宿主细胞中表达具有特异性刺激或增加血小板生成的生物活性的多肽之方式进行的。
本发明的药物组合物包括有效量的TPO多肽或衍生物和药用载体，易用于治疗血小板紊乱，尤其是治疗血小板减少症，如因化疗、放疗或骨髓移植所诱发的血小板减少症。本发明提供了相应的治疗方法。
最后，本发明提供与上述TPO多肽及其衍生物有特异性免疫反应的抗体。这类抗体用于本发明TPO多肽的分析和定量分析方法中。
根据本发明，提供了编码具有TPO活性的蛋白质的新DNA序列(下文称为“本发明的DNA序列”)。本发明的DNA序列包括编码所附序列表中SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸序列的DNA序列。
本发明的DNA序列还包括编码前述SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸的部分修饰(取代、缺失、插入或增加)变异体，前提是这类修饰作用不损害TPO活性。这就是说，编码TPO衍生物的DNA序列也包括在本发明中。
换句话说，本发明的DNA序列包括编码其氨基酸序列基本上为SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸序列的蛋白质分子的DNA序列。此外所用措词“氨基酸序列基本上为SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸序列”意指所说的氨基酸序列包括那些由SEQ ID NO2、4或6所表示的，以及那些由其中被部分修饰(如取代、缺失、插入、增加等)的SEQ ID NO2、4或6所表示的，后者的前提是所说的修饰作用不损害TPO活性。
更进一步，本发明的DNA序列本质上包括编码具有TPO活性蛋白质的DNA序列。
措词“编码氨基酸序列的DNA序列”包括可在核苷酸序列中存在简并性的所有DNA序列。
本发明的DNA序列还包括下列序列(a)SEQ ID NO7、194、195和196所表示的DNA序列或其互补链，(b)在严格条件下与(a)所定义的DNA序列杂交的DNA序列或其片段，或
(c)倘若没有遗传密码的简并性就将会与(a)和(b)中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。
换句话说，本发明的DNA序列还包括下列序列(a)整合到下列载体中并编码具有TPO活性蛋白质的氨基酸序列的DNA序列E.coli DH5菌株携带的载体pEF18S-A2α(保藏号为FERM BP-4565)、E.coli DH5菌株携带的载体pHT1-231(保藏号为FERM BP-4564)、E.coli DH5菌株携带的载体pHTF1(保藏号为FERM BP-4617)和E.coli DH5菌株携带的载体pHGT1(保藏号为FEMR BP-4616)；或(b)在严格条件下与(a)所定义的DNA序列或其片段杂交并编码具有TPO活性的氨基酸序列的DNA序列。
本文所描述的“严格”杂交条件是指在用变性的和/或单一序列寡核苷酸引物(探针)说明对本发明的DNA进行PCR扩增的实施例中所应用的条件(也可参见例如Molecular Cloning，Chapter 11 and12，Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Unit 2.10，Ausubel et al.，Eds.，Current Protocols，USA，1993)。
本发明的DNA序列还包括编码具TPO活性的蛋白质的DNA序列，包括编码SEQ ID NO6表示的氨基酸序列的1-163位的核苷酸序列。
这类DNA序列还可以在起始、中止和中间位置添加限制性酶解位点和/或另外的DNA序列，以便于构建易于表达的载体。当使用非哺乳动物宿主时，可在宿主中掺入对于基因表达的优选密码子。
本发明DNA序列的一个例子是通过从哺乳动物(包括人)细胞制备mRNA，然后以常规途径从已知方法制备的cDNA文库中筛选所需cDNA所得的cDNA分子。这种情况下mRNA的来源包括大鼠肝细胞来源的细胞系McA-RH8994、HTC细胞、H4-II-E细胞、大鼠肝脏、肾、脑和小肠、人肝等。
本发明DNA序列的另外一个例子是一种基因组DNA分子，它通过以常规途径从用已知方法由哺乳动物(包括人)细胞制备的基因组文库中筛选而得。这种情况下基因组DNA的来源包括得自人、大鼠、小鼠等的染色体DNA制备物。
制备编码TPO衍生物的DNA序列可以通过利用已知的定点诱变来修饰上述的cDNA序列，籍此部分修饰相应氨基酸序列，从而由上述编码具有TPO活性蛋白质的cDNA序列制得。
已推导出本发明具TPO活性之蛋白质的氨基酸序列或DNA序列，因而编码经部分修饰的氨基酸序列的DNA序列很容易用化学合成法制得。
本发明的DNA序列是利用各种重组DNA技术大规模生产具有TPO活性之蛋白质的有用物质。
同样，本发明的DNA序列还用作分离编码TPO相关蛋白之基因的标记探针，以及作为编码其它哺乳动物种类之TPO的cDNA和基因组DNA。它还可用于人和其它种哺乳动物的基因治疗。另外，本发明的DNA序列还用于开发能用作大规模生产TPO的真核宿主的转基因哺乳动物(Palmiter et al.，Science，vol.222，p809-814，1983)。
本发明还提供了被前述编码具TPO活性蛋白质之DNA序列整合的载体、用所说载体转化的宿主细胞以及生产具有TPO活性之蛋白质的方法，所说方法包括培养所说宿主细胞，分离并纯化被表达的具TPO活性的蛋白质。
用于上述情况的宿主细胞的例子包括原核细胞，如E.coli等，真核细胞，如酵母、昆虫、哺乳动物细胞等。举例说明的哺乳动物细胞的例子包括COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、C-127细胞、幼龄仓鼠肾(BHK)细胞等。举例说明的酵母的例子包括面包酵母(酿酒酵母)、甲醇同化酵母(巴斯德毕赤氏酵母)。举例说明的昆虫细胞的例子包括蚕的培养细胞等。
有关用于转化上述宿主细胞的载体，pKC30(Shimatake H.andM.Rosenberg，Nature，292，128-132，1981)、pTrc99A(AmannE.et al.，Gene，69，301-315，1988)等可用于转化E.coli细胞。pSV2-neo(Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet.，1，327-341，1982)、pCAGGS(Niwa et al.，Gene，108，193-200，1991)、pcDL-SRα296(Takebe.et al.，Mol.Cell.Biol.，8，466-472，1988)等可用于转化哺乳动物细胞。pG-1(Schena M.and Yamamoto K.R.，Science，241，965-967，1988)等可用于转化酵母细胞。用于构建重组病毒的转移载体如pAc373(Luckow etal.，Bio/Technology，6，47-55，1988)可以转化蚕细胞。
必要时，每一上述载体可以含有制复原点、选择标记、启动子等，以及在用于真核细胞的载体中还含有RNA拼接位点、多聚腺苷酸化信号等。
有关复制原点，来自例如SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒等的序列可用于转化哺乳动物细胞的载体中。来自ColEI、R因子、F因子等的序列可用于转化E.coli细胞的载体中。来自2μm DNA、ARS1等的序列可用于转化酵母细胞的载体中。
关于基因表达的启动子，那些来自例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、SV40等的启动子可用于转化哺乳动物细胞的载体。来自噬菌体λ的启动子，如trp、Ipp、Lac或tac启动子可用于转化E.coli细胞的载体。ADH、PHO5、GPD、PGK或MAFα启动子可用于转化面包酵母细胞的载体，而AOX1启动子等可用于转化甲醇同化酵母细胞的载体。来自核多角体病毒的启动子可用于转化蚕细胞的载体。
用于哺乳动物细胞载体中的选择标记的典型例子包括新霉素(neo)抗性基因、胸苷激酶(TK)基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、E.coli黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因等。用于E.coli细胞载体中的选择标记的说明性例子包括卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因等，用于酵母细胞的选择标记的例子包括Leu2、Trp1、Ura3等基因。
利用将上述宿主-载体系统的适当结合来生产具有TPO活性的蛋白质，可以通过用经在上述载体的合适位点插入本发明基因所得的重组DNA转化适宜的宿主细胞、培养所得的转化体，然后从所得细胞或培养基或滤液中分离并纯化所需多肽。通常所用的方式和过程都可以相结合地用于上述方法中。
当表达目的基因时，可以用来源于另一种蛋白质的信号序列修饰或置换原始的信号序列以获得被表达产物的均一性N末端。N末端均化作用可以通过修饰(替代或增加)N末端或其近邻位置的氨基酸残基来进行。例如在用E.coli作宿主细胞进行表达的情况下，Lys残基可进一步补充加入met残基。
本发明具有TPO活性的新蛋白质(下文称为“本发明的蛋白质”)包括各自含有SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸序列的蛋白质。氨基酸序列被部分修饰(取代、缺失、插入或增加)的TPO衍生物也包括在本发明中，前提是TPO活性不因修饰作用而破坏。
换句话说，本发明的蛋白质包括其氨基酸序列基本上是SEQ IDNO2、4或6所示氨基酸序列的蛋白质分子。
本文的措词“氨基酸序列基本上是SEQ ID NO2、4或6所示(或表示)的氨基酸序列”是指所说的氨基酸序列包括SEQ ID NO2、4或6所示的那些序列，以及其中已经部分修饰(如替代、缺失、插入或增加等)的SEQ ID NO2、4或6所示序列，对于后者这种情况前提是所说修饰作用不破坏TPO活性。
本发明的蛋白质包括含有SEQ ID NO6所示氨基酸序列7-151位并具有TPO活性的蛋白质。同样包括在本发明蛋白质中的是具有TPO活性并含有SEQ ID NO6所示1-163位氨基酸序列的蛋白质。
本发明其它TPO衍生物的例子包括其体内稳定性和持久性因氨基酸的修饰作用(替代、缺失、插入或增加)而得以改善的衍生物，其中至少一个潜在的糖基化因氨基酸的缺失或增加而得到改变的衍生物，或其中至少一个Cys残基缺失或由其它的氨基酸残基(如Ala或Ser残基)替代的衍生物。
优选的是，本发明蛋白质的特征在于它是从用含cDNA分子、基因组DNA分子或经化学合成法得到的DNA片段的重组载体转化的宿主细胞中分离和纯化的。
当用细菌如E.coli作宿主能有效地进行细胞内表达时，可得到起始蛋氨酸残基被加至具有TPO活性之蛋白质分子的N末端一侧的蛋白质，该蛋白质也包括在本发明中。根据所用宿主的不同，所生产的具TPO活性之蛋白质能够或不能被糖基化，这每种情况都包括在本发明的蛋白质中。
本发明的蛋白质还包括天然存在的TPO活性蛋白质，它们从天然来源，如具有TPO活性的细胞培养基中或人尿、血清和血浆中纯化并分离得到。
从上述天然来源中纯化TPO的方法也包括在本发明中。完成这类纯化方法可以采用一个或联合应用下列通常用于蛋白质纯化的步骤，如离子交换层析、凝集素亲和层析、三嗪染料亲和层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、肝素亲和层析、硫酸化凝胶层析、羟基磷灰石层析、等电点聚焦层析、金属螯合层析、制备性电泳、等电点聚焦凝胶电泳等。利用可从本说明书中实施例中推测出的TPO之理化特性而结合使用某些技术的纯化方法也包括在本发明中。另外，还可以应用抗体亲和层析，其中使用了能够识别TPO的抗体。而且，已发现TPO是Mpl的配体(de Sauvage et al.，Natuce 369533-538(1994)；Bartley et al.，Cell 771117-1124(1994)；Kaushansky et al.，Nature 369565-568(1994))，籍此可以利用Mpl已与树脂偶联的亲和凝胶柱纯化TPO。更确切地说，所说柱子的例子是一个Mpl-X柱，它是通过将树脂与Mpl的胞外区(Mpl-X)偶联而制成，所说的MpL-X是经用CHO细胞作宿主的重组DNA技术生产的(Bartley，et al.(1994)出处同上)。
如本文所公开的，本发明TPO多肽更进一步的特征在于它能结合Mpl受体并能特异性地结合其胞外(可溶性)区域。
同样包括在本发明中的是由与TPO基因的人cDNA或基因组DNA序列的蛋白质编码链互补的DNA部分编码的蛋白质，即Tramontano等人(Nucl.Acids.Res.，vol.12，p5049-5059，1984)公开的“互补反向蛋白质”。
同样包括在本发明中的是用可检测标记如125I标记或生物素化作用标记的本发明蛋白质，因此提供用于在固体样品(如组织)和液体样品(如血液、尿液等)中检测和定量分析TPO或TPO受体表达细胞的可能的试剂用品。
本发明的生物素化蛋白质用于其与固定化的链霉抗生物素蛋白的结合，以在同种异体骨髓移植时从骨髓中去除成巨核细胞。它还用于其与固定化的链霉抗生物素蛋白的结合，以在自体或同种异体骨髓移植时浓缩自体或同种异体的巨核细胞。TPO与毒素如蓖麻毒蛋白、白喉毒素等或与放射性同位素的结合物可用于抗肿瘤治疗和调理骨髓移植。
本发明还提供了核酸物质，它用于在用包括放射性或非放射性标记(如生物素)的可检测标记标记时，或用于杂交过程以检测人TPO基因和/或其相关基因家族在染色体图谱上的位置。这类核酸物质还用于在DNA水平证实人TPO基因紊乱，并能用作证实毗邻基因及其紊乱的遗传标记。
同样包括在本发明中的是药用组合物，它含有治疗有效量的本发明蛋白质和实用有效的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅剂和/或载体。本文所用术语“治疗有效量”是指对特定的疾病和施用条件的途径提供有效作用的量。这类组合物可以液体、冻干或干燥制剂的形式使用，它含有选自具有不同pH值和离子强度的各种缓冲液(例如Tris-HCl、乙酸盐和磷酸盐)的稀释剂，防止表面吸附的添加剂如白蛋白和明胶，表面活性剂如吐温20、吐温80、Pluronic F68或胆酸盐，增溶剂如甘油或聚乙二醇，抗氧化剂如抗坏血酸或焦亚硫酸氢钠，防腐剂如乙基汞硫代水杨酸钠、苄基醇或对羟苯甲酸酯，以及载体或张力剂如半乳糖或甘露糖醇。还有被应用的化合物包括本发明的蛋白质与聚合物如聚乙二醇共价相连，蛋白质与金属离子螯合，蛋白质掺入颗粒制剂，或在其表面，含有聚合物化合物如聚乳酸，聚乙醇酸或水凝胶，或者将蛋白质掺入脂质体、微乳液、微团、单层或多层泡囊、血影或原生质体。这类组合物将根据TPO的物理条件、溶解性、稳定性、体内释放速度和体内清除率而起作用。可以根据所用TPO活性蛋白质的理化特性决定对组合物的选择。同样包括在本发明中的是颗粒状组合物，其中的颗粒用聚合物如poloxamer，poloxamine包被，TPO与组织特异性受体、配体或抗原的抗体或组织特异性受体的配体结合。本发明组合物的其它例子是具有保护性包膜并含有蛋白酶抑制剂或渗透增强剂的粒状形式，用于各种途径施药，如胃肠外、经肺、经鼻腔和口服给药。
含有本发明蛋白质的药物组合物可以每天给药数次，根据病人的状况、性别、用药途径等通常用量为0.05μg-1mg/kg体重(TPO蛋白质)。
根据病人的症状、性别和用药途径的不同，含本发明蛋白质的药物组合物可以每公斤体重25,000-500,000,000活性成分的量(由下文将给出的M-07e测定法检测的相对活性)每天施用1至数次，每周用药1-7天。
本发明人已证实，关于人TPO的C末端位点，既使当SEQ ID NO6所示氨基酸序列缺失至第152位氨基酸残基仍能维持其活性；对于N末端位点，当氨基酸残基缺失至第6位时活性仍维持。
据此，具有TPO活性、含有SEQ ID NO6的7-151氨基酸序列并在其它部分被修饰(取代、缺失、插入或增加)的蛋白质也优选用作本发明的有效成分。更优选的TPO衍生物具有SEQ ID NO6的1-163氨基酸序列。
同样包括在本发明中的组合物除了含有本发明的蛋白质外，还含有至少一种其它的造血因子，如EPO、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、LIF和SCF。
本发明的蛋白质单独或与其它造血因子联合用于治疗各种血小板减少性疾病。其它造血因子的例子包括EPO、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、LIF和SCF。
用本发明的蛋白质可以治疗许多以因血小板的生成受损或血小板生存期缩短(血小板的破坏堆积所致)所引起的血小板紊乱(如血小板减少症)为特征的疾病。例如，它可以用于先天性Fanconi贫血或在骨髓移植后因化疗、放疗、骨髓发育不良综合征、急性髓细胞性白血病、再生障碍性危象所致的再生障碍性贫血的血小板减少症患者，以促进血小板的恢复。它还可以用于治疗因TPO的生成或减少所致的血小板减少症。血小板或巨核细胞生存期缩短所致的血小板减少症包括特发性血小板减少性紫癜、再生不良性贫血、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、弥散性血管内凝血综合征和血栓性血小板减少症。此外，本发明的蛋白质还用于血小板的自体再注入，其中将TPO在患者进行外科手术前施用，以增加患者自身的血小板数，并且因此而增加的血小板在手术时用作输注的血小板。
本发明蛋白质的其它用途是治疗因化学或药学药物或治疗方法所致的血小板暂时缺失或损害引起的疾病。TPO能够用于促进这类患者体内新的“完整”血小板的释放。
本发明进一步涉及对TPO有特异性的抗体。本发明的蛋白质可用作抗原，相应的抗体包括用常规方法制备的单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体，即“重组抗体”。为制备这类抗TPO的抗体，人TPO本身可用作抗原，或者可选择地，人TPO的部分肽可用作抗原。当应用针对这类肽抗原的抗体时，就可用特定的抗原区定义表位。另一方面，当应用针对抗原蛋白质(TPO)本身的抗体时，可以通过分析抗体的表位来明确抗原区。在这种情况下，这些分别具有如此明确之表位的抗体能够用于分级分离、检测、定量分析和纯化各种其特性(如所加糖链的种类、肽链的长度等)不同的TPO。
可以合成含有经上述选择的氨基酸序列之TPO肽，并将之与适宜的载体蛋白，如白蛋白、KLH(锁孔血兰蛋白)等通过共价键相连，以制备免疫反应性抗原。另外，根据Tam的方法生产多抗原肽(MAP)型肽作为抗原(Tam，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.855409-5413，1988)。然后，用所制备的抗原和佐剂等免疫哺乳动物、鸟类等，这通常被用来使之产生抗体，如兔、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、鸡、仓鼠、马、豚鼠等。从所免疫的动物回收抗血清和细胞，由此获得多克隆抗体。当肽用作抗原时，用特定的抗原区定义表位。在这种情况下，用免疫学工程筛选并鉴定具有不同分子量的各种TPO的抗原区。例如，可以筛选和鉴定肽缺失区。另外，从表达所需抗体的细胞克隆抗体基因或其部分，以得到用遗传工程方法表达的抗体分子。
与通常含有对多种抗原决定簇(表位)有特异性的多种抗体的多克隆抗体相比，单克隆抗体只对抗原上的单一抗原决定簇有特异性。TPO特异性的抗体用于改善抗原-抗体反应辅助性诊断和分析性测定方法的选择性和稳定性，并用于TPO的分离和纯化。另外，这类抗体可用于中和或从血清中除去TPO。单克隆抗体也用于检测和定量分析例如血清或全血中的TPO。
本发明的抗人TPO抗体可用作纯化和分离人TPO的亲和层析中的配体。为固定抗体以使之用于亲和层析，固定各种酶的任何常规方法都可以使用。例如，可以使用利用了CNBr活化的Sepharose 4B的载体(Pharmacia Fine Chemicals Co.)等的方法。为了利用固定的抗人TPO抗体实际地纯化人TPO，将被固定的抗人TPO抗体填充至柱中，并用含人TPO的液体过柱。经此操作过程，大量的人TPO吸附至柱中的载体表面。至于进行洗脱的溶剂，例如可用的是Gly-HCl缓冲液(pH2.5)，NaCl溶液、丙酸、二噁烷、1，2-乙二醇、离液序列高的盐、盐酸胍、脲素等。用上述溶剂进行洗脱，可以洗脱出具有高纯度的人TPO。
本发明的抗体可以通过免疫化学定量分析测定用于检测人TPO，尤其是通过固相夹心法进行的酶联免疫测定。
单克隆抗体的优点在于它们可以由培养基中不含任何其它免疫球蛋白分子的杂交瘤细胞产生。单克隆抗体可由杂交瘤细胞的培养物上清液或由经腹膜内注射杂交瘤所诱发的小鼠腹水中制备。最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)公开的杂交瘤技术已广泛地用于形成杂交瘤细胞，后者具有针对特异性抗原的高水平单克隆抗体。
为了从所得的含抗体的物质中分离所需的抗体，可以采用一步或联合使用多步通常用于纯化蛋白质的步骤(亲和层析如蛋白质A亲和层析、蛋白质G亲和层析，Avid凝胶层析，抗免疫球蛋白固定的凝胶层析等，以及阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝集素亲和层析、染料吸附层析、疏水作用层析、凝胶渗透层析、反相层析、羟基磷灰石层析、氟代磷灰石层析、金属螯合层析、等电点层析等)。除此之外，还可以使用抗原亲和纯化法，其中，制备与含有抗原区或其部分或即能识别所需抗体的分子的人TPO蛋白本身或肽经化学相连的凝胶载体或膜，向其上加入含抗体的物质，以使制备的所需抗体吸附至载体或膜表面，然后在适宜条件下洗脱并回收所吸附的抗体。
本发明还允许使用编码TPO多肽的内源性DNA序列大量地生产多肽产物。例如，利用体外和体内的同源性重组过程转化宿主细胞，以提供多肽的表达或增强表达。优选的宿主细胞包括其中插入了启动子或增强子序列的人细胞(如肝、骨髓细胞等)，插入时使用了与细胞基因组的靶区同源的侧翼序列，籍此完成或增强TPO多肽的表达(参见如U.S.Letters Patent 5,272,071，PCT WO 90/14092，WO91/06666和WO 91/09955)。
本发明还提供了生产上述TPO多肽的方法，包括在适宜宿主中表达本发明DNA编码的多肽，分离所说的TPO多肽。当被表达的TPO多肽为Met-2-Lys-1多肽时，这类方法进一步包括从所说分离的TPO多肽中裂解Met-2-Lys-1的步骤。
本发明还提供了生产具[Gly-1]结构之TPO多肽的方法，包括将编码谷胱甘肽-S-转移酶(GST)多肽的DNA5′与TPO多肽编码序列的连接物导入适宜的宿主细胞，其中的GST和TPO多肽由编码凝血酶识别多肽的DNA分隔开，分离GST-TPO表达产物，用凝血酶处理被表达的多肽以除去GST氨基酸，所得TPO多肽具有[Gly-1]结构。
下面将详细地描述本发明。(A)纯化大鼠TPO、分析纯化的大鼠TPO之部分氨基酸序列并分析纯化的大鼠TPO之生物学特征本发明的发明人最先尝试纯化具有促进大鼠CFU-MK增生和分化之活性的大鼠TPO蛋白质。在该纯化研究中，对纯化过程如各种天然供给来源的选择及用于层析的凝胶和分离模式的选择进行了大量的试验性和失败性尝试。最终，本发明人成功地从经X射线或γ射线照射诱导的血小板减少症大鼠血浆中纯化出具有TPO活性的蛋白质，基于下文参考实施例和测定被纯化蛋白质的部分氨基酸序列的实施例1和2中描述的大鼠CFU-MK测定法，将利用TPO活性作为标记。
血浆来源的大鼠TPO之生物学特征也在实施例3中检测。
下面列出从纯化大鼠TPO到测定纯化蛋白质之部分氨基酸序列过程的要点。
(i)从大约1,100只经X射线或γ射线照射诱导的血小板减少症大鼠制备血浆样品，并依次进行Sephadex G-25层析、阴离子交换层析(Q-Sepharose FF)和凝集素层析(WGA-Agarose)，从而得到WGA-Agarose吸附的TPO活性级分。
(ii)接下来，将如此所得的WGA-Agarose吸附的活性级分再依次进行三嗪染料亲和层析(TSK AF-BLUE 650MH)、疏水作用层析(Phenyl Sepharose 6FF/LS)和凝胶过滤层析(Sephacryl S-200HR)。因这通过Sephacryl S-200HR凝胶过滤TPO活性被分成4个峰(F1为最高分子量级分，随后为F2、F3和F4)，所以分别浓缩TPO活性级分F2和F3，得到分别用于后续纯化步骤中的高分子量TPO样品F2和低分子量TPO样品F3。
(iii)将低分子量TPO样品F3依次进行制备性反相层析(YMC-Pack PROTEIN-RP)、反相层析(YMC-Pack(N-AP)和另一个反相层析(Capcell Pack C1)。当如此所得的TPO活性级分被用于十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并从凝胶中提取TPO活性物质后，在非还原条件下从相当于表观分子量为约17,000-19,000的条带中证实存在TPO活性。
(iv)接着，所有的TPO活性级分在非还原条件下进行SDS-PAGE，并转移到PVDF膜。PVDF膜上的蛋白质经完全性限制性酶水解成为肽片段，然后测定大鼠TPO蛋白质的部分氨基酸序列。根据二个肽片段的氨基酸序列信息克隆大鼠TPO基因。
(v)至此，将经Sephacryl S-200HR获得的高分子量TPO样品F2以与低分子量TPO样品F3同样的方式纯化。当经最后一步反相层析(Capcell Pack C1)获得的TPO活性级分应用于SDS-PAGE，并从凝胶中提取TPO活性物质时，在非还原条件下从相当于表观分子量为约17,000-22,000的条带中证实存在TPO活性。(B)特征化大鼠产生TPO的细胞、制备mRNA和构建大鼠cDNA文库因为上述纯化的大鼠TPO来源于血浆，所以有必要筛选作为用于cDNA克隆的mRNA来源的器官或细胞。因此，根据大鼠血浆来源TPO的生化和生物学特性筛选各种器官和细胞培养物上清液中的TPO活性。结果，在大鼠肝细胞来源的细胞系McA-RH8994、HTC和H4-11-E的培养物上清液以及大鼠原代肝细胞的培养物上清液中发现了几乎与大鼠血浆来源的TPO相等的TPO活性(实施例4)。
另一方面，从表达载体pME18S和pEFBOS构建表达载体pEF18S(实施例5)。该载体的构建可以提供可能易于利用高效表达载体克隆cDNA，所说的高效表达载体具有能够用于整合插入段的多克隆位点。
除上述表达载体外，主要还用以质粒载体和λ基础的噬菌体载体的pUC和pBR构建cDNA文库。
培养McA-RH8994细胞，通过加入硫氰酸胍溶液均质化，然后进行CsCl密度梯度离心，得到总RNA(实施例6)。
也可以用热酚法，一种酸胍盐酚氯仿法等制备RNA。
在用寡脱氧胸苷酸固定的胶乳颗粒从总RNA中纯化poly(A)+RNA后，用寡脱氧胸苷酸作引物，加入限制性酶NotI识别序列，经逆转录酶的作用合成第一条cDNA链，再用RNase H和E.coli DNA聚合酶I合成第二条cDNA链。向所得的双链cDNA中加入EcoRI连接物，所得的cDNA与实施例5中所构建的哺乳动物细胞表达载体pEF18S(已用NotI和EcoRI消化)连接，然后将所连接的cDNA转化E.coli DH5菌株的感受态细胞以构建cDNA文库(实施例7)。(C)用PCR制备(克隆)大鼠TPO cDNA片段从经大鼠血浆纯化的大鼠TPO的部分氨基酸序列推测DNA序列，合成用于聚合酶链反应(PCR)的简并引物。所用引物也可以根据该处所用引物之位置以外的氨基酸序列获得。还可以使用未用肌苷的高度简并引物。另外，可以利用在大鼠中很常用的密码子设计降低了简并性的引物(Wada et al.，Nucleic Acids Res.，vol 18，p2367-2411，1990)。
当从上文所制备的cDNA文库的完整部分提取质粒DNA并用提取的DNA作为模板进行PCR时，检测到大约330bp的条带，这在随后的氨基酸序列分析中测定为编码大鼠TPO部分的DNA片段(A1片段)(实施例8)。
(D)用PCR筛选大鼠TPO cDNA、大鼠TPO cDNA的序列和证明TPO活性上述制备的cDNA文库被分成小库，各含大约10,000克隆，从每100个小库中提取质粒DNA。当用每一质粒DNA库作为模板并用根据A1片段的核苷酸序列新合成的引物进行PCR时，在3个小库中检测到被认为具特异性的条带。3个小库的其中之一又被分成亚库，分别含大约900个克隆，从100个亚库中纯化质粒DNA，并以相同的方式进行PCR。结果，在3个亚库中检测到特异性条带。这些库的其中之一又被分成亚库，各含40个克隆，最终以相同方式经PCR筛选每一克隆。结果，分离到看似编码大鼠TPO cDNA的克隆pEF18S-A2α
(实施例9和10)。
当分析该克隆的核苷酸序列时，结果表明该克隆编码由大鼠血浆纯化的蛋白质的部分氨基酸序列，因此证实了该克隆极可能含有大鼠TPO cDNA(实施例10)。
当由上述所得的克隆pEF18S-A2α纯化质粒DNA并转染COS1细胞时，在被转染细胞的培养物上清液中发现了TPO活性。结果，证实了克隆pEF18S-A2α含有编码大鼠TPO的cDNA(实施例11)。(E)在各种大鼠组织中检测TPO mRNA用PCR分析大鼠组织中TPO mRNA的表达，并检测了大鼠脑、肝、小肠和肾中的特异性表达(实施例12)。(F)构建人cDNA文库基于实施例4和12的结果，肝脏被选作进行人TPO cDNA克隆的起始组织。因此，用来源于正常人肝脏的市售mRNA构建cDNA文库。如大鼠文库的情况一样，以同样的方法用pEF-18S作载体合成cDNA，利用限制性酶NotI和EcoRI获得直接克隆的cDNA文库。通过将载体连接的cDNA导入E.coli DH5所制备的文库含有大约1,200,000个克隆(实施例13)。(G)用PCR制备(克隆)人TPO cDNA片段根据编码大鼠TPO cDNA的克隆pEF18S-A2α之核苷酸序列合成数种用于PCR的引物。当用来源于正常人肝脏的市售mRNA合成cDNA，并使用上述引物和用cDNA作模板进行PCR时，观察到大约620bp的条带。分析其核苷酸序列时证明，该克隆含有与大鼠TPO cDNA具约86％同源性的DNA片段，因此证明这极可能是编码人TPO的基因部分(实例14)。
(H)用PCR筛选人TPO cDNA、人TPO cDNA的序列和证实TPO活性扩增上述制备的人cDNA文库，将其分成小库，各含大约100,000个克隆，从90个小库中的每一小库提取质粒DNA。当用每个库的质粒分子作模板并应用根据实施例14所得的人TPO片段之核苷酸序列新合成的引物进行PCR时，在3个小库中检测到可能的条带。这些小库之一被分成亚库，各含5,000克隆，从90个亚库的每一亚库中纯化质粒DNA。在以相同方式用每一库质粒DNA作模板进行PCR时，在5个亚库中检测到可能的条带。当这些库之一被再分成亚库，各含250个克隆时，从90个亚库的每一亚库中纯化质粒DNA并进行PCR，在3个亚库中检测到可能的条带。而且，从这些亚库之一分离90个集落，由每一集落纯化的质粒DNA进行PCR，最终得到名为HL34的克隆(实施例15)。
在分析该克隆中的质粒DNA之核苷酸序列时，结果证明该克隆含有与大鼠TPO cDNA核苷酸序列有大约84％同源性的cDNA(实施例16)。
当纯化该克隆的质粒DNA并转染COS1细胞时，在被转染细胞的培养物上清液中发现了TPO活性。结果，证实了该质粒克隆含有编码人TPO的cDNA(实施例17)。
然而，该cDNA似乎是克隆过程的人工产物，因为在该克隆中未发现终止密码子，在其3′末端有poly A尾样序列。因此，构建编码不含相应于poly A尾样序列之氨基酸序列的表达载体。当如此构建的载体在COS1细胞中表达时，在所得的培养物上清液中发现了TPO活性(实施例18)。
用PCR获得人TPO 3′末端区的DNA片段，以便分析全长cDNA的结构。
测定该片段的核苷酸序列表明，它与实施例15所得的克隆HL34携带的cDNA部分重叠。还预料全长人TPO cDNA可含有其开放阅读框架，并编码353个氨基酸的蛋白质。因此，这表明人TPO含有包括21个氨基酸信号序列的353个氨基酸序列(实施例19)。
除了上述克隆方法外，还可以利用以pUC或pBR为基础的质粒载体、以λ噬菌体为基础的载体等，用大鼠TPO cDNA片段作探针经集落杂交或噬菌斑杂交获得人TPO cDNA的克隆。在设计简并探针时，肌苷可用来降低简异性的程度。当可以有效使用一种以特定方式或高灵敏度检测TPO活性的测定方法时，则有可能利用如本发明所用的表达文库来表达克隆。
然而，因为如下文实施例15所述，正常人肝脏中人TPO编码RNA的含量似乎非常低(从该实施例15的结果计算的含量是1∶3×106)，所以，用合成的寡核苷酸或大鼠或人TPO cDNA片段作探针进行杂交筛选很难奏效，因为待处理的集落或噬菌斑数变得非常庞大，而杂交法的灵敏度和特异性又不及PCR法。事实上，本发明人已用大鼠TPO cDNA片段作探针对在实施例13所制备的正常人肝脏之cDNA文库中的2×106克隆进行了杂交，但未能得到人TPO cDNA克隆。(I)重建正常人肝脏来源的cDNA因为实施例15所得的克隆HL34可能含有不完整的cDNA，所以用市售的正常人肝脏来源的poly(A)+RNA制剂重新构建cDNA文库，以获得完整的人TPO cDNA，通过将载体连接的cDNA导入E.coli DH5中而制备的文库(hTPO-F1)含有1.0×106转化子(实施例20)。(J)筛选TPO cDNA克隆、测序和表达人TPO cDNA及证实TPO活性根据实施例14中所得的部分cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和实施例19中预测的人TPO完整cDNA的核苷酸序列(SEQ IDNO196)合成用于PCR的引物。
实施例20中构建的人肝脏cDNA文库(hTPO-F1)被分成3个小库(库号1-3#)。用由各小库制备的质粒DNA作为模板并用合成的引物进行PCR。结果，当使用由3#小库制备的质粒DNA时，扩增了具有预期大小的DNA片段。然后将3#小库分成亚库，分别含15,000转化体，如上所述利用PCR进行筛选。结果，在90个小库的6个中发现有具预期大小DNA的扩增。当这些阳性小库被分成亚库，分别含1,000个克隆，以相同的方式提取质粒DNA并进行PCR时，未观察到DNA扩增。考虑这是由于目的克隆的生长较其它克隆更弱而引起的质粒DNA回收率低所致。因此，将原始的3#小库以每个LB平板上生长4,100个集落的接种体积涂布于100个LB平板中，由每一个如些接种的平板制备影印平板。当以上述相同方式用从平板上生长的集落中提取的DNA进行PCR时，在100个亚库之一中观察到了所预期条带的扩增。
由该亚库的平板制备二复制滤膜，用标记的探针(质粒pEF18S-HL34的EcoRI/BamHI片段)完成集落杂交。结果，观察到被认为是阳性的单信号，从原始平板中收集集落，并再次接种到LB平板上。从生长于平板上的总共50个集落中制备DNA样品，并进行PCR，最终得到名为pHTF1的克隆(实施例21)。在筛选cDNA克隆时，主要利用的方法如杂交、PCR和表达克隆及联合使用这些方法，以提高筛选的效力和灵敏度，或降低劳动强度。当测定如此获得的克隆pHTF1的核苷酸序列时，结果表明克隆pHTF1具有开放阅读框架，而且被认为由开放阅读框架编码的蛋白质的氨基酸序列与所推测的人TPO之氨基酸序列(SEQ ID NO6)完全一致。该核苷酸序列在3个位置上与被推测的一种序列(SEQ ID NO196)不同，但这些差别未引起氨基酸改变。已证实人TPO蛋白质含有具21个氨基酸信号序列的353个氨基酸残基。当由如此获得的克隆pHTF1制备质粒DNA并转染人COS1细胞时，在培养物上清液中发现了TPO活性(实施例23)。(K)利用噬菌斑杂交筛选人TPO染色体DNA、测序和表达人TPO染色体DNA，证实TPO活性由T.Yamamoto(the Gene Research Center，TohokuUniversity)惠赠的基因组文库以每个平板含30,000噬菌体颗粒的接种量接种至18个NZYM平板上，从所制的18个平板中的每一个制备二个影印滤膜。用PCR扩增人TPO cDNA片段(SEQ ID NO7中的碱基位数178-1,025)，并纯化之。利用以32P标记的纯化片段为探针进行噬菌斑杂交。结果获得13个阳性信号。从原始平板中收集噬菌斑，并以每个平板形成1,000个噬菌斑的接种量再次接种至NZYM平板上。从每个所得平板制备二个影印滤膜，在上述相同条件下进行噬菌斑杂交。结果，在13个组的所有滤膜上都检测到阳性信号。从每个所得的平板回收单个噬菌斑以制备噬菌体DNA。用PCR核查由13个克隆制备的噬菌体DNA样品中是否存在cDNA编码区。5/13的克隆似乎含有由cDNA预测的完整氨基酸编码区。因此，选择这些克隆之一(克隆λHGT1)，并用Southern印迹(使用上述探针)分析。因为在HindIII消化的情况下观察到大约1Okb的单一条带，所以用HindIII消化克隆λHGT1，并进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切除并纯化10kb带，亚克隆入克隆载体pUC13，最终得到名为pHGT1的克隆(实施例24)。
当测定如此获得的克隆pHGT1的核苷酸序列时，发现该克隆携带的染色体DNA含有实施例19预示的蛋白质之完整编码区，该编码区的核苷酸序列与所预示的核苷酸序列(SEQ ID NO196)完全相符。
另外，对应于编码氨基酸的外显子的区域有4个内含子，该核苷酸序列不同于实施例21所得克隆pHTF1携带的完整cDNA的序列(SEQ ID NO7)。
当测定通过筛选而分别选择的5个染色体DNA克隆中的剩余4个克隆的核苷酸序列时，发现4个克隆中有2个与克隆pHGT1一致，另外2个克隆除了如用克隆pHTF1观察到的在3′非编码区内具有不同的核苷酸外也与克隆pHGT1相同(实施例25)。
将如此获得的质粒克隆pHGT1中的EcoRI片段与表达载体pEF18S相连，得到人TPO表达质粒pEFHGTE。当制备质粒DNA(pEFHGTE)并转染入COS1细胞时，在培养物上清液中发现了TPO活性(实施例26)。(L)制备人TPO的缺失衍生物，该衍生物在COS1细胞中的表达和证实TPO活性实施例18和22的结果表明，人TPO蛋白质即使在去掉其C末端的3个氨基酸之后仍能表现其生物活性。因此，为了进一步分析具有生物活性的部分而进行了缺失衍生物实验。利用实施例18所得的质粒克隆pHT1-231的DNA作模板和用合成的寡核苷酸作引物经PCR制备一系列的表达质粒。
所得的表达质粒含有编码人TPO缺失衍生物的DNA，该DNA缺乏TPO蛋白质的C末端区，即缺失衍生物编码1-211、1-191、1-171和1-163位的氨基酸序列。当从各个克隆制备质粒DNA并转染至COS1细胞中时，在每一培养物上清液中检测到TPO活性(实施例27)。
设计一系列缺失C末端氨基酸残基至151位的衍生物和分别缺失N末端侧氨基酸残基达6、7和12位的其它衍生物，在其于COS1细胞中表达后检测活性，以进一步详细分析具有TPO活性的区域，当N末端侧的氨基酸缺失至第7位或C末端侧的氨基酸残基缺失至151位时，检测不到TPO活性(实施例28和29)。
通过修饰(缺失、替代、插入或增加)编码蛋白质的cDNA可以得到具有TPO生物活性之蛋白质的衍生物。用于进行修饰作用的方法如PCR、定位诱变和化学合成法。(M)在CHO细胞中表达人TPO cDNA和纯化TPO构建表达载体pHTP1，它能在动物细胞中表达编码如SEQ ID NO6所示之人TPO推测氨基酸序列的DNA(实施例30)。
pHTP1中的TPO cDNA区被用于构建在CHO细胞中进行表达的载体pDEF202-hTPO-P1(实施例31)。
在用上述载体转染CHO细胞继而选择转染细胞之后，得到其中携带人TPO cDNA的表达载体已整合到CHO细胞染色体中的转染细胞(实施例32)。
在实施例32中，大规模地培养了生产人TPO的CHO细胞系(CHO28-30细胞，抗25nM MTX)，该细胞系是通过人TPO表达质粒pDEF202-hTPO-P1转染CHO细胞制备的(实施例55)。
从100升培养物上清液中纯化人TPO(实施例56)。
可以选择不同的方式从实施例55的培养物上清液中纯化人TPO(实施例57)。(N)在X63.6.5.3.细胞中表达人TPO cDNA并证实活性利用实施例30所制备的质粒pBLTEN中所编码的TPO cDNA区构建用于X63.6.5.3.细胞中的表达载体BMCGSneo-hTPO-P1(实施例33)。
当用上述载体转化X63.6.5.3.细胞时，所得的转化体细胞中编码人cDNA的表达载体已整合到其染色体中。培养该转化细胞，在培养物上清液中检测到TPO活性(实施例34)。(O)在COS1细胞中大量表达人TPO、纯化TPO、测定分子量和描述其生物学特征将实施例30中制备的表达载体pHTP1转染到COS1细胞中，得到大量(总共约40升)含表达产物的培养物上清液(实施例35)。
从7升实施例35所制备的含表达载体pHTP1来源的TPO之COS1细胞无血清培养物上清液中纯化TPO。借助疏水作用层析、阳离子交换柱层析、WGA柱层析和反相柱层析步骤能够得到高活性的TPO(实施例36)。
将由COS1细胞培养物上清液中如此部分纯化的TPO进行分子量检测和生物学特征分析(实施例37和38)。(P)在E.coli中表达人TPO构建用于在E.coli中表达谷胱苷肽-S-转移酶和人TPO(1-174位氨基酸残基)之融合蛋白质(称为“GST-TPO(1-174)”)的载体pGEX-2T/hT(1-174)。在这种情况下，用E.coli的优选密码子交换人TPO cDNA核苷酸部分(大约5′侧的一半区域)(实施例39)。
GST-TPO(1-174)在E.coli中表达，裂解所得的细胞，然后溶解沉淀部分所含的GST-TPO(1-174)。接下来，结合应用检查TPO重折叠条件、纯化条件(谷胱苷肽亲和层析、阳离子交换柱等)和用凝血酶消化GST蛋白质部分的各种步骤后，能够对含有所设计的TPO氨基酸序列的蛋白质进行部分纯化。在大鼠CFU-MK测定系统中已证实该蛋白质表现出TPO活性(实施例40和41)。
同样，构建在E.coli中表达突变型人TPO蛋白质的载体pCFM536/h6T(1-163)，所说的突变蛋白质(称为“h6T(1-163)”)中，1位的Ser和3位的Ala分别由Ala和Val取代，同时在-1位和-2位分别增加一个Lys和一个Met。上述载体携带的人TPO cDNA核苷酸序列的整个部分(相当于1-163氨基酸残基)与E.coli的优选密码子交换(实施例42)。
h6T(1-163)在E.coli中表达，裂解所得的细胞，然后溶解沉淀部分所含的h6T(1-163)，并检查该蛋白质的重折叠条件。籍此成功地部分纯化了含有所设计的TPO氨基酸序列的蛋白质。在大鼠CFU-MK测定系统中已证实了该蛋白质的TPO活性(实施例43和44)。
另外，构建了用于在E.coli中表达突变型人TPO蛋白质的载体pCFM536/hMKT(1-163)，所说的突变型蛋白质(称为“hMKT(1-163)”)中，在-1和-2位分别增加了Lys和Met。hMKT(1-163)在E.coli中以实施例43所述的相同方式表达，并且将表达蛋白质进行SDS-PAGE，转移至PVDF膜上，然后进行N末端氨基酸序列分析，继而证实该蛋白质含有所设计的氨基酸序列(实施例52)。
另外，构建用于在E.coli中表达突变型人TPO蛋白质的载体pCFM536/hMKT(1-332)，所说的突变型蛋白质(称为“hMKT(1-332)”)中，分别在人TPO(1-332位氨基酸)的-1位增加Lys和在-2位增加Met。hMKT(1-332)在E.coli中以与实施例42中相同的方式表达，并且利用下文给出的实施例45中所制备的抗人TPO肽抗体经Western印迹证实了上述表达结果(实施例66)。(Q)制备抗TPO肽抗体和抗TPO肽抗体柱利用合成肽(相当于实施例10中所测定的大鼠TPO氨基酸序列的三个部分区域)制备兔多克隆抗TPO肽抗体。已证实这些抗体能够识别大鼠和人TPO分子。而且，合成相当于SEQ ID NO6(或SEQID NO7)所示人TPO氨基酸序列的6部分区域的肽，然后用于制备兔多克隆抗TPO肽抗体。已证实所得抗体能识别人TPO(实施例45)。
有可能利用以某些对TPO有结合亲和力的分子(如抗TPO抗体、TPO受体等)填充的柱子经亲和柱层析来纯化TPO。因此，通过结合实施例45所得的抗TPO肽抗体首先制备抗TPO抗体柱(实施例46)。(R)利用抗TPO肽抗体柱纯化COS1细胞中表达的人TPO、测定分子量和描述其生物学特征利用以表达载体pHTP1转染的COS1细胞之培养物上清液作为起始物得到部分纯化的TPO，然后用于抗TPO抗体柱。因为在被吸附级分中发现了TPO活性，因此该级分被进一步进行反相柱层析，以纯化该蛋白质并检测其分子量和生物学特征(实施例47)。(S)证实COS1细胞所表达的人TPO之部分纯化样品的生物活性检查实施例36中所纯化的TPO活性级分的生物活性，以确定它是否在活体内起增加血小板数的功能(实施例48)，所说的活性级分即由以表达载体pHTP1转染的COS1细胞之培养物上清液纯化至Capcell Pak C1 300A柱步骤的TPO样品。
同样，检查由携带表达载体pHTP1的转染COS1细胞所制备的33升培养物上清液经阳离子交换柱得到之粗制TPO级分的生物活性，以证实它能在体内升高血小板数(实施例49)。(T)在CHO细胞中表达人TPO染色体DNA并证实其活性构建用于在CHO细胞中表达人TPO染色体的载体pDEF202-ghTPO(实施例50)。
在该载体导入CHO细胞时，得到其中人TPO染色体的DNA编码表达载体已整合到其染色体中的转化细胞。当培养该细胞克隆时，在培养物上清液中检测到TPO活性(实施例51)。(U)部分纯化在E.coli中表达的突变型人TPO并证实其活性利用盐酸胍和谷胱甘肽对来源于编码人TPO核苷酸序列之克隆pCFM536/h6T(1-163)并在E.coli中表达的突变型人TPO进行再折叠，以确定如此所得的h6T(1-163)在活体内起升高血小板数的作用(实施例53)。
利用N-十二烷酰肌氨酸钠和硫酸铜对来源于编码人TPO核苷酸序列之克隆pCFM536/h6T(1-163)并在E.coli中表达的突变型人TPO进行再折叠，然后进行阳离子交换层析，以确定如此所得的h6T(1-163)在活体内升高血小板数(实施例54)。
另外，还可用其它的方法对突变型人TPO h6T(1-163)进行再折叠和纯化(实施例60和61)。(V)在昆虫细胞中表达人TPO cDNA并鉴定TPO活性制备用于在昆虫细胞中表达人TPO的重组病毒(实施例58)，并在昆虫细胞Sf21中表达，继而在培养物上清液中鉴定TPO活性(实施例59)。(W)在CHO细胞中表达人TPO(1-163位氨基酸)并纯化该TPO构建在CHO细胞中表达人TPO蛋白质的表达载体pDEF202-hTPO163，所说的蛋白质(称为“hTPO163”)具有SEQ ID NO7所示人TPO氨基酸序列的1-163位氨基酸。将表达载体转染CHO细胞，并大规模地培养如此所得的生产hTPO163的CHO细胞系。从培养物上清液中纯化hTPO163(实施例62-65)。(X)制备人TPO的替代衍生物制备人TPO中的Arg-25和Glu-231分别被Asn和Lys替代的衍生物(称为“N3/TPO”)以及His-33被Thr替代的衍生物(称为“09/TPO”)。
编码每种衍生物的质粒被转染到COS7细胞中，然后进行培养。在培养物上清液中检测到TPO活性(实施例67)。
通过利用E.coli表达系统制备h6T(1-163)中的一个氨基酸被其它的氨基酸替代的衍生物。在每种衍生物中都发现了TPO活性(实施例94)。(Y)制备人TPO的插入或缺失衍生物插入一个氨基酸至hTPO163或从中缺失一个氨基酸以制备其插入或缺失衍生物，然后用编码所得衍生物的质粒转染COS7细胞，在COS7细胞培养物上清液中检测到TPO活性(实施例68)。
本发明用于检测TPO活性的方法(体外测定系统)在下文以“参考实施例”描述。(2)制备和纯化抗人TPO抗体利用人TPO肽片段制备多克隆抗体(实施例69)，继而用于Western印迹分析(实施例70)和构建抗TPO抗体亲和柱(实施例71)。(AA)人TPO的体内活性将纯化的人TPO施用于诱发了血小板减少症的小鼠，相对于对照组监测血小板数的改变(实施例72-79)。还描述了药物组合物在治疗血小板减少症中的有效应用(实施例80-89)。(BB)TPO活性与MLP受体结合的关系所提供的测定方法中，TPO活性根据其与Mpl受体的特异性结合作用来定义(实施例93)。
参考实施例A.大鼠巨核细胞祖细胞测定(大鼠CFU-MK测定)系统(液体培养系统)巨核细胞通过主动的能量依赖过程向胞浆密度颗粒中掺入并贮存5-羟色胺(Fedorko，Lab.Invest.，vol.36，p310-320，1977)。这一现象已在较小的单核乙酰胆碱酯酶阳性细胞中观察到，所说细胞据认为定位于CFU-MK和可识别的巨核细胞之间(Bricker andZuckerman，Exp.Hematol.，vol.12，p672，1984)。所掺入的5-羟色胺量随着巨核细胞体积的增大而增多(Schick and Weinstein，J，Lab.Clin.Med.，vol.98，p607-615，1981)。另外，已知上述现象只特异地出现于骨髓细胞中的巨核细胞中(Schick andWeinstein，J，Lab.Clin.Med.，vol.98，p607-615，1981)。在本文的测定系统中，于待测样品存在的情况下培养高度富集的大鼠CFU-MK细胞(即下文将描述的GpIIb/IIIa+CFU-MK级分)，并检测掺入至巨核细胞中的14C-5羟色胺(14C-肌酸硫酸羟基色胺，14C-5HT)。
该测定系统的优点是能够减少被污染细胞的直接影响(例如，形成由目的因子之外的某些物质所刺激的污染细胞之Meg-CSF活性，或者由污染的细胞产生某种因子，它与目的因子产生联合作用)，因为GpIIb/IIIa+CFU-MK级分细胞中的CFU-MK百分比相当高(参见下文的[测定方法])而污染细胞数很少。此外，适宜的培养条件可以维持一段相对长的时间，因为每孔中所接种的细胞总数很少。另一个优点在于在相差显微镜下可检查培养期间有活性样品存在时由CFU-MK生长的许多较大体积的成熟巨核细胞，因此，对所说活性的存在及程度提供了可能的定量判断。定量判断的结果与根据定量测定14C-5羟色胺的掺入所得结果非常相符。因此，通过联合应用定量判断可进一步改善定量测定的可靠性。
测定方法对Miyazaki等人的方法(Exp.Hematol.，vol.20，p855-861，1992)进行细微的修改，以制备用于本测定方法中的高度富集的大鼠CFU-MK细胞(GpIIb/IIIa+CFU-MK级分)。
简单地说，从Wister大鼠(雄性，8-12周龄)中去除股骨和胫骨以制备所述的骨髓细胞悬液。用于制备骨髓细胞悬液的悬浮培养基(该溶液含有13.6mM柠檬酸三钠，11.1mM葡萄糖，1mM腺苷，1mM茶碱，10mM HEPES(pH7.25)，0.5％牛血清白蛋白(下文称为“BSA”)(Path-O-Cyte 4；Seikagaku Kogyo Co.，Ltd.)和无Ca2+无Mg2+的Hanks平衡盐溶液(下文将称为“HATCH溶液”)在Levine和Fedoroko所报道的巨核细胞分离培养基(Levine andFedoroko，Blood，vol.50，p713-725，1977)基础上作了细微修改。将如此制备的骨髓细胞悬液铺在Percoll非连续密度梯度溶液(密度1.050g/ml/1.063g/ml/1.082g/ml)上，该梯度溶液是通过用HATCH溶液稀释制得，于20℃以400×g离心20分钟。离心后，回收1.063g/ml和1.082g/ml密度层之间的细胞。洗涤后，将回收的细胞悬于含10％胎牛血清(下文称作“FCS”)的Iscove改良的Dulbeceo培养基(下文称作“IMDM”培养基)，置于100mm组织培养塑料平皿中，在5％CO2温箱中于37℃培养1小时。保温后，回收未粘附的细胞，再于塑料平皿中在37℃培养1小时。在HATCH溶液中悬浮未粘附细胞，于其中已吸附了小鼠单克隆抗大鼠血小板GpIIb/IIIa抗体P55抗体(Miyazaki et al.，Thromb.Res.，vol.59，p941-953，1990)的100mm细胞学培养皿中保温1小时。保温后，用HATCH溶液彻底冲洗以去除未粘附细胞，通过吸移管吹打分开吸附在固定的P55抗体上的剩余细胞，并收集之。一般来说，由一只大鼠得到3-4×105细胞。如此所得的细胞级分含有高度富集的大鼠CFU-MK(下文称为“GpIIb/IIIa+CFU-MK级分”)，根据由在饱和浓度的大鼠IL-3存在情况下的集落测定系统的检测结果已知该细胞部分含大约5-10％CFU-MK。能够产生前述P55抗体的杂交瘤已于1994年2月14号保藏，保藏号为FERM BP-4563(National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry ofIntetnational Trade and Industry)。
接下来，将如此获得的GpIIb/IIIa+CFU-MK部分悬于含10％FCS的IMDM培养基中，并以104细胞/孔的比例分散于96孔组织培养板中。各孔中再添加标准样品(下文将详述)或待测样品，因此而调整最终培养基体积至200μl/孔。将如此制备的平板置于CO2温箱中，于37℃保温4天。保温的第4天，在完成培养的前3小时向各孔中加入0.1μCi(3.7kBq)14C-5-羟色胺，于37℃继续最后的保温。保温3小时之后，平板以1,000rpm离心3分钟，经吸取去除所得上清液。向每孔中加入含有0.05％EDTA的200μl PBS部分，离心平板，去掉所得上清液洗涤平板。重复洗涤步骤一次。将200μl2％Triton X-100加至每孔所得的细胞团丸中，在平板混合仪上振摇平板约5-10分钟以彻底裂解细胞。将150μl如此所得的细胞裂解液转移至商售的帽形固体闪烁剂(Ready CapBeckman)，随后再置于烘箱中于50℃过夜以干燥裂解液。第二天，将Ready Cap置入玻璃小瓶中，用液体闪烁计数器检测14C的放射性。
在这种情况下，当根据Ishibashi和Burstein的方法(Blood，vol.67，p1512-1514，1986)检测前述细胞裂解液中的乙酰胆碱酯酶活性时，能够得到与14C-5羟色胺掺入测定的几乎完全相同的结果。标准样品首先，以下列方式制备用于制备标准样品的血小板减少症大鼠的血浆。
以0.5mg/动物的剂量给正常的雄性Wister大鼠(7-8周龄)静脉注射上述P55抗体两次(间隔约24小时)，以诱发血小板减少症。在第二次用药24小时后，于乙醚麻醉条件下经腹主动脉采血，所用的10ml注射器中已加入1ml3.8％(v/v)柠檬酸三钠溶液作为抗凝剂。如此采集的血样被分散至塑料离心管中，以1,200×g离心10分钟以回收血浆部分。如此收集的血浆部分再以1,200×g离心10分钟。回收所得的血浆部分，小心操作，防止其中含有细胞、血小板等，合并之(以该方式获得的血浆在下文被称为“TRP”)。根据实施例1方法由TPO获得的Ca处理TRP(标准样品C)、WGA-Agarose柱活性级分(标准样品W)或Phenyl Sepharrose 6FF/LS柱活性级分将对足够体积的IMDM培养基进行彻底的透析，并用作测定标准物。
在实施例1所述的大鼠TPO纯化方法中，标准样品C用于早期，但在中期之后改用标准样品W，然后改用标准样品P。标准样品C的比活性试验性地定为1，根据这一定义计算标准样品W和P的相对活性。通过比较标准样品的剂量反应曲线和待测样品的剂量反应曲线来确定每一待测样品的相对活性，并且待测样品的相对活性定义为n，其中n表示其活性比标准样品C的高n倍。
B.集落测定系统在该测定系统中，于待测样品存在的情况下在半固体培养基中培养骨髓细胞，并通过计算CFU-MK增生和分化所形成的巨核细胞集落数来检测Meg-CSF活性。测定方法(a)利用未分离的大鼠骨髓细胞等的情况将1ml终体积的含未分离的大鼠骨髓细胞之IMDM培养基、得自上述测定系统A的GpIIb/IIIa+CFU-MK之各分离步骤的细胞或GpIIb/IIIa+CFU-MK级分的细胞和10％ FCS、2mM Gln、1mM丙酮酸钠、50μM 2-巯基乙醇和0.3％琼脂(AGAR NOBLE，DIFCO)加入35mm组织培养塑料平皿中，于室温固化后，在CO2温箱中于37℃培养。一般说来，用来分离的骨髓细胞情况下，每个平皿中的细胞数调整为2－4×105；在Percoll密度梯度或粘附细胞耗尽时的情况下，细胞数为2－5×104；或在GpIIb/IIIa+CFU-MK级分的情况下，细胞数为0.5－2×103。培养6-7天后，从平皿中分出琼脂平皿，并置于载玻片上(76mm×52mm)。为了干燥各琼脂平皿，在凝胶上依次放上一张50筛目的尼龙筛和滤纸。如此干燥的琼脂玻片在加热板上于50℃热固定5分钟，并在根据Jackson的方法(Blood，vol.42，p413-421，1973)制备的乙酰胆碱酯酶染液中浸泡2-4小时。当证实巨核细胞被充分染色后，用水洗琼脂玻片，干燥之，再用Harris苏木精溶液二次染色30秒，水洗，空气干燥。巨核细胞集落被定义为具有3个或3个以上紧密聚集的乙酰胆碱酯酶阳性细胞。(b)利用未分离的小鼠骨髓细胞的情况每个平皿用2－4×105细胞，以与上述(a)相同的方式进行集落测定。(c)利用人骨髓细胞或人脐带血细胞的情况人骨髓细胞或脐带血细胞可以直接应用，或以下述方式以富集的CFU-MK级分形式使用。
首先，将骨髓液或脐血铺在Lymphoprep(Daiichi Kagaku Co.，Ltd)上并离心，回收所得的分界面白细胞部分。用亲和素连接的磁珠从上述回收的细胞部分去除与对人表面抗原(CD2、CD11c和CD19)有特异性的生物素化单克隆抗体相连的细胞。由磁珠法去除的细胞主要是B细胞、T细胞、巨噬细胞和部分粒细胞。所剩细胞以FITC标记的抗CD34抗体和PE标记的抗HLA-DR抗体染色，然后用细胞分类器(例如COULTER生产的ELITE)回收CD34和HLA-DR阳性部分。CFU-MK细胞在该部分中得以浓缩(下文称为“CD34+DR+CFU-MK级分”)。可以用上述利用大鼠骨髓细胞情况时的相同方式进行人细胞的集落测定，有所改变的是每平皿中用3－5×103的CD34+DR+CFU-MK级分细胞和用12.5％人AB血浆和12.5％FCS的混合物代替10％FCS。形成巨核细胞集落的培养时间是12-14天。为检测人巨核细胞，利用对巨核细胞表面抗原GpIIb/IIIa有特异性的小鼠单克隆抗体经碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶抗体法对巨核细胞进行免疫染色(例如参见Teramura et al.，Exp.Hematol.，vol.16，p843-848，1988)，对各含有3个或3个以上巨核细胞的集落计数。C.利用人成巨核细胞的细胞系的测定系统(M-07e测定)人成巨核细胞的细胞系M-07e细胞因应答GM-CSF、IL-3、SCF、IL-2等而增生(Avanzi et al.，J.Cell.Physiol.，vol.145，p458-464，1990)。因为这些细胞也对TPO有反应，因此它们用于替代大鼠CFU-MK测定系统的测定系统。
测定方法回收在GM-CSF存在下维持的M-07e细胞，彻底洗涤，然后悬于含10％FCS的IMDM培养基中。所得的M-07e细胞悬液以每孔104细胞的比例分散于96孔组织培养板中，每孔中再添加标准样品或待测样品，因此调整终体积至200μl/孔。如此制备的平板置于5％CO2温箱中，于37℃培养3天。培养3天后，于培养完成4小时前每孔加入1μCi(37KBq)3H-胸苷。培养完成后，用细胞收集仪将细胞收集到玻璃纤维滤器上，用液体闪烁计数仪检测3H放射性(例如，Pharmacia生产的Beta Plate)。D.利用小鼠原B细胞系的测定系统(Ba/F3测定)小鼠原B细胞系Ba/F3被认为是在应答IL3、I4等时增生的细胞系(Palacios et al.，Cell，vol.41，p727-734)。因其亚株BF-TE22不仅能应答IL3和IL4，而且应答TPO产生细胞增生，所以该细胞可用于作为替代大鼠CFU-MK测定的测定系统，或者说人成巨核细胞的细胞系辅助测定(M-07e测定)如下。简单地说，回收在含1ng/ml小鼠IL-3的Iscove改良DMF培养基(IMDMGIBCO)中生长的BF-TE22，用IMDM洗3次，再悬于含10％FCS的IMDM培养基中。然后，将细胞悬液以1×104细胞/孔的密度分散于96孔组织培养板的各孔中，每孔中再加入标准TPO溶液或待测样品，并调终体积为200μl/孔。所得平板在5％CO2温箱中保温2-3天。在第2或第3天，向各孔中加入1μCi(37KBq)3H-胸苷，继续培养4小时。最后，用细胞收集仪将细胞收集到玻璃纤维滤膜上，用液体闪烁计数器检测3H放射性，在该测定系统中，在缺乏TPO活性的培养基中培养的几乎所有的细胞都死亡，因此无3H-胸苷掺入。然而，在含TPO活性的培养基中培养的细胞表现出TPO浓度依赖性方式的活性增生和胸苷掺入。另外，该测定结果与M-07e和CFU-MK测定结果相符。
下面的实施例进-步举例说明了本发明。
实施例1-1纯化因施用抗血小板抗体所诱发的血小板减少症大鼠血浆中的大鼠TPO制备因施用抗血小板抗体所诱发的血小板减少症大鼠的血浆根据前述参考实施例A大鼠巨核细胞祖细胞(CFU-MK)测定系统所描述的方法，从大约1,000只大鼠制备TRP作为纯化来源。从TRP纯化大鼠TPO首先，以设想TRP中TPO的含量最多为1∶3×106为依据用大约1,000只大鼠的TRP进行纯化，结果得到略少于1pmole的部分纯化的大鼠TPO。尽管总的说来纯化TPO很困难，但还是尝试分析其部分氨基酸序列，结果得到三部分氨基酸序列，但准确度很低。这些序列与肝脏中产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的氨基酸序列一致或很相近。由这一结果尚不能明确是否TPO具有与丝氨酸蛋白酶抑制剂相似的结构，或者说该序列来源于除TPO以外的污染细胞。利用这些未明确的序列从大鼠cDNA文库中克隆TPO基因，但未能得到有效的TPO编码基因。因此，以设想这一失败是因为被分析样品的纯度低和含量不足为基础又进行了广泛的研究。为了得到氨基酸分析所需的被纯化之终样品，根据下面的实施例1-2所述的方法进行纯化。令人意外的是，从实施例1-2的结果估算看，TRP或XRP(将在下文描述)中的TPO含量极少，只是总血浆蛋白质的1∶108-109，因此，对TPO进行完全纯化是相当困难的。
实施例1-2从经全身X线或γ线照射引起血小板减少症的大鼠血浆中纯化大鼠TPO[制备经全身X线或γ线照射引起血小板减少症大鼠的血浆]将正常的雄性Wister大鼠(7至8周龄)全身置于亚致死剂量(6至7Gy)的X线或γ线下照射，使之患有血小板减少症。在照射的第14天收集大鼠血液并以前文提到的制备TRP方法相同的方式制备血浆级分(本文此后称之为“XRP”)。
在这种情况下，将由总数约1,100只大鼠制得的XRP(约8L)用作进行纯化的来源。由XRP纯化大鼠TPO由于1,100只大鼠的血浆样品中总蛋白含量达到493,000mg，因此不能将其一次处理。因而，将血浆样品在下面进行的纯化步骤(1)至(4)中分成11份，每份对应于约100只大鼠。在随后进行的纯化步骤(5)至(7)中，将样品分成6批，在纯化步骤(8)及其以后的步骤中，使用了由约1,100只大鼠全部血浆粗制纯化的样品。下文描述了样品为(XW9)份和(XB6)批情况下每一纯化步骤的典型例子。
在所有纯化步骤中，TPO活性是用在参考实施例中描述的大鼠CFU-MK检测系统进行测定的。除非特别注明，所有的纯化步骤均在4℃下进行，除了进行反相层析和在表面活性物质存在时的Superdex75pg凝胶过滤以外，此时是在室温下进行的。蛋白测定是用考马斯染料结合测定法(一种由PIERCE生产的试剂系统，目录号23236X)或使用双辛可宁酸的一种方法(一种由PIERCE生产的试剂系统，目录号23225)进行的。
纯化的概要示于表1。
表1大鼠血浆TPO的纯化步骤 总蛋白质 相对活性 总活性 活性回收(mg) (％)总血浆 493000 -- -Ca处理后的血浆/G25 480300 2864600100<离子交换>Q-Sepharose FF 314400 9704000313<外源凝集素> WGA-Agarose15030132 1987000 230<三嗪染料>TSK-gel AF-Blue 650MH 4236 905 3834000 443<疏水性的>Phenyl-Sepharose 6FF/LS2762 847 2339000 271<凝胶滤过>S-200HR F3(低分子量TPO)51 200001020000 118S-200HR F2(高分子量TPO)262 7838 2055000 238
低分子量TP0(得自S-200HR F3)步骤总蛋白质相对活性总活性活性回收(mg) (％)<凝胶滤过>S-200HR F3(低分子量TPO) 50.3300 20000 1007000 116<反相>YMC Protein-RP制备柱2.8540 130000 37100043<反相>YMC CN-AP 0.3730 800000 29840035<反相>Cepcell Pak Cl 0.0396 4890000 19360022<电泳>15％ SDS-PAGE 0.0017 149000000 25030029(在非还原条件下)
高分子量TPO(得自S-200HR F2)步骤 总蛋白质相对活性总活性 活性回收(mg) (％)<凝胶滤过>S-200HR F2(高分子量TPO) 257.000078402015000233<反相>YMC Protein-RP制备柱 11.4000 227000 2588000300<凝胶滤过>Superdex 75pg/CHAPS 1.1660 1750000 2041000236<反相>YMC CN-AP 0.6200 700000 434000 50<反相>Capcell Pak Cl0.0630 200000001260000146<电泳>15％ SDS-PAGE 0.0030 330000000 990000 117(在非还原条件下)(1)大鼠血浆的氯化钙处理、离心以及蛋白酶抑制剂处理在样品份号为XW9的情况下将贮存于-80℃，相应于约100只大鼠的XRP(742ml；蛋白质浓度，54.8mg/ml；总蛋白质，40,686mg)融化并分至聚丙烯管(由Nalgere生产)中。向各管中加入氯化钙粉末至其终浓度为100mM。于4℃下过夜温育后，将所得混合物以8,000rpm离心60分钟。将一种蛋白酶抑制剂p-APMSF((对-氨基二苯基)甲磺酰氟盐酸盐，Wako Pure Chemical Industries，Lte.生产，目录号010-10393))加至所得的有TPO活性的上清液(742ml；蛋白质浓度，54.9mg/ml；总蛋白质，40,740mg)中，使其终浓度为1mM。所获得的样品用于下面的Sephadex G-25柱缓冲交换步骤中。
以这种方式，通过将由1,100只大鼠得到的全部XRP分成每份等于约100只大鼠XRP的11份，一份一份地处理，从而完成了对全部XRP的氯化钙/p-APMSF处理。将所得的11份样品在随后的Sephadex G-25柱步骤中分别处理。(2)Sephadex G-25<缓冲交换>在样品份号为XW9的情况下将由钙处理步骤(1)之后所得的上清液(742ml；蛋白质浓度，54.9mg/ml；总蛋白质，40,740mg)以40-70ml/min的流速加至Sephadex G-25柱(由Pharmacia Biotech生产，目录号17-0033-03；直径，11.3cm；床高，47cm)上，在此之前该柱已用20mMTris-HCl，pH8平衡。用同样的缓冲液进行洗脱。将在蛋白洗脱之前的1,300ml洗脱液弃去。当在洗脱液中测出UV吸收时，贮存馏出液直至电导达到500μS/cm，从而找到了以20mM Tris-HCl，pH8交换的TPO活性蛋白质馏分(1,377ml；蛋白质浓度，27.56mg/ml；总蛋白质，37,882mg；蛋白质产率，93％)。级分中TPO的相对活性为2.3。
将所有各份样品进行Sephadex G-25柱处理的结果是获得了总量为21,117ml的Sephadex G-25柱含TPO活性的级分(总蛋白质，480,300mg；平均相对活性，2；总活性，864,600)。(3)Q-Sepharose FF(强力阴离子交换层析)在样品份号为XW9的情况下将在上述步骤(2)中通过Sepharose G-25处理得到的TPO活性级分(1,377ml；蛋白质浓度，27.5mg/ml；总蛋白质，37,841mg；相对活性，2.3)以40ml/min的流速加至Q-SepharoseFF柱(由Pharmacia Biotech生产，目录号17-0510-01；直径5cm；床高27cm)上，并以20mM Tris-HCl(pH8)洗脱，将过柱的级分F1贮存(3,949ml；蛋白质浓度，0.98mg/ml；总蛋白质，3,870mg；相对活性，0)。
下一步将缓冲液换成含175mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH8)以洗脱含TPO活性的级分F2(4,375ml；蛋白质浓度，5.36mg/ml)。
最后，以含1,000mM NaCl的20mM Tris-HCl洗脱级分F3(1,221ml；蛋白质浓度，3.9mg/ml；总蛋白质，4,783mg；相对活性，3.8)。含TPO活性的级分F2中总蛋白质为23,440mg，且通过该步骤F2的蛋白质产率为61.9％。另外，TPO的相对活性增加至6.8。
将全部各份Sephadex G-25含TPO活性级分加至Q-SepharoseFF的结果是获得了35,842ml Q-Sepharose FF含TPO活性的级分F2(总蛋白质，314,384mg；平均相对活性，9；总活性，2,704,000)。(4)小麦胚芽凝集素(WGA)-琼脂糖<外源凝集素亲合层析>在样品份号为XW9的情况下将通过Q-Sepharose FF处理在上述步骤(3)中获得的含TPO活性级分F2分成三部分，以5ml/min的流速加至WGA-Sepharose柱(由Honen Corp.生产，编号为800273，直径5cm，床高22.5cm)上。并以Dulbecco′s等张磷酸盐缓冲液(DPBS)洗脱。将过柱的级分F1(9,336ml；蛋白质浓度，2.30mg/ml；总蛋白质，21,407mg，相对活性6.9)贮存。
然后，将缓冲液换成含0.2M N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc，由Nacalai tesque生产，编号005-20)、150mM NaCl和0.02％叠氮化钠的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)，贮存所得洗脱液并用一超滤装置(Omega Ultrosette，标定截流分子量为8,000；Filtron生产)进行浓缩，从而获得WGA-琼脂糖吸附的含TPO活性的级分F2(2,993ml；蛋白质浓度，0.376mg/ml)。
含TPO活性的级分F2中的总蛋白质为1,125mg，且通过该步骤F2的蛋白质产率为4.8％。另外，TPO的相对活性增加至101。将如此得到的级分F2贮存于-80℃下。
将全部各份Q-Sepharose FF TPO活性F2级分加至WGA-琼脂糖的结果是获得了总量为33,094ml的WGA-琼脂糖TPO活性的级分F2(总蛋白质，15,030mg；平均相对活性，132；总活性，1,987,000)。(5)TSK凝胶AF-BLUE 650MH<三嗪染料亲合层析>在样品批号为XB6的情况下将份号为XW8的WGA-琼脂糖吸附的TPO活性的级分与在上述步骤(4)中从等于215只大鼠XRP起始获得的份号为XW9的WGA-琼脂糖吸附的含TPO活性级分F2混合形成批号为XB6的样品(5,947ml；蛋白质浓度，0.388mg/ml；总蛋白质，2,319mg；相对活性，150)。
将5,974ml已混合的样品的一部分与1000ml含0.85摩尔的NaCl(总量为296.76g)混合，生成NaCl终浓度为0.822M的6,132ml溶液，并以7ml/min的流速将所得到的溶液加至预先已用含1M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)平衡的TSK凝胶AF-BLUE 650MH柱(TOSOH CORP，目录号08705；直径5cm；床高23cm)上。
此过程完成后，用含1M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)以10ml/min的流速洗脱蛋白质。将所得洗脱液贮存并用一超滤装置(Omega Ultrasette，标定截流分子量为8,000)浓缩，从而获得过柱的级分F1(543ml；蛋白质浓度，2.05mg/ml；总蛋白质，1,112mg；相对活性，31)。
下一步将洗脱缓冲液换成2M NaSCN以得到洗脱的TSK凝胶AF-BLUE 650MH吸附的含TPO活性的级分F2(1,427ml；蛋白质浓度，0.447mg/ml)。
含TPO活性的级分F2中的总蛋白质为638mg，借助该步骤F2的蛋白质产率为27.5％。另外，TPO的相对活性增至1,500。
将各批WGA-琼脂糖吸附的含TPO活性级分F2加至TSK凝胶AF-BLUE 650MH的结果是得到了总量为10,655ml的TSK凝胶AF-BLUE650MH含TPO活性的级分F2(总蛋白质，4,236mg；平均相对活性，905；总活性，3,834,000)。(6)Phenyl Sepharose 6FF/LS<疏水性相互作用层析>在样品为XB6批的情况下将1,424ml TSK凝胶AF-BLUE 650MH含TPO活性级分F2(1,424ml；蛋白质浓度，0.447mg/ml；总蛋白质，638mg；相对活性，1,500)的一部分与每1000ml中1.5摩尔硫酸铵粉(总量为282.2g)混合，得到硫酸铵终浓度为1.35M的溶液1,581ml。
将所得溶液以7ml/min的流速加至预先已用含1.5M硫酸铵的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)平衡的Phenyl Sepharose 6 FF(LowSub)柱(Pharmacia Biotech，目录号17-0965-05；直径5cm；床高10cm)上。该项操作完成后，用含0.8M硫酸铵的36mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)以10ml/min的流速进行洗脱。贮存所得洗脱液(约3,160ml)并用一超滤装置(Omega Ultrasette，标定截流分子量8,000)进行浓缩，从而得到级分F1(485ml；蛋白质浓度，0.194mg/ml；总蛋白质，94.2mg；相对活性，0)。
下一步将洗脱缓冲液换成20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)以获得含TPO活性的级分F2(约3,500ml)。用一超滤装置(OmegaUltrasette，标定截流分子量8.000)对洗脱的级分进行浓缩并取出一份进行测定的样品。在该阶段，含TPO活性的级分F2的蛋白质浓度和总蛋白质分别为1.45mg/ml和319mg，经此步骤F2的蛋白产率为50.0％。TPO的相对活性为1,230。
将各批TSK凝胶AF-BLUE 650MH含TPO活性的F2级分加至Phenyl Sepharose 6FF/LS的结果是获得了总量为1,966ml的Phenyl Sepharose 6FF/LS含TPO活性的级分F2(总蛋白质，2,762mg；平均相对活性，847；总活性，2,339,000)。(7)Sephacryl S-200HR<凝胶过滤层析>在样品为XB6批的情况下(参见图1)将Phenyl Sepharose 6FF/LS含TPO活性的级分F2(217ml；蛋白质浓度，1.45mg/ml；总蛋白质，315mg；相对活性，1,230)与144.8ml 5M NaCl溶液混合以获得362ml NaCl终浓度为2M的溶液，应用使用YM3膜(直径76mm，Amicon Corp.生产)的超滤装置将所得溶液浓缩至约50ml。
向该溶液中加入相同体积(50ml)的8M尿素，从而获得100ml含1M NaCl和终浓度为4M尿素的溶液。将该溶液浓缩至约80ml，制成88.78ml的样品，然后加至Sephacryl S-200HR柱(由Pharmaci Biotech生产，目录号17-0584-01；直径7.5cm，床高100cm)上。
此后，用DPBS以3ml/min的流速有效地进行洗脱，将在弃去无用的1,200ml洗脱液后的洗脱液以每份45ml收集在60个聚丙烯试管中。每两管进行一次测定，其余的贮于-85℃直至由1,100只大鼠得来的所有样品完成了Sephacryl S-200HR处理。基于测定结果，批号XB6的级分分组如下(F1)管数1-15(处于无用洗脱液边缘的级分；分子量等于或大于94,000)(F2)管数16-26(分子量，94,000至33,000)(F3)管数27-44(分子量，33,000至3,000)(F4)管数45-55(分子量，小于或等于3,000)以这种方式，分别将所有各批由Phenyl Sepharose 6FF/LS获得的含TPO活性F2级分加至Sephacryl S-200HR处理、测定和贮于-85℃。在所有各批完成了S-200HR处理之后以及在随后进行反相层析(YMC-Pack PROTEIN-RP)之前，将这些样品融化并使用YM3膜(直径76mm，Amicon Corp.制造)的超滤装置进行浓缩获得如下的两分样品。由Sephacryl S-200HR处理所获得的含TPO活性级分F2的浓缩样品在下文称为“高分子TPO样品F2”，经同样处理的F3称为“低分子TPO样品F3”。
高分子TPO样品F2和低分子TPO样品F3是为了方便对贮存凝胶滤过层析中不同洗脱区域级分，术语“高分子”和“低分子”因此并不意味着它们真正的分子量。
高分子TPO样品F2低分子TPO样品F3分子量94,000-33,000 33,000-3,000总体积3,420ml6,480ml总体积(浓缩后)293ml 280ml总蛋白262mg 51.3mg平均相对活性 7,838 20,000总活性2,055,000 1,020,000低分子TPO样品F3和高分子TPO样品F2分别进行随后的纯化步骤。
低分子TPO样品F3的纯化在以下的步骤(8)-(11)中进行了描述。(8)YMC-Pack PROTEIN-RP<反相层析>
将在上述步骤(7)中得到的低分子TPO样品F3(总蛋白质，50.3mg；蛋白质浓度，0.184mg/ml；相对活性，20,000；总活性，1,007,000，总体积，274ml)与溶剂A(0.025％三氟乙酸(TFA))和溶剂B(含0.025％TFA的1-丙醇)混合以获得总体积为508.63ml，丙醇、TFA和蛋白质终浓度分别为20％、0.012％和0.0989mg/ml的溶液。在制备该溶液过程中生成的不溶物质通过离心分离出来，将上清液分成两份254.3ml(25.2mg蛋白质)并以2ml/min的流速加至装有YMC-Pack PROTEIN-RP的柱(YMC生产，目录号A-PRRP-33-03-15；直径3cm；床高7.5cm)上，该柱预先已用30％ B平衡。离心的沉淀用含有5mM CHAPS(3-[3-胆酰氨基丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐；Dojindo Laboratories生产；目录号75612-03-3)的20ml 20mM乙酸钠(pH5.5)溶解并上柱。
样品上柱后，用约50ml溶剂(溶剂A∶B＝321)过柱以获得过柱级分。下一步，开始展开过程(在120分钟内用30％B至45％B的线性梯度溶液洗脱)，以每管10ml收集36个聚丙烯试管的洗脱液。对剩余样品重复此过程，用相同收集管收集，这样获得了每份含20ml洗脱液的总数为36的级分试管。使用用YM3膜(直径76mm，Amicon Corp.生产)的超滤装置将过柱级分直接浓缩至20ml。
取每份过柱级分和管1至36的20ml级分的各0.1ml与20μl5％BSA混合，蒸发干燥，溶于0.25ml IMDM测定培养液中，然后测定以找出含TPO活性的级分。结果在管17至27(36.0至43.0％的丙醇浓度范围)的级分中发现了TPO活性，这些级分合起来被作为低分子TPO样品F3来源的YMC-Pack PROTEIN-RP含TPO活性级分F2使用。该级分贮于-85℃直至用于随后的YMC-Pack CN-AP步骤。低分子TPO样品F3来源的YMC-Pack PROTEIN-RP含TP0活性级分F2总体积220ml蛋白质浓度0.0130mg/ml总蛋白质 2.85mg相对活性 130,000总活性371,000(9)YMC-Pack CN-AP<反相层析>
将上述步骤(8)中获得的低分子TPO样品F3来源的YMC-PackPROTEIN-RP含TPO活性级分F2 214.9ml(总蛋白质，2.79mg；蛋白质浓度，0.0130mg/ml；相对活性，130,000；总活性，36,300)与0.6ml 50％的甘油混合并浓缩至1.8ml。该浓缩物用含小于或等于20％的丙醇以及约6％甘油调整到5ml体积。
将浓缩物分成5份在下面的柱操作使用(每一操作用1ml和0.555mg蛋白质)。将所分的样品(以0.6ml/min速度)加至铺有YMC-Pack CN-AP的柱(YMC生产，目录号AP-513；直径6mm；床高250mm)上，用0.1％TFA作为溶剂A和0.05％含1-丙醇的TFA作为溶剂B，所说的柱预先用15％ B进行平衡。加样后，将丙醇的浓度由15％B增至25％B，且在65分钟内将B的浓度由25％线性增至50％。在最后一个操作(第5个)完成后，将1ml含有除去蛋白质的同样组分的溶液加至柱上并以同样的方法处理以获得仍存在于柱中的TPO活性。由于采用相同的聚丙烯管贮存6个操作的洗脱液，总共获得了44只每管含7.2ml洗脱液的试管。
将每一上述获得的级分取30μl(每一级分的1/240)与20μl5％BSA混合，蒸发干燥，再溶于0.24ml IMDM测定培养基中进行测定以确定含TP0活性的级分。结果在管28至33(37.0至42.0％丙醇范围)的级分中发现了强的TPO活性，这些级分合起来用作低分子TPO样品F3来源的YMC-Pack CN-AP主要TPO活性级分FA。低分子TPO样品F3来源的YMC-Pack CN-AP主要TPO活性级分FA总体积43.20ml蛋白质浓度0.00863mg/ml总蛋白质 0.373mg相对活性 800,000总活性298,400(10)Capcell Pak C1 300<终反相层析>
将在上述步骤(9)中获得的43.20ml低分子TPO样品F3来源的含TPO活性级分FA中的43.12ml(总蛋白，0.372mg；蛋白质浓度，0.00863mg/ml；相对活性，800,000；总活性，297,500)与0.2ml50％甘油混合并浓缩获得0.1ml甘油溶液。
将该溶液与2ml溶剂A(0.1％TFA)∶溶剂B(含0.05％TFA的1-丙醇)＝85∶15(15％B)的溶液混合以制备2.1ml含约14％丙醇、约4.8％甘油和0.177mg/ml蛋白质的样品。将该制得的溶液加至预先以15％B平衡的Capcell Pak C1 300A柱(Shiseido Co.，Ltd.生产目录号C1 TYPESG 300A；直径4.6mm，床高250mm)上，在65分钟内用线性梯度从27％B增至38％B的溶液以0.4ml/min的流速处理。以0.6ml一份收集洗脱液至72个聚丙烯管中。
将所得每一级分的3μl(每一级分的1/200)与20μl 5％BSA混合，将基质转换成225μl IMDM测定培养液，测定稀释了75倍的级分。
将每一级分取1μl(级分的1/600)用于电泳，将其蒸发干燥并用10μl非还原样品缓冲液于95℃处理5分钟以进行SDS-PAGE。然后将处理后的样品进行使用15-25％SDS-聚丙烯酰胺预制凝胶(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd生产)的SDS-PAGE，并用2D-Silver Stain.II“DAIICHI”(由Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.，生产，目录号167997；下文称为“银染色药盒”)的银染色药盒染色。用[DAIICHI]-III低分子量标记物(由Daiichi PureChemicals Co.，Ltd.生产；目录号181061；下文称为“DPCIII”)作为分子量标记物。
上述测定的结果是在管35至43(30.0至32.5％丙醇浓度范围)的级分中发现了显著的TPO活性。其中的管36至42(30.5至32.0％丙醇浓度范围)的级分合起来用作主要TPO活性级分FA。结果示于图2。
当将由色谱推断的蛋白质含量与测定结果相比时，发现所得级分总蛋白质为39.6μg，蛋白质浓度为9.4μg/ml，相对活性为4,890,000，总活性为193,600。对管36至42的TPO活性级分的SDS-PAGE图样的检测显示了染色强度与活性强度相关联条带的存在。此外，发现该非还原带的表观分子量在与于同样凝胶上的已还原的标准分子量蛋白质比较时为17,000至19,000，这表明该带很可能是TPO。(11)从电泳凝胶<15％SDS-PAGE>提取TPO活性蛋白质含TPO活性的级分FA分析的例子在上述步骤(10)中获得的4,200μl低分子量TPO样品F3来源TPO活性级分FA(总蛋白质，39.6μg；蛋白质浓度，9.4μg/ml；相对活性，4,890,000；总活性，193,600)中，将用于活性蛋白质提取的5.5μl(级分的1/764)和用于银染色的2.5μl(级分的1/1680)转入各自的样品试管中，蒸发干燥，与10μl用于SDS-PAGE的非还原样品缓冲液于37℃反应1小时，然后室温下静置18小时，由此进行SDS反应。
用预染Low Range Marker(Bio-Rad Laboratories，Inc.，生产，161-0305)和前述DPCIII作为分子量标记物。利用microslab凝胶，按照通常使用的方法(Laemmli，Nature，vol.227，pp.680-685，1970)于4℃进行这些样品的15％ SDS-PAGE。电泳完成后，用刀将准备进行银染色的凝胶部分迅速切下置入固定液中，然后用前述的银染色药盒进行染色。
另外，将用于检测活性的所有分子量范围的凝胶用刀切成34片，各凝胶电宽1.5-2.5mm，将其用稍加改良的Kobayashi法(Kobayashi，M.，Seikagaku(Biochemistry)，vol.59，no.9，1987，published by the Japanese Biochemistay Society)粉碎。粉碎成小碎片的各凝胶片与0.3ml提取缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8，500mM MaCl，0.05％ BSA)混合，于4℃摇动6小时以进行提取。
向其中加入500mM磷酸钾(pH6.8)以使终浓度为20mM。4℃下摇动1小时后，将所得混合物转至Ultra Free C3GV 0.22μm滤过装置(Millipore Corp.生产，UFC3 OGV OS)中，在1,000×g(4,000rpm)下离心15分钟以除去沉淀的SDS，重新获得产生的上清液。将滤出液转至Ultra Free C3-LGC超滤装置(标定截流分子量10,000，Millipore Corp.生产，UFC3 LGC00)中，以3,000×g(7,000rpm)离心。当浓缩溶液体积达到约50μl时，加入20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)300μl，再进行超滤。
重复两次用300μl 20mM磷酸钠缓冲液的超滤，以去除残余的SDS。此后，重复类似的步骤以交换成检测培养液制备随后进行灭菌并用于TPO活性测定的样品(300μl)。
通过银染色清楚地检测出三条蛋白带，所说的银染色基于DPCIII分子量标记物显示了表观分子量为约17,000至19,000、14,000至11,000的蛋白质。
在前述步骤(10)中，在Capcell Pak C1柱TPO活性级分的电泳中观察到了具有活性强度与染色密度相关且表观分子量为约17,000至19,000的条带。在本步骤(11)的实验中，在表观分子量约17,000至19,000的条带中发现了TPO活性(参见图3)。
基于上述结果，已经证实了Capcell Pak C1 300A柱中的活性级分中的TPO活性蛋白质在电泳凝胶上被纯化至可检测出的水平。基于由15％SDS-PAGE获得的条带的银染色密度，在总TPO活性级分中可能的TPO蛋白质(表观分子量约17,000至19,000)的量测定为约1.7μg。
高分子TPO样品F2的纯化在下述步骤(12)至(15)中得到描述。(12)YMC-Pack PROTEIN-RP<反相层析>
将上述步骤(1)中得到的高分子TPO样品F2(总蛋白质，257mg；蛋白质浓度，0.894mg；相对活性，7,840；总活性，2,015,000；总体积，287ml)与95.8ml(样品的1/3体积)的溶剂B(含0.025％TFA的1-丙醇)混合以得到总体积为383ml，丙醇、TFA和蛋白质终浓度分别为约25％、0.006％和0.671mg/ml的溶液。将0.025％TFA的溶液用作溶剂A。在输入样品制备过程中形成的不溶物质用离心将其分离出来，所产生的上清液分成6个62.3ml(42.8mg蛋白质)部分以2ml/min的流速加至预先用30％B平衡、铺有YMC-Pack PROTEIN-RP的柱(YMC生产，目录号A-PRRP-33-03-15；直径3cm；床高7.5cm)上。将离心产生的沉淀物溶于10ml含5mM CHAPS的20mM乙酸钠(pH5.5)，也加至柱上。
加样完成后，将约50ml的溶剂(溶剂A∶B＝3∶1)过柱以得到过柱级分。下一步，开始一逐步变化的洗脱方法(在120分钟内用30％B呈线性梯度变化的至45％B的溶剂进行洗脱)，以每管15ml将洗脱液收集在24只聚丙烯管中。对6个分开的样品用相同的收集管重复进行此过程，从而获得总数为24管、每管含90ml洗脱液的级分试管。将过柱级分与管1级分合起来，用使用YM3膜(76mm直径，Amicon Corp.生产)的超滤装置直接浓缩至90ml。
将过柱级分与管1级分混合物以及管2至管24的级分各取0.3ml与10μl 5％BSA混合，蒸发干燥，溶于0.3ml IMDM测定培养液中，然后测定以找出含TPO活性的级分。结果在管10至15(34.0至39.5％丙醇浓度范围)的级分中发现了TPO活性，这些级分合起来用作高分子TPO样品F2来源的YMC-Pack PROTEIN-RP TPO活性级分F2。该级分贮于-85℃直至用于随后的YMC-Pack CN-AP步骤。高分子TPO样品F2来源的YMC-Pack PROTEIN-RP TPO活性级分F2总体积 540ml蛋白质浓度 0.021mg/ml总蛋白质11.4mg相对活性227,000总活性 2,588,000(13)Seperdex 75pg<CHAPS存在下的凝胶过滤层析>
将上述步骤(12)中得到的高分子TPO样品F2来源的YMC-PackPROTEIN-RP TPO活性级分F2(总蛋白质，11.3mg；蛋白质浓度，0.021mg/ml；相对活性，227,000；总活性，2,565,000)的538.2ml与0.6ml 50％甘油混合并蒸发浓缩。向其中加入18ml 20mM CHAPS，然后搅拌，随后于4℃温育41小时。此后，将第-个样品加至铺有HiLoad 26/60 Superdex 75pg的柱(Pharmacia Biotech生产，目录号17-1070-01；直径2.6cm，床高60cm)上，用含5mM CHAPS的DPBS以1ml/min的流速洗脱。将每一样品取4ml(蛋白质浓度0.466mg/ml；蛋白质，1.86mg)加至柱上。
在这一例子中，通过将整个YMC-Pack PROTEIN-RP TPO活性级分或6个部分而将Superdex75柱操作过程重复6次。每一操作的洗脱液以每份5ml收集于45只试管中，从而在完成了6个柱操作后最终获得了每份含30ml洗脱液的45份级分。
取所得的每份级分中的0.1ml与5％的BSA 10μl混合，蒸发干燥，溶于0.25ml IMDM测定培养液中，然后测定以找出含TPO活性的级分。结果是在管13至31的级分(分子量范围从78,000至3,000)中发现了TPO活性，管13至31的级分合起来用作高分子TPO样品F2来源的Superdex 75pg TPO活性级分F2。高分子TPO样品F2来源的Superdex 75pg TPO活性级分F2总体积 540ml蛋白质浓度 0.00216mg/ml总蛋白质1.17mg相对活性1,750,000总活性 2,041,000(14)YMC-Pack CN-AP<反相层析>
将在上述步骤(13)中得到的540ml高分子TPO样品F2来源的Superdex 75pg TPO活性级分F2(分子量，78,000-3,000)中的513.2ml(总蛋白质，1.11mg；蛋白质浓度，0.00216mg/ml；相对活性，1,750,000；总活性，1,943,000)与1/10体积的溶剂B(含0.05％TFA的1-丙醇)混合，并以0.6ml/min的流速用溶剂A(0.1％TFA)和溶剂B将其加至预先用15％B平衡的铺有YMC-Pack CN-AP的柱(YMC生产，目录号AP-513，直径6mm，床高250mm)上。这一过程完成后，丙醇浓度由15％B增至25％B，且在65分钟内由25％B线性梯度增至50％B。
在开始YMC-Pack CN-AP柱层析之前，用总加样样品的1/20用于试验操作以证实活性的适当回收。此后，将剩余的19/20分成2份样品以进行两次操作。换句话说，柱操作重复进行三次。由于用同样的44只聚丙烯管贮存三次操作的洗脱液，所以得到了44只每管含3.6ml洗脱液的试管。
将所得每个级分取5μl(每个级分的1/720)与0.25ml IMDM测定培养液混合，然后测定以找出TPO活性级分。结果是在管24至30(丙醇浓度范围为36.0至42.0％)的级分中发现了很强的TPO活性，这些级分合起来用作高分子TPO样品F2来源的YMC-Pack CN-AP主要TPO活性级分FA。高分子TPO样品F2来源的YMC-Pack CN-AP TPO活性级分FA总体积 25.20ml蛋白质浓度 0.0246mg/ml总蛋白质0.620mg相对活性700,000总活性 434,000(15)Capcell Pak C1 300A<终期反相层析>
将在上述步骤(14)中获得的25.20ml高分子TPO样品F2来源的YMC-Pack CN-AP TPO活性级分FA中的24.66ml(总蛋白质，0.606mg；蛋白质浓度，0.0246mg/ml；相对活性，700,000；总活性，424,000)与0.4ml 50％甘油混合，蒸发浓缩。
以此方式，获得含百分之n浓度的丙醇、10％的甘油和0.303mg/ml蛋白质浓度的2ml浓缩样品。用溶剂A(0.1％TFA)和溶剂B(含0.05％TFA)将其加至预先用15％B平衡的铺有Capcell PakC1 300A的柱(Shiseido Co.，Ltd.生产，目录号C1 TYPE；SG300A；直径4.6mm；床高250mm)上，以流速0.4ml/min进行此过程，在此过程中在65分钟内线性梯度由27％B增至38％。以每管0.6ml将洗脱液收集在72只聚丙烯试管中。
将每管所得级分取0.75μl(每个级分的1/800)与20μ1 5％BSA混合，基质转换成225μl IMDM测定培养液，然后测定稀释了300倍的级分。
将每一级分取样2μl(级分的1/300)用于电泳，蒸发干燥并用10μl非还原性样品缓冲液于95℃处理5分钟以进行SDS-PAGE。然后将处理过的样品用于使用15-25％、SDS-聚丙烯酰胺预制凝胶(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.生产)的SDS-PAGE，用前文所述的银染色药盒进行染色。用前述的DPCIII作为分子量标记物。
上述测定的结果是在管33至39(丙醇浓度范围是29.5至31.5％)的级分中发现了显著的TPO活性。在这些级分中，将管34至39(丙醇浓度范围30.0至31.5％)的级分合起来用作主要TPO活性级分FA。对主要TPO活性级分SDS-PAGE图型的检查显示出现了在非还原条件下表观分子量范围在17,000至19,000之间、其染色密度与活性强度相关联的一条色带，这与前文所述步骤(10)中低分子TPO样品F3来源的TPO活性级分的情况相似。
<实施例2>
分析已纯化大鼠TPO部分的氨基酸序列按照Iwamatsu(Iwamatsu et al.，“Shin Kiso SeikagakuJikken-ho(New Basic Biochemical Experiments)”，vol 4，pp.33-84，pub.Maruzeu；Iwamatsu，A.，Seikagaku(Biochemistry)，vol.63，no.2，pp.139-143，1991；Iwamatsu，A.，Electrophoresis，vol.13，pp.142-147，1992)的方法，对由实施例1纯化步骤(10)中获得的、存在于CapcellPak C1 300A柱TPO活性级分FA中的大鼠TPO候选蛋白质进行氨基酸序列分析。即将样品进行SDS-PAGE并电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在该蛋白质于PVDF膜上还原和S-烷基化后，以三种蛋白酶对已经上述处理的蛋白质进行彻底的和有步骤的原位限制性酶解，使之消化或肽片段，在每一消化步骤分离所产生的肽段并用反相层析进行纯化，用高敏感度氨基酸序列测定法分析其氨基酸序列。下文详细描述了这一过程。低分子TPO样品F3来源的Capcell Pak C1 300A TPO级分FA中的TPO候选蛋白质分析的例子(1)浓缩Capcell Pak C1 300A柱TPO级分FA(管号36至42)将4,200μl在实施例1的纯化步骤(10)中获得的低分子TPO样品F3衍生的Capcell Pak C1 300A柱TPO活性级分FA(管号36至42)(总蛋白质，39.6μg；蛋白质浓度，9.4μg/ml；相对活性，4,890,000；总活性，193,600)中的4,151μl(总级分的98.8％)用于氨基酸序列分析。由色谱推测的总蛋白质为39.1μg，其中约1.6μg是在SDS-PAGE之后被银染的TPO候选蛋白质，表观分子量约为17,000至19,000。
将该样品与甘油混合，用蒸发法浓缩以得到5μl甘油溶液。向其中加入用于SDS-PAGE的非还原缓冲液和1M Tris-HCl(pH8)以调整其pH，从而获得约25μl的含200mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM Tris-HCl(pH6.8)、1.1％SDS、2mM EDTA、0.02％溴酚蓝和30％甘油的样品。
所得样品在室温下维持14小时，然后于60℃处理5分钟以在无过度加热的情况下产生有效适当的SDS反应。(2)电泳制备Micro-Slab凝胶(4.0％丙烯酰胺堆积凝胶和15％丙烯酰胺分离凝胶)，于室温下先用12.5mA然后是17.5mA的稳定电流进行SDS-PAGE 2小时。用预染的Low Range Marker(Bio-Rad，161-0305)和DOCIII作为分子量标记物。电泳完成后立即将获得的蛋白质分子转移至PVDF膜上(参见下面的步骤)。
在非还原条件下或在用二硫苏糖醇(DTT)使样品还原之后将样品的一部分用于另一使用15-25％聚丙烯酰胺预制凝胶(Multi Gel15/25，Daiichi Pure Chemicals Co.Ltd生产，目录号211072)的电泳。当将所得凝胶用前文所述的银染色药盒染色后，证实了所希望成为TPO蛋白质条带的分子量在还原条件下约为19,000，且CapcellPak C1 300A柱的TPO候选蛋白质纯度为百分之几。另外，由于该条带的移动性在非还原和还原条件下不同，所以提示该候选蛋白质含有至少一个二硫键。(3)通过电泳印迹法转移PVDF膜上的蛋白质并检测条带应用半干燥转移装置(Model KS-8460，Marysol生产)在160mA(11至17V)的稳定电流下在PVDF膜(ProBlott，AppliedBiosystems生产，目录号400994)上进行蛋白质转移1小时。用由0.3M Tris和20％甲醇(pH10.4)组成的溶液作为阳性电解液，由25mM Tris和20％甲醇(pH10.4)组成的溶液作为转移膜溶液，由25mM Tris、40mM氨基己酸和20％甲醇(pH10.4)组成的溶液作为阴极电解液。
当用Ponceau S染色溶液(100ml水中含0.1g Ponceau S和1ml乙酸)染色所得转移后的膜时，检测出多个条带，证实其中之一为分子量约19,000的候选蛋白质的条带。将该带切下以用于随后进行的肽段生成步骤中。(4)肽片段生成、肽的酶谱分析以及氨基酸序列分析为了对在PVDF膜上还原后进行了转移和S-烷基化的TPO候选蛋白质进行彻底的片段化，应用了下面的三种蛋白酶有步骤地进行限制性酶性水解。第一次消化赖氨酰内肽酶(Achromobacter lyticus m497-1，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产，目录号129-02541)。第二次消化内蛋白酶Asp-N(Boehringer-Mannheim Corp.生产，目录号1054589)第三次消化胰蛋白酶-TPCK(Worthington Biochemical生产，目录号3740)回收每次酶消化获得的肽片段，加至Wakosil-II 5C18 C18反相柱(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产，直径2.0mm，长度150mm)上，并以0.25ml/min的流速和30℃的柱温，用溶剂A(0.05％TFA)和溶剂B(异丙醇∶乙腈＝7∶3，0.02％TFA)在30分钟内使B由1％线性梯度增至50％B进行洗脱。以这种方法，作肽的酶谱分析(见图4)。回收所得肽段并用一气相氨基酸测序仪(PPSQ-2，Shimadzu Corp.生产)进行Edman降解。此后，从测序仪依次回收的每个氨基酸用借助同溶剂洗脱的C18反相柱层析进行鉴定，所说的氨基酸其N末端已被PTH耦联。结果总结于下文。由赖氨酰内肽酶进行第一次消化获得的肽片段的氨基酸序列片段 氨基酸序列AP3(K)XYYES2(X为A、S、G、M或Q，Z是E或K)(SEQ ID NO184)AP6 (K)XRAAZ(X为E或Q，Z为E或N)(SEQ IDNO185)AP7 (K)AGXCSG(不能被全部鉴定)(SEQ ID NO186)AP8 (K)XPVPPACDPRLL(X为I、T或S)(SEQ IDNO187)AP12(K)DSFLADVK(SEQ ID NO188)AP5 (不能被鉴定)AP20(不能被鉴定)AP21(不能被鉴定)AP23(不能被鉴定)由内蛋白酶Asp-N进行第二次消化获得的肽片段的氨基酸分析片段氨基酸序列ASP1(不能被鉴定)ASP2(不能被鉴定)ASP6(不能被鉴定)ASP11 (不能被鉴定)由胰蛋白酶-TPCK进行第三次消化获得的肽段的氨基酸分析片段氨基酸序列TP2(K或R)TLPTXAVP(SEQ ID NO189)TP3(K或R)TLPTXAVP在上述序列中，N末端括号内显示的是能从彻底的酶消化推测出的氨基酸残基。(5)所得氨基酸的同源性分析<同源性检索>
为了了解是否所得氨基酸序列含于一已知报导过的蛋白质中或者是否有一蛋白质具有相似的序列，用序列分析软件Mac Vector(Kodak Intemational Biotechnologies，Inc.)对其进行了分析。就关于已知蛋白质或已知基因的信息方面，应用了Entrez Release 6数据库(National Center for Biotechnology Information，National Library of Medicine，National Institute of Health，USA，published on August 15，1993)。数据库包括以下内容Entrez Release 6数据库NCBI-GenBank，August 15，1993(Release 78.0)EMBL，July 15，1993(Release 35.0 plus updates)DDBJ，July 15，1993SWISS-PROT，April，1993(Release 25.0)PIR，June 30，1993(Release 37.0)PDB，April，1993PRF，May，1993dbEST，July 15，1993(Release 1.10)U.S.and European Patents结果是AP12的序列(K)DSFLADVK与大鼠皮质甾类结合球蛋白(CBG)前体的内序列KDSFLDVK[PIR数据库登记号A40066；Smithand Hammond；“Rat corticosteroid-binding globulinprimarystructure and messenger ribonucleic acid levels in the liverunder different physiological conditions.”，Mol.Endocrinol.，(1989)，3,420-426]恰好完全相合。
进一步检查显示与AP3的(K)XYYESZ(X为A、S、G、M或Q，Z为E或K)序列具有高度相似性的KQYYESE序列(SEQ ID NO193)包含在大鼠CBG氨基酸序列中。在大鼠CBG中，相应于AP12和AP3的序列互相连接，从而形成了内部氨基酸序列KDSFLADVKQYYESE(SEQID NO190)。
至于除AP12和AP3外其它片段的氨基酸序列，没有发现其相似性应加以考虑的蛋白质或基因。
<实施例3>
分析由血小板减少症大鼠血浆衍生的TPO的生物特性(1)在大鼠CFU-MK测定系统(液体培养系统)中作为典型的例子，图5显示了用从血小板减少症大鼠血浆部分纯化的TPO样品(由在实施例1-2的纯化步骤(8)中描述的、来自YMC Pack Protein-RP柱的TPO活性级分F2)的剂量反应曲线。当在显微镜下周期性地观察培养的细胞时，识别出巨核细胞的生成与成熟，也就是细胞大小的增加，这可能与巨核细胞数目的增加是一起进行的。特别显著的变化是在第4天也就是培养的最后一天发现了巨核细胞突起的形成(在第3天时几乎不能识别出巨核细胞的突起的形成)。这样的突起形成称为胞浆突起形成(Leven and Yee，Blood，vol.69，pp.1046-1052，1987)或前血小板突起形成(Topp etal.，Blood，vol.76，pp.912-924，1990)，后者被认为是由成熟巨核细胞进一步分化的血小板前体结构以及被认为处在于体外目前可观察到的巨核细胞分化的最终阶段。由于单独用TPO样品以高频率观察到如此的形态学上的变化，可能该因子独自能够刺激CFU-MK增殖和分化，产生成熟巨核细胞并最终释放血小板。(2)在集落测定系统中当采用集落测定系统检测由血小板减少症大鼠血浆部分纯化的TPO样品时，大鼠血浆来源的TPO刺激了巨核细胞集落的形成，所说的集落测定系统应用了未分离的大鼠骨髓细胞、每一分离/浓缩步骤的细胞或GpIIb/IIIa+CFU-MK级分。与由其它细胞因子如大鼠IL-3、小鼠GM-SF或人EPO导致的巨核细胞集落进行比较，TPO导致的巨核细胞集落的特征是每个集落由更小数目的巨核细胞组成，但每个巨核细胞体积更大，这意味着提前成熟。另外，由于TPO不产生或只产生很少的其它细胞系集落，TPO的Meg-CSF活性因而可被认为巨核细胞特异性的。基于这些事实，很明显TPO具有不同于其它细胞因子如大鼠IL-3、小鼠GM-CSF和人EPO的生物学特性，并有独特的Meg-CSF活性。
由血小板减少症大鼠的血浆中部分纯化的TPO样品也对CD34+、来源于人骨髓细胞或人索状血细胞的DR+细胞级分显示其Meg-CSF活性并且显著增加了人巨核细胞集落的数目，表明该因子无种属特异性。
<实施例4>
大鼠产生TPO的细胞的特定(1)大鼠产生TPO的器官的筛选为了保证用于大鼠TPO基因克隆的mRNA来源，进行了大鼠TPO生产器官的筛选和特定。首先，定期从由施用P55抗体患有血小板减少的大鼠上获取骨髓、肺、肝和脾脏，培养其细胞(肺和肝脏为器官的切片)，用大鼠CFU-MK测定系统检测所产生的培养物上清液。然而这一最初尝试并未取得明显结果。后来进行了进一步尝试，培养用胶原酶灌注由施用P55抗体导致的血小板减少大鼠的肝脏所制备的肝细胞，这是因为考虑到有一篇报道指出大鼠的肝脏与TPO产生之间有一定关系(Siemensma et al.，J.Lab.Clin.Med.，vol.86，pp.817-833，1975)。将所得培养物上清液加至WGA-Agarose柱上，然后在Vydac苯基反相柱上分馏已吸附的级分，在大鼠CFU-MK测定系统中大鼠血装来源的TPO活性相同的位置处发现了非常相似的活性。在正常大鼠肝细胞培养物上清液中也发现了较弱但相同的活性。这些结果强有力地表明肝脏是产生TPO的器官之一。(2)筛选大鼠产生TPO的细胞系基于上述结果，进行了大鼠产生TPO之细胞系的筛选。首先，将20种大鼠肝脏来源的细胞系中的每个细胞系在各自的继代培养液基质中培养直至细胞达到几乎汇合状态，用补充了5％FCS的相同的各自培养液基质更换培养基，继续培养3天。当按照上面步骤(1)所描述方法部分纯化每一种所得培养物上清液以测定存在TPO的产生时，在三个大鼠肝脏实质细胞来源的细胞系中发现了显著的TPO活性，这三种细胞系叫作McA-RH8994细胞(ATCC保藏号CRL 1602；Beckeret al.，“Oncodevelopmental Gene Expression”ed.by Fishmanand Sell，Academic Press，NY.pp.259-270，1976；购自Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)、H4-II-E细胞(ATCC保藏号CRL 1548；Pitot et al.，Nat.Cancer Inst.Monogr.，vol.13，pp 229-245，1964；购自Dainippon Phannaceutical Co.，Ltd.)和HTC细胞(Thompson et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，vol.56，pp.296-303，1966；购自Dainippon PharmaceuticalCo.，Ltd.)。(3)详尽分析McA-RH8994细胞、H4-II-E细胞和HTC细胞中的TPO活性将由这三种大鼠细胞系分泌的TPO活性蛋白的生化和生物学特性进行了检测，并与大鼠血浆来源的TPO进行了比较。
将McA-RH8994细胞悬浮在含10％FCS的α-MEM(-)液体培养基中并移入175cm2的塑料组织培养瓶中，每瓶含1×106个细胞。在5％CO2温箱中于37℃培养3天后，将培养基换成含5％FCS的IMDM培养基，并继续培养3天，回收所得的培养物上清液。将H4-II-E细胞悬浮在含10％FCS的Dulbecco′s改良Eagle液体培养基(葡萄糖4.5g/l，下文称为“DMEM”)中并移入175cm2的塑料组织培养瓶中，每瓶含5×105个细胞。在5％CO2温箱中于37℃培养3天后，将培养基换成含5％FCS的IMDM培养基，继续培养3天，回收所得培养物上清液。同样，将HTC细胞悬浮在含5％FCS的DMEM液体培养基中并移入175cm2的塑料组织培养瓶中，每瓶含2.5×105个细胞。在5％CO2温箱中于37℃培养3天后，将培养基换成含5％FCS的IMDM培养基并继续培养3天。回收所得培养物上清液。
应用分别从该三个细胞系培养所得的2升上清液，按照实施例1-2中所述的由XRP纯化TPO的方法对各细胞系来源的TPO进行部分纯化。下文描述了其结果的大致情况。
首先，用超滤装置使每个培养物上清液浓缩约6倍并用SephadexG-25柱将培养基换成20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。所得洗脱液加至Q-Sepharose FF柱上，将该柱用20mM Tris-HCl(pH8.0)冲洗，然后吸附的级分用含175mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH8.0)洗脱。所得洗脱的级分加至WGA-琼脂糖柱上，将该柱用PBS冲洗，所吸附的级分用含0.2M GlcNAc和0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.2)洗脱。所得洗脱液加至TSK-凝胶AF-BLUE 650MH柱上，将该柱用含1M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.2)冲洗，所吸附的级分用2M NaSCN洗脱。所得洗脱液加至Phenyl-Sepharose 6FF/LS柱上，将该柱先用含1.5M硫酸铵的50mM磷酸钠(pH7.2)冲洗，再用含36mM磷酸钠的0.8M硫酸铵冲洗，然后所吸附的级分用20mM磷酸钠(pH7.2)洗脱。将所得吸附级分浓缩并用反相Vydac Protein C4柱(The Separations Group生产，目录号214TP51015；直径1cm；床高15cm)进行分馏。即将样品加至预先用20％B平衡的C4柱上，用展开溶剂A中0.1％TFA和展开溶剂B中含0.05％TFA的1-丙醇，通过90分钟内由20％B线性梯度增至40％B，以1ml/min的流速进行有效的洗脱。结果在1-丙醇浓度为30-43％时洗脱出每种来源于这些细胞系的TPO活性蛋白质。
当用大鼠CFU-MK测定系统检测每一纯化步骤样品中TPO活性时，结果显示这三种细胞系的TPO活性与XRP来源的TPO具有相似的型式(参见实施例1-2)。表2显示了用大鼠CFU-MK测定系统检测的每一纯化步骤中的相对活性，活性产率等等。另外，当用大鼠CFU-MK系统检测来源于最终反相柱的洗脱液的TPO活性时，在同一高峰区域发现了所说的三个细胞系的TPO活性和XRP来源的TPO。当用大鼠GpIIb/IIIa+CFU-MK分离和浓缩的去粘附步骤中获得的非粘附细胞进行反相柱TPO活性级分的集落测定时，Meg-CSF活性的洗脱型式与用大鼠CFU-MK测定系统检测的TPO活性的洗脱型式非常相似(参见表3)。另外，与XRP来源的TPO情况相似，三个细胞系中的每个细胞系的TPO活性未形成或很少形成其它细胞系的集落。
按照实施例1-2中描述的方法，将来自于反相柱的每种贮存的活性级分加至SDS-PAGE柱上。当从所产生的凝胶中提取蛋白质且用大鼠CFU-MK测定系统检测TPO活性时，发现XRP来源的TPO、McA-RH8994细胞来源的TPO和H4-II-E细胞来源的TPO的表观分子量分别为17,000至22,000、33,000至39,000和31,000至38,000，且HTC细胞来源的TPO表现出表观分子量为17,000至22,000和28,000至35,000。
因此，这些结果显示了由McA-RH8994细胞、H4-II-E细胞和HTC细胞产生的TPO蛋白质在其生物学特性方面等同于XRP来源的TPO，尽管其生化特性在表观分子量上互相间略有不同。本发明的一个显著发现是血液中含有的TPO活性蛋白分子可能是在其产生的细胞中或在其分泌之后于其上的特殊或非常规位点部分消化的产物这一可能性。它也提示可能存在具有不同长度的TPO基因(mRNA和cDNA)。
表2大鼠细胞系TPO的纯化细胞系 McA-RH8994HTC H4-II-E步骤TP*1 RA*2 TA*3 TP RATATPRATA(mg)(mg) (mg)培养物上清液48068 38450 5760 5 28800 4087 5 20440Sephadex G25482416 77180 6458 1277500 4011 5 20050Q-Sepharose FF 197320 39460 3112 1546680 1821 1527320WGA-Agarose 76.01350102600 132.0 250 33000 80.0 907200TSK-凝胶AF-Blue 5.0 12500 62500 9.2 7500 69000 5.4 150 810650MHPhenyl-Sepharose14.7500 735013.1 2500 32750 11.4 170 19406FF/LSVydac Protein C40.23- - 0.75 - - 0.11 - -*1，总蛋白质；*2，相对活性；*3，总活性表3由大鼠TPO(反相C4柱级分)刺激的大鼠巨核细胞集落形成洗脱丙醇 XRP集落 McA-RH8994集落 HTC集落 H4-II-E集落30.0-32.6％ 0 33 41832.6-34.7％ 0 13219 5034.7-36.7％ 67 290291 23036.7-38.8％ 70 214183 10338.8-40.9％ 2 15 52840.9-43.0％ 0 4 04<实施例5>
构建用于cDNA文库的表达载体(pEF18S)构建cDNA片段可很容易整合进入的载体，且该载体能建立已克隆的cDNA高表达效率，以用于TPO cDNA的克隆和表达。即通过用已知为一高表达启动子的延长因子1α(EF1α)启动子替代SRα启动子从表达载体pEF18S构建表达载体pEF18S(参见图6)。延长因子1α的启动子是通过以下方法获得的，即用限制性酶HindIII和EcoRI部分消化1μg的表达载体pEF-BOS(Mizushima et al.，NucleicAcids Res.，vol.18，p.5322，1990)，将消化物用于进行2％琼脂糖凝胶(FMC BioProducts生产)电泳以分离出约1,200bp的DNA片段，并用Prep-A-Gene DNA纯化试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.生产；为一用于选择性纯化DNA的试剂盒，它是基于Willis etal.在Bio Techniques，vol.9，pp.92-99，1990中所报导的方法发展的，它通过多孔硅石助成基质DNA吸附有效地进行选择性纯化DNA)纯化该DNA片段。将所得DNA片段一部分100ng与预先已用HindIII和EcoRI消化的50ng的表达载体pME18S连接(Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.90，pp.8957-8961，1993)。将市售宿主株——高感受态(Competent High)E.coli DH5细胞(Toyobo Co.，Ltd.生产；一种通过Hanahan et al.，J.Mol.Biol.，vol.166，pp.557-558，1983的改良方法制备的感受态E.coli株)以所得已构建的载体转化。培养已转化细胞之后，随机选取12个集落并从每个集落中纯化质粒DNA。用分析这些DNA分子的限制性酶消化图型获得了总数为10个的含所希望质粒(pEF18S)的克隆。此后，将所选的一个克隆培养以制备大量的质粒DNA。
基本上按照Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Labordorg Press，1989)中描述的方法进行质粒DNA的纯化。即将所获克隆pEF18S于37℃在50ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1％Becto-胰胨，0.5％Becto-酵母提取液，0.5％NaCl)中培养过夜，将离心后收集的所得细胞悬浮在4ml TEG-溶菌酶溶液(25mN Tris-HCl，pH8，10mM EDTA，50mN葡萄糖，0.5％溶菌酶)中。向其中先加入8ml 0.2N NaOH/1％SDS溶液，然后再加入6ml 3M钾/5M乙酸盐溶液以彻底悬浮细胞。将悬液离心后，用混有同样体积异丙醇的苯酚/氯仿(1∶1)处理所得上清液，然后离心。将所得沉淀小团溶解于TE溶液(10mMTris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)中并用RNase处理，然后用苯酚/氯仿(1∶1)处理，再用乙醇沉淀。将所得沉淀小团再溶于TE溶液中，随后加入NaCl和聚乙二醇3,000至两者终浓度分别为0.63M和7.5％。离心后，将沉淀小团溶于TE溶液中并用乙醇沉淀。以这种方法得到了约300μg所说质粒DNA。将其中100μg用EcoRI和NotI完全消化并进行0.8％琼脂糖凝胶(FMC BioProducts生产)电泳，将回收的载体片段用Prep-A-Gene DNA纯化试剂盒(Bio-Rad Laboratocies，Inc.生产)纯化，以获得在随后的cDNA文库构建中使用的55μg质粒DNA。
<实施例6>
McA-RH8994细胞的mRNA纯化选取在实施例4的集落测定中显示相对较高活性的McA-RH8994细胞作为用于大鼠TPO cDNA克隆的材料并进行下述实验。
基本上按照Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法进行全部RNA的分离。即在15个直径为90mm的培养皿中McA-RH8994细胞生长至融合。移除液体基质后，将每个皿中的细胞彻底悬浮在0.8ml5M胍溶液(5M硫氰酸胍，5mM柠檬酸钠(pH7.0)，0.1Mβ-巯基乙醇，0.5％肌氨酰硫酸钠(Sodium sarcosylsulfate))中，将所有培养皿中的所得悬液收集在一只试管中，用胍溶液将总体积调整至20ml。将由于细胞破坏变得粘滞的所得混合物用装有18G针头(后换成21G针头)的一只20ml注射器重复进行约20次吹打直至该混合物变得几乎不粘滞为止。用18ml 5.7M CsCl-0.1M EDTA(pH7.5)作为一用于Beckman SW28转子的同质异晶聚合物离心管中的缓冲层，将前述的约20ml混合物以各层不被破坏的方式轻轻置于缓冲层上，该试管几乎装满。然后所制得的试管在20℃以25,000rpm离心20个小时。所产生的沉淀小团用少量80％乙醇冲洗两次后溶于TE溶液中，然后用苯酚/氯仿(1∶1)提取，再用1/10体积的3M乙酸钠和2.5倍体积的乙醇进行乙醇沉淀。以这种方法从约108个细胞中获得了约2.5mg总RNA。
使用OligotexTM-dT30(Super)从总RNA中纯化poly(A)+RNA(所用OligotexTM-dT30(Super)由Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche生产；通过共价结合使寡dT分子固定在胶乳颗粒上，且poly(A)+RNA的纯化可以通过与使用一般用于此目的的寡dT柱相似的方法进行。结果是从约500μg总RNA中得到了20μg poly(A)+RNA。
<实施例7>
大鼠cDNA文库的构建用Time SaverTMcDNA合成试剂盒(Pharmacia生产；为基于Okayama and Berg，Mol.Cell.Biol.，vol.2，pp.161-170，1982的改良方法的cDNA试剂盒)和DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX，从实施例6中得到的5μg poly(A)+RNA中合成了在其5′末端有EcoRI识别位点且在其3′末端有NotI识别位点的双链cDNA(所用的DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX由Pharmacia生产；它是一组由一个用于合成cDNA的含一个NotI识别序列的引物5′-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T)18-3′(SEQ ID NO15)与用于加入一个EcoRI识别序列的连结子5′-AATTCGGCACGAG-3′(SEQ ID NO16)和5′-CTCGTGCCG-3′(SEQ ID NO17)组成)。将所合成的cDNA与预先已用EcoRI和NotI消化的1.2μg表达载体pEF18S(参见实施例5)连接，并转化入8.4ml前文所述的高感受态E.coli DH5(Toyobo Co.，Ltd.生产)中。结果获得了5.3×105转化体。
<实施例8>用PCR制备(克隆)大鼠TPO cDNA片段将实施例7中构建的530,000个克隆的McA-RH8994 cDNA文库在含50μg/ml氨苄青霉素的50ml LB基质中培养过夜，并用QIAGEN-tip 100(DIAGEN生产，为一用于DNA纯化的阴离子交换硅柱)从通过离心收集的细胞中纯化McA-RH8994 cDNA文库质粒。得到约200μg的质粒DNA。
合成相应于实施例2中描述的肽片段AP 8氨基酸序列的2个反义核苷酸引物AP8-1R和AP8-2R以及相应于用于制备cDNA文库的质粒载体pEF-18S(参见图6)。人延长因子1α的第一内含子的2个有义核苷酸引物EF1α-1和EF1α-2。通过利用394DNA/RNA Synthesizer(Applied Biosystems生产；为一基于β-cyanoethylamdite法的合成仪)有效地进行这些引物的合成，且应用用于合成的DNA纯化的OPC柱(Applied Biosystems生产；为一用于纯化含有三苯甲游基团的合成DNA的反相硅胶柱)有效地对其进行了纯化。将每一个如此合成和纯化的DNA分子溶于TE溶液中至终浓度为50μM并贮于-20℃直至应用。合成在下述过程中应用的合成寡核苷酸并以同样方法加以纯化。
引物AP8-1R和AP8-2R为如Takahashi et al报导的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.82，pp.1931-1935，1985)含有17个连续核苷酸的混合引物，所说的核苷酸中掺入了脱氧肌苷。
基于Uetsuki et al.(J.Biol.Chem.，vol.264，pp.5791-5798，1989)报导的基因组序列第1491至1512位和1513位至1532位的核苷酸序列合成分别含21和20个核苷酸的引物EF1α-1和EF1α-2。AP8Ile Pro val Pro Pro Ala Cys Asp pro Arg Leu Leu(SEQ ID NO18)Thr(SEQ ID NO19)Ser(SEQ ID NO20)AP8-1R3′-ACG CTG GGG GCI GAT GA-5′ (SEQ ID NO21)A A A T A A (SEQ ID NO22)T(SEQ ID NO23)C(SEQ ID NO24)AP8-2R3′-GGG GGG CGG ACG CTG GG-5′ (SEQ ID NO25)A A A A A(SEQ ID NO26)T T T(SEQ ID NO27)C C C(SEQ ID NO28)EFla-15′-GGA TCT TGG TTC ATT CTC AAG-3′(SEQ ID NO29)EFla-25′-CCT CAG ACA GTG GTT CAA AG-3′ (SEQ ID NO30)应用3μg McA-RH8994cDNA文库质粒作为模板，AP8-1R(500pmol)和EF1α-1(100pmol)作为引物以及带AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产，为一组用于PCR的热稳定Taq聚合酶、反应缓冲液和dNTP)，通过GeneAmpTMPCR system 9600(Perkin-Elmer生产，为一PCR的热循环器)进行PCR(100μl体积；于95℃加热2分钟，进行35次循环，每个循环由在95℃变性1分钟、于40℃退火1分钟和于72℃合成1分钟组成，最后于72℃温育7分钟)。为了改善所扩增DNA片段的专一性，进行了进一步的PCR(100μl体积；于95℃加热2分钟，进行35次循环，每个循环包括在95℃变性1分钟，于45℃退火1分钟和于72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟)，该PCR用1μl所得的PCR溶液作模板，用EF1α-2(100pmol)和AP8-2R(500pmol)作引物。
将所获得的反应液进行2％琼脂糖凝胶(FMC BioProducts生产)电泳以分离作为PCR主要产物的约330bp的DNA片段，所说片段利用前述的Prep-A-Gene DNA纯化试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.生产)进一步纯化。应用T4 DNA连接酶(Life Technologies生产)将所得纯化的DNA片段亚克隆至pCRTMII载体(用于PCR产物的TA克隆的载体，Invitrogen生产)。由于PCR中使用的热稳定聚合酶具有末端转移酶的活性，利用该酶的性质将一个脱氧腺苷酸加至PCR扩增的DNA的3′末端使已扩增DNA片段直接亚克隆至具有5′-dT粘合末端的PCRTMII载体中。用QIAGEN-tip100(DIAGEN生产)从所产生的克隆中随机选出的28个克隆纯化出质粒DNA分子，且利用Taq Dye DeoxyTMTerminator Cycle Sequening Kit(AppliedBiosystems生产，为一基于Sanger et al.的双脱氧方法Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.74，pp.5463-5467，1977，用荧光染料在PCR帮助的核苷酸测序中应用的试剂盒)，通过373A DNA测序仪(一种荧光测序仪，Applied Biosystems生产)测定其核苷酸序列。
当从所得DNA片段中选出编码上文所示AP8氨基酸序列中邻近AP8-2R引物的三个氨基酸残基(Ile/Thr/Ser)-Val-Pro的DNA片段且对其全长进行测序时，该片段包含了261bp的cDNA。该cDNA片段的第173位至175位编码甲硫氨酸，且编码框架与AP8的氨基酸框架一致。由于插入了所说DNA片段的第173位至175位的序列与Kozak的序列(Kozak，M.，Cell，vol.44，pp.238-292，1986)一致，因此看起来该cDNA片段含有一翻译启动区域，编码大鼠TPO蛋白的N-末端。排除载体序列的A1片段的核苷酸序列以及由其推算出的氨基酸序列示于附于下文的Sepuence Listing(SEQ IDNO1)。
<实施例9>
用PCR筛选大鼠TPO cDNA将前文所述的cDNA文库分成约10,000个克隆的小库中，在1ml含50μg/ml氨苄青霉素的前述LB培养基中培养过夜，然后用自动质粒分离装置PI-100(VER-3.0，Kurabo Industries，Ltd.生产；为一基于在Molecular Cloning，Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中公开的碱性SDS方法的改良法之上的自动质粒DNA提取装置进行质粒DNA提取)。与此步骤分开的是基于cDNA片段A1合成了下面的两个寡核苷酸并进行了纯化。5′CGAGGGTGTACCTGGGTCCTG 3′(SEQ ID NO31)(SEQ ID NO1序列从第1至17位的一段有义序列；CGAG代表一连接物序列)5′CAGAGTTAGTCTTGCGGTGAG 3′(SEQ ID NO32)(SEQ ID NO1序列从第212至232位的一段反义序列)用每一种在上面步骤中获得的质粒DNA样品的1/30体积作为模板，所合成的寡核苷酸作为引物以及带AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，通过GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER生产)进行PCR(进行30个循环，每个循环包括于94℃变性30秒，于66℃退火30秒和于72℃合成1分钟)。结果是在所检测的100个小库中的3个检测出236bp的特异条带。当将3个小库中的一个再分成约900个克隆的亚小库以提取质粒DNA并且以同样方法进行PCR时，在100个受检测的亚小库中的3个检测出特异条带。当将3个亚小库中的一个再分成40个克隆的小库且进行同样的筛选过程时，在100个受检测的小库中的3个发现了特异条带。将这些候选小库中的一个在补充有50μg/ml氨苄青霉素的LB板(含有15％琼脂的培养基)上培养，将每个所形成的集落进行质粒DNA提取且按同样的方法进行PCR。结果是在所检测的100个克隆中的2个检测出阳性条带。
<实施例10>
大鼠TPO cDNA的测序基本上按照Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的方法进行质粒DNA的纯化。将实施例9中得到的2个克隆的每一个均在含50μg/ml氨苄青霉素的50ml LB培养基中培养过夜，在按实施例6中所述的同样方法进行纯化后得到了约300μg质粒DNA。
按照实施例8中所述的同样方法对所得质粒DNA测序以确定含A1片段的全部核苷酸序列，这一过程中应用了Taq Dye DeoxyTMTerminator Cycle Sequening Kit(Applied Biosystems生产)。结果是两个克隆的核苷酸序列完全相同，这表明它们是同一克隆。选择其中一个克隆，将其所载的质粒称为pEF18S-A2α。它的核苷酸序列以及以其推算的氨基酸序列示于Sequence Listing(SEQ ID NO2)中。
示于Sequence Listing(SEQ ID NO2)中的序列具有显著的特征。在172bp 5′非翻译区下游的序列编码了富含疏水氨基酸的氨基酸序列，该序列被认为是含有以甲硫氨酸为起始的21个氨基酸的一个蛋白分泌信号序列。该蛋白质含有126个氨基酸残基、一个1,025个核苷酸的3′非翻译序列以及在终止密码子(TAA)之后的poly A尾链。该蛋白质含有相应于实施例2中分析出的氨基酸序列AP8的一段序列(SEQ ID NO2中从第1至12个氨基酸)，但并不含有N-糖基化的一段共有序列。紧紧位于3′非翻译序列末端旁的第1624-1629核苷酸序列不同于一段共有序列，但似乎是潜在的多腺苷酸化序列。
由E.coli株DH5载有的载体pEF18S-A2α已由本发明人于1994年2月14日贮藏于日本国国际贸易与工业部工业科学与技术司生物科学与人类技术国家研究所中，贮藏号FERM BP-4565。
<实施例11>
COS1细胞中大鼠TPO cDNA的表达与TPO活性的确认按照下述稍加修改的DEAE-葡聚糖方法即包括氯喹处理(Sompayrac et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.78，pp.7575-7578，1981；Luthman et al.，Nucl.Acids Res.，vol.11，pp.1295-1308，1983)将质粒pEF18S-A2α转染入COS1细胞中。将COS1细胞(ATCC CRL 1650)悬浮在前文所述的含10％FCS的DMEM培养基中，置入100mm塑料组织培养皿中，在5％CO2温箱里于37℃培养直至细胞达到约40％融合的阶段。与此相独立地，将溶于30μl HBS(21mM HEPES，145mM NaCl，pH7.1)中的pEF18S-A2α(10μg)加至4ml DMEM培养基中，该培养基补充有500μg/ml的DEAE-葡聚糖(Pharmacia生产)、80μM氯喹(Sigma ChemicalCo.生产)、8％(v/v)HBS和9％(v/v)Nu-Serum(Collaborative Research，Inc.生产)。将所得混合物加至上述培养的已用DMEM培养基冲洗两次的COS1细胞，在5％CO2温箱中于37℃继续培养5小时。此后，吸出培养皿中的培养物上清液，皿中留下的细胞用DMEM培养基冲洗两次后，再加入15ml含10％ FCS的DMEM培养基在5％CO2温箱中于37℃培养3至5天，回收所得培养物上清液。
将所得培养物上清液用IMDM培养基进行充分地透析且用大鼠CFU-MK检测系统进行评价。发现在质粒pEF18S-A2α表达了的COS1细胞培养物上清液中TPO活性是剂量依赖性的(见图7)。与XRP来源的TPO相似，许多巨核细胞在4天的培养中形成了延长的细胞浆突起。与此相反，在只转染了pEF18S的COS1细胞培养物上清液中未发现TPO活性(图7)。在M-07e测定系统中，也发现在质粒pEF18S-A2α表达了的COS1细胞培养物上清液中M-07e细胞增殖增强活性为剂量依赖性的，但在只转染了pEF18S的COS1细胞培养物上清液中却未发现。这些结果表明A2α含有编码具有TPO活性的蛋白质的cDNA。
下一步，为了检测该TPO活性在体内促进血小板生成的能力制备了部分纯化的TPO样品。首先，将转染了质粒pEF18S-A2α的COS1细胞在补充有0.2mg BSA的无血清培养基中培养3天，从而得到约5.8升无血清培养物上清液。向该无血清培养物上清液中加入蛋白酶抑制剂p-APMSF至终浓度为1mM，并且0.22μm过滤器过滤该混合物。向所得5,793ml滤液(蛋白质浓度，0.229mg/ml；总蛋白质，1,326mg；相对活性，1,000；总活性，1,326,000)中加入1000ml的0.85moles(总共288g)NaCl，从而得到5,849ml含0.822M NaCl的溶液。将所制备的溶液以7ml/min的流速加至预先已用含1M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.2)平衡过的TSK-凝胶AF-BLUE 650MH柱(Tosoh Corp.生产，目录号08705；直径5cm，床高6cm)上。在样品加样完毕后，用含1M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.2)7,900ml作为洗脱液过柱。贮存洗脱液并用一超滤装置(Omega Ultrasette，标定截留分子量8,000，Filtron生产)浓缩，获得过柱级分F1(460ml；蛋白质浓度，2.11mg/ml；总蛋白质，973mg；相对活性，16.3)。下一步，洗脱溶液改为2M NaSCN，用带YM3膜的超滤装置(直径76mm，Amicon Corp.生产)将洗脱的TSK-凝胶AF-BLUE650MH吸附的TPO活性级分F2(2840ml)浓缩至6.81ml。该TPO活性级分F2中的总蛋白为12.5mg，此步骤F2的蛋白产率为0.62％。TPO相对活性计算为240。下一步，将F2加至HiLoad 26/60Superdex 200pg(Pharmacia Biotech生产，目录号17-1071-01；直径2.6cm；床高60cm)上并用含50mM NaCl的20mM乙酸钠(pH5.5)以1ml/min的流速展开。展开开始后，在加样后的194至260ml范围的洗脱液中发现了TPO活性。将这些洗脱液贮存，得到Superdex200pg TPO活性级分F2(66ml；蛋白质浓度，0.112mg/ml；总蛋白质，7.41mg；相对活性，142,860；总活性，1,058,600)。下一步，制备缓冲液A(20mM乙酸钠，pH5.5)和缓冲液B(20mM磷酸钠，pH7.2，含500mM NaCl)，将该TPO活性级分以1ml/min的流速加至预先用100％A平衡过的强阳离子交换柱RESOURCE S(PharmaciaBiotech生产，目录号17-1178-01；直径0.64cm；床高3cm)上。此后，利用在40分钟内由100％A转至100％B的线性梯度以0.3ml/min的流速进行洗脱。在较宽范围的洗脱液中(从5％B至32％B)检测出TP0活性。贮存这些洗脱液并用带YM3膜的超滤装置(直径25mm，由Amicon Corp.生产)浓缩，得到RESOURCE S TPO活性级分F2(1.65ml；蛋白质浓度，4.74mg/ml；总蛋白质，7.82mg；相对活性，71,400；总活性，558,600)。
将部分纯化的TPO样品连续5天皮下给药(474μg(100μl)/只/天)至在给药前的当天已测过血小板数目的1CR雄性小鼠(9周龄)。作为对照，以同样方法用BSA(200μg(100μl)/只/天)或作为部分纯化TPO溶剂的缓冲液(100μl/只/天)给药。在最后一次给药后的第二天，从每只小鼠的心脏收集血液，用血球计(F800，Toa Iyo Denshi生产)测定血小板数目。在施用部分纯化TPO的小鼠中，与给药前的血小板数相比血小板数增加了约2.14倍。与对照组相比，在施用部分纯化TPO的小鼠中血小板数的增加比给BSA的小鼠高约1.74倍，比给缓冲液的小鼠高约1.9倍。这些结果显示TPO促进了体内血小板生成。另外，由于在施用部分纯化TPO的小鼠中，被称为小鼠急性期蛋白的免疫抑制酸性蛋白(IAP)的数量并没有升高，所以这有力地表明在诱导急性期蛋白方面TPO不同于IL-6和IL-11。
<实施例12>
大鼠组织中TPO mRNA的检测为了定位大鼠体内大鼠TPO mRNA表达的组织，从不同的大鼠组织中提取RNA。用总数6只的大鼠按实施例1中描述的相同方法进行X线照射，在照射后第11至14天时从大鼠身上切除不同组织(脑、胸腺、肺、肝、心、脾、小肠、肾、睾丸和骨髓细胞)，且立即在液氮中冷冻。通过用RNA分离试剂ISOGEN(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd生产)有效地进行总RNA提取。依照每一冷冻组织样品的重量确定所用ISOGEN的量，将已加入该试剂的组织样品用均浆器(PhyscotronRNS-60，NITI-ON Medical & PhysicalInstruments MFG.Co.，Ltd生产)处理直至得到完全打碎的组织(约在10,000rmp下45至60秒)。利用基于Chomczynski et al.的酸胍苯酚氯仿法(Anal.Biochem.，vol.162，pp.156-159，1987)的方法将组织均浆进行总RNA提取。结果，从各组织中获得了1.1至5.6mg的总DNA。
利用OligotexTM-dT30(Supper)(Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche生产)，从约500μg总RNA中纯化出20μg poly(A)+RNA。
用随机引物，从获自每一组织的1μg poly(A)+RNA中合成cDNA的第一股链。即，将1μg poly(A)+RNA溶于10μl无菌水中，于70℃温育15分钟，然后快速冷却。向其中加入75pmoles随机引物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)、10U RNase抑制剂(Bochringer-Mannheim Corp.)、50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM of KCl、3mM MgCl2和200U Super ScriptTMII(一种由LifeTechnologies生产的反转录酶)。所制备溶液(总体积20μl)于室温下温育1小时，且所产生的反应溶液于70℃温育10分钟以使酶失活，然后贮于-20℃直至使用。
基于实施例10获得的大鼠TPO cDNA序列合成用于PCR的新引物。所合成的引物的序列如下rTPO-I5′-CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG-3′(SEQ ID NO33)(SEQ ID NO2中的第347至367位)rTPO-N5′-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3′(SEQ ID NO34)(相应于SEQ ID NO2中第1005至1025位的反义引物)。
用1/10体积的每一种合成的cDNA溶液作为模板、1μM每一种所合成的rTPO-I和rTPO-N作为引物以及带AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Lte.生产)，利用GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER生产)在100μl体积内进行PCR，于95℃加热2分钟，重复30个循环，每个循环包括于95℃变性1分钟、于57℃退火1分钟和于72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟。当将所得的每一反应溶液用2％琼脂糖凝胶(FMC BioProducts生产)进行电泳以及检测扩增条带时，在来自于脑、肝、小肠和肾脏的凝胶上发现了似为TPO mRNA特异性的条带。这些结果表明大鼠中TPO mRNA的表达发生于这些器官中，尽管其表达的量不能判定。当将人体内可能存在相似的表达方式以及实施例4的结果结合起来加以考虑时，似乎肝脏是获得人TPOcDNA的适宜起始物质。
<实施例13>
人正常肝脏来源的cDNA文库的构建基于实施例12的结果，选择肝脏作为用于克隆人TPO cDNA的起始物质。按照实施例7中描述的同样的方法，用Time SaverTMcDNA合成试剂盒(Pharmacia生产)和DIRECTIONAL CLONINGTOOLBOX(Pharmacia生产)从5μg商售的正常人肝脏来源的poly(A)+RNA(由Clontech生产，为一基于Chomczynski et al.的酸胍苯酚氯仿法提取的产物)中合成了在其5′末端有EcoRI识别位点且在其3′末端有NotI识别位点的双链cDNA。将所合成的cDNA与1.2μg预先已用EcoRI和NotI消化的前文所述的表达载体pEF18S连接，并转化至8.4ml前文所述的高感受态E.coli DH5(ToyoboCo.，Ltd.生产)中。结果得到了1.2×106转化体。
<实施例14>用PCR制备(克隆)人TPO cDNA片段用随机引物，从1μg市售正常人肝脏来源的poly(A)+RNA(Clontech生产)中合成cDNA第一股链。即将1μg poly(A)+RNA溶于10μl无菌水中，于70℃温育15分钟，然后快速冷却。向其中加入75pmoles随机引物(Takara Shuzo Co.，Ltd)、10URNase抑制剂(Boehringer-Mannheim Corp.)、50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2和200U反转录酶SuperScriptTMII(Life Technologies)。将所制得的溶液(总体积20μl)于37℃温育1小时，且将所得反应溶液于70℃温育10分钟以使酶失活，然后贮于-20℃直至应用。
按照大鼠TPO cDNA序列(SEQ ID NO2)合成用于PCR的引物。所合成引物的序列如下rTPO-AIN5′-ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC-3′(SEQ IDNO35)(SEQ ID NO2中第173至193位)rTPO-N5′-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3′(SEQ ID NO36)(相应于SEQ ID NO2中第1005至1025位的反义引物)。
用1/10体积的合成cDNA溶液作为模板，1μM每种所合成的rTPO-AIN和rTPO-N作为引物以及带AmpliTaqTMDNA Polymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd生产)，利用GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-EIMER生产)在100μl体积内进行PCR，于95℃加热2分钟，重复35个循环，每个循环包括于95℃变性1分钟、于40℃退火1分钟以及于72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟。
将所得反应溶液进行2％琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)电泳以分离出作为PCR主要产物的约620bp的DNA片段，它随后利用前文所述的Prep-A-Gene DNA纯化试剂盒(Bio-Rad Laboratories.Inc.)进行纯化。所纯化的DNA片段的核苷酸序列利用前文所述的Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening Kit(AppliedBiosystems生产)由373A DNA测序仪(Applied Biosystems生产)直接确定。所测定的排除引物部分的核苷酸序列以及由此推算的氨基酸序列示于Sequence Listing(SEQ ID NO3)中。
该排除了引物序列的DNA片段长580bp。当进行比较时，人cDNA显示出与大鼠cDNA核苷酸序列具有80％的同源性，这表明该DNA片段编码了一部分人TPO cDNA。
<实施例15>
用PCR筛选人TPO cDNA克隆基于SEQ ID NO3合成进行PCR的人TPO相应的引物。所合成的引物序列如下hTPO-I5′-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3′(SEQ ID NO37)(SEQ ID NO3中第60至80位)hTPO-J5′-TGA CGC AGA GGG TGG ACC CTC-3′(SEQ ID NO38)(相应于SEQ ID NO3中第479至499位的反义引物)。
扩增在实施例13中构建的人cDNA文库，且分成多个小库(每库含约100,000个克隆)，在1ml含50μg/ml氨苄青霉素的前文所述的LB培养基中培养过夜，用自动质粒分离装置PI-100(VER-3.0，Kurabo Industries，Ltd.生产)进行质粒DNA提取。所提取的DNA溶于TE溶液中。
用5％提取的DNA样品作为模板、1μM每种合成的寡核苷酸(hTPO-I和hTPO-J)作为引物以及带AmpliTaqTMDNAPolymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，通过GeneAmpTMPCR系统9600在20μl体积中进行PCR(总共35个循环，每个循环包括于95℃变性1分钟、于59℃退火1分钟和在72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟)。结果是在所用的90个小库中的3个中检测出特异的条带。将3个小库中的一个分成亚小库，每个约含约5,000个克隆，从90个亚小库中纯化出质粒DNA以用相同的方法进行PCR。结果是在5个亚小库中检测出特异性的条带。将这5个小库中的一条再分成小库，每个含250个克隆，从90个小库中提取质粒DNA。当将这些提取的样品以同样方法进行PCR时，在三个小库中检测出特异性条带。将这三个小库其中之一进一步分成亚小库，每个含30个克隆，从90个亚小库中纯化质粒DNA，按同样方法进行PCR。结果是，在3个亚小库中检测出特异性条带。将候选小库其中之一在含50μg/ml的氨苄青霉素的前述LB板上培养，且将所形成的90个集落的每一个进行质粒DNA提取以及以同样方法进行PCR。结果最终获得了克隆HL34。
<实施例16>
人TPO cDNA的测序基本上按照Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法进行质粒DNA的纯化。在含有50μg/ml氨苄青霉素的50ml LB培养基中将克隆HL34培养过夜，将通过离心所收集的细胞悬浮在4ml前文所述的TEG-溶菌酶溶液中。向其中加入8ml0.2N NaOH/1％SDS溶液，然后再加入6ml 3M钾/5M乙酸盐溶液，完全悬浮细胞。将悬浮液离心后，将所得上清液用苯酚/氯仿(1∶1)处理，与同等体积的异丙醇混合，然后离心。所得沉淀小团溶于TE溶液中并以RNase处理，然后用苯酚/氯仿(1∶1)处理，再用乙醇沉淀。将所得沉淀小团再溶于TE溶液中，随后加入NaCl和聚乙二醇3,000至其终浓度分别为0.63M和7.5％。离心后，沉淀小团溶于TE溶液中，用乙醇沉淀。以这种方式，获得了约300μg pEF18S-HL34质粒DNA。
将所纯化的质粒DNA加至前文所述的373A DNA测序仪(AppliedBiosystems生产)上，以便用前文所述的Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening Kit(Applied Biosystems生产)测定其完整的核苷酸序列。所测的核苷酸序列以及由其推算的氨基酸序列示于Sequence Listing(SEQ ID NO4)中。在此例中，将基于SEQ ID NO3的核苷酸序列合成的寡核苷酸和基于由序列分析获得的内部序列设计的合成寡核苷酸在核苷酸测序中用作引物。
结果证实了质粒克隆pEF18S-HL34包含一个861bp的cDNA片段，且含有与实施例2中分析的氨基酸序列AP8(SEQ ID NO4中第l至12位氨基酸)和TP2/TP3(SEQ ID NO4中第157至162位氨基酸)具有高度同源性的序列。该DNA片段似乎在其第25位为起始编码了一个开放阅读框，但没有终止密码子，它在其3′末端含有76个碱基的多聚A尾状序列。其含有正在多聚A尾状序列之前的253个氨基酸残基的氨基酸序列显示与大鼠TPO cDNA相应部分(SEQID NO2中显示的包括147个残基的氨基酸序列部分)有84％的同源性。结果，发现该克隆为编码相应于大鼠TPO cDNA的人cDNA部分的DNA片段。由于缺少终止密码子以及在其3′末端存在多聚A尾状序列，似乎该克隆并不是完整的cDNA，而是在cDNA文库构建过程中产生的人工产物。
<实施例17>
在COS1细胞中表达人TPO cDNA以及证实TPO活性按照实施例11的方法将所得质粒克隆pEF18S-HL34转染至COS1细胞中。即借助包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖法用10μg的质粒DNA进行转染。于37℃培养COS1细胞3-5天，然后收集上清液。
用IMDM培养基充分透析所得的培养物上清液，并用大鼠CFU-MK测定系统进行评估。在质粒pEF18S-HL34表达的COS1细胞培养物上清液中，检测出TPO活性是剂量浓赖性的(图8)。培养4天后，许多巨核细胞形成了增长的细胞浆突起。与此相反，在只表达pEF18S的COS1细胞培养物上清液中未发现TPO活性(图8)。在M-07e测定系统中，只在通过质粒pEF18S-HL34的转染对其进行表达的COS1细胞培养物上清液中发现了M-07e细胞增殖增强活性。这些结果表明pEF18S-HL34含有编码具有TPO活性蛋白质的基因。另外，这也表明人TPO作用于大鼠巨核细胞祖细胞(没有种特异性)。
<实施例18>
人TPO缺失型cDNA的表达以及TPO活性的证实实施例15中得到的克隆HL34含有在其3′末端存在多聚A尾状连续序列的cDNA，该序列并不存在于大鼠TPO cDNA中，因此似为实验的人工产物。结果制备去除了多聚A尾状序列的cDNA分子以观察是否由缺失cDNA表达的蛋白具有TPO活性。利用PCR制备缺失cDNA。用于PCR的引物序列如下，在各引物的5′末端加上了一个限制性酶识别位点(EcoRI加至hTPO5，NotI与两个终止密码子TAA和TGA加至hTPO3)。hTPO55′-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3′(SEQ ID NO170)(SEQ ID NO4中第1至21位)hTPO35′-TTTGCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATC CTG TTCAGG TAT CC-3′(SEQ ID NO171)(相应于SEQ ID NO4中第757至780位的反义引物)。
用实施例16中得到的质粒克隆pEF18S-HL34的质粒DNA 1μg作为模板、10μM每个所合成的hTPO5和hTPO3作为引物以及带AmpliTaqTMDNA Polymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，利用GeneAmpTMPCR System9600(PERKIN-ELMER生产)在100μl体积内进行PCR，重复15个循环，每个循环包括于95℃变性1分钟、于65℃退火1分钟和于72℃合成1分钟，最后在72℃温育7分钟。用限制性酶EcoRI和NotI消化所获得的约800bp的一条带，进行纯化，然后亚克隆至预先用同样限制性酶处理过的表达载体pEF18S中。从所产生的转化体中选出5个含约800bp DNA片段的克隆，按照实施例5中所述方法制备大量质粒DNA。将各质粒约800bp的已扩增区的全长进行核苷酸序列分析以发现其与实施例16中分析的核苷酸序列(SEQ ID NO4中的第1至780位)的完全一致性。
所获得的质粒克隆称为pHT1-231。由E.coli DH5所载的载体pHT1-231已被本发明人于1994年2月14日保藏于日本国国际贸易和工业部工业科技司国家生物科学与人类技术研究所，其保藏号为FERM BP-4564。
按照实施例11的方法将所得质粒转染至COS1细胞中。即借助包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖法用10μg质粒DNA进行转染。COS1细胞于37℃培养3-5天，收集上清液。
用IMDM培养基充分透析所得培养物上清液，并用大鼠CFU-MK测定系统进行评价。在质粒pHT1-231表达的COS1细胞培养物上清液中发现了TPO活性(图9)。在培养的4天中，许多巨核细胞形成了增长的细胞浆突起。与此相对照，在只有质粒pEF18S表达的COS1细胞培养物上清液中未发现TPO活性(图9)。在M-07e测定系统中，只在质粒pHT1-231表达的COS1细胞培养物上清液中发现了M-07e细胞增殖增强活性。这些结果显示pHT1-231含有编码具有TPO活性的cDNA。
<实施例19>
用PCR制备人TPO cDNA 3′末端区由于实施例15中制备的克隆HL34含有包含多聚(A)尾状序列的cDNA，所以这表明其3′末端是不完整的。因此尝试用PCR获得全长3′末端区。基于实施例16中测定的序列，合成了用于PCR的下列4种5′侧的引物hTPO-H5′-AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC-3′(SEQ ID NO39)(SEQ ID NO4的第574-594位)hTPO-K5′-ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC-3′(SEQ ID NO40)(SEQ ID NO4的第595-615位)hTPO-N5′-AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT-3′(SEQ ID NO41)(SEQ ID NO4的第660-680位)hTPO-05′-AGG GAT TCA GAG CCA AGA TTC-3′(SEQ ID NO42)(SEQ ID NO4的第692-712位)合成在3′末端的四个碱基处含混合核苷酸的下列3′侧引物，以从多聚(A)部分开始扩增cDNA。也合成了没有混合核苷酸的锚引物。hTPO3mix5′-TAG CGG CCG C(T)17G GGG-3′(SEQ ID NO43)A AAA-3′(SEQ ID NO44)C TTT-3′(SEQ ID NO45)CCC-3′(SEQ ID NO46)hTPO3锚5′-TAG CGG CCG C(T)11-3′ (SEQ ID NO47)正如实施例14中所作的，从1μg市售的正常人肝脏来源的多聚(A)+RNA(Clontech生产)合成cDNA第一股链，但用的是0.5μg寡dT引物(它包括在由Pharmacia生产的TimeSaverTMcDNASynthesis Kit中)。用1/10体积的合成cDNA溶液作为模板，20μM的hTPO-H引物和10μM的hTPO 3mix引物以及带AmpliTaqTMDNA Polymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，利用GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER)在50μl体积内进行PCR，并于96℃加热2分钟，重复10个循环，每个循环包括于96℃热变性1分钟、于48℃退火1分钟和于72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟。
用1/10体积的第一次PCR形成的溶液作模板、体积为50μl的20μM的hTPO-K引物和1OμM的hTPO 3mix进行第二次PCR，于96℃加热2分钟，重复10个循环，每个循环包括于96℃热变性1分钟、于63℃退火1分钟和于72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟。
由1/10体积的第二次PCR形成溶液作模板、体积为50μl的20mM hTPO-N引物和10μM hTPO 3mix引物进行第三次PCR，于96℃加热2分钟，重复10个循环，每个循环包括于96℃热变性1分钟、于63℃退火1分钟和于72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟。
用1/10体积的第三次PCR形成溶液作模板、体积为50μl的20μM hTPO-○引物和10μM hTPO 3mix引物进行第四次PCR，于96℃加热2分钟，重复10个循环，每个循环包括于96℃热变性1分钟、于63℃退火分钟和于72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟。
用1/10体积的第4次PCR形成溶液作模板、50μl 20μM hTPO-○引物和20μM hTPO3锚引物进行第五次PCR，于96℃加热2分钟，重复10个循环，每个循环包括于96℃热变性1分钟、于58℃退火1分钟和于72℃合成1分钟，最后于72℃温育7分钟。
将所得反应溶液进行2％琼脂糖凝胶(FMC Bio-Products生产)电泳，分离作为PCR主要产物的约600bp的DNA片段，它随后利用前文所述的Prep-A-Gene DNA纯化试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.生产)进行纯化。利用前文所述的Taq Dye DeoxyTMTerminaterCycle Sequening Kit(Applied Biosystems生产)，通过373A DNA测序仪(Applied Biosystems生产)直接测定所纯化的DNA片段的核苷酸序列。将所测定的核苷酸序列和由此推算的氨基酸序列示于Sequence Listing(SEQ ID NO5)。
该DNA片段具有编码起自引物hTPO-○的130个氨基酸的核苷酸序列，其后跟有在3′末端的多于180个核苷酸的序列(第577位以后的核苷酸不能确定)。起自甘氨酸的30个氨基酸序列与SEQ IDNO4中的第203-232位的氨基酸序列一致。第1-94位的核苷酸序列也与SEQ ID NO4中的第692-785位的核苷酸序列一致。
实施例17中cDNA片段以及本实施例中经PCR扩增之片段的序列分析结果使人们有理由估计人TPO蛋白由含有示于SEQ ID NO6中的21个氨基酸信号序列的353个氨基酸所组成。
<实施例20>
人正常肝脏来源的cDNA文库的构建由于实施例15中所得的克隆HL34直接在其开放阅读框架的3′末端上含有多聚A尾状序列而无终止密码子且似乎因此为cDNA合成的人工产物，所以用5μg商售人肝脏来源多聚(A)+RNA制剂(Clontech生产)重新构建cDNA文库。由用于cDNA合成的SuperScriptTMLambda System和λCloning Kit以及SuperScriptTMII RNase H-(两者均由LIFE TECHNOLOGIES生产)进行cDNA合成。将多聚(A)+RNA进行热变性，然后加至20μl作为引物附于试剂盒的、含NotI序列包括在内的寡dT的反应液(50mMTris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，1mM DTT，1mMdNTP mix，200U SuperScriptTMII RNase H-)中，然后在37℃温育60分钟。在cDNA的第二股链合成后(在150μl反应液中于16℃温育2小时，该反应液含有25mM Tris-HCl(pH8.3)、100mM KCl、5mM MgCl2、250μM dNTP mix、5mM DTT、40U E.coli DNA聚合酶I、2U E.coli RNase H和10U E.coli DNA连接酶)，加入10U T4 DNA聚合酶，将所得混合物于16℃温育5分钟。将反应液在65℃加热10分钟，用相同体积苯酚/氯仿提取并用SizeSepTM400旋转柱(一种附于由Pharmacia生产的TimeSaverTMcDNA Synthesis Kit中的、用于去除低分子量DNA的旋转柱)去除长度小于400bp的cDNA分子。在加入EcoRI连接物(附于Pharmacia生产的Directional Cloning Toolbox)后，用NotI消化所处理的样品并再加至SizeSepTM400旋转柱上以去除低分子量DNA。将所合成的1.3μg在其5′末端具有EcoRI识别序列且在3′末端具有NotI识别序列的双股cDNA与已用EcoRI和NotI消化过的表达载体pEF18S连接，然后转化至9.2ml高感受态E.coliDH5(Toyobo Co.，Ltd.生产)中。所得人肝脏cDNA文库(hTPO-F1)含1.0×106个转化体。
<实施例21>
从人肝脏cDNA文库hTPO-F1中筛选TPO cDNA克隆基于SEQUENCE LISTING中显示的Sequence ID Nos3和6合成用于PCR的人TPO cDNA相应的引物。所合成引物的序列如下hTPO-I5′-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3′(SEQ ID NO48)(SEQ ID NO3中第60-80位)hTPO-KU5′-AGG ATG GGT TGG GGA AGG AGA-3′(SEQ IDNO49)(相应于SEQ ID NO6中第901-921位序列的反义引物)。
将实施例20中构建的人肝脏cDNA文库hTPO-F1(1.0×106个转化体)分至3个小库(库号1-3)中，将小库冷冻。用从各小库制得的质粒DNA作模板以及用1μM各合成的寡核苷酸(hTPO-I和hTPO-KU)作引物进行PCR。用带AmpliTaqTMDNA Polymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shzuo Co.，Ltd生产)，通过GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER生产)在100μl体积中进行PCR(总共35个循环，各个循环包括于95℃变性1分钟、于59℃退火1分钟以及于72℃合成1分钟；最后于72℃温育7分钟)。结果当用从3号小库制得的质粒DNA时，扩增了具有所期望大小的DNA片段。然后将3号小库分成亚小库，每个亚小库含15,000个转化体，在含50μg/ml氨苄青霉素的1ml LB培养基中将这些亚小库培养过夜，然后用自动质粒分离装置P1-100提取质粒DNA。将所提取的DNA溶于TE溶液中，用5％的所得溶液作为模板以进行使用如上文所述的相同引物和在相同条件下的PCR。结果在90个小库中的6个发现了具有所期望大小的DNA的扩增。将这些阳性小库其中之一再分成亚小库，使每个亚小库含1,000个克隆时，提取质粒DNA并以上文所述的相同方法进行PCR，未观察到DNA的扩增。在由一系列PCR扩增的DNA片段的电泳凝胶上，条带的密度在亚小库被进一步细分时变得越来越薄。这似乎是由于所感兴趣的克隆较差的生长引起质粒DNA低回收率所导致的。因此，用原来的3号小库应用集落杂交法进行另一次筛选。
将3号小库散开于直径15cm的100LB琼脂板上，其接种强度为每块LB琼脂板上生长4,100个集落。在从每块所接种的平板制备一复制平板后，将复制平板其中之一于37℃培养6小时以回收在平板上生长的集落并提取质粒DNA样品。当以上文所述相同的方式对这些DNA样品进行PCR时，在100个亚小库中的一个观察到一等同于所期望大小的条带的扩增。用BIODYNETMA TRANSFER MEMBRANE(PALL生产)由该亚小库的平板制得2块复制过滤器。这些滤器的变性是通过将其依次浸入10％SDS中10分钟、0.5N NaOH/1.5M NaCl 10分钟和0.5M Tris-HCl(pH8.0)/1.5M NaCl 10分钟而进行的，其后进行30分钟风吹干燥，再在真空炉中于80℃烘焙1小时。烘焙过的滤器用补充用1％SDS的6×SSC(通过稀释溶于1升水中的175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠组成的20×SSC贮存液制备)冲洗。所冲洗滤器的预杂交是通过于42℃温育30分钟、同时在30ml反应液中摇动而进行的，所说反应液由50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液(由在500ml水中含5g Ficoll、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白级分V的50×Denhardt′s液制得)、1％SDS和20μg/ml鲑鱼精子DNA。预杂交后，用含有相同成分的30ml杂交溶液置换反应液，与已际有[α-32P]dCTP(Amersham生产)的探针混合，然后于42℃摇动温育20小时。用于本实验的标记探针为质粒pEF18S-HL34的EcoRI/BamHI片段，它是通过纯化SEQ IDNO4的从5′末端至第458位碱基的部分以及标记所纯化部分而制得的，而所说的纯化部分的标记是通过用Megaprime DNA LabellingSystem(基于Ahal.Biochem.，132，6-13，1983所公开的方法、由Amersham生产的试剂盒)的随机引物技术进行的。处理后的滤器在2×SSC/0.1％SDS液中于42℃冲洗30分钟，然后在0.2×SSC/0.1％SSD液中于42℃冲洗30分钟。然后用增感屏和X-OMATTMAR5胶片(Eastman Kodak生产)将滤器在-70℃进行16小时放射自显影。结果，观察到被认为是阳性的单个信号。从原平板收集大约相应于该信号的集落，并再于10cm LB琼脂平板上接种。分别培养生长于该平板上的50个集落，在如前文所述的相同条件下用前述引物hTPO-I和hTPO-KU对这些集落的DNA样品进行PCR。结果仅在一个克隆中发现了等同于所期望大小的条带的扩增，该克隆称为pHTF1。
<实施例22>
确定ATPO cDNA克隆pHTF1的核苷酸序列基本上按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中描述的方法纯化质粒DNA。在含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中将克隆pHTF1培养过夜。离心收集所得的细胞，然后悬于4ml前述的TFG-溶菌酶溶液中。向该溶液中加入8ml 0.2N NaOH/1％SDS溶液，然后加入6ml 3M钾/5M乙酸溶液以使细胞完全悬浮。将悬浮液离心后，用酚/氯仿(1∶1)处理所得的上清液，与等体积异丙醇混合，然后离心。将所得的颗粒溶解于TE溶液，然后用RNase和酚/氯仿(1∶1)处理，接着进行乙醇沉淀。将所得沉淀再溶于TE，随后向其中加入NaCl和聚乙二醇3,000，使其终浓度分别达到0.63M和7.5％。离心后，将颗粒沉淀溶于TE溶液并用乙醇沉淀。用这种方法，得到300μg质粒DNA pHTF1。
将由此纯化的质粒DNA用于上述的373A DNA测序仪(由AppliedBiosystems制造的)以便用上述的Taq Dye DeoxyTMTerminaterCycle Sequening试剂盒(由Applied Biosystems制造的)确定全部核苷酸序列。将由此确定的核苷酸序列和推测的氨基酸序列列于序列表中(SEQ ID NO7)。在核苷酸序列确定中，用以SEQ ID NO6的核苷酸序列和由其序列反应分析得到的内部序列为基础合成的寡核苷酸作为引物用于核苷酸序列确定。
结果，证实克隆pHTF1含有1.721bp的cDNA片段，并且与实施例2中分析的氨基酸序列AP8(SEQ ID NO7中的氨基酸数1到12)和TP2/TP3(SEQ ID NO7中的氨基酸数157到162)有高度的同源性。该DNA片段看起来含有101个碱基的5′非编码区、由353个氨基酸残基组成的开放阅读框架(从在102到104位核苷酸编码的Met残基开始，在1158到1160位核苷酸编码的Gly残基终止)、随后是终止密码子(TAA)、531个碱基的3′非编码区和30个碱基的polyA尾序列，认为由开放阅读框架编码的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO6所示的预测的人TPO氨基酸序列完全一致。pHTF1的cDNA序列比SEQ ID NO6所示的推测cDNA序列大，在5′侧含有77个附加的碱基，并在其polyA尾序列前，于3′侧有347个附加的碱基。而且核苷酸序列在3个位置上不同于SEQ ID NO6。即SEQID NO7中的A(位置84)，A(位置740)和G(位置1198)在SEQ ID NO6中分别是C、T和A。在蛋白质编码区只包括位置740的突变，但由于A和T均是Thr密码子的第三个碱基，因此该突变不会引起氨基酸改变。尽管那时并不清楚这些碱基取代的原因，但分析质粒克隆pHTF1证实人TPO蛋白由带有21个氨基酸信号序列的353个氨基酸残基组成。估计除去信号序列后，成熟蛋白质的分子量为35,466。
由E.coli菌株DH5携带的载体pHTF1由本发明人于1994年3月24日以登记号No.FERM BP-4617寄存于the NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry，Japan。
<实施例23>
在COS1细胞中表达人TPO cDNA克隆并确证TPO活性按实施例11的方法，用由此得到的质粒克隆pHTF1转染COS1细胞，即经包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖方法，用10μg质粒DNA完成转染。将转染的COS1细胞于37℃培养3天，然后收集培养物上清液。
将培养物上清液对IMDM培养基彻底透析，然后用大鼠CFU-MK检测系统估测。在表达质粒pHTF1的COS1细胞上清液中，以剂量依赖形式检测TPO活性(图10a)。相反，在仅表达质粒pEF18S的COS1细胞培养物上清液中没有TPO活性(图10a)。用M-07e检测系统得到了相似的结果。在其中表达质粒pHTF1的COS1细胞上清液以剂量依赖方式明显增大M-07e细胞的增殖(图10b)。这些结果说明，pHTF1含有编码具有TPO活性之蛋白质的基因。
<实施例24>
克隆人TPO染色体DNA用人TPO cDNA作为探针克隆人TPO染色体DNA。在克隆中所用的基因组文库是由来自the Gene Research Center，Tohoku UniversityT.Yamamoto教授的所赠送(Sakai et al在J.Biol.Chem.，269，2173-2182，1994报告了该文库，通过用限制酶Sau 3AI部分消化人染色体DNA，然后将部分消化产物连至Stratagene制造的噬菌体载体λEMBL 3的BamHI位点而构建的)。基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法，用人TPO cDNA为探针筛选该文库。用E.coli LE392作为宿主，将文库接种到含NZYM(在1升水中含10g的NZ胺、5gNaCl，5g Bacto Yeast Extract，2g MgSO4·7H2O和15g琼脂，pH7.0)的15-cm平板上，以这样的接种大小一个平板含30,000个噬菌体颗粒。用BIODYNETMA TRANSFER MEMBRANE(由PALL制造的)从每个由此制备的18个平板制备两个复制滤膜。通过将滤膜浸在0.5N NaOH/1.5M NaCl中10分钟，然后在0.5M Tris-HCl(pH8.0)/1.5M NaCl中10分钟，接着空气干燥30分钟，随后在真空烤箱中于80℃烤1.5小时而使其变性。将由此处理的滤膜在含50％甲醛、5×SSC，5×Denhardt′s溶液、1％SDS和20μg/ml鲑精DNA的500ml反应溶液中于42℃温育1小时而完成预杂交。为了用作探针，经PCR扩增人TPO cDNA片段(SEQ ID NO7中178到1,025位碱基)，然后提纯，用Random Primar DNA Labelling盒(由Takara Shuzo以Anal.Biochem.，132，6-13，1983中公开的随机引物法制造的DNA标记盒)用32P标记纯化的片段。在该PCR中，所用的引物序列如下hTPO-I5′-TTG TGA CCT CCGAGT CCT CAG-3′(SEQ ID NO50)(SEQ ID NO7中的位置178到198)hTPO-N5′-AGG GAA GAG CGT ATA CTG TCC-3′(SEQ ID NO51)(SEQ ID NO7中位置1,005到1,025序列相应的反义引物)。
用同位素标记的探针，在500ml含与预杂交溶液组分相同的反应溶液中于42℃杂交20小时。将所得的滤膜在室温下用2×SSC/0.1％SDS溶液经5分钟洗3次，然后在68℃用0.1×SSC/0.1％SDS溶液洗一次1小时。然后用增强屏和X-OMATTMAR5胶片(由Eastman Kodak制造的)在-70℃使滤膜经16小时的放射自显影。结果，得到13个阳性信号。在原平板上收集约相当于每个阳性信号的噬菌斑，然后以在每个平板上形成1,000个噬菌斑的接种大小再接种以15-cm NZYM平板上。从每个所得的平板制备两个复制膜以便在与上述相同的条件下完成杂交。结果，在13个组的所有滤膜上均检测到了阳性信号。从每个所得的平板中回收一个噬菌斑以便用Molecular Cloning中描述的平板溶解产物方法制备噬菌体DNA。通过使用含有下列序列之引物的PCR，检测从13个克隆中由此制备的噬菌体DNA样品是否存在cDNA编码区。hTPO-L5′-GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3′(SEQ ID NO52)(SEQ ID NO6中的位置1到21)hTPO-F5′-ATG GGA GTC ACG AAG CAG TTT-3′(SEQ ID NO53)(相当于SEQ ID NO6中位置127到147序列的反义引物)hTPO-P5′-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3′(SEQ ID NO54)(SEQ ID NO6中的位置503到523)hTPO-V5′-AAC CTT ACC CTT CCT GAG ACA-3′(SEQ lD NO55)(相当于SEQ ID NO6中位置1,070到1,090序列的反义引物)当用这些引物结合完成PCR时，13个克隆中的5个似乎含有从cDNA预测的完整氨基酸编码区。这5个克隆所含的染色体DNA分子含有一约20kb的相似长度，初步经预先的限制酶分析表明结构几乎相同。因此，筛选一个这样的克隆(克隆λHGT1)，然后用Southern印迹分析。即，用限制酶EcoRI或HindIII完全消化克隆λHGT1的1μg DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，然后将凝胶上的带转移到BIODYNETMA TRANSFER MEMBRANE(由PALL制造的)上。所得的滤膜空气干燥30分钟，然后在真空烤箱中于80℃烤2小时。通过在50ml含有50％甲醛，5×SSC，5×Denhardt′s溶液，1％SDS和20μg/ml鲑精DNA的反应溶液中，于42℃将由此处理的滤膜温育1小时而完成预杂交。为了用作探针，经PCR扩增人TPO cDNA片段(SEQ ID NO7中178到1,025位的碱基)，然后纯化，并用RandomPrimer DNA Labelling盒(由Takara Shuzo制造的)以32P标记纯化的片段。使用同位素标记的探针，在50ml含有与预杂交溶液组分相同的反应溶液中，于42℃经20小时完成杂交。在室温下，将所得的滤膜用2×SSC/0.1％SDS溶液经5分钟洗涤3次，然后在68℃，用0.1×SSC/0.1％SDS溶液经1小时再洗1次。然后用增强屏和X-OMATTMAR5胶片(Eastman Kodak制造的)于-70℃使滤膜经16小时的放射自显影。结果，在HindIII消化的情况下，观察到一个约10kb的单带。因此，用HindIII消化克隆λHGT1的10μg DNA，然后经0.8％琼脂糖凝胶电泳，从凝胶上切下10kb的带，用Prep-A-Gene DNA纯化盒(Bio-Rad制造的)纯化，然后亚克隆到预先已用HindIII消化的克隆载体pUC13(Pharmacia制造的)中。在这种情况下，用TOYOBO生产的高感受态E.coli DH5作为宿主菌株。
在所得到的克隆中，筛选含10kb HindIII片段的克隆，称为pHGT1。
噬菌体克隆λHGT1的限制图谱列于图11中。
<实施例25>
确定人TPO染色体克隆pHGT1的核苷酸序列基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中描述的方法培养克隆pHGT1并纯化质粒DNA。将克隆pHGT1在50ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。离心收集所得的细胞，然后悬浮于4ml前述的TEG-溶菌酶溶液中。向该溶液中先加入8ml 0.2N NaOH/1％SDS溶液，然后加入6ml 3M钾/5M乙酸溶液以完全使细胞悬浮。悬浮液离心后，用酚/氯仿(1∶1)处理所得的上清液与相同体积的异丙醇混合，然后离心。将所得的颗粒溶于TE溶液，并用RNase，然后用酚/氯仿(1∶1)处理，接着乙醇沉淀。将所得的颗粒再溶于TE溶液中，随后向其中加入NaCl和聚乙二醇3,000以使其终浓度分别达到0.63M和7.5％。离心后，将颗粒溶于TE溶液，然后用乙醇沉淀。用该方法，得到了约300μg的质粒DNA pHGT1。
用上述的Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems生产的)，将由此纯化的质粒DNA用于上述的373A DNA测序仪(Applied Biosystems生产的)以确定从cDNA核苷酸序列预测的蛋白质-编码区周围的核苷酸序列。在序列表中列出了由此确定的核苷酸序列和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。在这种情况下，用实施例22中用于cDNA核苷酸序列分析的寡核苷酸以及以经其序列反应分析得到的内序列为基础设计的合成寡核苷酸作为核苷酸序列确定中的引物。
结果，发现由质粒克隆pHGT1携带的染色体DNA含有从SEQ IDNO6推测的氨基酸序列的完整编码区，而且编码区的核苷酸序列与SEQ ID NO6的完全一致。另外，相当于氨基酸-编码外显子的区域从5′侧开始计数，含有4个长度为231bp，286bp，1932bp和236bp的内含子(图11)。还有核苷酸序列在3个位置上不同于SEQ ID NO7的cDNA核苷酸序列，所述的3个位置与实施例22中描述的位置相同(SEQ ID NO6和7之间的不同位置)。即SEQ IDNO7中的A(位置84)，A(位置740)和G(位置1198)在SEQID NO8中分别是C，T和A。因此，揭示出实施例21中得到的人TPO cDNA克隆pHTF1的核苷酸序列在3个位置上不同于人染色体DNA克隆pHGT1的核苷酸序列。因此，为了分析cDNA克隆pHTF1序列中的这些突变是否反映染色体DNA序列，确定经筛选而单独得到的5个染色体克隆中其它4个克隆的核苷酸序列。用根据MolecularCloning中描述的平板溶菌产物法而制备的噬菌体DNA样品，经直接的核苷酸序列测定法进行序列分析。用实施例22中所用的序列引物(在可以分析核苷酸序列中前述3个突变位置那部分的序列之基础上合成的)，经前述的373A DNA测序仪(由Applied Biosystems制造)和前述的Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(由Applied Biosystems制造)完成每个克隆的测序。发现所有4个克隆的核苷酸序列均与SEQ ID NO6的相同。在这4个克隆中，相当于SEQ ID N07之位置84和740上的核苷酸分别由C和T取代。但在位置1,198，两个克隆中是G，另两个克隆中是A。换句话说，这表明原染色体DNA本来有两种类型的核苷酸序列。目前，还不清楚核苷酸序列中的这种差异是起因于同源染色体或多基因。另外，这说明核苷酸序列中的差异可能是由种族差异而造成的。因为从Clontech购买的poly(A+)RNA是高加索人的，而染色体DNA是日本人的。
本发明人已于1994年3月24日以登记号No.FERM BP-4616将由E.coli菌株DH5携带的载体pHGT1保藏于日本的国家生物科学和人体技术研究所，工业科学和技术代理部，国际贸易和工业部。
<实施例26>
在COS1细胞中表达人TPO染色体DNA并确定TPO的活性由亚克隆得到的质粒克隆pHGT1共含有4个EcoRI识别序列，3个在插入部分，1个在载体中。核苷酸序列分析表明，在一约4.3kb的DNA片段中含有完整人TPO蛋白质的编码区，该片段在最靠近插入片段5′测的EcoRI识别序列和载体中的EcoRI识别序列之间。因此，将该片段与EcoRI处理的表达载体pEF18S相连，并得到4个人TPO表达质粒pEFHGTE#1-4(见图11)。通过制备这些质粒DNA，完成表达实验。基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法纯化质粒DNA，由此得到约250μg的质粒DNA。
按实施例11的方法，用由此得到的克隆pEFHGTE#1-4转染COS1细胞。即，用包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖方法，由10μg质粒DNA完成转染。将转染的COS1细胞在37℃温育3天，然后收集培养物上清液。
对IMDM培养基彻底透析培养物上清液，然后用大鼠CFU-MK检测系统估测。在分别表达4个克隆(pEFHGTE#1-4)的COS1细胞上清液中，检测的TPO活性为剂量依赖方式。相反，在单独表达质粒pEF18S的COS1细胞上清液中没有TPO活性。在图12a中给出了用pEFHGTE#1得到的代表性数据。在M-07e检测系统中得到了相似的结果。分别表达4个克隆(pEFHGTE#1-4)的COS1细胞上清液以剂量依赖方式明显增加M-07e细胞的生长。图12b中列出了用pEFHGTE#1得到的代表性数据。
这些结果说明质粒克隆pEFHGTE#1-4带有功能性的人TPO染色体DNA。
<实施例27>
制备人TPO缺失型DNA并在COS1细胞中表达以及确定TPO活性实施例18中的结果说明，甚至在除去其第三羧基(its carboxylthird)后，人TPO也可以表现出其生物活性。因此，为了进一步估测生物活性部分，而进行缺失衍生物实验。在本实施例中，检测TPO缺失衍生物发挥体外TPO生物活性的能力，所述衍生物缺少了从pHT1-231编码之TPO蛋白质(氨基酸1-231)的羧基末端数20，40，60或68个氨基酸。最短的衍生物(氨基酸1-163)仍包含了相当于实施例2中所述大鼠血浆TPO之TP 2/3的氨基酸序列。用实施例18中得到的质粒克隆pHT1-231的DNA作为模板，合成的寡核苷酸作为引物，经PCR制备缺失质粒。PCR所用的引物之序列如下hTPO-55′-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3′(SEQ ID NO56)(通过将一EcoRI识别序列加到SEQ ID NO4中的位置1到21的序列上而得到的；它与图9中所述的序列相同)；hTPO-S5′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTGGTG GGT-3′(SEQ ID NO57)(相当于SEQ ID NO4中位置555到576之序列的反义引物，其制法是通过加入了两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列，以用于制备编码位置1到163氨基酸残基的缺失衍生物)；hTPO-45′-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGT GTG AGG ACT AGAGAG GTT CTG-3′(SEQ lD NO58)(相当于SEQ ID NO4中位置576到600之序列的反义引物，其制法是通过加入两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列，以用于制备编码位置1到171氨基酸残基的缺失衍生物)；hTPO-305′-TTT GCG GCC GCT CAT TAT CTG GCT GAG GCA GTGAAG TTT GTC-3′(SEQ ID NO59)(相当于SEQ ID NO4中位置636到660之序列的反义引物，通过加入制备缺失衍生物所用的两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列而制备的，所述缺失衍生物编码位置1到191的氨基酸残基)；和hTPO-25′-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGA CCA GGA ATC TTGGCT CTG AAT-3′(SEQ ID NO60)(相当于SEQ ID NO4中位置696到720之序列的反义引物，通过加入制备缺失衍生物所用的两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列而制备的，所述缺失衍生物编码位置1到211的氨基酸残基)。
用1μg实施例18中得到的克隆pHT1-231的质粒DNA作为模板，各10μM由此合成的hTPO-5(用于5′侧)和hTPO-2，-3，-4和-S(用于3′侧)作为引物以及带AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR试剂盒(由Takara Shuzo制造)，用100μl体积，使用GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造的)共重复20个循环，每个循环含于95℃变性1分钟，于65℃退火1分钟以及在72℃合成1分钟，然后再于72℃温育7分钟，从而完成PCR。用限制酶EcoRI和NotI消化由各PCR得到的所需带，然后将所得的消化产物进行1％琼脂糖凝胶(由FMC BioProducts制造的)电泳以分离由各PCR扩增的具有所期望大小的主要DNA片段。用Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad制造的)纯化由此分离的DNA片段，然后将其亚克隆到预先经相同的限制酶处理的表达载体pEF18S中。在这种情况下，用TOYOBO制造的高感受态的E.coli DH5作为宿主菌株。从来自各PCR的所得转化体，筛选4到5个含所需大小之插入片段的克隆以基本上按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Prass，1989)中所述的方法制备质粒DNA样品。在一系列的上述操作中，从下列缺失衍生物得到质粒DNA样品编码位置1到163氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-163#1-5)，编码位置1到171氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-171#1-4)，编码位置1到191氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-191#1-4)和编码位置1到211氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-211#1-4)。对各质粒DNA的全长扩增区进行核苷酸序列分析，发现它与SEQ ID NO4中所示的核苷酸序列有完全的一致性。
按实施例11的方法，用由此得到的克隆转染COS1细胞。即经包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖方法，用各10μg的质粒DNA样品进行转染。将转染的COS1细胞培养3天，然后回收培养物上清液。
对IMDM培养基彻底透析培养物上清液，然后用大鼠CFU-MK检测系统评估。在分别表达pHT1-211，pHT1-191，pHT1-171或pHT1-163的COS1细胞上清液中，检测出TPO活性为剂量依赖方式。用pHT1-211#，pHT1-191#和pHT1-171#2得到的代表性数据列于图13a，而在图13b中列出了由pHT1-163#2得到的数据。在M-07e检测系统中得到了相似的结果。分别表达pHT1-211，pHT1-191，pHT1-171或pHT1-163的COS1细胞上清液，明显提高M-07e细胞的增殖。图14中列出了用pHT1-211#1，pHT1-191#1，pHT1-171#2得到的代表性数据。
这些结果表明即使Ser(第163位)以上的羧基末端那一半缺失人TPO仍能保持其体外活性，而且有力地证明人TPO的生物活性部分位于止于以Ser(位置163)为界的那一半氨基末端内。
<实施例28>
C-末端缺失型人TPO的制备及其在COS1细胞中的表达和活性为了分析对于人TPO蛋白质表现其活性所必需的区域，从实施例27中得到的缺失衍生物进一步缺失C-末端氨基酸，然后检测在COS1细胞中表达的TPO活性。用实施例16中得到的质粒克隆pEF18S-HL34，通过缺失编码从163位Ser开始的C-末端氨基酸残基的核苷酸序列而制备表达质粒。用PCR有效地进行了这些缺失质粒的构建。为PCR所用而制备的引物序列如下hTPO-55′-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACCCCG GCC-3′(SEQ ID NO61)(通过将EcoRI识别序列加到SEQ ID NO4中位置1到21的序列中而制备的；实施例18中列出了相同的序列)；
hTPO-1505′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG AGG GTGGAC CCT CCT ACA AGC AT-3′(SEQ ID NO62)(对应于SEQ ID NO4中位置514到537之序列的反义引物，通过加入制备缺失突变体所用的两个终止密码子TAA和TGA和一个NotI识别序列而制备的，所述缺失突变体编码位置1到150的氨基酸残基)；hTPO-1515′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CAG AGGGTG GAC CCT CCT ACA A-3′(SEQ ID NO63)(对应于SFQ ID NO4中位置518到540之序列的反义引物，通过加入制备缺失衍生物所用的两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列而制备的，所述缺失衍生物编码位置1到151氨基酸残基)；hTPO-1535′-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CTG ACGCAG AGG GTG GAC CC-3′(SEQ ID NO64)(对应于SEQ ID NO4中位置526到546之序列的反义引物，通过加入制备缺失衍生物所用的两个终止密码子TAA和T6A以及一个NotI识别序列而制备的，所述缺失衍生物编码位置1到153氨基酸残基)；hTPO-1545′-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CGC CTGACG CAG AGG GTG GA-3′(SEQ ID NO65)(对应于SEQ ID NO4中位置529到549之序列的反义引物，通过加入制备缺失衍生物所用的两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列而制备的，所述缺失衍生物编码位置1到154氨基酸残基)；hTPO-1555′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GCC CGCCTG ACG CAG AGG GT-3′(SEQ ID NO66)(对应于SEQ ID NO4中位置532到552之序列的反义引物，通过加入制备缺失衍生物所用的两个终止密码子TAA和T6A以及一个NotI识别序列而制备的，所述缺失衍生物编码位置1到155氨基酸残基)；hTPO-1565′-TTT GCG GCC GGT CAT TAT GGG GCCCGC CTG ACG GAG AG-3′(SEQ ID NO67)(对应于SEQ ID NO4中位置535到555之序列的反义引物，通过加入制备缺失衍生物所用的两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列而制备的，所述缺失衍生物编码位置1到156氨基酸残基)；hTPO-1575′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GGT GGGGCC CGC CTG ACG CA-3′(SEQ ID NO68)(对应于SEQ ID NO4中位置538到558之序列的反义引物，通过加入制备缺失衍生物所用的两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列而制备的，所述缺失衍生物编码位置1到157的氨基酸残基)。
用实施例16中得到的1μg克隆pEF18S-HL34的质粒DNA作为模板，用各10μM由此合成的寡核苷酸(hTPO-5用于5′侧，hTPO-150，-151，-153，-154，-155，-156和-157用于3′侧)作为引物完成PCR。用含有AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR试剂盒(由Takara Shuzo制造)，利用GeneAmpTMPCR System9600(由PERKIN-ELMER制造的)共重复20个循环，每循环于95℃变性1分钟，于66℃退火1分钟和在72℃合成1分钟，然后于72℃最终温育7分钟从而在100μl体积中完成PCR反应。用限制酶EcoRI和NotI消化由各PCR得到的所需带，然后使所得的消化产物进行1％琼脂糖凝胶(由FMC BioProducts制造的)电泳以分离由各PCR得到的具有所需大小的主要DNA片段。用Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad制造的)纯化分离的DNA片段，然后将其亚克隆到预先用相同的限制酶处理的表达载体pEF18S中。在这种情况下，用由TOYOBO生产的高感受态E.coli DH5作为宿主菌株。从来自各PCR试验的所得转化体，筛选3到5个含所需大小之插入片段的克隆以便基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述方法制备质粒DNA样品。经一系列所述操作，从下列缺失衍生物中制备质粒DNA编码位置1到150氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-150#21，22和25)，编码位置1到151氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-151#16，17和18)，编码位置1到153氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-153#1到5)，编码位置1到154氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-154#1到5)，编码位置1到155氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-155#1到5)，编码位置1到156氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-156#1到5)以及编码位置1到157氨基酸残基的缺失衍生物(pHT1-157#1到5)。
在这些纯化的质粒DNA样品中，通过利用Taq Dye DeoryTMTerminater Cycle测序盒(Applied Biosystems)用373A DNA测序仪(由Applied Biosystems制造的)检测pHT1-50#21，22和25以及pHT1-151#16，17和18的序列，由此证实在全长核苷酸序列中，预期的TPO cDNA序列没有取代。
按实施例11的方法，分别用所得的克隆转染COS1细胞。即通过包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖方法，用各10μg的质粒DNA样品完成转染，培养3天后回收培养物上清液。用前面所述的IMDM培养并透析所得的培养物上清液，然后用M-07e检测系统评估。在用编码C-末端缺失衍生物之相应克隆转染的COS1细胞培养物上清液中检测TPO活性，所述缺失衍生物分别由1到151位氨基酸，1到153位氨基酸，1到154位氨基酸，1到155位氨基酸，1到156位氨基酸或1到157位氨基酸组成。所有这些衍生物在位置151均含有Cys残基。但在用编码由1-150位氨基酸组成的C-末端测缺失衍生物之克隆转染的COS1细胞培养物上清液中未检测到TPO活性，该衍生物151位上的Cys残基也被缺失了。
<实施例29>
N-末端缺失型人TPO的制备及其在COS1细胞中的表达和活性为了分析TPO蛋白质表现其活性所必需的区域，进一步缺失实施例28中得到的缺失衍生物的N-末端氨基酸，然后检测所得缺失衍生物之TPO活性的表达。用实施例16中得到的质粒克隆pEF18S-HL34和实施例27中得到的质粒克隆pHT1-163，通过缺失编码信号序列后之N-末端氨基酸残基的核苷酸序列制备表达质粒。用PCR有效地进行这些缺失质粒的构建。为在PCR中应用所制备的引物序列如下hTPO-55′-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACCCCG GCC-3′(SEQ ID NO69)(通过将EcoRI识别序列加到SEQ ID NO4中位置1到21的序列中而制得；实施例18中所列的相同序列)；hTPO35′-TTT GCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATCCTG TTC AGG TAT CC-3′(SEQ ID NO70)(对应于SFQ ID NO4中位置757到780之序列的反义引物，通过加入两个终止密码子TAA和TGA以及一个NotI识别序列而制备的；合成的相同序列用于制备编码位置1到231氨基酸残基的缺失衍生物)；
hTPO-S5′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACAGCT GTG GTG GGT-3′(SEQ ID NO71)(对应于SEQ ID NO4中位置555到576之序列的反义引物；用于制备编码位置1到163氨基酸残基的缺失衍生物)；hTPO-135′-AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CATGTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TG-3′(SEQ ID NO72)(SEQ ID NO4中的位置124到173；用于制备缺失位置1到12之氨基酸残基的衍生物)；hTPO-13R5′-CAT GGG AGT CAC GAA GCA GTT TACTGG ACA GCG TTA GCC TTG CAG TTA G-3′(SEQ ID NO73)(对应于SEQ ID NO4中位置64到87和124到148之序列的反义引物，用于制备缺失了位置1到12之氨基酸残基的衍生物)；hTPO-75′-TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAACTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT C-3′(SEQ ID NO74)(SEQ ID NO4中的位置106到154，用于制备缺失位置1到6之氨基酸残基的衍生物)；hTPO-7R5′-TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC ACAGGA CAG CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3′(SEQ ID NO75)(对应于SEQ ID NO4中位置64到87和106到129之序列的反义引物，用于制备缺失了位置1到6之氨基酸的衍生物)；hTPO-85′-GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTGCTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC A-3′(SEQ ID NO76)(SEQ ID NO4中的位置109到157；用于制备缺失了位置1到7之氨基酸残基的衍生物)；和
hTPO-8R5′-CAG TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTCGGA CAG CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3′(SEQ ID NO77)(对应于SEQ ID NO4中位置64到87和109到132之序列的反义引物；用于制备缺失了位置1到7之氨基酸残基的衍生物)。(1)制备缺失了位置1到12之氨基酸残基的衍生物(pHT13-231)用实施例18中得到的1.4μg克隆pEF18S-HL34的质粒DNA作为模板及各5μM由此合成的寡核苷酸(在一个组合中有hTPO-13和hTPO-3，在另-结合中有hTPO-5和hTPO-13R)作为引物进行PCR。用含有AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造的)的GeneAmpTMPCR试剂盒，GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)，于95℃变性5分钟后，共重复30个循环，每个循环包括于95℃变性1分钟，65℃退火1分钟和在72℃合成1分钟，最后72℃再温育7分钟，从而在100μl体积中完成PCR反应。使各PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶(由FMC BioProducts生产)上电泳以分离随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad制造)纯化的具有预期大小的主要DNA片段，然后溶于15μl TE缓冲液中。此后，用各1μl的所得溶液为模板完成第二个PCR。
用各5μM的合成引物(hTPO-5和hTPO3)完成第二个PCR。用含有AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造)的GeneAmpTMPCR试剂盒，GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)，于95℃变性5分钟后，共重复30个循环，每个循环包括在95℃变性1分钟，60℃退火1分钟和72℃合成1分钟，最后72℃再温育7分钟从而在100μl体积中完成PCR反应。将各PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶(由FMC BioProducts制造)电泳以分离随后经Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad制造)纯化的具有预期大小的主要DNA片段，然后溶于15μl TE缓冲液中。用限制酶EcoRI和NotI消化后，用相同体积的酚/氯仿提取所得的溶液，然后进行乙醇沉淀。离心后，将所得的沉淀溶于15μl TE缓冲液中，然后亚克隆到预先用相同的限制酶处理的表达载体pEF18S中。在这种情况下，用TOYOBO制造的高感受态E.coli DH5作为宿主菌株。从所得的转化体，筛选含预期大小之插入片段的45个克隆以便基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的方法，制备质粒DNA样品。用这种方法，可以得到编码蛋白质分子的缺失衍生物(pHT13-231)的质粒DNA，在所述蛋白质分子中，已经从位置1到231的原氨基酸残基中缺失了位置1到12的氨基酸残基。用引物hTPO-5和hTPO3对这45个克隆进行PCR，证实在8个克隆中，有具有约预期大小的插入片段。利用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems)用373A DNA测序仪(由Applied Bisystems制造)检测其中3个克隆的序列，由此得到一克隆pHT13-231#3，它含有所设计的TPO cDNA和所期望的在整个核苷酸序列中没有取代等的缺失。(2)制备衍生物(pHT7-163)，其中缺失位置1到6的氨基酸残基由于尽管在上述步骤(1)中，设计第231位氨基酸作为用于制备缺失衍生物的TPO蛋白质的C末端，但发现甚至进一步缺失C末端氨基酸时，仍可表达TPO活性，因此在这种情况下，由第163位氨基酸作为用于制备缺失衍生物的C末端。出于相同的原因，在随后的步骤(3)中也用163位氨基酸作为C末端。用实施例27中得到的克隆pHT1-163之1.4μg质粒DNA作为模板，各5μM的合成寡核苷酸(hTPO-7和hTPO-S结合，hTPO-5和hTPO-7R结合)作为引物进行PCR。用带有AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造)的GeneAmpTMPCR试剂盒，经GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)在100μl体积中，于95℃变性5分钟后，共重复30个循环，每个循环包括在95℃变性1分钟，65℃退火1分钟并在72℃合成1分钟，然后在72℃最后温育7分钟，从而完成PCR反应。使各PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶(由FMC BioProducts制造)电泳以分离具有所期望大小的主要DNA片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad制造)纯化，然后溶于15μl TE缓冲液中。用各1μl由此制备的溶液作为模板完成第二次PCR。
用各5μM的合成引物(hTPO-5和hTPO-S)进行第二次PCR。用带AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造)的GeneAmpTMPCR试剂盒，经GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)在100μl体积中，于95℃变性5分钟后，共重复30个循环，各循环包括于95℃变性1分钟，60℃退火1分钟和72℃合成1分钟，然后在72℃最后温育7分钟，从而完成PCR反应。使各PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶(由FMC BioProducts制造)电泳以分离具有所期望大小的主要DNA片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad制造)纯化，然后溶于15μl TE缓冲液中。用限制酶EcoRI和NotI消化后，用相同体积的酚/氯仿和随后的乙醇沉淀提取所得的溶液。离心后，将所得的沉淀溶解于15μl TE缓冲液中，然后将其亚克隆至已预先用相同的限制酶消化的表达载体pEF18S中。在此情况下，用高感受态E.coli DH5(由TOYOBO制备)作为宿主菌株。从所得的转化体，筛选30个含所需大小之插入片段的克隆以便基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中描述的方法制备质粒DNA样品。用这种方法，可以得到编码蛋白质分子的缺失衍生物(pHT7-163)的质粒DNA，在所述蛋白质分子中，已经从SEQ ID NO4中位置1到163的原氨基酸残基中缺失了1到6位的氨基酸残基。当用引物hTPO-5和hTPO-S，使这些克隆经PCR后，证实在所有克隆中均含有约所预期大小的插入片段。对于这些，通过利用用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems)的373ADNA测序仪(由Applied Biosystems制造)检测其中3个克隆的序列，由此得到2个克隆，pHT7-163#4和#29，两者分别含有所设计的TPO cDNA序列以及在全部核苷酸序列上没有取代等的所期望的缺失。(3)制备其中缺失了1-7位氨基酸残基的衍生物(pHT8-163)按与制备缺失1-6位氨基酸残基之衍生物(pHT7-163)的上述实例基本相同的方法，制备缺失了1-7位氨基酸残基的衍生物(pHT8-163)。用实施例27中得到的克隆pHT1-163的1.4μg质粒DNA作为模板，各5μM的合成寡核苷酸(hTPO-8和hTPO-S结合，hTPO-5和hTPO-8R结合)作为引物进行PCR。用带AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造)的GeneAmpTMPCR试剂盒，经GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)在100μl体积中，于95℃变性5分钟后，共重复30个循环，各循环包括95℃变性1分钟，65℃退火1分钟和72℃合成1分钟，然后在72℃最后温育7分钟，从而完成PCR反应。使各PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶(由FMC BioProducts制造)电泳以分离具有预期大小的主要DNA片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad制造)纯化，然后溶于15μl TE缓冲液中。此后，用1μl各所制得的溶液作模板进行第二次PCR。
用5μM各合成的引物(hTPO-5和hTPO-S)进行第二次PCR。用带AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(TakaraShuzo制造)，利用GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER生产)，在95℃变性5分钟后，重复30个循环，每个循环包括于95℃变性1分钟，于60℃退火1分钟和于72℃合成1分钟，然后在72℃最后温育7分钟，从而完成PCR反应。使各PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶(由FMC BioProducts生产)电泳以分离具有预期大小的主要DNA片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad生产)纯化，然后溶于15μl TE缓冲液中。用限制酶EcoRI和NotI消化后，用相同体积的苯酚/氯仿和随后的乙醇沉淀提取所得的溶液。离心后，将所得沉淀溶于15μl TE缓冲液中，然后将其亚克隆到预先已用相同的限制酶消化的表达载体pEF18S中。在该实例中，用高感受态的E.coli DH5(由TOYOBO制造)作为宿主菌株。从所得的转化体，筛选30个含所预期大小之插入片段的克隆以便基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring HarborLaboratory Press，1989)中描述的方法制备质粒DNA样品。用这种方法，可以得到编码蛋白质分子的缺失衍生物(pHT8-163)的质粒DNA，在所述蛋白质分子中，已经从SEQ ID NO4的1-163位原氨基酸残基中缺失了1-7位的氨基酸残基。用引物hTPO-5和hTPO-S，使这些克隆经PCR后，证实在所有克隆中均含有约预期大小的插入片段。通过使用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems)的373A DNA测序仪(由AppliedBiosystems制造)检测其中3个克隆的序列，由此得到2个克隆，pHT8-163#33和#48，分别含有设计的TPO cDNA序列并在全部核苷酸序列上没有取代等的预期缺失。(4)在COS1细胞中表达缺失衍生物并证实TPO活性按实施例11的方法，分别用由此得到的缺失克隆转染COS1细胞。即用包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖方法，各10μg的质粒DNA样品完成转染，培养3天后，回收培养物上清液。将由此得到的培养物上清液对前述的IMDM培养基彻底透析，然后用M-07e检测系统评估。
结果，在COS1细胞的培养物上清液中检测到弱但明显的TPO活性，所述COS1细胞是用编码由7-163位氨基酸组成的缺失衍生物的克隆转染的。然而，在用编码由8-163位氨基酸或13-231位氨基酸组成之衍生物的克隆转化的COS1细胞培养物上清液中未检测到TPO活性。
<实施例30>
制备全长的人TPO cDNA质粒(pHTP1)构建含有SEQ ID NO6中所假设的ATPO cDNA全部氨基酸编码区的表达载体以用于在哺乳动物细胞中进行表达。
为了制备覆盖全部人TPO cDNA编码区的DNA片段，用下列方法完成PCR。
所用的引物的核苷酸序列如下
hTPO-15′-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3′(SEQID NO78)(SEQ ID NO6中的位置105到125)；SA5′-CAG GTA TCC GGG GAT TTG GTC-3′(SEQ IDNO79)(相对于SEQ ID NO6中位置745-765之序列的反义引物)；和hTPO-P5′-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3′(SEQID NO80)(SEQ ID NO6中的位置503到523)；和hTPO-KO5′-GAG AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCCTGA GAC AGA TT-3′(SEQ ID NO81)(通过将一限制酶NotI识别序列和GAGAGA序列(SEQ ID NO82)加到相对于SEQ ID NO6中位置1066到1086之序列的反义序列中而制备的序列)。
用300ng实施例16中得到的克隆pEF18S-HL34作为模板进行第一次PCR。用各0.5μM的引物hTPO-1和SA以及1单位的Vent RTMDNA聚合酶(由New England BioLabs制造)，完成PCR(共重复30个循环，各循环包括在96℃温育1分钟，在62℃1分钟和在72℃1分钟，然后在72℃最后温育7分钟)反应溶液组分的终浓度如下10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH8.8)，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和200μM dNTP混合物。
将1mg从人正常肝得到的市售poly(A)+RNA制品(由Clontech制备)在70℃加热10分钟，迅速在冰上冷却，然后与10mM DTT，500μM dNTP混合物，25ng随机引物(由Takara Shuzo制备)，10单位RNase抑制剂(由Boehringer-Mannheim制备)和200单位SuperScriptTMII RNase H-(由LIFE TECHNOLOGIES制造)混合，然后在37℃温育1小时以合成cDNA。此后，用1/20体积的合成cDNA的反应溶液作为模板，各2.5μM引物hTPO-P和hTPO-KO以及2.5单位AmpliTaqTMDNA聚合酶(Takara Shuzo制造)进行第二次PCR(共重复30个循环，每个循环包括在96℃温育1分钟，在58℃1分钟和72℃1分钟)。
分别使所得的第一次和第二次PCR溶液经1％琼脂糖凝胶电泳以分离各自的含预期大小的相应主要DNA片段，随后用Prep-A-GeneDNA纯化盒(由Bio-Rad纯化)纯化。此后，分别用由此得到的溶液作为模板完成第三次PCR。用1单位的Vent RTMDNA聚合酶(由New England BioLabs制造)进行该反应(在96℃加热2分钟，然后共重复3个循环，每循环包括在96℃温育2分钟和72℃温育2分钟，然后在72℃再温育7分钟)。将所得反应溶液与各1μM的hTPO-1和hTPO-KO混合，在96℃加热2分钟，然后经25个循环的反应，每循环包括在96℃1分钟，62℃1分钟和72℃1分钟的温育，最后在72℃再温育7分钟。用相同体积水饱和的酚-氯仿，然后用相同体积的氯仿提取所得的反应溶液，然后用乙醇沉淀(2.5体积乙醇含0.3M醋酸钠和0.5μ1由Boehriger-Mannheim制造的糖原)处理提取物，以回收DNA。用限制酶BamHI和NotI消化回收的DNA，然后经1％琼脂糖凝胶电泳，用Prep-A-Gene DNA纯化盒(Bio-Rad制造)纯化由此分离的具有预期大小的主带，与预先已经限制酶BamHI和NotI消化的pBluescript II SK+载体(由Stratagene制造)相连，然后转化到高感受态的E.coli DH5(由TOYOBO制造)中。从所得的克隆中筛选4个克隆以制备质粒DNA样品。通过利用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems)的373A DNA测序仪(由Applied Biosystems制造)检测纯化的质粒DNA样品的序列，由此得到一个克隆，pBLTP，含有设计的TPO cDNA序列，在BamHI和NotI之间区域内的核苷酸序列中没有取代。
用限制酶EcoRI和BamHI消化克隆pBLTP，用1％琼脂糖凝胶电泳，用Prep-A-Gene DNA纯化盒(由Bio-Rad制造)纯化由此分离的具有高分子量的带。用相同的方法，用限制酶处理pEF18S-HL34以纯化约450bp的DNA片段。将由此得到的各DNA样品相连，然后转化到高感受态的E.coli DH5(由TOYOBO制造)中。从所得的菌落制备质粒DNA样品以得到含有人TPO cDNA插入片段的克隆pBLTEN。用限制酶EcoRI和NotI消化由此得到的pBLTEN，经1％琼脂糖凝胶电泳，用Prep-A-Gene DNA转化盒(由Bio-Rad制造)纯化由此分离的约1,200bp的DNA片段，然后与预先经相同限制酶消化的表达载体pEP18S相连并转化到高感受态的E.coli DH5(由TOYOBO制造)中。从所得克隆制备质粒DNA样品以得到含有完整人TPO cDNA编码区之插入片段pHTP1的克隆。从该克隆大量制备质粒DNA并用于下列实验。基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的方法制备质粒DNA。
<实施例31>
构建哺乳动物表达质粒pDEF202-hTPO-P1以便在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达人TPO用限制酶EcoRI和BamHI消化含有小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)微基因的1mg质粒pMG1，经琼脂糖凝胶电泳以分离含小鼠DHFR微基因的片段(约2.5kb)。将分离的DNA片段溶于25ml由50mM Tris-HCl(pH7.5)，7mM MgCl2，1mM 2-巯基乙醇和0.2mM dNTR混合物组成的反应溶液中，与2单位klenow片段混合，然后在室温温育30分钟以便在DNA片段的两个末端均形成平整末端。酚/氯仿处理和乙醇沉淀后，将所得的片段溶于10ml TE溶液(10mMTris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA)中。用限制酶Smal消化哺乳动物表达载体pEF18S，用碱性磷酸酶(由Takara Shuzo制造)去磷酸化，然后用T4 DNA连接酶(由Takara Shuzo制造)与含小鼠DHFR微基因的DNA片段相连以得到表达载体pDEF202。
接着，用限制酶EcoRI和SpeI消化构建的表达载体pDEF202，然后经琼脂糖凝胶电泳以分离一较大的DNA片段。用T4 DNA连接酶(由Takara Shuzo制造)，将通过用限制酶EcoRI和SpeI消化含人TPO cDNA(克隆P1)的质粒pHTP1而得到的人TPO cDNA与该线性化的pDEF202载体相连以得到用于表达人TPO cDNA的质粒pDEF202-hTPO-P1。所述的构建质粒含有SV40复制原点，人延长因子1-α-启动子，和用于转录人TPO cDNA的SV40早期多腺苷酸化信号，小鼠DHFR微基因，和pUC18-复制原点以及β-内酰胺酶基因(Ampr)。
<实施例32>
在CHO细胞中表达人TPO用一直径6cm的组织培养皿(Falcon)在含10％胎牛血清(FCS)的α-基本必需培养基(α-MEM(-)，由次黄嘌呤和胸苷补充的)中保持CHO细胞(一个DHFR株；Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.77，p4216(1980))。按下述的磷酸钙方法(CellPhect，由Pharmacia制造)用pDEF202-hTPO-P1质粒转化CHO细胞。将实施例31中制备的10mg质粒pDEF202-hTPO-P1与120ml缓冲液A和120ml水混合，然后将所得的混合物在室温温育10分钟。将该溶液再与120ml缓冲液B混合，并在室温下再放30分钟。将该DNA混合物加到培养基中，在CO2保温箱中温育6小时。6小时后，用无血清α-MEM(-)将培养物洗涤两次，用含10％二甲基亚砜的α-MEN(-)处理两分钟，然后在含10％已透析FCS的非选择培养基(用次黄嘌呤和胸苷补充的α-MEM(-))中温育2天。培养2天后，在含10％已透析FCS的选择培养基(α-MER(-))中筛选细胞。为了筛选带DHFR阳性表型的转化细胞，用胰蛋白酶/EDTA溶液处理细胞，然后用选择培养基悬浮。将6cm组织培养皿中的细胞分到5个10cm组织培养皿或12个24孔组织培养皿中，然后在选择培养基中培养。以2天的间隔交换培养基。用CFU-MK试验，M-07e试验或Ba/F3试验检测在带DHFR-阳性表型的CHO细胞之培养基中的人TPO活性。在用25nM氨甲喋呤补充的选择培养基中，进一步筛选将人TPO分泌到培养基中的细胞以便分离生产高数量人TPO的细胞克隆。
在该实例中，通过用pHTP1和pMG1质粒共转染CHO细胞也可以转染CHO细胞。
本申请人已在1995年1月31日以保藏号FERM BP-4988将用质粒pDEF202-hTPO-P1转染的CHO株(CHO-DUKXB11)寄存于日本生物科学和人体技术国立研究所，工业科学和技术司，国际贸易和工业部。
<实施例33>
构建用于X63.6.5.3细胞重组载体BMCGSneo-hTPO-P1用限制酶XhoI和NotI消化1mg哺乳动物表达载体pBMCGSneo，然后经琼脂糖凝胶电泳以分离载体DNA部分。用T4 DNA连接酶将该DNA片段与通过用限制酶XhoI和NotI消化含有人TPO cDNA的质粒pBLTEN而得到的人TPO cDNA(P1克隆)相连以得到所需的表达载体pBMCGSneo-hTPO-P1。该表达质粒含有cytomegalovirus早期启动子、部分兔β球蛋白基因来源的内含子和用于转录人TPO cDNA转录的多腺苷酸化区域、人β球蛋白基因、69％的牛乳头状瘤病毒1基因、胸苷激酶启动子和多腺苷酸区域、磷酸转移酶I基因(新霉素抗性基因)和pBR322复制原点和β-内酰胺酶基因(Ampr)，人TPOcDNA被连在细胞巨化病毒启动子的下游位点。
<实施例34>在X63.6.5.3细胞中表达在含10％胎牛血清的Dulbecco′s基本必需(DME)培养基中培养X63.6.5.3细胞。按下列所述用电穿孔方法由BMCGSneo hTPO质粒转染X63.6.5.3细胞。
将20mg实施例33中得到的质粒BMCGSneo-hTPO-P1加到含107细胞的750μl DME培养基中，然后将混合物放在缺口为4mm的电穿孔样品池中，在4℃放10分钟。然后将样品池放入电穿孔装置(BTX 600，由BTX制造)中以便在380V，25mF和24的条件下完成基因转移。基因转移后，将样品池于4℃再放15分钟，然后用含10％胎牛血清的DME将细胞洗涤一次。将转染的细胞悬于50ml含10％胎牛血清的DME中，分散到96孔组织培养皿中的各孔中，然后在CO2保温箱中培养2天。培养2天后，用含10％胎牛血清和1mg/ml G418(由GIBSCO制造)的DME更换培养基，然后每隔3天换一次培养基。用CFU-MK，M-07e或Ba/F3检验检测转化体培养基中的人TPO活性。用限制稀释克隆将分泌人TPO到培养基中的转化体克隆两次以建立人TPO生产细胞系。
<实施例35>
在COS1细胞中大规模表达人TPO按实施例11中的描述，按包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖方法完成COS1细胞的转染。用胶原蛋白包被的175cm2培养瓶，在含10％(v/v)FCS的IMDM中于37℃在5％CO2保温箱中培养COS1细胞(ATCC CRL1650)直到细胞100％汇合。为了使胶原蛋白包被培养烧瓶，将已用1mM HCl将其浓度调至0.3mg/ml的25ml胶原蛋白溶液(Cellmatrix型1-C，Lwaki制造)25ml加到各175cm2的培养烧瓶中，在室温下放1小时，回收胶原蛋白溶液，然后用20到50mlPBS将由此处理的烧瓶洗涤一次。通过将20ml含250μg/ml DEAE-葡聚糖(Pharmacia制造)的IMDM，60μM氯喹(Sigma制造)和10％(v/v)Nu-Serum(Collaborative制造)与已溶于500μlPBS中的质粒混合，将所得混合物加到一上述175cm2培养烧瓶所含的COS1细胞中(在转染前，用IMDM已将所述细胞洗涤过一次)，然后在5％CO2保温箱中，于37℃将细胞培养3小时从而完成转染。此后，抽吸除去培养物上清液，用IMDM将细胞洗涤一次，与50ml无血清培养基混合，然后在5％CO2保温箱中于37℃培养5天以回收培养物上清液。在一次操作中，使用了175cm2的100-260个培养烧瓶，并回收到5到13升的培养物上清液。通过用补充有5μg/ml胰岛素(Sigma制造)，5μg/ml转铁蛋白(Sigma制造)，10μM单乙醇胺(由Wako Pure Chemical Industries制造)，20nM亚硒酸钠(由Sigma制造)和200μg/ml BSA(无脂肪酸的高纯度牛白蛋白，由Nichirei制造)制备无血清培养基。
<实施例36>
纯化在COS1细胞中表达的人全长TPO(得自表达质粒pHTP1.P1克隆)及其生物活性下面描述在COS1细胞中表达的人全长TPO(得自表达质粒pHTP1)的活性和纯化。为了检测血小板增加的活性，先制备部分纯化的产物，然后再纯化得到高纯度产物。在下列制备步骤中，主要用M-07e检测系统检测TPO活性。在大鼠CFU-MK检测系统中，发现相似的TPO活性。在完成这些检测时，将人血清白蛋白(HSA)分别加到各样品中以达到0.02到0.05％的终浓度。
首先，在5％CO2中，用在1000ml中含0.2g BSA，5mg牛胰岛素，5mg人转铁蛋白，0.02mM单乙醇胺和25nM亚硒酸钠的无血清IMDM培养基中，按Ohashi和Sudo(Hideya Ohashi and TadashiSudo，Biosci.Biotech.Biochem.58(4)，758-759，1994)的方法，将用质粒pHTP1转染的COS1细胞于37℃培养5天，由此得到7升无血清培养物上清液。将蛋白水解酶抑制剂p-APMSF和Pefabloc SC(4(2-氨基乙基)-苯磺酰基氟盐酸(由Merk制造，商品号24839)加到无血清培养物上清液中达到约1mM的终浓度，接着用0.2μm滤器过滤以回收上清液。用一超滤单位(OmegaUltrasette，正常分子量截断为8,000，由Filtron制造；或PLGCPellicon Cassetle，正常分子量截断为10,000，由Millipore制造)将该上清液浓缩约10倍，将723ml的浓缩产物(蛋白质浓度3.38mg/ml；总蛋白质2,445mg；相对活性43,000；总活性105,100,000)与每1000ml 1.6mol的硫酸铵(总288g)混合以得到804ml含终浓度为1.5M硫酸铵的溶液，然后以10ml/分的流速将所得溶液用于Macro-Prep Methyl HIC柱(直径5cm，床高9cm，由Bio-Rad制造，商品号156-0080)，该柱已预先用含1.5M硫酸铵的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.2)平衡过。上样后，用含1.25M硫酸铵的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.2)进行洗脱以得到过柱级分F1(2,384ml蛋白质浓度，0.864mg/ml；总蛋白质2,061mg；相对活性；6,000)。
接着，将洗脱液换成柠檬酸钠，pH5.8，以收集级分F2(1,092ml；蛋白质浓度0.776mg/ml；总蛋白质847mg；相对活性，150,000)。
将由此得到的Macro-Prep Methyl HIC柱的F2(1,081ml)以10ml/分的流速用于SP Sepharose Fast Flow柱(直径3cm，床高10cm，Pharmacia Biotech制造，商品号17-0729-01)，该柱已预先用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.8)平衡过。上样后，用含110mMNaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.6)洗脱以得到F1级分(2,262ml；蛋白质浓度0.270mg/ml；总蛋白质610mg，相对活性30,000)。接着，将洗脱溶液换成含400mM NaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.4)以收集F2级分(856ml；蛋白质浓度，0.189mg/ml；总蛋白质162mg，相对活性300,000)。然后，再将洗脱液换成含1000mM NaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.2)以收集洗脱的F3级分(370ml；蛋白质浓度0.034mg/ml；总蛋白质12.6mg；相对活性150,000)。
将SP Sepharose Fast Flow柱步骤的主要TPO活性级分F2(845ml)与终浓度为约10％的1-丙醇混合，然后以3ml/分的流速用于LA-WGA柱(直径2cm，床高14cm，由Honen制造，商品号WG-007)，该柱已预先用含400mM NaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.4)平衡过。上样后，用含400mM NaCl的20mM柠檬酸钠与1-丙醇(9∶1)的混合物洗脱得到F1级分(64.4ml；蛋白质浓度0.0178mg/ml；总蛋白质1.15mg，相对活性17,220)。接着将洗脱溶液换成含0.4M GlcNAc和10％1-丙醇的20mM柠檬酸钠缓。冲液(pH6.1)以收集F2级分(45ml；蛋白质浓度0.0104mg/ml；总蛋白质0.470mg；相对活性675,000)。
将LA-WGA柱操作的主要TPO活性F2级分(340ml)与终浓度约0.005％的TFA混合，然后经YMC-Pack CN-AP(直径6mm，床高250mm，YMC制造，商品号AP-513))柱层析。即，用0.1％TFA作为展开剂A，含0.05％TFA的1-丙醇作为展开剂B，以0.6ml/分的流速使样品经预先用15％B平衡的YMC-Pack CN-AP柱。上样后，将丙醇浓度从15％B提高到25％B。用25％B到50％B的浓度线性梯度增加经65分钟完成洗脱，同时用聚丙烯试管以每1.5ml(2.5分)收集洗脱液。
将各试管中0.5μl(1/3,000部分)的洗脱物与HSA混合，经超滤浓缩以得到含0.05％HSA的0.25ml IMDM检测培养溶液，以经检测鉴别TPO活性级分。结果，在24到30号试管(丙醇浓度为35.0和42.0％之间)发现强TPO活性(相对活性约为630,000到4,800,000)，收集这些试管作为TPO活性级分FA(13.5ml)。
用0.1％TFA作为展开剂A，含0.05％TFA的1-丙醇作为展开剂B，使由YMC-Pack CN-AP柱得到的FA级分经Capcell Pak CI300A(直径4.6mm，床高150mm，Shiseido制造，商品号CI TYPESG 300A)柱层析。将由YMC-Pack CN-AP柱操作得到的级分FA部分(8.9ml)与0.3ml甘油混合，经离心蒸发浓缩，然后与2.5ml10％的B混合，将所得的溶液以0.4ml/分的流速经预先用20％B平衡过的Capcell Pak CI 300A柱。上样后，先用20％B洗脱5分钟，然后用20％B到40％B的浓度线性梯度增加洗脱50分钟，同时用聚丙烯试管每1ml(2.5分钟)收集洗脱液。
将各试管中的1μl(1/1,000部分)洗脱液与HSA混合，超滤浓缩以得到含0.05％HSA的0.25ml IMDM检测溶液，以通过检测鉴别TPO活性部分。结果，在20到23号试管(丙醇浓度为28.5到32.5％之间)中发现强TPO活性(相对活性约为3,000,000到22,500,000)，收集这些试管作为高活性级分。
<实施例37>
检测在COS1细胞中表达的人TPO的分子量由于加入了糖链，因此推测在COS1细胞中表达的人全长TPO(得自表达质粒pHTP1，F1克隆)的分子量应大于从肽链的大小推测的分子量。结果，第一步，用下列方法，从含有在COS1细胞中表达的人全长TPO(得自表达质粒pHTP1，F1克隆)的培养物上清液制备部分纯化的TPO级分。即，用展开剂A(0.1％三氟乙酸(TFA))和展开剂B(含0.05％TFA的1-丙醇)，将0.3ml的培养物上清液用至预先经25％B平衡的YMC-Pack PROTEIN-RP(直径0.46cm，床高15cm，由YMC制造，商品号A-PRRP-33-46-25)柱，25％的B以0.4ml/分的流速通过柱5分钟，然后用25％B到50％B的线性密度梯度经50分钟完成分离。在丙醇浓度为34.5％到43.5％范围内的洗脱液中发现了TPO活性，经离心蒸发蒸发干燥这些洗脱液以得到部分纯化的样品。
接着，在从以实施例1中所述的非还原条件下完成的SDS-PAGE电泳凝胶中提取蛋白质后，用M-07e检测系统检测TPO活性，或者按将在下文实施例45中所述的Western分析法，以还原-处理的DPCIII标记为基础，测量分子量。结果，发现了TPO活性在约69,000到94,000的宽分子量范围内，由此证实分子量的变化。另外，在用N-聚糖酶(由Genzyme制造，商品号1472-00)消化其N-配糖键型糖链后，以还原-处理的DPCIII标记为基础，测量到TPO的表观分子量为36,000到40,000，大于从肽链的大小推测的约35,000的分子量。因此，也有力地说明存在○-配糖键型糖链。
用相同的方法，发现在COS1细胞中表达的人全长TPO(得自表达质粒pHTP1，P1克隆)的分子量为63,000到83,000。
<实施例38>
人TPO的生物学特征主要用由pHTF1转染之COS1细胞的培养物上清液检测人TPO对人和大鼠生血细胞的影响。
在使用从人脐带血制备的CD34+DR+细胞级分的集落检测中，人TPO明显刺激巨核细胞集落的形成。例如，在用pHT1-231转染之COS1细胞的10％(v/v)培养物上清液存在的条件下，由6,000个CD34+DR+细胞形成11.5个巨核细胞集落。为了检测人TPO对外周血中人巨核细胞祖代细胞的影响，按下列方法从人外周血制备CD34+细胞。从用Ficoll-Paque密度梯度从人外周血得到的白细胞级分中去掉粘附于塑料盘的细胞。随后，通过使用AIS Microselecter SBA(Asahi Medical)进行淘汰从非粘附细胞中去掉SBA(大豆凝集素)阳性细胞。在AIS Microselecter CD34上培养所得的细胞，当转染的COS1细胞的培养物上清液存在的条件下，在液体培养基中培养CD3+细胞时收集吸附的细胞，CD34+细胞，观察到大体积的GpIIb/IIIa+细胞的选择性增殖，在这些GpIIb/IIIa+细胞中还发现倍性增加。这些结果有力地说明人TPO对人巨核细胞谱系的祖代细胞有选择作用，并且刺激其增殖和分化。
在使用对于CFU-MK高度富集的GpIIb/IVa+的集落检测中，人TPO诱导形成明显数量的巨核细胞集落，所述CFU-MK来自大鼠骨髓细胞和在前面的GpIIb/IIIa+细胞步骤得到的成形的非粘附细胞。例如，在20％(v/v)转染之COS1细胞培养物上清液存在的条件下，由1,000个GpIIb/IIIa+细胞形成34.5个巨核细胞集落，由20,000个成形的非粘附细胞形成28.5个巨核细胞集落。另外，尽管成形的非粘附细胞级分含有各种生血祖代细胞而不是CFU-MK，但只有在存在人TPO的情况下才形成巨核细胞集落，这有力地说明人TPO对巨核细胞谱系的祖代细胞有选择作用。在20％(v/v)转染COS1细胞之培养物上清液存在的情况下，将得自大鼠骨髓的GpIIb/IIIa+细胞在液体培养基中培养3到5天后，在培养的第5天清楚地观察到倍性的增加。
<实施例39>
构建用于在E.coli中表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和人TPO(1-174的氨基酸残基)的融合蛋白质(下文称为“GST-TPO(1-174)”)的载体为了有利于在E.coli中表达人TPO，制备编码人TPO并含有E.coli优选密码子的人工基因。该DNA的核苷酸序列在-1位含有用于在E.coli中转译启动的氨基-末端Met密码子(ATG)。制备合成寡核苷酸1到1215′-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAGCCCGGCTCCGCCAGCTTGTGACCTTCGTGTTCTGTCT-3′(SEQ ID NO83)；25′-CAGTTTAGACAGAACACGAAGGTCACAAGCTGGCGGAGCCGGGCTCATTATTTATTACCTCCTTGGRTTTTTT-3′(SEQ ID NO84)；35′-AAACTGCTTCGCGACTCTCACGTGCTGCACTCTCGTCTGTCCCAGTGCCCGGAAGTTCACCCGCTGCCG-3′(SEQ ID NO85)；45′-CGGGGTCGGCAGCGGGTGAACTTCCGGGCACTGGGACAGACGAGAGTGCAGCACGTGAGAGTCGCGAAG-3′(SEQ ID NO86)；55′-ACCCCGGTTCTGCTTCCGGCTGTCGACTTCTCCCTGGGTGAATGGAAAACCCAGATGGAAGAGACCAAA-3′(SEQ ID NO87)；65′-CTGAGCTTTGGTCTCTTCCATCTGGGTTTTCCATTCACCCAGGGAGAAGTCGACAGCCGGAAGCAGAAC-3′(SEQ ID NO88)；75′-GCTCAGGACATCCTGGGTGCAGTAACTCTGCTTCTGGAAGGCGTTATGGCTGCACGTGGCCAGCTTGGC-3′(SEQ ID NO89)；85′-GGTCGGGCCAAGCTGGCCACGTGCAGCCATAACGCCTTCCAGAAGCAGAGTTACTGCACCCAGGATGTC-3′(SEQ ID NO90)；95′-CCGACCTGCCTGTCTTCCCTGCTTGGCCAGCTGTCTGGCCAGGTTCGTCTGCTGCTCGGCGCTCTGCAG-3′(SEQ ID NO91)；105′-CAGAGACTGCAGAGCGCCGAGCAGACGAACCTGGCCAGACAGCTGGCCAAGCAGGGAAGACAGGCA-3′(SEQ ID NO92)；115′-TCTCTGCTTGGCACCCAGCTGCCGCCACAGGGCCGTACCACTGCTCACAAGGATCCGAACGCTATCTTCC-3′(SEQ ID NO93)；and125′-AAGACAGGAAGATAGCGTTCGGATCCTTGTGAGCAGTGGTACGGCCCTGTGGCGGCAGCTGGGTGCCAAG-3′(SEQ ID NO94)然后在由1mM ATP、10mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁和50mM乙酸钾组成的溶液中，用T4激酶(由Pharmacia制造)分别将2-11的合成寡核苷酸磷酸化。为了将这些合成的寡核苷酸制成6个双链DNA片段，将这些合成寡核苷酸以1和2，3和4，5和6，7和8，9和10，及11和12结合，在由10mM Tris/HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和50mM NaCl组成的溶液中使各组结合退火。接着，用T4连接酶(Life Technology制造)分别处理1和2，3和4及5和6的3个双链DNA片段，以及7和8，9和10，11和12的另3个双链DNA片段，用相同的方法用T4连接酶再处理这2种反应溶液。用BamHI(由Boehringer-Mannheim制造)消化经连接反应得到的DNA片段，然后经2％琼脂糖凝胶电泳以回收约390到400bp的片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化，然后亚克隆到预先经XbaI和BamHI消化的pUC18中(用E.coli DH5α作宿主)。从这些所得克隆中，用核苷酸序列分析筛选出具有编码人TPO并含有下列E.coli优选密码子之人工基因的克隆，并命名为pUC18(XB)(1-123)。在序列表(SEQ ID NO9)中列出了编码链的DNA序列。
10 1 20 30 40 50 60CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT GTGACCTTCGTTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA CTCGGGCCGA GGCGGTCGAA CACTGGAAGCXbaI 270 80390100110120TGTTCTGTCT AAACTGCTTC GCGACTCTCA CGTGCTGCAC TCTCGTCTGT CCCAGTGCCCACAAGACAGA TTTGACGAAG CGCTGAGAGT GCACGACGTG AGAGCAGACA GGGTCACGGG4130140150 5 160170180GGAAGTTCAC CCGCTGCCGA CCCCGGTTCT GCTTCCGGCT GTCGACTTCT CCCTGGGTGACCTTCAAGTG GGCGACGGCT GGGGCCAAGA CGAAGGCCGA CAGCTGAAGA GGGACCCACT6190200210220 7 230240ATGGAAAACC CAGATGGAAG AGACCAAAGC TCAGGACATC CTGGGTGCAG TAACTCTGCTTACCTTTTGG GTCTACCTTC TCTGGTTTCG AGTCCTGTAG GACCCACGTC ATTGAGACGA8250260270280290 9 300TCTGGAAGGC GTTATGGCTG CACGTGGCCA GCTTGGCCCG ACCTGCCTGT CTTCCCTGCTAGACCTTCCG CAATACCGAC GTGCACCGGT CGAACCGGGC TGGACGGACA GAAGGGACGA10
310320330340350360TGGCCAGCTG TCTGGCCAGG TTCGTCTGCT GCTCGGCGCT CTGCAGTCTC TGCTTGGCACACCGGTCGAC AGACCGGTCC AAGCAGACGA CGAGCCGCGA GACGTCAGAG ACGAACCGTG11 370380390400410420CCAGCTGCCG CCACAGGGCC GTACCACTGC TCACAAGGAT CCGAACGCTA TCTTCCGGTCGACGGC GGTGTCCCGG CATGGTGACG AGTGTTCGTA GGCTTGCGAT AGAAGGACAG AA12 BamHI用oligo dT引物，从1μg人正常肝来源的poly(A)+RNA合成单链cDNA，然后用0.1体积的cDNA合成反应溶液为模板进行PCR。用hTPO-C和hTPO-Z(EcoRI)作为引物，在100μl体积中进行PCR反应(在96℃温育2分钟，共重复30个循环，每个循环包括在95℃温育1分钟，58℃1分钟和72℃1分钟，在72℃最后再温育7分钟)。用BamHI和EcoRI消化用这种方法得到的人TPO cDNA片段，然后经2％琼脂糖凝胶电泳以回收约600bp的片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化，然后亚克隆到预先用EcoRI和BamHI消化的pUC18中(E.coli DH5α为宿主)。经核苷酸序列分析筛选出编码正确的人TP0核苷酸序列的克隆，并称为pUC18(BE)(124-332)。在PCR反应中所用的引物的寡核苷酸序列如下hTPO-C5′-GGA GGA GAC CAA GGC ACA GGA-3′(SEQ ID NO95)(pHTF1克隆的位置329到349)；和hTPO-Z(EcoRI)5′-CCG GAA TTC TTA CCC TTC CTG AGACAG ATT-3′(SEQ ID NO96)(通过将一EcoRI识别序列加到相当于pHTF1克隆1,143到1,163位的反义引物中而制备的)。
用BamHI和EcoRI消化克隆pUC18(BE)(124-332)，然后经2％琼脂糖凝胶电泳以回收约600bp的人TPO cDNA的C-末端侧片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化，然后亚克隆到预先用EcoRI和BamHI消化的pUC18(XB)(1-123)中(用E.coli DH5α作为宿主)。用该方法得到的克隆称为pUC18(XE)(1-332)。
由于通过制备并表达各种人TPO cDNA的C-末端缺失构建体以测量体外人TPO活性的实施例已经证实，在1到163位氨基酸残基的人TPO肽片段中存在人TPO活性，因此构建含该肽片段的表达载体。在该实例中，表达编码GST-TPO(1-174)的DNA序列。
由于限制酶SacI识别对应于pHTF1克隆之681-686位(173和174位的氨基酸残基)的核苷酸序列，利用该限制酶的识别位点用两个合成寡核苷酸导入2个末端密码子。即，在由10mM Tris/HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和50mM NaCl组成的溶液中，利用DNA连接盒(Takara Shuzo制造)，将两个合成的寡核苷酸SSE1和SSE2退火，将由此得到的双链DNA片段导入经SacI和EcoRI消化已从中除去了约480bp人TPO cDNA C-末端片段的pUC18(XE)(1-332)中，由此得到克隆pUC18(XS)(1-174)(用E.coli DH5α作为宿主)。本文所用的合成寡核苷酸的序列如下SSE1 CTAATGAG(SEQ ID NO97)；SSE2 AATTCTCATTAGAGCT(SEQ ID NO98)；SacI SSE1 EcoRI5′-CTAATGAG-3′(SEQ ID NO99)3′-TCGAGATTACTCTTAA-5′(SEQ ID NO100)SSE2用XbaI和EcoRI消化上述得到的克隆pUC18(XS)(1-174)，然后经2％琼脂糖凝胶电泳以回收编码人TPO之1-174位氨基酸残基的约600bp的片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化该片段，然后亚克隆到预先用XbaI和EcoRI消化的pBluescript IISK+(Stratagene制造)(用E.coli DH5α作为宿主)。用该方法得到的克隆称为pBL(XS)(1-174)。用相同的方法，由XbaI和HindIII消化克隆pBL(XS)(1-174)以回收编码人TPO之1-174位氨基酸残基的约550bp片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化所述片段，然后亚克隆到预先用XbaI和HindIII消化的pCFM536(EP-A-136490)中(用E.coli DH5α为宿主)。用该方法所得到的克隆称为pCFM536/hT(1-174)。
为了有效表达GST-TPO(1-174)，利用PGEX-2T(Pharmacia)进行下列实验，pGEX-2T是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白质的表达载体。用pCFM536/hT(1-174)作为模板，以及两个PCR引物GEX1和GEX3进行PCR反应(在96℃温育2分钟，共重复22个循环，每个循环包括在95℃温育1分钟，41℃1分钟和72℃1分钟，最后在72℃温育7分钟)。用NaeI和EcoRI消化用该方法得到的人TPO编码片段，然后经2％琼脂糖凝胶电泳以回收约550bp的片段，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化所述片段，将其克隆到预先用EcoRI和SmaI消化的pGEX-2T中(用E.coli DH5α为宿主)，然后用核苷酸序列分析筛选出编码正确人TPO核苷酸序列的克隆，称为pGEX-2T/hT(1-174)以制备用于表达GST-TPO(1-174)的转化体。在PCR反应中所用之引物的序列如下GEX15′-ATC GCC GGC TCC GCC AGC TTG TGA C-3′(SEQ IDNO101)(通过将NaeI识别序列加到SEQ ID NO10的21到39位而制备的)；和GEX35′-GCC GAA TTC TCA TTA GAG CTC GTT CAG TGT-3′(SEQ ID NO102)(对应于SEQ ID NO10中523-549位之序列的反义引物)。
该表达质粒含有编码接有凝血酶识别肽和人TPO(1-174位氨基酸)的GST蛋白质的DNA序列。在序列表中(SEQ ID NO10)中列出了编码凝血酶识别肽和人TPO(1-174位氨基酸)的DNA序列。
<实施例40>
在E.coli中表达GST-TPO(1-174)用含50μg/ml的氨苄青霉素的60ml LB培养基在振荡器上将实施例39中制备的转化体于37℃培养过夜，将25ml所得的培养液加到含50μg/ml氨苄青霉素的1,000ml LB培养基中，在振荡器上于37℃培养直到在A600的OD达到0.7到0.8。然后，将IPTG加到培养液中达到0.1mM的终浓度，继续再振荡培养3小时以诱导GST-TPO(1-174)的表达。
<实施例41>
纯化在E.coli中表达的GST-TPO(1-174)，并证明其生物活性将5.9克重组菌株的冻细胞悬浮在10ml水中，然后用高压破碎仪破碎，所述菌株生产得自ATPO核苷酸序列-编码克隆pGEX-2T/hT(1-174)的GST-TPO(1-174)。使悬浮液离心，在沉淀部分回收GST-TPO(1-174)，除去大部分污染蛋白质、细胞组分等。接着，将所得的含GST-TPO(1-174)的沉淀部分悬浮在5ml水中，随后边搅拌边向其中加入6ml 1M Tris缓冲液(pH8.5)，120ml10M脲和16ml水。搅拌5分钟溶解内含物后，将所得溶液平均分成4份以完成下列的步骤(1)-(4)。
(1)用20mM Tris缓冲液(pH8.5)将一份样品稀释10倍。向其中加入还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使其分别达到5mM和0.5mM的浓度，然后于4℃过夜培养。将所得的混合物离心以回收作为上清液的GST-TPO(1-174)，用pH为5.5的20mM柠檬酸钠稀释2倍，然后用乙酸将pH调至5.5，将GST-TPO(1-174)溶液加至预先用20mM柠檬酸钠(pH5.5)平衡的SP Sepharose Fast Flow(由Pharmaeia Biotech制造，商品号17-0729-01)阳离子交换柱。用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)洗涤该柱后，用含500mM NaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)洗脱GST-TPO(1-174)。将129ml洗脱液与2.6ml 1M Tris缓冲液(pH8.5)混合，将pH为8.1的所得混合物用于Glutathione Sepharose 4B(由Pharmacia Biotech制造，商品号17-0756-01)柱以吸附GST-TPO(1-174)。用PBS洗涤柱后，用含10mM还原型谷胱甘肽的20mM Tris缓冲液洗脱GST-TPO(1-174)。将所得的洗脱液与37NIH单位的凝血酶混合，在室温放4小时，用PBS稀释10倍，然后用于Glutathione Sepharose4B柱以吸附消化的GST，并回收在非吸附级分中的TPO(1-174)。将回收的非吸附级分用20mM柠檬酸钠缓冲液pH5.5稀释3倍，然后用于预先用相同的缓冲液平衡的SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用溶于相同缓冲液的线性密度梯度的0-500mM MaCl洗脱所需的物质。
(2)存在0.1％多乙氧基醚(polysorbate 80)的条件下完成步骤(1)的所有操作。
(3)用pH值为8.5的20mM Tris缓冲液将一份样品稀释10倍。向其中加入还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使其终浓度分别为5mM和0.5mM，然后在4℃培养过夜。将所得的混合物离心以收集作为上清液的GST-TPO(1-174)，然后用pH值5.5的20mM柠檬酸钠缓冲液稀释2倍，再用乙酸将pH调至5.5。将GST-TPO(1-174)溶液加至预先经20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)平衡的SPSepharose Fast Flow阳离子交换树脂。用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)洗涤树脂后，用含500mM NaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)洗脱GST-TPO(1-174)。用pH8.5的1M Tris缓冲液将洗脱液的pH调至8，与320NIH单位的凝血酶混合以便在凝血酶识别肽接头经裂解除去GST多肽序列，在室温放4小时，用pH5.5的20mM柠檬酸钠缓冲液稀释5倍，然后加至预先经相同缓冲液平衡的SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用在相同缓冲液中线性密度梯度的0-500mN NaCl洗脱所需的物质。
(4)存在0.1％多乙氧基醚的条件下完成步骤(3)的所有操作。
将经SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析在约200-400mM的NaCl密度洗脱的各级分对IMDM培养基彻底透析，然后用大鼠CFU-MK检测系统评估。在还原剂存在的条件下，用SDS-PAGE分析该级分时，检测到对应于分子量为19kd的条带(纯度1-20％)为该级分的一个主要蛋白质带。用SDS-PAGF对该带进行N-末端序列分析并按实施例1中描述的方法经PVDF膜转移后，证实该带含有表达为pGEX-2T/hT(1-174)-衍生的融合蛋白的TPO序列。所得TPO之推测的氨基酸序列为[Gly-1]TPO，给予了凝血酶识别肽接头的序列和接头上凝血酶的已知活性。
<实施例42>
构建用于在E.coli中表达在位置1(Ser-＞Ala)和位置3(Ala-＞Val)有取代的人TPO(1-163位氨基酸)的载体用XbaI和EcoRI消化实施例39中制备的克隆pUC18(XE)(1-332)，经2％琼脂糖凝胶电泳以回收约1000bp的片段，该片段编码人TPO的1-332位氨基酸残基，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化该片段，然后亚克隆到预先经XbaI和EcoRI消化的pBluescriptIISK+(由Stratagene制造)中(用E.coli DH5α为宿主)。用这种方法得到的克隆称为pBL(XE)(1-332)。接着，将克隆pBL(XE)(1-332)从其BamHI识别序列到163位氨基酸(366-489位)的区域换成E.coli的优势密码子。制备下列所示的合成寡核苷酸13-20，然后在含溶液的相同试管中将每对合成寡核苷酸13和14，15和16，以及17和18磷酸化，所述溶液由0.1mM ATP，10mMTris-乙酸，1OmM乙酸镁和50mM乙酸钾组成。再加入1/10体积由100mM Tris/HCl(pH7.5)，100mM MgCl2和500mM NaCl组成的溶液后，在沸水浴中将所得溶液加热3分钟，然后冷却到室温以得到双链DNA片段。接着用DNA连接盒(Takara Shuzo制造)连接所得的3对双链DNA片段13和14，15和16，17和18，用由此连接的产物作为模板，合成的寡核苷酸19和20为引物完成PCR。用BamHI和HindIII消化所得的PCR产物，然后经2％琼脂糖凝胶电泳以便用Prep-A-Gene DNA纯化盒回收约130bp的片段。将所述片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的pBL(XE)(1-332)中(用E.coli DH5作为宿主)。用序列分析从所得的克隆中筛选出含有下列核苷酸序列的克隆，并命名为pBL(XH)(1-163)135′-GATCCGAACGCTATCTTCCTGTCTTTCCAGCACCTGCTGCGT-3′(SEQ ID NO103)；145′-TTTGCCACGCAGCAGGTGCTGGAAAGACAGGAAGATAGCGTTCG-3′(SEQ ID NO104)；155′-GGCAAAGTTCGTTTCCTGATGCTGGTTGGCGGTTCTACCCTG-3′(SEQ ID NO105)；165′-ACGCACAGGGTAGAACCGCCAACCAGCATCAGGAAACGAAC-3′(SEQ ID NO106)；175′-TGCGTTCGTCGGGCGCCGCCAACCACTGCTGTTCCGTCTTAATGAA-3′(SEQ ID NO107)；185′-AGCTTTCATTAAGACGGAACAGCAGTGGTTGGCGGCGCCCGACGA-3′(SEQ ID NO108)；195′-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3′(SEQ ID NO109)；和205′-AGAAGCTTTCATTAAGACGGAACA-3′(SEQ ID NO110).
为了提高人TPO(1-163位)的表达数量并防止蛋白酶水解N-末端，构建用于表达突变型人TPO(1-163位)(下文称为“h6T(1-163)”)的表达载体，所述突变型人TPO在人TPO(1-163位)([Ala1，Val3]TPO(1-163))的位置1(Ser变成Ala)和位置3(Ala变成Val)有取代，同时在-1位编码Lys，在-2位编码Met([Met-2，Lys-1，Ala1，Val3]TPO(1-163))。制备下列4种合成的寡核苷酸，在由1mM ATP，10mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁和50mM乙酸钾组成的溶液中，用T4激酶(Pharmacia制造)将合成的寡核苷酸2-9和3-3磷酸化。为了使这些合成的寡核苷酸形成双链DNA片段，在由10mM Tris/HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和50mM NaCl组成的溶液中将各对单链DNA片段1-9和2-9和3-3和4-3退火。接着用DNA连接盒(Takara Shuzo制造)处理由1-9和2-9和3-3和4-3组成的所得两对双链DNA。将经连接反应得到的DNA片段亚克隆至预先经XbaI和NruI消化的pBL(XH)(1-163)中，用序列分析筛选由下列合成寡核苷酸正确取代的克隆(用E.coli DH5α为宿主)并命名为pBL(XH)h6T(1-163)1-95′-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAAAGCACCTGTACCA-3′(SEQ ID NO111)；2-95′-CAGGTGGTACAGGTGCTTTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT-3′(SEQ ID NO112)；3-35′-CCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAACTGCTGCG-3′(SEQ ID NO113)；4-35′-CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG-3′(SEQ ID NO114)；10 1-9 20 30 40CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCTTTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA CTTTCGTGGAXbaI2-950 60 3-370 80GTACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCGCATGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC4-3(SEQ ID NO115)用XbaI和HindIII消化克隆pBL(XH)(1-163)以回收约500bp的片段。该片段编码突变型人TPO的1-163位氨基酸残基，随后用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化该片段，然后克隆到预先用XhaI和HindIII消化的pCFM536(EP-A-136490)(用预先由pMW1(ATCC No.39933)转化的E.coli JM109作为宿主)。用该方法得到的克隆命名为pCFM536/h6T(1-163)。用含有该表达载体的E.coli菌株作为转化体用于表达突变型人TPO，即h6T(1-163)。该表达质粒含有序列表中所示的DNA序列(SEQ ID NO11)。
<实施例43>
在E.coli中表达h6T(1-163)由其自身在cI857阻遏物基因控制下的λPL启动子控制表达质粒pCFM536的表达。用含50μg/ml的氨苄青霉素和12.5μg/ml四环素的60ml LB培养基，在振荡器上将实施例42中得到的转化体在30℃培养过夜，将所得的25μl培养液加到1000ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在振荡器上于37℃培养直到在A600的OD值达到1.0-1.2。此后，将加热到65℃的约330ml LB培养基加到培养液中以便使培养基的最后温度为42℃，在42℃继续振荡培养3小时以诱导h6T(1-163)的表达。
<实施例44>
纯化在E.coli中表达的h6T(1-163)并证实其生物活性将3.69生产h6T(1-163)的重组菌株的冻细胞悬浮在10ml水中，用高压破碎仪破碎。使悬浮液离心，回收沉淀部分并除去大部分污染蛋白质、细胞组分等。将含h6T(1-163)的所回收的沉淀部分悬浮于7ml水中，边搅拌边加入3ml Tris缓冲液(pH8.5)，然后再加入脲(终浓度，8M)，盐酸胍(终浓度，6M)，N-十二烷基肌氨酸钠(终浓度，2％)。在室温搅拌5-20分钟溶解了内含物后，用pH值为8.5的20mM Tris缓冲液将所得溶液稀释10倍，在4℃培养过夜使蛋白质重折叠。在该实例中，除空气氧化外，用谷胱甘肽和硫酸铜作为添加剂。经离心，将h6T(1-163)回收在上清液中。在存在还原剂的情况下，经SDS-PAGE分析各回收级分时，检测到一对应于分子量18kd的为各级分的主蛋白质带(纯度，30-40％)。用SDS-PAGE对该带进行N-末端序列分析，然后按实施例1中所述的方法用PVDF膜转移，证明该带含有表达为pCMF536/h6T(1-163)-衍生突变型TPO的TPO序列。将各级分对TMDM培养基彻底透析，并用大鼠CFU-MK检测系统评估，在所有级分中均发现剂量依赖形式的TPO活性。
<实施例45>
制备抗-TPO肽抗体并用SDS-PAGE和Western分析检测TPO成功地制备抗-TPO肽抗体使得有可能经免疫学方法检测TPO蛋白质。结果，从确定的TPO氨基酸序列中筛选了3个作为抗原似乎相对有用的区域(见下文)，用各筛选的区域，按Tam(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5409-5413，1988)的方法合成四链多抗原肽(MAP)型肽，然后用100μg的各种所合成的肽免疫2只兔8次以得到相应的抗血清样品。在合成的肽抗原中所含的氨基酸序列(a)大鼠TPO(9-28)(肽RT1区)PRLLNKLLRDSYLLHRRLSQ(SEQ ID NO116)(在从基因确定的氨基酸残基中，24位的R原是S。)(b)大鼠TPO(46-66)(肽RT2区)FSLGEWKTQTEQSKAQDILGA(SEQ ID NO117)(c)大鼠TPO(163-180)(肽RT4区)SRTSQLLTLNKFPNRLLD(SEQ ID NO118)(在从基因确定的氨基酸残基中，178-180位的LLD原是TSG。)接着，在这些抗血清样品中，抗-RT1肽和抗-RT2肽首先经蛋白质A(PROSEP-A；由Bioprocessing Ltd.制造，商品号8427)柱层析以制备IgG级分(分别为2,344mg和1,920mg)，通过其与活性型生物素(NHS-LC-Biotin II；PIERCE制造，商品号21336)偶联而使分别为54mg和32mg的各级分生物素化。将含重组TPO的样品经SDS-PAGE，然后用与实施例中所述相同的方法电印迹在PVDF或硝酸纤维素膜上，用这些生物素化的抗体作为第一抗体，用常规方法完成Western分析。
即，将印迹后的膜用由20mM Tris-HCl和0.5M NaCl(pH7.5)(TBS)组成的溶液洗涤5分钟，用含TBS的0.1％Tween 20(TTBS)洗2次每次5分钟，再用阻断剂(BlockAce；由DainipponPharmaceutical制造，商品号uk-B25)处理60分钟。接着，用含10μg/ml生物素化的抗-TPO肽抗体、0.05％BSA和10％BlockAce的TTBS溶液将膜处理60分钟，然后用TTBS洗涤2次每次5分钟。此后，用通过由含10％BlockAce的TTBS溶液稀释5,000倍的碱性磷酸酶-标记的亲和素(由Leinco Technologies制造，商品号A108)而得到的溶液将膜处理30分钟，再用TTBS洗涤2次各5分钟，用TBS洗5分钟，然后用碱性磷酸酶底物(由Bio-Rad制造，商品号170-6432)显色。在室温下完成上述的Western印迹分析。
结果，它不仅能够识别在COS1细胞中表达的多种重组大鼠TPO蛋白质，而且也识别在COS1细胞和E.coli细胞中表达的各种重组人TPO蛋白质(说明性地，如在COS1细胞中表达的质粒pHTP1-或质粒pHTF1-来源的人TPO，和在E.coli中表达的GST-TPO(1-174)的配糖键-裂解的产物和凝血酶消化的产物以及在E.coli中表达的突变型TPOh6T(1-163)，所有这些均已在实施例中作了描述)。另外，这些结果也使得可能分析各种类型的重组人TPO。
除上述外，也证明了制备抗-人TPO肽抗体的可能性。由这些技术得到的抗体不仅可用于Western分析，而且可通过抗体柱纯化TPO以及常用的以抗体为辅助的免疫学方法。
筛选在SEQ ID NO7中所示的人TPO氨基酸序列中预期具有相对适宜的抗原性的6个区域(见表4)。合成四聚的多抗原肽(MAP)型肽，每个单体分别与不同的区域相对应。用每种肽以100mg/次的剂量免疫2只兔8次。
与此不同，也合成了其中Cys残基已与各肽区之C-末端键合的单体肽。用该肽作为试验抗原以便用酶免疫检测确定抗体滴定度。结果，确定了上述制备的血清其抗体滴定度增加，因此用这些血清作为抗血清。
通过用各抗原肽免疫两只兔子以生产针对该肽的抗血清从而制备抗体。根据不同兔个体，分别将所得的两种抗-HT1肽抗体称为抗-HT1-1肽抗体和抗-HT1-2肽抗体。
下面将举例说明抗-HT1-1肽抗体的纯化。
首先，将已与Cys残基键合的HT1单体肽与12ml Sulfo-Liak偶联凝胶(Pierce，商品号44895)偶联。简而言之，将含抗原的肽溶液与用6体积(相对凝胶体积)的偶联缓冲液(50mM Tris，50mMEDTA-Na pH8.5)平衡的凝胶偶联15分钟。然后温育30分钟后，用3体积(相对于凝胶体积)的偶联缓冲液洗涤凝胶。将含0.05ML-Cys-HCl的偶联缓冲液以1ml/ml凝胶的量加到凝胶中经15分钟以上阻断未反应的基团。温育30分钟后，用8体积(相对于凝胶体积)偶联缓冲液洗涤凝胶。在室温下完成所有的偶联反应。因此，肽以28.3％的偶联率与凝胶共价结合，然后制备含0.8mg肽/ml凝胶的抗原性。
将76.7ml(蛋白含量3620mg)含抗-HT1-1肽抗体的抗血清(已从一只兔中抽出，总量为78.4ml)加至预先经含150mM NaCl和0.05％叠氮化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH8)平衡的抗原柱，然后用相同的缓冲液洗涤以得到105.9ml的流出物级分(蛋白质含量3680mg)。然后用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)洗脱吸附的级分，紧接着用21.1ml 0.1M的碳酸盐缓冲液(pH9.9)中和，然后超滤(用Amicon YM30膜)浓缩以得到在含150mM NaCl和0.05％ NaN3的50mM磷酸盐缓冲液(pH8)中的纯化抗-HT1-1肽抗体。
相似地，制备下列抗体抗-HT1-2肽抗体(60.0mg)；抗-HT2-1肽抗体(18.8mg)；抗-HT2-2肽抗体(8.2mg)；等。用相似的方法也可以制备抗-HT3到-HT6肽抗体。
通过与活化的生物素(Pierce，NHS-LC-Biotin II，商品号21336)偶联使3mg亲和纯化的抗-HT1-1肽抗体，抗-HT1-2肽抗体，抗-HT2-1肽抗体或抗-HT2-2肽抗体生物素化。
将从已将编码表4所列的氨基酸序列的基因导入并使其表达的CHO细胞之培养物上清液中部分纯化的重组人TPO标准物SDS-PAGE后，用Western印迹(在硝酸纤维素滤膜或PVDF上)，发现所有上述纯化的抗体均可识别并检测人TPO。表4在四聚MAP型合成肽抗原中所包括的人TPO氨基酸序列人TPO(氨基酸数8-28)肽HT1区DLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQ(SEQ ID NO119)人TPO(氨基酸数47-62)肽HT2区SLGEWKTQMEETKAQD(SEQ ID NO120)人TPO(氨基酸数108-126)肽HT3区LGTQLPPQGRTTAHKDPNA(SEQ ID NO121)人TPO(氨基酸数172-190)肽HT4区NELPNRTSGLLETNFTASA(SEQ ID NO122)人TPO(氨基酸数262-284)肽HT5区SLPPNLQPGYSPSPTHPPTGQYT(SEQ ID NO123)人TPO(氨基酸数306-332)肽HT6区PSAPTPTPTSPLLNTSYTHSQNLSQEG(SEQ ID NO124)<实施例46>
制备抗-TPO肽抗体柱由于实施例45中得到的抗-大鼠TPO肽抗体能识别大鼠和人TPO分子，因此用下列方法将抗-RT1肽抗体和抗-RT2肽抗体的免疫球蛋白(IgG)级分与化学活化的凝胶支持体相连以制备抗-TPO肽抗体柱。分别从两只兔血清制备用作材料的两种抗体。即，从两只兔制备的抗-RT1肽抗体分别命名为抗-RT1-1肽抗体和抗-RT1-2肽抗体，从另2只兔制备的抗-RT2肽抗体分别命名为抗-RT2-1肽抗体和抗-RT2-2肽抗体。由于分别将这些抗体用于抗体柱的制备，因此共得到5个柱，即2个抗-RT1肽抗体柱(下文称作“抗-RT1-1抗体柱”和“抗-RT1-2抗体柱”)，2个抗-RT2肽抗体柱(下文称为“抗-RT2-1抗体柱”和“抗-RT2-2抗体柱”)和一个通过将抗-RT1-2肽抗体与抗-RT2-1肽抗体混合，然后将混合物与凝胶偶联而制备的抗体柱(抗RT1-2+2-1混合抗体柱)。
将各抗体溶于50mM磷酸钠和0.15M NaCl(pH8.0)的溶液中，达到5mg/ml的终浓度(或者对于抗-RT1+2混合抗体柱来说，抗-RT1-2肽抗体和抗-RT2-1肽抗体各为2.5mg/ml)，将2.31ml所得的溶液与1.54ml的膨胀的甲酰-活化的凝胶(Formyl-Cellulofine，Chisso制造)混合，于4℃进行2小时的偶联反应。向其中加入1.1ml 10mg/ml的还原剂(三甲基胺硼烷(TMAB)溶液，由Seikagaku kogyo制造，商品号680246)溶液，接着再进行6小时的偶联反应，随后离心回收凝胶部分。将10ml纯化水加到凝胶中，再次经离心回收的凝胶部分，将该步骤重复4次以除去未反应的抗体分子。接着，将所得的凝胶与4.6ml阻断溶液(0.2M磷酸钠和1M乙醇胺，pH7.0)和1.1ml还原剂溶液混合，在4℃至少处理2小时以阻断未反应凝胶的活性基团。此后，用纯化水和DPBS洗涤凝胶，用离心机离心，放在小柱形管中，用3M硫氰酸钾溶液，和0.1MGly-HCl(pH2.5)溶液洗涤，用DPBS平衡，然后贮存。
抗-RT1-1抗体柱，抗-RT1-2抗体柱，抗-RT2-1抗体柱，抗-RT2-2抗体柱和抗-RT1-2-2-1混合抗体柱的5种抗-TPO肽抗体凝胶中，相应IgG级分的偶联率分别为97.4％，95.4％，98.4％，98.3％和99.4％。另外，与每凝胶体积偶联的IgG级分的数量分别为5.6mg/ml凝胶，5.8mg/ml凝胶，5.7mg/ml凝胶，5.7mg/ml凝胶和2.9mg/ml凝胶。结果，随抗体的来源和抗原差异，偶联数量和效率并没有明显的变化，用这些抗体柱完成下列实施例47中所示的实验。
<实施例47>
用抗-TPO抗体柱和反相柱层析纯化得自培养物上清液(通过用表达载体pHTP1转染COS1细胞而得到的)的TPO，然后确定其生物活性用M-07e检测系统进行体外检测以评估下列纯化样品。将从实施例35中通过用表达载体pHTP1转染COS1细胞所得培养物上清液得到的TPO部分纯化样品(除主要TPO级分以外的级分，即用20mM柠檬酸钠，pH5.8洗涤Macro-Prep Methyl HIC柱的过柱级分F1和F2以后的级分F3以及SP Sepharose Fast Flow柱的级分F1和F3)混合以制备TPO的亚收集池级分(5,463.79ml；蛋白质浓度，0.490mg/ml；总蛋白质，2,676mg；相对活性12,100；和总活性32,380,000)，然后用超滤装置(Omega Ultraset，正常分子量截断为8,000，由Filtron制造)浓缩，将浓缩级分的溶剂换成DPBS，再用配有YM-10膜的超滤装置(Amicon制造)处理小体积样品以使其成为含0.05％NaN3的120.2ml DPBS溶液。接着，将实施例46中得到的所有5种抗-TPO肽抗体凝胶混合，制成一个抗体柱(直径1.6cm，床高4.8cm，称为抗-RT1+2混合抗体柱)，将TPO至收集池级分以0.033ml/分的流速加至该柱。完成上样后，用DPBS洗脱，收集洗脱液直到UV吸收值非常小，然后用配有YM-10膜的超滤装置(Amicon制造)浓缩由此收集的洗脱液以得到过柱级分F1(82.62ml；蛋白质浓度，14.3mg/ml；总蛋白质1.184mg；相对活性67,500；总活性79,900,000)。接下来，用酸性洗脱液(0.1M Gly-HCl，pH2.5)洗脱柱吸附的F2级分(92.97ml；蛋白质浓度，0.12mg/ml；总蛋白质，11.1mg；相对活性，257,100，总活性，2,860,000)。尽管过柱级分F1仍含有TPO活性，但进一步纯化抗体柱吸附的TPO其相对活性提高了约20倍。即，用0.1％TFA为展开剂A，含0.05％ TFA的1-丙醇为展开剂B，将从抗体柱得到的F2级分与1/10体积的展开剂B混合，将混合物以0.4ml/分的流速用于预先经20％B平衡的Capcell Pak CI 300A柱，从而完成CapcellPak CI 300A(Shiseido制造，商品号CI TYPESG300A，直径4.6mm，床高150mm，与一直径4.6mm，床高35mm的前柱连接)柱层析。完全上样后，用20％B洗脱5分钟，然后再用线性密度梯度20％B到40％B洗脱50分钟，以1ml(2.5分钟)一部分将洗脱液收集在聚丙烯试管中。
将各试管中2μl(级分的1/500)的洗脱液与HSA混合，经超滤浓缩，得到含0.02％HSA的0.25ml IMDM检测培养溶液用于经检测鉴定TPO活性级分。结果，在20到23号试管的样品中(丙醇浓度在28.5-32.5％的范围内)发现了强TPO活性。另外，按实施例45中所述的方法经Western印迹分析这些样品后，确定存在TPO，以DPCIII分子量标记为基础，在还原条件下检测后，其表观分子量为60,000-70,000，同时还存在分子量分别为32,000-43,000和20,000-30,000的其它分子。
<实施例48>
确定TPO的生物活性，所述TPO得自通过用表达载体pHTP1转染COS1细胞而得到的培养物上清液，并经Capcell Pak CI 300A柱纯化收集实施例36中纯化的TPO活性级分，即Capcell Pak CI 300A柱的20-23号试管(丙醇浓度在28.5％和32.5％的范围内)，与0.21ml甘油混合，然后经离心蒸发浓缩。将所得浓缩物与0.21ml6M的盐酸胍溶液混合，用DPBS稀释到1ml，用Sephadex G25柱(NAP-10，由Pharmacia Biotech制造，商品号17-0854-01)，用含0.01％HSA的DPBS进行缓冲液交换，然后与含0.01％FHSA的1.1ml DPBS，最后得到TPO活性级分FA(2.6ml)。为了检测该样品的TPO生物活性，而进行体内检测。即，将该活性级分经皮下施用于ICR雄性小鼠(8周龄)，每组包括4只动物，每天每只动物100μl的剂量共5天(经M-07e检测系统测量的总活性为110,000)。作为对照，用相同的方法皮下施用含0.01％HSA的100μl DPBS。施用前和最后施用的第二天，从眼底收集血液以便用微细胞计数器(F800，Toa Lyo Denshi制造)测量血小板计数。在TPO处理组中，与施用前相比，施用完后，血小板计数平均增加了约1.42倍，比对照组高1.23倍，它们之间有显著性差异(p＜0.05，Studeut t-检验)。在这些结果的基础上，证实由哺乳动物细胞生产的前述人TPO具有体内提高血小板计数的能力。
<实施例49>
确定粗TPO级分的生物活性，所述TPO级分得自通过用表达载体pHTP1转染COS1细胞而得到的33升培养物上清液，并由阳离子交换柱部分纯化(1)用M-07e检测系统进行体外检测以评估下列纯化样品。用与实施例36中所述相同的方法，由表达载体pHTP1转染COS1细胞而得到33升无血清培养物上清液，然后通过一0.22μm滤器过滤以回收上清液。用一超滤装置(PLGC pellicon Cassette，正常分子量截断为10,000，由Millipore制造)将其浓缩10倍，然后与1mM终浓度的蛋白酶抑制剂p-APMSF混合以得到2,018ml的样品(蛋白质浓度3.22mg/ml；总蛋白质6,502mg，相对活性66,000；总活性，429，100,000)。接着再用超滤装置(Omega Ultraset，正常分子量截断为30,000，由Filtron制造)浓缩，得到分子量为30,000或30,000以上的级分(体积，1,190ml；蛋白质浓度，2.54mg/ml；总蛋白质3,020mg，相对活性82,500；总活性，249,000,000)和分子量为30,000或30,000以下的级分(体积2,947ml；蛋白质浓度0.471mg/ml；总蛋白质1,402mg；相对活性，4,500，总活性6,310,000)。在分子量为30,000或低于30,000级分中，存在TPO活性，说明培养物上清液可能含有在其从动物细胞中表达或分泌的过程中。已降低了其分子量的TPO。另一方面，用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.1)交换分子量30,000或高于30,000级分的缓冲液，并以5ml/分的流速加至预先经20mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.1)平衡的SP Sepharose Fast Flow(直径2.6cm，床高29cm，由PharmaciaBiotech制造，商品号17-0729-01)柱。上样完毕后，用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.1)对该柱进行洗涤和洗脱。接着，用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.1)作为展开剂A和由展开剂A和1M NaCl组成的溶液作为展开剂B，以3ml/分的流速，用线性梯度0％B-50％B洗脱215分钟，再由50％B-100％B洗脱20分钟，用聚丙烯试管以每30ml(10分钟)收集一次洗脱液。用M-07e检测系统检测各洗脱液以确定活性分布时，发现在很宽的范围内均能发现TPO活性。结果，收集用浓度为50mN或更低的NaCl洗脱的包括过柱级分的级分作为F1级分，用50-1,000mM NaCl洗脱的主要TP0级分为F2级分。F1级分的体积为1,951ml(蛋白质浓度，2.05mg/ml；总蛋白质，3,994mg，相对活性，13,500；总活性53,900,000)，F2为649.8ml(蛋白质浓度1.11mg/ml；总蛋白质721mg；相对活性268,000；总活性，193,000,000)。
(2)确定SP Sepharose Fast Flow级分F2的生物活性通过Sephadex G25柱(NAP-25，Pharmacia Biotech制造，商品号17-0852-01)，用含0.01％HSA的3.5ml DPBS缓冲交换上述步骤(1)中分离的2.5mlSP Sepharose Fast Flow级分F2，用体内检测确定该样品(蛋白质浓度，1.46mg/ml)的TPO生物活性。即，将活性级分皮下施用给ICR雄性小鼠(8周龄)，每组包括4只动物，每只动物每天100μl共5天(由M-07e检测系统测量的总活性为123,000)。作为对照，将含0.01％HSA的100μl DPBS以相同的方法经皮下施用。在施用前和施用后的第二天，从眼底收集血液以便用微细胞计数器(F800，由Toa Lyo Deushi制造)测量血小板计数。在施用TPO的组中，施用完毕后与施用前的值相比，血小板计数平均增加约1.29倍，而且比对照组高1.12倍，它们之间有显著性差异(p＜0.05，Student t-检验)。这些结果说明，由哺乳动物生产的前述人TPO有提高血小板计数的能力。
<实施例50>
构建用于在CHO细胞中表达人TPO染色体DNA的重组载体，pDEF202-ghTPO用限制酶KpnI和SpeI消化载体pDEF202，然后经琼脂糖凝胶电泳以分离含小鼠DHFR小基因和SV40多腺苷酸化信号的片段，然后用T4 DNA连接酶(由Takara Shuzo制造)连接得到表达载体pDEF202-ghTPO，由此得到的片段含有通过用限制酶KpnI和SpeI处理从质粒pEFHGTE中除去含SV40多腺苷酸化信号的区域而得到的载体DNA。该质粒含有SV40复制原点、人伸长因子1-α启动子，用于转录人TPO基因的SV40早期多腺苷酸化区域、小鼠DHFR小基因、pUC18复制原点和β-内酰胺酶基因(Ampr)，而且人TPO染色体DNA连在人伸长因子1-α启动子的下游位点。
<实施例51>
在CHO细胞中表达人TPO染色体DNA用一直径6cm的平板(Falcon制造)在含10％胎牛血清的α-基本必需培养基(α-MEM(-)，用胸苷和次黄嘌呤补充)在培养CHO细胞(-种dhfr-菌株；Uvlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.77，p4216，1980)使其生长，然后用磷酸钙方法(Cellphect，Pharmacia制造)转染所得的细胞。
即，将实施例50中制备的10μg质粒pDEF202-ghTPO与120μl缓冲液A和120μl H2O混合，然后于室温将所得的混合物温育10分钟。再将该溶液与120μl缓冲液B混合，于室温再温育30分钟。将所制备的DNA溶液放在平板中，在CO2保温箱中培养6小时。除去培养基并用α-MEM(-)将所得平板洗涤2次后，将含10％二甲基亚砜的α-MEM(-)加到平板中，在室温处理2分钟。接着，加入含10％已透析胎牛血清的非选择培养基(α-MEM(-)op.cit.，用次黄嘌呤和胸苷补充)，然后培养2天，用含10％已透析胎牛血清的选择培养基(α-MEM(-)，无次黄嘌呤和胸苷)完成选择。用胰蛋白酶处理细胞，并将在一个直径6cm平板中处理的细胞分散到5个直径1Ocm的平板或20个24孔平板中，将细胞继续培养，同时每2天换一次选择培养基，从而完成选择。用Ba/F3检测测量人TPO活性时，在观察到细胞增殖的平板或孔中上清液中，有人TPO活性。
在此例中，也可以用pEFHGTE和pMG1共转染CHO进行CHO细胞的转染。
<实施例52>
构建用于在E.coli中表达人TPO蛋白质(1-163位氨基酸残基)(下文称为“hMKT(1-163)”)的载体并确定其表达，在所述TPO蛋白质中，在-1和-2位分别加入Lys残基和Met残基为了表达其1-和3-位氨基酸残基与人TPO蛋白质(1-163位氨基酸残基)同一位置的氨基酸残基相同的蛋白质，用下列合成的寡核苷酸1-13，2-13，3-3和4-3，按与实施例42中所述相同的方法，构建用于在E.coli中表达hMKT(1-163)的载体pCFM536/hMKT(1-163)，也称[Met-2，Lys-1]TPO(1-163)1-135′-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAAATCTCCTGCACCA-3′(SEQ ID NO125)；2-135′-CAGGTGGTGCAGGAGATTTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT-3′(SEQ ID NO126)；3-35′-CCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAACTGCTGCG-3′(SEQ ID NO127)；4-35′-CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG-3(SEQ ID NO128)；101-13 20 30 40CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCTTTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA CTTTAGAGGAXbaI 2-1350 60 3-3 70 80GCACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCGCGTGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC4-3(SEQ ID NO129)该表达质粒含有序列表中所示的DNA序列(SEQ ID NO12)。此后，用与实施例43中所述相同的方法诱导hMKT(1-163)的表达。
使由此得到的表达蛋白质经SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上，再通过N-末端氨基酸序列分析，证实该蛋白质含有所表达之hMKT(1-163)的氨基酸序列。
<实施例53>
用盐酸胍和谷胱甘肽重折叠得自在E.coli中表达之人TPO的人TPO，h6T(1-163)，然后纯化并确定其生物活性将实施例43中制备的1.2g生产h6T(1-163)之重组株的冻细胞悬于3ml水中，用高压破碎机破碎。将悬浮液离心，回收沉淀部分，除去大部分污染的蛋白质、细胞组分等。将由此回收的含h6T(1-163)的沉淀部分悬浮于终体积为4ml的水中。将1ml 1MTris缓冲液(pH8.5)边搅拌边加到悬浮液中，然后再加入20ml8M盐酸胍，随后在室温搅拌5分钟以溶解内含物。用20mM Tris缓冲液(pH8.5)将所得溶液稀释10倍，将5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽边搅拌边溶于稀释的溶液中，将所得溶液在4℃培养过夜。经过离心，h6T(1-163)回收在上清液中。用YM10超滤膜(由Amicon制造)浓缩所得的160ml上清液，然后用DPBS换缓冲液以得到终体积为3.4ml的级分(蛋白质浓度，2.18mg/ml)。将该级分对IMDM培养基彻底透析并用大鼠CFU-MK检测系统评估后，发现了强TPO活性(相对活性，58,000)。
将上述制备的TPO活性级分进行体内检测。即，将活性级分经皮下施用于ICR雄性小鼠(7周龄)，每组4只动物，每只动物每天170μl连续5天(由大鼠CFU-MK检测系统测量的总活性为22,000)。作为对照，用相同的方法，将170μl DPBS皮下施用于对照组的6只动物。在施用前和施用完的第二天和3天后，从眼底收集血液以便用微细胞计数器(F800，由Toa Lyo Denshi制造)测量血小板计数。在施用TPO的组中，与施用前的值相比，在施用完的第2天，血小板计数平均提高约2.15倍，甚至在施用完3天后，所值为2.13倍，仍保持不变。在施用完的第2天和3天后，TPO-处理组中的血小板计数比对照组高1.73和1.80倍，它们之间有显著性差异(p＜0.001，Student t-检验)。这些结果表明，由E.coli生产并由上述方法制备的人TPO有体内提高血小板计数的能力。
<实施例54>
用N-十二烷酰肌氨酸钠和硫酸铜重折叠在E.coli中表达的人TPO，h6T(1-163)，然后纯化并确定其生物活性将实施例43中制备的0.6g生产h6T(1-163)之重组株的冻细胞悬浮于3ml水中，用高压破碎机破碎，然后离心回收沉淀部分。将沉淀部分悬浮于3.1m1水中后，将0.19ml 1M Tris缓冲液(pH9.2)，11.25μl 1M DTT，38μl 0.5M EDTA和0.38ml 10％脱氧胆酸钠溶液边搅拌边加到悬浮液中，将所得的混合物在室温下搅拌40分钟。然后将其离心以回收沉淀部分并除去大部分的污染蛋白质、细胞组分等。将所得的沉淀悬于4ml水中，离心回收含h6T(1-163)的沉淀部分。将所回收的沉淀悬于3.8ml水中，将0.2ml 1M Tris缓冲液(pH8)和1ml 10％N-十二烷酰肌氨酸钠边搅拌边加到悬浮液中，然后在室温下搅拌20分钟以溶解内含物。将所得溶液与5μl 1％硫酸铜混合，在室温下搅拌过夜(约20小时)。将所得的溶液离心以回收含h6T(1-163)的上清液部分，5ml上清液与5ml水和10ml 20mM Tris缓冲液(pH7.7)混合，然后与2.6g 20-50目Dowex 1-X4氯化物形式离子交换树脂混合，接着搅拌90分钟。用玻璃滤器除去离子交换树脂以回收树脂未吸附的级分，随后将该级分离心以回收上清液。将所得上清液用于预先经20mM Tris缓冲液(pH7.7)平衡的SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用相同的缓冲液由线性梯度0-500mM的NaCl洗脱。将SP SepharoseFast Flow阳离子交换柱层析洗脱的各级分对IMDM培养基彻底透析，并用大鼠CFU-MK检测系统评估，在NaCl浓度为约100mM的洗脱级分发现了强TPO活性(相对活性，19,000,000)。用一超滤装置(Ultra Free CL，正常分子截断为5,000，由Millpore制造，商品号UFC4LCC25)将该级分浓缩1.6倍(2.5ml，蛋白质浓度，25μg/ml)。在存在还原剂的条件下，用SDS-PAGE分析所浓缩的级分时，检测到一相当于TPO的主要带(纯度，70-80％)。
用体内检测法检测用上述方法制备的TPO活性级分。即，将活性部分皮下施用于ICR雄性小鼠(8周龄)，各组包括4只动物，每只动物每天100μl连续5天(由大鼠CFU-MK检测系统测量的总活性为47,500)。作为对照，用相同的方法，将含100mM NaCl的100μl20mM Tris缓冲液(pH7.7)皮下施用。在施用前和施用完的第二天，从眼底收集血液以便用微细胞计数器(F800，由Toa Lyo Denshi制造)测量血小板计数。在施用TPO的组中，与施用前相比，施用完毕后，血小板计数平均增加了约1.73倍，而且比对照组高1.59倍，两者之间有显著性差异(p＜0.01，Student t-检验)。这些结果说明由E.coli生产的并由上述方法制备的人TPO有体内提高血小板计数的能力。
<实施例55>
CHO细胞的大规模培养用下列方法大规模培养通过人TPO表达质粒pDEF202-hTPO-P1转染到实施例32中的CHO细胞中而得到的生产人TPO的CHO细胞系(CHO28-30细胞，25nM MTX抗性)。在含25nM MTX和FCS的DMEM/F-12培养基(GIBCO)中培养并增殖CHO细胞。用胰蛋白酶溶液分离细胞后，将1×107个细胞接种在含200ml相同培养基的旋转瓶(ex Falcon，Falcon 3000)中，然后以1rpm的转速，于37℃培养3天。培养3天后，抽吸除去培养物上清液，然后用100ml PBS漂洗粘附的CHO细胞。将既不合25nM MTX也不含10％FCS的200mlDMEM/F-12培养基(GIBCO)加到瓶中，以1rpm的转速于37℃将细胞培养7天。培养7天后，回收培养物上清液作为起始材料以用于随后的纯化过程。用500个旋转瓶完成上述过程以得到100L的培养物上清液。
<实施例56>
从生产TPO的CHO细胞系中纯化人TPO(1)将约100L实施例55中得到的无血清培养物上清液通过0.22μm的滤器过滤以得到其滤物，然后在超滤装置(PLTK Pelliconcassette，正常分子量截断为30,000，ex Millipore)上浓缩。用纯水取代浓缩物的溶剂后，将蛋白酶抑制剂p-APMSF(Wako PureChemicals)和Pefabloc SC(Merck)以分别为1mM和0.35mM的终浓度加到所得的水溶液中以得到3628ml分子量30,000或大于30,000的级分(蛋白质浓度1.60mg/ml；总蛋白质5805mg；相对活性1,230,000；总活性7,149,000,000)。随后按实施例45中所述，用Western印迹分析该级分。结果，所含TPO蛋白质的分子量在66,000和100,000之间。在更详细的检测中，发现在过柱级分中含有分子量低于上述TPO的TPO种。
用一超滤装置(PLGC Pellicon cassette，正常分子量截断10,000，Millipone)单独浓缩含有分子量不大于30,000之TPO的超滤物，以得到1901ml的低分子量TPO级分(蛋白质浓度0.36mg/ml；总蛋白质684mg；相对活性245,500；总活性167,900,000)。这表明在细胞培养期间产生了低分子量的TPO种。
接着，将764g硫酸铵和144.5ml 0.5M柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)加到3614ml含有分子量为30,000或大于30,000之TPO的级分以得到4089ml含1.41M(终浓度)硫酸钠和17.7mM(终浓度)柠檬酸钠缓冲液的溶液。离心从溶液中除去未溶解的物质，得到澄清的溶液。
将澄清溶液以25ml/分的流速加至预先经含1.2M硫酸铵的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)平衡的Macro-Prep Methyl HIC柱(Bio-Rad，商品号156-0080；直径5cm，床高24.5cm)。上样完毕后，用含1.2M硫酸钠的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)进行洗脱。随后在超滤装置(ex Fitron.Omega Ultrasette，正常分子量截断8,000)上浓缩洗脱的级分以得到过柱级分F1(4455ml；蛋白质浓度0.400mg/ml；总蛋白质1780mg；相对活性1,831,000)。
接着，用20mM柠檬酸钠(pH6.0)作为洗脱缓冲液通过该柱以得到洗脱液，然后用相同的超滤装置(即，Omega Ultrasette，正常分子量截断8,000)浓缩以收集F2级分(1457ml；蛋白质浓度0.969mg/ml；总蛋白质1411mg；相对活性1,715,000)。在F2中，用SDS-PAGE证实存在分子量为66,000到100,000的蛋白质。经Western印迹分析，证明该蛋白质是TPO。
然后，将从Macro-Prep Methyl HIC柱上洗脱的F2以15ml/分的流速加至预先经20mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)平衡的SPSepharose Fast Flow(Pharmaci a Bioteck，商品号17-0729-01；直径5cm，床高12cm)。上样完毕后，用含50mM NaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)进行洗脱。收集洗脱液并命名为F1级分(3,007ml；蛋白质浓度0.226mg/ml；总蛋白质679mg；相对活性88,830)。此后，用含750mM NaCl的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.4)取代洗脱缓冲液以收集洗脱的F2级分(931ml蛋白质浓度0.763mg/ml；总蛋白质710mg；相对活性5,558,000)，然后用超滤装置(Filtron，Omega(Ultrasette，正常分子量截断8,000；和Amicon，YN3膜)浓缩到202ml。
接着，将浓缩的含有TPO活性的F2级分(197ml)以3ml/分的流速加至Sephacryl S-200HR凝胶滤柱(Pharmacia Biotech，商品号17-0584-05；直径7.5cm，床高100cm)。分别收集洗脱体积第1,200-1785ml；1785-2010ml，2010-2280ml和2280-3,000ml以便得到级分F1(585ml；蛋白质浓度1.00mg/ml；总蛋白质589ml，相对活性4,118,000)，F2(225ml，蛋白质浓度0.263mg/ml；总蛋白质59.2mg；相对活性2,509,000)，F3(270ml；蛋白质浓度0.119mg/ml，总蛋白质32.1mg；相对活性2,535,000)和F4(720ml；蛋白质浓度0.0467mg/ml；总蛋白质33.6mg；相对活性1,155,000)。因此，按凝胶过滤确定的，分馏的TPO活性有很宽的分子量范围。将分离的各级分经SDS-PAGE和Western印迹分析后，发现F1主要含有分子量为66,000到1,000,000的TPO分子种类；F2的TPO分子种类的分子量为32,000到60,000，F3中TPO分子种类的分子量为32,000到42,000。而且所有TPO分子具有TPO活性。
基于对分子量为66,000到100,000的TPO分子进行N-末端氨基酸序列分析结果，证实TPO分子具有人TPO基因编码的蛋白质的氨基酸序列。
另外，用由N-聚糖酶(ex Genzyme，商品号1472-00)，神经氨糖酸苷酶(Nakarai-Tesqu，商品号242-29SP)，内-α-N-乙酰半乳糖胺酶(Seikagaku Kogyo，商品号100453)和○-糖苷酶(Boehringer Mannheim Biochemica，商品号1347101)单独或结合组成的糖苷酶，对分子量为66,000-100,000的TPO分子进行酶消化实验，然后进行SDS-PAGF分析。结果，发现，正如从其理论分子量所预期的，TPO的多肽部分的分子量为约36,000，而且是带N-和○-连接的糖链的糖蛋白。
<实施例57>
从生产人TP0的CHO细胞系纯化人TPO(1)将211.4g硫酸铵加到1L用实施例55中的方法得到的CHO细胞的无血清培养物上清液中，然后，使混合物通过0.2μm滤器(ex Gelman Science，商品号12992)。将所得的滤液以15ml/分的流速用于预先经含1.2M硫酸铵的20mM乙酸钠缓冲液(pH5.6)平衡的Macro-Prep Methyl HIC柱(Bi0-Rad，商品号156-0081，直径50mm，床高90mm)。上样完毕后，用含1.2M硫酸铵的450ml20mM乙酸缓冲液(pH5.6)进行洗脱。将洗脱的级分以0.75ml/分的流速用于反相Vydac C4柱(The Separatiohs Group，商品号214BTP54，直径4.6mm，床高250mm)。用含5％乙醇(称为“展开剂A”)的10mM Tris缓冲液(pH6.4)将柱洗涤15分钟，用展开剂A到含94％乙醇的10mM Tris缓冲液(pH6.4)(称为“展开剂B”)的66-分钟线性梯度完成洗脱。在图15中列出了得到的层析谱。作为SDS-PAGE分析的结果，认为是TPO并且对应于加样后滞留时间为68-72分钟的级分的分子(分子量为65,000-100,000)在SDS-PAGE凝胶上是一个单带(见图16)。进一步的Western分析表明所得蛋白质为TPO。
蛋白质样品的N-末端氨基酸分析表明，该蛋白质具有人TPO基因编码之蛋白质的氨基酸序列。
<实施例58>
制备用于在昆虫细胞内表达人TPO的重组病毒用限制酶EcoRI和NotI消化实施例30中制备的质粒pHTP1，然后经1％琼脂糖凝胶电泳以约1200bp的带，随后用Prep-A-GeneDNA纯化盒纯化。然后将纯化的DNA与用相同限制酶预处理的转移载体pVL1393(Invitrogen)相连，然后转化到高感受态E.coli DH5(Toyo Boseki)中。从所得的集落中筛选含有人TPO cDNA之全长编码区的克隆pVL1393/hTPO。按Molecular Cloning(Sambrook etal.，C0ld Spring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法从该克隆制备质粒DNA，然后用BaculoGoldTM转染盒转染到昆虫细胞Sf21(Invitragen)中，将转染的细胞在27℃于Sf-900培养基(Lifetechnology)中培养4天以回收含病毒的上清液。将上清液以1∶109～1∶105稀释，在-35mm(直径)荚(Shale)中，在27℃用1ml稀释的上清液将约7×105Sf21细胞感染1小时。除去上清液后，将在Sf-900培养基中的1％热琼脂糖加到培养中，使其凝固，接着在湿润的空气中于27℃培养6天。检出一个形成的噬菌斑，将病毒从噬菌斑中释放到200μl Sf-900培养基中。用24-孔平板中得到的病毒克隆感染Sf21细胞以使病毒增殖。用酚/氯仿，然后乙醇沉淀处理从单个噬菌斑得到的含病毒液体以回收病毒DNA，然后用其作为模板，用人TPO cDNA的特异性引物完成PCR。在扩增特异性DNA片段的基础上筛选含人TP0 cDNA的重组病毒。然后用含有携带人TPO cDNA之重组病毒的上清液感染Sf21细胞以增殖病毒。
<实施例59>
在Sf21昆虫细胞中表达人TPO并鉴别TPO活性在175cm2培养烧瓶中培养Sf21细胞以达到约80％的融合，接着用实施例58中制备的携带人TPO cDNA的重组病毒于27℃感染1小时，其后将所得细胞在Sf-900培养基中于27℃培养4天以回收培养物上清液。在NApTM-5柱(Pharmacia)上用IMDM培养基取代所得的培养物上清液。在大鼠CFU-MK检测和M-07e检测中，在所得上清液中检测出明显的以剂量依赖形式的TPO活性。用实施例45中描述的Western分析也鉴别了Sf21细胞中表达的重组人TPO。
<实施例60>
通过用N-十二烷酰肌氨酸钠和硫酸铜重折叠得自克隆pCFM536/h6T(1-163)的变异体人TPO，h6T(1-163)并纯化h6T(1-163)，所述克隆携带在E.coli中表达的人TPO碱基序列。
将30g实施例43中制备的生产h6T(1-163)的冻重组微生物悬浮在300ml水中，用高压破碎装置(10,000psi，Rannie HighPressure Laboratory)破碎，然后离心以回收沉淀部分。将沉淀部分悬浮在90ml水中，然后边搅拌边再加水直到达到150ml的总量。随后向混合物中边搅拌边加入9ml 1M Tris缓冲液(pH9.2)、540μl 1M DTT，1.8ml 0.5M EDTA和18ml 10％脱氧胆酸钠，接着在室温下搅拌30分钟。离心回收沉淀部分，并除去大部分污染的蛋白质和微生物组分。向沉淀中加入180ml 5M DTT以得到-悬浮液，然后离心回收含h6T(1-163)的沉淀部分。向所得的沉淀中加入300ml水以得到悬浮液，再向其中边搅拌边加入水以使液体总量为570ml。在室温下将30ml 1M Tris缓冲液(pH8)，150ml 10％N-十二烷酰肌氨酸钠加到混合物中，搅拌20分钟以溶解h6T(1-163)。再向其中加750μl 1％硫酸铜，将混合物在室温下搅拌过夜(约20小时)。离心回收含h6T(1-163)的上清液级分后，向750ml上清液中加入750ml水和1500ml 20mM Tris缓冲液(pH7.7)，接着边搅拌边加入3ml多乙氧基醚(Nikko Chemicals)。将600gDowex 1-X4(20-50目，氯化物形式)离子交换树脂加到所得溶液中，在室温下搅拌90分钟。用玻璃滤器回收非吸附的级分后，用750ml 20mMTris缓冲液(pH7.7)洗涤离子交换树脂。用2N氢氧化钠将未吸附和洗涤级分结合的溶液调至pH9.2，然后用于预先经含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris缓冲液(pH9.2)平衡的Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(ID5cm×10cm)以回收未吸附的级分。用盐酸将所得未吸附级分的pH调至7.2，加至预先经含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris缓冲液(pH7.2)平衡的SPSepharose Fast Flow柱(ID5cm×10cm)，再用相同缓冲液中线性梯度0M到500mM的NaCl洗脱。用SDS-PAGE分析洗脱的级分以收集TPO级分，向其中加入三氟乙酸达到0.1％的浓度。将所得的溶液加至Capcell Pak 5μm 300A C1柱(ID2.1cm×5cm×2，Shiseido)后，用0.1％三氟乙酸中浓度逐渐增加的1-丙醇线性梯度洗脱法完成反相HPLC。在无还原剂的情况下在SDS-PAGE上分析洗脱液。结果，根据在反相HPLC中的洗脱位置分馏出三个级分，用0.1％三氟乙酸将各级分稀释3倍。以相同的方法，将各洗脱的级分加至上述的反相HPLC柱。在没有还原剂的情况下，在SDS-PAGE上分析根据在反相HPLC上的洗脱顺序而命名为Fr.S-a，Fr.S-b和Fr.S-c的所得三个TPO级分(见图17)。结果，在分子量为约18KDa(Fr.S-a)，约19KDa(Fr.S-b)或18KDa(Fr.S-c)检测到一个单一的带(见图18)。经氨基酸分析后，确定的各氨基酸组分几乎与从序列资料估计的相应的理论值相一致。另外，N-末端氨基酸分析的结果表明，它们是所预期的序列。用氨基酸分析确定的各级分的蛋白质数量为0.64mg(Fr.S-a)，1.81mg(Fr.S-b)或3.49mg(Fr.S-c)。对IMDM培养基将各级分完全透析后，进行M-07e检测。结果，各级分的相对活性为约1,620,000(Fr.S-a)，23,500,000(Fr.S-b)或746,000,000(Fr.S-c)。
<实施例61>
用盐酸胍和Cys-胱氨酸重折叠得自克隆pCFM536/h6T的人TPO，h6T(1-163)并纯化h6T(1-163)，所述克隆携带在E.coli中表达的人TPO碱基序列将50g实施例43中制备的生产h6T(1-163)的冻重组微生物加到500ml水中并悬浮，用高压破碎装置(10,000psi，Rannie HighPressure Laboratory)破碎，然后离心回收沉淀部分。将所得的沉淀悬浮在水中，边搅拌边加入水使液体量达到250ml。其后，向其中加入15ml 1M Tris缓冲液(pH9.2)，900μl 1M DTT，3ml0.5M EDTA和30ml 10％脱氧胆酸钠并在室温下搅拌30分钟。离心后，回收沉淀同时除去大部分污染的蛋白质，微生物组分等。将300ml 5mM DTT加到沉淀中，使其悬浮，然后离心回收含h6T(1-163)的沉淀部分。将含h6T(1-163)的所回收沉淀部分悬浮在水中，达104ml的总体积。向悬浮液中加入20ml 1M Tris缓冲液(pH8.5)，然后边搅拌边加入376ml 8M盐酸胍，随后于室温下搅拌10分钟以溶解h6T(1-163)。向其中加入含0.1％多乙氧基醚的2500ml 20mM Tris缓冲液(pH8.5)，然后边搅拌边加入含1M盐酸胍的2000ml 20ml Tris缓冲液(pH8.5)，再加5mM Cys和0.5mM胱氨酸(cystin)。将由此得到的溶液于4℃温育过夜，离心回收上清液中的h6T(1-163)，然后用Prep Scale UF cartridgePLDC超滤膜(Millipore)浓缩。用含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris缓冲液(pH9.2)代替浓缩物的缓冲液直到终体积达1,000m1。将所得溶液加至预先经含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris缓冲液(pH9.2)平衡的Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(ID 5cm×10cm)，然后用在相同缓冲液中线性梯度0M至500mM NaCl洗脱。回收在约20mM至约150mM NaCl洗脱的级分(240ml)。用20mM Tris缓冲液(pH7.2)将所得的级分稀释4倍以使总体积达960ml，然后用乙酸将pH调至7.2，再加至预先经含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris缓冲液(pH7.2)平衡的SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱(ID5cm×10cm)，然后用相同缓冲液中线性梯度0M-500mM NaCl洗脱。在SDS-PAGE上分析洗脱液以收集TPO级分。将三氟乙酸加到TP0级分中直到其终浓度达0.1％。将所得的溶液用于Capcell Pak 5μm300A C1柱(ID2.1cm×5cm×2，Shiseido)，随后用在0.1％三氟乙酸中浓度逐渐增加的1-丙醇，通过线性梯度洗脱法完成反相HPLC。在没有还原剂的情况下，经SDS-PAGE分析洗脱液，然后根据在反相HPLC中的洗脱位置分馏成2个级分。根据在反相HPLC中的洗脱顺序(见图17)，分别将两个TPO级分称为Fr.G-a和Fr.G-d。在没有还原剂的情况下，在SDS-PAGE上分析各级分。结果，在分子量为约18KDa(Fr.G-a)或约32KDa(Fr.G-d)的位置检测到一个单一带(见图18)。此外，在存在还原剂的条件下，上述级分的SDS-PAGE分析表明，在这两个级分中，在分子量为约20KDa位置处均检测到一个单带。各级分氨基酸分析的结果表明其各氨基酸的组分几乎与从序列资料估计的相应的理论值一致。另外，N-末端氨基酸分析的结果表明，它们是预期的序列。从氨基酸分析之结果确定的各级分的蛋白质量为2.56mg(Fr.G-a)或1.16mg(Fr.G-d)。将各级分对IMDM完全透析后，进行M-07e检测。结果，TPO级分的相对活性为约3,960,000(Fr.G-a)或约7,760,000(Fr.G-d)。
<实施例62>
构建用于在CHO细胞中表达部分长度的人TPO(氨基酸1-163)(下文称为“hTPO163”)的重组载体pDEF202-hTPO163用限制酶EcoRI和SpeI处理实施例31中构建的载体pDEF202，然后用琼脂糖凝胶电泳回收较大的载体片段。用T4DNA连接酶(Takara-Shuzo)将该片段与通过用限制酶EcoRI和SpeI处理含有编码氨基酸-21到163(SEQ ID NO13)之hTPO163 cDNA的质粒pEF18S-hTPO163而制备的hTPO163 cDNA相连以得到表达载体pDEF202-hTPO163。该质粒含SV40的复制原点、人伸长因子1-α启动子、SV40早期多腺苷酸化位点、鼠DHFR小基因、pUC18的复制原点和β-内酰胺酶基因(Ampr)，其中，hTPO163 cDNA连在人伸长因子1-α-启动子的位点下游。
<实施例63>
在CHO细胞中表达hTPO163用6cm平皿(Falcon)，在含10％胎牛血清的α基本必需培养基(α-MEM(-)，含胸苷和次黄嘌呤)中，使CHO细胞系(dhfr-菌株，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，p4216，1980)生长，然后经transfectum法(Seikagaku KogyoK.K.)，用pDEF202-hTPO163质粒转化。
简而言之，将实施例62中制备的10μg质粒pDEF202-hTPO163与240μl 0.3M NaCl混合，然后与20μl transfectum和220μlH2O的混合物混合。将DNA溶液逐滴加到平皿中，接下来在CO2保温箱中培养6小时。从平皿中除去培养基，然后用α-MEM(-)洗涤两次，接着加入含α-MEM(-)的10％DMSO，再在室温温育2分钟。此后，向平皿中加入含10％透析的胎牛血清的非选择培养基(含次黄嘌呤和胸苷的α-MEM(-))，接着再培养2天，然后在含10％透析的胎牛血清的选择培养基(不含次黄嘌呤和胸苷的α-MEM(-))上筛选。通过将细胞用胰蛋白酶处理，将每个上述6cm的平皿中的细胞分至5个10cm的平皿或20个24孔平皿中，然后继续培养同时每隔2天用新鲜的培养基换一次培养基，从而完成筛选。用Ba/F3检测检验平皿或孔上清液的TPO活性，由此观察到TPO活性。用含25nM氨甲蝶呤的选择培养基将细胞分成1∶15的细胞浓度后，将在上清液中观察到TPO活性的细胞转移到平板或孔中，随后再培养使其生长并克隆氨甲蝶呤抗性的细胞。
另外，通过将pEF18S-hTPO163和pMG1共转染到CHO细胞中而完成CHO细胞的转化。
用质粒pDEF202-hTPO163转染的CHO菌株(CHO-DUKXB11)已由本申请人于1995年1月31日保藏于日本国家生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术司，国际贸易和工业部，保藏号FERMBP-4989。
<实施例64>
CHO细胞的大规模培养按如下步骤大规模培养通过将hTPO163-表达质粒pDEF202-hTPO163转染到实施例63中的CHO细胞中而得到的生产hTPO163的CHO细胞系(CHO109细胞，在含10％透析的胎牛血清的选择培养[不含次黄嘌呤和胸苷的α-MEM-]中经上述筛选而得到的)。在含10％FCS的DMEM/F-12培养基(GIBCO)中生长CHO109细胞。用胰蛋白酶溶液收集(或胰蛋白酶化)细胞后，将10×107个细胞接种到含200ml相同培养基的Falcon旋转瓶(Falcon 3000)中，然后以1rpm的转速于37℃培养3天。抽吸除去培养基，用100ml PBS漂洗细胞培养的表面。将不含10％FCS的200ml DMEM/F-12培养基(GIBCO)加到细胞培养中，然后以1rpm于37℃培养7天。用收集的培养物上清液作为起始物质用于随后的纯化步骤。在300个旋转瓶中完成相似的过程以得到60L无血清培养物上清液。
<实施例65>
从生产hTPO163的CHO细胞系中纯化hTPO163(1)将实施例64中得到的60L无血清培养物上清液通过0.22μm的过滤器过滤以收集滤物，然后用超滤装置(Filtron，分子量截断10,000)浓缩，以得到浓缩的级分(600ml，11.2mg蛋白质/ml，总蛋白质6430mg)。用抗-HT1肽抗体经Western分析该级分，显示存在表观分子量为20,000到26,000的表达的hTPO163蛋白质。
在用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)预平衡的Sephadex G-25Fine柱(Pharmacia-Biotech，商品号17-0032-02；直径10cm，床高30cm)上处理所得的浓缩培养物上清液(537ml)以得到在10mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)中的蛋白质级分F1(938ml，蛋白质浓度4.9mg/ml，总蛋白质4594mg)溶液。
将来自Sephadex G-25 Fine柱的该蛋白质级分(929ml)以15ml/分的流速加至预先经10mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡的SPSepharose Fast Flow柱(Pharmacia-Biotech，商品号17-0729-01；直径5cm，床高12cm)，然后用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱，再用含10％乙醇的相同缓冲液洗脱。将洗脱合为F1级分(1608ml，蛋白质浓度2.13mg/ml，总蛋白质3426mg)。再用含750mM NaCl和25％乙醇的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)进行第二次洗脱以得到F2级分的主要hTPO163洗脱液(651ml，蛋白质浓度1.67mg/ml，总蛋白质1087mg)。
向来自SP Sepharose Fast Flow柱的含TPO活性的F2级分(200ml)加入乙醇和纯化水以制备300ml 45％(终浓度)的乙醇溶液。经离心除去因加入乙醇而产生的不溶物质。将上清液以2ml/分的流速注入经50％溶剂A(10mM乙酸钠缓冲液，pH6.7)加50％溶液B(10mM含90％乙醇的乙酸钠缓冲液，pH6.7)预平衡的SOURCE15RPC柱(Pharmacia-Biotech，商品号17-0727-02；直径2cm，床高20cm)。然后用55％溶剂A加45％溶剂B洗涤该柱直到几乎完全洗脱下未吸附的物质，然后以下列洗脱方法以1.5ml/分的流速洗脱55％B5分钟；线性梯度50％B到100％B140分钟以上；100％B35分钟。每隔5分钟(相当于7.5ml体积)收集各级分。使所有的级分经SDS-PAGE，然后Western分析以检测hTPO163的洗脱范围。结果，在66％到87％乙醇的范围内的洗脱液中发现了表观分子量为约20,000到26,000的高度纯化的hTPO163。在这些hTPO163蛋白质中，从反相柱上较早洗脱下的是较高分子量的hTPO163，说明，糖基化的hTPO163分子其亲水性提高。
将CHAPS加到88.8ml来自SOURCE 15RPC柱的hTPO163洗脱级分(即，在68％到86.5％乙醇范围内洗脱的hTPO163级分(90ml))，然而将混合物浓缩并洗涤以得到含约5％乙醇和4mM CHAPS的2.5ml浓缩物。随后，将该浓缩物以1.5ml/分的流速加至经10mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡的Superdex 75pg柱(Pharmacia-Biotech，商品号17-1070-01)，直径2.6cm，床高60cm)。从上样后60分钟时开始，以每次6ml的量(即每4分钟)收集洗脱级分。结果，按SDS-PAGE确定的，在试管号16到至少31的级分中，洗脱了hTPO163。该洗脱位置对应于按使用标准分子量标记物(Bio-Rad的混合物，Gel Filtration Standard，商品号151-1901，andCalbiochem，insul in，商品号407696)的凝胶过滤确定的约44,000到约6,000的分子量范围。另外，这些hTPO163分子似乎是以糖基化程度逐渐降低的顺序而被洗脱的。收集试管号16到31(洗脱体积180到276ml)的所有hTPO163种类作为AF级分。除FA部分外，分别收集试管号16到18(洗脱体积180到198ml)，19到24(洗脱体积198到234ml)和25到31(洗脱体积234到276ml)的级分，然后分别命名为级分FH，FM和FL。将部分的级分FH、FM和FL结合也可制备FA级分。图19对上述内容作了描述。
(2)接着，将更详细地说明来自前述(1)中Superdex 75pg的hTP01 63洗脱级分FH，FM，FL和FA。通过与实施例1中相同的方法确定上述各hTPO163种类的N-末端氨基酸序列，但大部分N-末端的Ser残基都不能鉴定出。这说明将○-连接的糖加到了N-末端Ser上。此外，证实N-末端Ser后的序列是从hTPO的基因序列推测的氨基酸序列。经氨基酸分析(AccQ.Tag方法，Wasters)确定，在FH，FM，FL和FA中的hTPO163蛋白质的浓度分别为10.2ng/ml，6.2ng/ml，0.84ng/ml和3.2ng/ml，说明该浓度是不含任何糖链的肽部分。在非还原条件下，用多凝胶15/25(Dai-ichi Kagaku.Yakuhin，15-25％预制聚丙烯酰胺凝胶)或还原条件下，用DTT使这些级分(各100ng)经SDS-PAGE，然后银-染色(Daiichi PureChemicals)。结果，发现这些级分的每一级分均含有高纯度的hTPO163。在还原条件下，用DPCIII分子量标记(Daiichi Dure.Chemicals)作为标准计算，在FH，FM，FL和FA中hTPO163的表观分子量分别为24,000-21,500,23,000-21,000,23,000-20,500和23,500到20,500(见图20)。另外，在还原条件下Western分析上，用生物素标记的SDS-APGE标准物(Bio-Rad，BiotynylatedSDS-PAGE Standards，Board Range商品号161-0319)计算的FH，FM，FL和FA中hTPO的表观分子量分别为26,000到22,000,25,500到22,000,26,000到21,000和26,000到21,000。FH，FM，FL和FA分子量的不一致性可能是○-连接的糖链的不一致性造成的。因此，用神经氨糖酸苷酶(Neurami ni dase，Nacalai tesque，商品号242-29SP)消化，用DTT还原，然后在SDS-PAGE上分析各级分FH，FM，FL和FA。结果，在所有级分中，表观分子量为约19,000，说明hTPO分子量的不一致性主要是由于与hTPO163蛋白质偶联的糖链中的唾液酸量的不一致性而造成的，而且在CHO细胞中，得到的hTPO163作为糖蛋白而得到表达。
(3)用M-07e检测系统检测(2)中得到的FH，FM，FL和FA级分的体外活性。结果，相对特异活性为511,000,000，775,000,000，1,150,000,000和715,000,000/mg hTP0163蛋白质(不含任何糖重量的肽部分的重量)。
<实施例66>
构建用于表达分别在-1位加入Lys并在-2位加入Met之人TPO(氨基酸1-332)(下文称为“hMKT(1-332)”)的E.coli载体并表达hMKT(1-332)为了在E.coli中表达人TPO的全长氨基酸序列，将氨基酸164到氨基酸332的所用密码子换成下列所述的E.coli优选密码子。
表5215′-CTCCCGAACCGTACCAGCGGCCTGCTGGAAACCAACTTTACCGCGAG-3′(SEQ ID NO130)225′-GGTAAAGTTGGTTTCCAGCAGGCCGCTGGTACGGTTCGGGAGCTCGT-3′(SEQ ID NO131)235′-CGCGCGTACCACCGGCAGCGGCCTGCTGAAATGGCAGCAGGGCTTTCGT-3′(SEQ ID NO132)245′-AGCCCTGCTGCCATTTCAGCAGGCCGCTGCCGGTGGTACGCGCGCTCGC-3′(SEQ ID NO133)255′-GCGAAAATCCCGGGCCTGCTGAACCAGACCAGCCGTAGCCTGGATCAGAT-3′(SEQ ID NO134)265′-ATCCAGGCTACGGCTGGTCTGGTTCAGCAGGCCCGGGATTTTCGCACGAA-3′(SEQ ID NO135)275′-CCCGGGCTATCTGAACCGTATCCATGAACTGCTGAACGGCACCCGTG-3′(SEQ ID NO136)285′-GTGCCGTTCAGCAGTTCATGGATACGGTTCAGATAGCCCGGGATCTG-3′(SEQ ID NO137)295′-GCCTGTTTCCGGGCCCGAGCCGTCGCACCCTGGGCGCGCCGGATATCAG-3′(SEQ ID NO138)305′-ATCCGGCGCGCCCAGGGTGCGACGGCTCGGGCCCGGAAACAGGCCACGG-3′(SEQ ID NO139)315′-ATCAGCTCTGGCACCAGCGATACCGGCAGCCTGCCGCCGAACCTGCAGCC-3′(SEQ ID NO140)325′-CAGGTTCGGCGGCAGGCTGCCGGTATCGCTGGTGCCAGAGCTGATATCCG-3′(SEQ ID NO141)335′-GGGCTATAGCCCGAGCCCGACCCATCCGCCGACCGGCCAGTATACCCTGTT-3′(SEQ ID NO142)345′-GGTATACTGGCCGGTCGGCGGATGGGTCGGGCTCGGGCTATAGCCCGGCTG-3′(SEQ ID NO143)355′-TCCGCTGCCGCCGACCCTGCCGACCCCGGTGGTTCAGCTGCATCCGCTGC-3′(SEQ ID NO144)365′-GGATGCAGCTGAACCACCGGGGTCGGCAGGGTCGGCGGCAGCGGAAACAG-3′(SEQ ID NO145)375′-TGCCGGATCCGAGCGCGCCGACCCCGACCCCGACCAGCCCGCTGCTGAACA-3′(SEQ ID NO146)385′-AGCAGCGGGCTGGTCGGGGTCGGGGTCGGCGCGCTCGGATCCGGCAGCAGC-3′(SEQ ID NO147)395′-CCAGCTATACCCATAGCCAGAACCTGAGCCAGGAAGGCTAATGAAGCTTGA-3′(SEQ ID NO148)405′-CTTCATTAGCCTTCCTGGCTCAGGTTCTGGCTATGGGTATAGCTGGTGTIC-3′(SEQ ID NO149)415′-ACGAGCTCCCGAACCGTACCA-3′(SEQ ID NO150)425′-CTGATATCCGGCGCGCCCAGG-3′(SEQ ID NO151)435′-CGGATATCAGCTCTGGCACCA-3′(SEQ ID NO152)445′-TCAAGCTTCATTAGCCTTCCT-3′(SEQ ID NO153)在含0.1mM ATP、10mM Tris-乙酸盐、10mM酸镁、50mM酸钾溶液中，用同一试管中的T4连接酶(Pharmacia)将合成的寡核苷酸21和22，23和24；25和26；27和28；29和30；31和32；33和34；35和36；37和38；或39和40磷酸化。然后将1/10体积的含100mM Tris/HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、500mM NaCl溶液加到反应混合物中，在水浴中煮3分钟，然后使其冷却以形成双链DNA。将四组双链DNA即寡核苷酸21和22/23和24(组合-A)；寡核苷酸25和26/27和28(组合-B)；和寡核苷酸31和32/33和34(组合-C)；及寡核苷酸35和36/37和38/39和40(组合-D)分别用DNA连接盒(Takara-Shuzo)连接，其后，将组合-A与组合-B相连，相似地，将组合-C与组合-D相连以分别得到连接物-1和连接物-2。用连接物-1和-2作为模板，寡核苷酸-41和-42用作引物用于连接物-1，以及寡核苷酸-43和-44用作引物用于连接物-2，进行PCR。分别用SacI和EcoRV以及EcoRV和HindIII消化连接物-1和-2的PCR产物，然后在2％琼脂糖凝胶上电泳并用Prep-A-Gene DNA纯化盒纯化以便分别回收约240bp和250bp的片段。将所得的两个片段亚克隆到经SacI和HindIII预消化的pBluescript II KS+(Stratagene)中(用E.coli DH5作为宿主)。在所得的克隆中，通过测序筛选出具有表6所示之碱基序列的克隆并命名为pBL(SH)(174-332)(见SEQ ID NO154)。
表6CTC CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG GAA ACC AAC TTT ACC GCG AGCLeu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser174 180GCG CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG AAA TGG CAG CAG GCC TTT CGTAla Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg190 200GCG AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG ACC AGC CGT AGC CTG GAT CAGAla Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln210 220ATC CCG GGC TAT CTG AAC CGT ATC CAT GAA CTG CTG AAC GGC ACC CGTIle Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg230GGC CTG TTT CCG GGC CCG AGC CGT CGC ACC CTG GGC GCG CCG GAT ATCGly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile240 250AGC TCT GGC ACC AGC GAT ACC GGC AGC CTG CCG CCG AAC CTG CAG CCGSer Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro260GGC TAT AGC CCG AGC CCG ACC CAT CCG CCG ACC GGC CAG TAT ACC CTGGly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu270 280TTT CCG CTG CCG CCG ACC CTG CCG ACC CCG GTG GTT CAG CTG CAT CCGPhe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro290 300CTG CTG CCG GAT CCG AGC GCG CCG ACC CCG ACC CCG ACC AGC CCG CTGLeu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu310CTG AAC ACC AGC TAT ACC CAT AGC CAG AAC CTG AGC CAG GAA GGC TAALeu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly320 330 332TGA AGC TTG A接着，以下列合成的寡核苷酸45和46作为引物，实施例42中制备的pBL(XH)h6T(1-163)为模板完成PCR，用BamHI和SacI消化PCR产物，接着在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳以便从凝胶上回收约160bp的片段。455′-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3′(SEQ ID NO155)465′-GGGAGCTCGTTCAGGGTCAGAACCAAGAGAGGTACGAGACGGAACAGCAGTGGTTGG-3′(SEQ ID NO156)用SacI和HindIII消化pBL(SH)(174-222)，然后用Prep-A-GeneDNA纯化盒纯化消化产物以得到约480bp的片段。将上述制备的两个片段亚克隆到经BamHI和HindIII预消化的pBluescript II KS+(Stratahene)中(E.coli DH5作为宿主。)中。
在所得的克隆中，通过测序筛选出具有表7所示之碱基序列的克隆并命名为pBL(BH)(123-332)(见SEQ ID N0157)。
表7G GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGCAsp Pro Ash Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly123 130AAA GTT CGT TTC CTG ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGTLys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg140 150CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT CGT ACC TCT CTG GTT CTGArg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu160ACC CTG AAC GAG CTCThr Leu Asn Glu Leu170 174用BamHI和HindIII消化实施例42中制备的pBL(XH)h6T(1-163)，相以地消化上述制备的pBL(BH)(123-332)以得到约640bp的片段，其后将两个片段连在一起以得到克隆pBL(XH)h6T(1-334)。此外，用XbaI和SfiI消化实施例52中制备的pCFM536/hMKT(1-163)以得到一约270bp的片段，随后，将该片段与经相同限制酶消化的pBL(XH)h6T(1-334)相连以得到克隆pBL(XH)hMKT(1-334)。用XbaI和HindIII消化pBL(XH)hMKT(1-334)后，得到一编码突变型人TPO氨基酸1-332的约1040bp片段，然后纯化，并克隆到经XbaI和HindIII预消化的pCFM536(EP-A-136490)中(用由pMW(ATCC No.39933)预先转化的E.coli JM109作为宿主。)。将所得的克隆命名为pCFM536/hMKT(1-332)，用携带该表达载体的E.coli菌株作为转化体用于表达突变型蛋白质hMKT(1-332)蛋白质。表达质粒pCFM536/hMKT(1-332)含有SEQ ID NOl4所示的DNA序列。
在60ml含50μg/ml氨苄青霉素和12.5μg/ml四环素的LB培养基中，将上述转化体于30℃过夜培养，然后将培养物(25ml)加到含50μg/ml氨苄青霉素的1000ml LB培养基中，于36℃振荡培养直到OD600达到1.0到1.2。将65℃的约330ml LB培养基加到培养物中以便使培养物的终温度达到42℃，于42℃再继续振荡培养3小时以诱导表达变异体人TPO；hMKT(1-332)(也称为[Met-2，Lys-1]TPO(1-332)。
将所得的培养物直接进行SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE分析中，应用Multigel15/25(Dai-ichi Chemical Co.)。电泳以及考马斯兰染色后，根据诱导hMKT(1-332)蛋白质表达的转化体，在凝胶上分子量为约35KD处，检测到具有诱导表达特异性的蛋白质。另外，SDS-PAGE和电印迹(用硝酸纤维素膜)后，将上述表达的蛋白质与实施例45中制备的抗-HT1肽抗体反应。染色后，在分子量为约35KD处，检测到一个带，说明表达了hMKT(1-332)。
<实施例67>
制得人TPO取代衍生物，其在COS7细胞中的表达并鉴别其活性根据下列方法，研究用其他氨基酸部分取代人TPO氨基酸的几个衍生物是否有TPO活性。
按如下构建本实施例所用的，用于在动物细胞中表达的载体pSMT201。
首先，用限制酶KpnI和EcoRI处理含有鼠促红细胞生成素受体之cDNA(得自Dana Farbor Cancer Institute的D′Andrea博士Cell57，277-285(1989))的表达质粒pXM-mEPORn，然后在琼脂糖凝胶上电泳以回收除去了鼠促红细胞生成素受体之cDNA的pXM载体片段。接着，用DNA合成仪(ABI)合成用于将不同的克隆限制位点导入上述表达载体的两个寡核苷酸。合成的寡核苷酸有下列基本序列引物-15′-CCTCGAGGAATTCCTGCAGCCCGGGACTAGTATCGGCTACCCCTACGACGTCCCCGACTACGCCGGCGTCCATCACCATCACCATCACTGAGCGGCCGCC-3′(SEQ ID NO158)引物-25′-AATTGGCGGCCGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGCGCCGGCGTAGTCGGGGACGTCGTAGGGGTAGCCGATACTAGTCCCGGGCTGCAGGAATTCCTCGAGGGTAC-3(SEQ ID NO159)将两个寡核苷酸混合并退火以形成双链寡核苷酸，然后存在T4DNA连接酶(Takara-Shuzo)的情况下，与上述回收的pXM载体相连以得到表达载体pDMT201。为了从pDMT201中除去pDMT201中所含的鼠DHFR cDNA，分别用NotI和HpaI消化载体pDMT201和pEF18S，然后经琼脂糖凝胶电泳以便从pDMT201载体DNA中回收一个较大片段并从pEF18S载体DNA中回收一个较小的片段。然后用T4DNA连接酶(Takara-Shuzo)将这些片段连在一起以得到表达载体pSMT201。如图21所示，pSMT201含有SV40的复制原点、增强子序列、腺病毒主要晚期启动子序列、腺病毒三分前导序列、拼接信号序列、SV40早期多腺苷酸化位点序列、腺病毒VA RNA基因序列、pUC18的复制原点和β-内酰胺酶基因(Ampr)，以及用于连接所需基因的下列限制位点BgIII，PstI，KpnI，XhoI，EcoRI，SmaI，SpeI和NotI位点。用EcoRI和SpeI消化实施例30中说明的携带全长人TPO cDNA的pHTP以得到全长的人TPO cDNA片段，随后亚克隆到经相似预消化的载体pSMT201中以得到质粒pSMT201-hTPO。
用由此得到的质粒pSMT201-hTPO作为模板，首先按如下方法构建质粒βGL-TPO/pBlue，用该质粒作为用于制备所需衍生物的模板。
在βGL-TPO/pBlue中，用Annweiler′s的方法(Annweileret al.，Nucleic Acids Research，193750，1991)将兔β-球蛋白前导序列加到人TPO的5′-非转译位点。为了达到该目的，将化学合成的下列双DNA链5′-AATTCCAAGATCTCACACTTGCTTTTGACACAACTGTGTTTACTTGCAATCCCCCAAAACAGACAGACCC-3′(sEQ ID NO160)；和5′-3GGGTCTGTCTGTTTTGGGGGATTGCAAGTAAACACAGTTGTGTCAAAAGCAAGTGTGAGATCTTGG-3′(SEQID NO161)，与经EcoRI和SmaI消化载体Bluescript II SK+(Toyo-boseki)而得到的片段相连以得到插入了前导序列的载体βGL/pBLue。
用下列引物序列完成PCRSma-ATG5′-GGCCCGGGATGGAGCTGACTGAATTGCTC-3′(SEQ ID NO162)(即与SmaI序列相连的SEQ ID NO7的102-122序列)；和末端5′-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3′(SEQ ID NO163)(即与SpeI和HindIII序列相连的SEQ ID NO7之1140-1160序列的反义序列)。
用1ng质粒pSMT201-hTPO DNA为模板和10μM合成引物完成PCR。用TakaRa PCR扩增盒(Takara-Shuzo)和ProgrammableThermal Controller(MJResearch)，在下列条件下，100μl体积中完成PCR94℃1分钟，55℃2分钟，72℃2分/循环共3个循环；然后94℃45秒，55℃1分，72℃1分/循环共20个循环。用氯仿提取PCR产物，然后乙醇-沉淀两次，然后悬于100μl TE缓冲液中。
随后，用SmaI和HindIII限制消化PCR产物，用酚/氯仿提取，并经乙醇沉淀。将所得沉淀溶于10μl TE缓冲液中，然后亚克隆到由相同限制酶预消化的载体βGL/pBlue中(用高感受态的E.coliJM109(Toyo-boseki)为宿主)。在所得的转化体细胞中，筛选出20个克隆，基本按Sambrook等人(Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))中的描述从这些克隆中制备质粒DNA。用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cyele Sequencing盒(Applied Biosystems，Inc)和373A DNA测序仪(AppliedBiosystems，Inc.)通过测序鉴定纯化的质粒DNA。结果，证实编码βGL-TPO/pBlue的质粒含有预期的TPO cDNA序列而在其全长上没有任何取代。用BgIII和SpeI消化βGL-TPO/pBlue后，用酚/氯仿提取消化产物然后乙醇-沉淀。将所得沉淀溶于10μl TE缓冲液中，然后亚克隆到经相同酶消化的载体pSMT201中(用高感受态的E.coliJM109(Toyo-boseki)作为宿主。)。按Molecular Cloning(Sambrook et a1.，上文)中描述的方法，从转化体细胞中制备质粒DNA。如图21所示，所得表达载体pSMT/βGL-TPO的结构为在pSMT201载体之拼接信号序列下游的BgIII/SpeI限制位点，β-球蛋白前导序列和人TPO cDNA相连。将该pSMT/βGL-TPO载体转染到COS细胞中。
为了制备人TPO取代衍生物，在PCR中使用了Ito方法(Ito etal.，Gene，10267-70，1991)。具体地说，说明性地制备两种人TPO衍生物，其中，人TPO的Arg-25和His-33分别由Asn和Thr取代。相应地，这些衍生物可称为[Asn25]TPO和[Thr33]TPO。在PCR中，使用下列引物T75′-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3′(SEQ ID NO164)(对应于Bluescript II SK+的T7启动子区)；ΔBgIII5′-AATTCCAAGATCACACACTTGC-3′(SEQ ID NO165)(用于取代BgIII识别序列)；末端5′-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3′(SEQ ID NO166)(与SpeI和HindIII相连的SEQ ID NO7之1140-1160的反义)；N35′-TGGGCACTGGCTCAGGTTGCTGTGAAGGACATGGG-3′(SEQ ID NO167)(SEQ ID NO7的Arg25→Asn)；和O95′-TGTAGGCAAAGGGGTAACCTCTGGGCA-3′(SEQ ID NO168)(SEQ ID NO7的His-33→Thr)。用lng质粒βGL-TPO/pBlue DNA为模板和各10μg合成引物完成第一步PCR。引物的组合是[1]ΔBgIII和“末端”引物；[2]T7和N3；和[3]T7和O9。用TakaRa PCR扩增盒(Takara-Shuzo)和Programmable Thrmal Controller(MJ Research)，在下列条件下，100μl体积中完成PCR94℃1分钟，55℃2分，72℃2分/循环共3个循环；然后94℃45秒，55℃1分，72℃1分/循环共17个循环。用氯仿提取PCR产物并用乙醇沉淀两次，然后将沉淀溶于100μl TE缓冲液中。随后，使所得的PCR产物(各1μl)经第二次PCR。模板的组合为PCR产物[1]/[2]和PCR产物[1]/[3]。对于引物，在两种情况下用T7和末端组合。在95℃温育10分钟后，加入TakaRa Taq，在下列条件下完成PCR94℃1分，55℃2分和72℃2分/循环共3个循环，然后94℃45秒，55℃1分和72℃1分/循环共9个循环。向所得的各PCR产物中加入1μl蛋白酶K(5mg/ml)，2μl 0.5MEDTA和2μl 20％SDS，于37℃温育30分钟，以使Taq失活，用酚/氯仿提取，并乙醇-沉淀。此后，用BgIII和SpeI消化溶于20μl无菌水中的沉淀，然后经酚/氯仿提取和乙醇-沉淀。将所得沉淀溶于10μl TE缓冲液中，随后亚克隆到经相同限制酶预消化和牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer-Mannheim)处理的表达载体pSMT201中(用高感受态的E.coli JM109为宿主。)。在所得的转化细胞中，每种情况筛选出两个克隆，基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，上文)中所述的方法，从克隆中制备质粒DNA。用373A DNA测序仪和Taq Dye DeoxyTMTerminater CycleSequencing盒(均来自Applied Biosystems，Inc.)测定纯化质粒DNA的序列。
利用引物[1]和[3]由PCR制备的质粒含有编码TPO取代衍生物(O9/TPO)的cDNA。证实Thr(ACC)氨基酸取代了His33(CAC)，而且通过加入氨基酸序列TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH(SEQ IDNO169)而延伸了原C-末端(Gly332)。将该衍生物称为[Thr33，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO.
另一方面，利用引物[1]和[2]由PCR制备的质粒含有编码TPO取代衍生物(N3/TPO)的cDNA。证实由Asn(AAC)氨基酸取代了Arg25(AGA)，并由Lys(AAA)取代了Glu231(GAA)并通过加入氨基酸序列TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH而延伸了原C-末端(Gly332)。将该衍生物称为[Asn25，Lys231，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO.
按实施例35中描述的包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖法，将所得的各克隆转染到COS7细胞中。简而言之，在转染中，用40μg各质粒DNA，5天后，回收培养物上清液，随后用Centricon-30(Amicon)浓缩到1/20体积以便由M-O7e检测评估其TPO活性。结果，在分别转染了含有编码人TPO取代衍生物N3/TPO和O9/TPO之cDNA的质粒的COS7细胞培养物上清液中，检测出TPO活性为剂量依赖方式(见图22)。
<实施例68>
制备人TPO的插入或缺失衍生物，其在COS7细胞中的表达并鉴定TPO活性本实施例要证实hTPO163的插入或缺失衍生物是否有TPO活性。
制备的衍生物为His33-缺失衍生物([ΔHis33]TPO(1-163)，dH33)Gly116-缺失衍生物([ΔGly116]TPO(1-163)，dG116)；Arg117-缺失衍生物([ΔArg117]TPO(1-163)，dR116)；Thr-插入衍生物([His33，Thr33′，Pro34]TPO(1-163)，T33′)Ala-插入衍生物([His33，Ala33′，Pro34]TPO(1-163)，A33′)和Gly-插入衍生物([His33，Gly33′，Pro34，Ser38]TPO(1-163)，G33′)，其中分别将Thr，Ala和Gly插入His33和Pro34之间；及Asn-插入衍生物([Gly116，Asn116′，Arg117]TPO(1-163)，N116′)，Ala-插入衍生物([Gly116，Ala116，ArgA117]TPO(1-163)，A116′)和Gly-插入衍生物(Gly116，Gly116，Arg117]TPO(1-163)，G116′)，其中分别将Asn，Ala和Gly插入Gly116和Arg117之间，所有序列均以SEQ ID NO13为基础。
在这些衍生物中，T33′和N 116′分别导入粘蛋白型和Asn-结合型糖链。
用Ito等人(Gene，10267-70，1991)描述的方法用PCR制备上述衍生物。PCR中所用的引物序列如下dH335′-TGTAGGCAAAGGAACCTCTGGGCA-3′(SEQ ID NO172)(用于制备以SEQ ID NO7所示之序列为基础的His33-缺失衍生物)；T33′5′-TGTAGGCAAAGGAGTGTGAACCTCTGG-3′(SEQ IDNO173)(用于制备在SEQ ID NO7所示之序列的His33和Pro34之间含有插入的Thr的Thr-插入衍生物)；A33′5′-TGTAGGCAAAGGAGCGTGAACCTCTGG-3′(SEQ IDNO174)(用于制备在SEQ ID NO7所示之序列的His33和Pro34之间含有插入的Ala的Ala-插入衍生物)；G33′5′-TGTAGGCAAAGGTCCGTGAACCTCTGG-3′(S EQ IDNO175)(用于制备在SEQ ID NO7所示之序列的His33和Pro34之间含有插入的Gly的Gly-插入衍生物)；dG1165′-AGCTGTGGTCCTCTGTGGAGGAAG-3′(SEQ ID NO176)(用于制备在SEQ ID NO7所示之序列基础上的Gly116-缺失衍生物)；dR1175′-GTGAGCTGTGGTGCCCTGTGGAGG-3′(SEQ ID NO177)(用于制备在SEQ ID NO7所示之序列基础上的Arg117-缺失衍生物)；N116′5′-AGCTGTGGTCCTGTTGCCCTGTGGAGG-3′(SEQ IDNO178)(用于制备在SEQ ID NO7所示之序列中的Gly116和Arg117之间含有插入的Asn的Asn-插入衍生物)；A116′5′-AGCTGTGGTCCTAGCGCCCTGTGGAGG-3′(SEQ IDNO179)(用于制备在SEQ ID NO7所示之序列中的Gly116和Arg117之间含有插入的Ala的Ala-插入衍生物)；G116′5′-AGCTGTGGTCCTTCCGCCCTGTGGAGG-3′(SEQ IDNO180)(用于制备在SEQ ID NO7所示之序列中的Gly116和Arg117之间含有插入的Gly的Gly-插入衍生物)dRI5′-CGGGCTGCAGGATATCCAAGATCTCA-3′(SEQ ID NO181)(用于取代限制酶EcoRI-识别序列)；T75′-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3′(SEQ ID NO182)(对应于Bluescript II SK+的T7启动子区)；和末端Notl 5′-GGGCGGCCGCTCAGCTGGGGACAGCTGTGGTGGG-3′(SEQ ID NO183)(SEQ ID NO7之633-653核苷酸序列的反义，其中已加入了终止密码子和Notl识别序列)。
用实施例67中制备的1ng质粒βGL-TPO/pBlue DNA为模板和10μM合成引物完成第一步PCR。引物组合为[1]dRI和末端Notl或[2]T7和突变的引物(dH33，A33′，G33′，T33′，dG116，dR117，A116′，G116′和N116′)。在PCR中，用TakaRa PCR扩增盒(Takara-Shuzo)和Programmable Thermal Controller(MJResearch)，在100μl终体积中完成PCR。在[1]的第一PCR反应中，一个循环为94℃1分钟，45℃2分钟和72℃2分钟，完成3个循环；接着进行1循环为94℃45秒，45℃1分钟和72℃1分钟共17个循环。另一方面，在下列条件下完成[2]的第一PCR反应；94℃1分钟，55℃2分钟，72℃2分钟共3个循环，然后94℃45秒，55℃1分钟，72℃1分钟共17个循环。在乙醇沉淀2次前，用氯仿提取各PCR产物，然后将所得的沉淀溶于100μl TE缓冲液中。
接着，用1μl的[1]和[2]的各PCR产物完成第二步PCR。所用的引物为T7和末端NotI的组合。在94℃温育10分钟后，将TakaRa Taq加到各PCR反应混合物中。在下列条件下完成第二PCR94℃1分钟，55℃2分钟和72℃2分钟共3个循环；接着94℃45秒，55℃1分钟和72℃1分钟共9个循环。将1μl的5mg/ml蛋白酶K、2μl 0.5M EDTA和2μl 2％SDS加到各PCR产物中，然后将混合物保持于37℃30分钟以使Taq失活。用酚/氯仿提取PCR产物，接着乙醇沉淀，然后将所得的沉淀溶于20μl无菌水中。用EcoRI和NotI消化后，用酚/氯仿提取沉淀，然后用乙醇沉淀。将所得的沉淀溶于10μl TE缓冲液中，然后亚克隆到用相同限制酶预消化并用碱性磷酸酶(来自牛小肠，Boehringer-Mannheim)处理的表达载体pEF18S中。所用的宿主细胞是高感受态的E.coli JM109(Toyo-Boseki)。从所得的转化体中，基本按Molecular Cloning(Sambook et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，(1989))中描述的方法制备质粒DNA。此后，用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequencing盒(AppliedBiosystems)和Applied Biosystems 373A DNA测序仪确定纯化的质粒DNA的核苷酸序列。结合，证实编码dH33，A33′，T33′，dG116，dR117，A116′，G116′和N116′的所有质粒均含有预期的TPO cDNA序列，而且除在所需的位点外，没有任何核苷酸序列的取代。此外，在G33′中，观察到碱基取代[Pro38(CCT)→Ser(TCT)]，但不是在所需的位点上。
按实施例11中的方法，将所得的各克隆转染到COS7细胞中。总之，用包括氯喹处理的DEAE-葡聚糖方法，用10μg各质粒DNA完成转染，4到5天后，回收培养物上清液，然后用M-07e检测系统评估。结果，在用编码氨基酸插入或缺失衍生物的质粒转染的各COS7细胞培养物上清液中，检测到TPO活性为剂量依赖方式(见图23)。相反，在转染并表达不含有编码TPO衍生物之cDNA的表达质粒pEF18S的COS7细胞培养物上清液中没有TPO活性。
<实施例69>
制备并纯化抗-人TPO肽抗体(1)从SEQ ID NO191的人TPO氨基酸序列中，筛选出认为相对来讲适宜于作为抗原的6个区域(示于表8)，用Tam的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5409-5413，1988)从中合成多抗原肽(MAP)型的四-链肽。每次用100μg该肽免疫2次兔，免疫8次。
不考虑上述情况外，将Cys残基与SEQ ID NO119-124所示之各肽区(分别称为肽区HT1-6区，它们分别对应于SEQ ID NO191之序列8-28，47-62，108-126，172-190，262-284，和306-332的部分肽)的C-末端结合而生产单链肽。用这些作为检测抗原，用酶-免疫检测法检测从由此免疫的兔的血清中的抗体值，在所有被检血清中，均发现了抗体值的增加。因此，这些血清称为抗-血清。
另外，再用上述单链合成肽(在其C-末端结合有Cys残基)作为抗原在下列(2)中亲和纯化抗-血清。
(2)用上述抗原肽之一分别免疫两只兔，从所免疫的兔中，分别制备抗体。具体地说，对于抗-HT1肽抗体从两只免疫兔中得到抗-HT1-1肽抗体和抗-HT1-2肽抗体。
作为一个实施例，下文举例说明抗-HT1-1肽抗体的纯化。
首先，将30mg HT1的单链肽(其上结合有Cys残基)偶联到12ml Sulfo Link Coupling Gel(由Pierce Co.，生产，商品号44895)上。具体地说，在l5分钟的时间内，将含抗原的肽溶液偶联到经6倍凝胶体积的偶联缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA-Na，pH8.5)平衡的凝胶上。然后按原样使其静置30分钟，用3倍凝胶体积的偶联缓冲液洗涤凝胶。接着将含0.05M L-cys-HCl的偶联缓冲液以1ml/ml-凝胶的速率加凝胶中，这样在15分钟的时间内使未处理的基团阻断。按原样静置30分钟后，用8倍凝胶体积的偶联缓冲液洗涤凝胶。在室温下完成上述偶联反应。用这种方法，将含抗原区的肽以28.3％的偶联率通过共价结合偶联到凝胶上，以便在抗原柱中制备1ml凝胶上偶联0.8mg肽的抗原肽凝胶。从各免疫兔收集了全部血液后，得到78.4ml含抗-HT1-1肽抗体的抗-血清。将76.7ml抗-血清(蛋白质含量3620mg)加到预先经含150mMNaCl和0.05％叠氮钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH8)平衡的抗原柱上，然后用相同的缓冲液洗涤。因此得到105.9ml流出级分(蛋白质含量3680mg)。接着用0.1M柠檬酸(pH3.0)洗脱吸附的级分，随后通过加入21.1ml 0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.9)使其立即中和，用超滤(用由Amicon Co.生产的YM30膜)浓缩，并在含150mMNaCl和0.05％叠氮钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH8)纯化。因此，在缓冲液中得到11.2ml纯化的抗-HT1-1肽抗体(蛋白质含量77.7mg)。用与上述相同的方法，得到抗-HT1-2肽抗体(60.Omg)，抗HT 2-1肽抗体(18.8mg)，抗-HT2-2肽抗体(8.2mg)等。
用与上述相同的方法，得到抗-HT3到抗-HT6肽抗体。
<实施例70>
TPO Western分析的检测(1)为了评估实施例69中所得的抗-血清，用下列方法检测它们。
按常规方法将从CHO细胞之培养物上清液部分纯化的标准重组人TPO样品进行SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)，然后在PVDF或硝酸纤维素膜上电印迹，在所述CHO细胞中已导入并表达了编码SEQ IDNO6之氨基酸-21到332的基因。印迹后，用20mM Tris-HCl和0.5M NaCl(pH7.5)(TBS)将该膜洗涤5分钟，然后用含0.1％Tween20的TBS(TTBS)洗5分钟，洗2次，再用阻断剂(BlockAce；由Dai-Nippon Pharmaceutical Co.生产的，商品号UK-B25)处理60分钟。用含0.05％BSA和10％Block Ace的TTBS溶液将含抗-HT1-1肽抗体、抗-HT2-1肽抗体、抗-HT3-2肽抗体、抗-HT4-1肽抗体、抗-HT5-2肽抗体和抗-HT6-1肽抗体之一的各抗-血清稀释到1/1000的稀释度。用由此稀释的抗体作为第一抗体进行Western检测。准确地说，用含抗-TPO肽抗体、0.05％BSA和10％Block Acl的TTBS溶液将按上述加工的重组人TPO样品处理60分钟，然后TTBS洗涤5分钟。接着用含抗-兔(ab′)山羊生物素化的抗体(由Caltag Co.生产，商品号L43015)作为第二抗体，以及0.05％BSA和10％Block Ace的TTBS处理60分钟，然后用TTBS洗两次每次5分钟。接着，用由含10％Block Ace的TTBS溶液以1/5000稀释的碱性磷酸酶-标记的抗生物素蛋白(由Leinco Technologies Co.生产的，商品号A108)处理30分钟，其后用TTBS洗涤2次，每次5分钟，然后用TBS洗5分钟。接着用碱性磷酸酶底物(由Bio-Rad Co.，生产的，商品号170-6432)显色。于室温下完成上述的Western检测，从而证实抗-血清可以识别并检测人TPO。
(2)将经实施例69中的亲合层析纯化的各3mg的抗-HT1-1肽抗体，抗-HT1-2肽抗体，抗-HT2-1肽抗体和抗-HT2-2肽抗体称重并通过使其偶联到活化的生物素(NHS-LC-BiotinII，由Pierce Co.，生产的，商品号21336)上使其生物素化。将与上述(1)所用的相同的标准重组人TPO样品进行SDS-PAGE，然后在PVDF或硝酸纤维素膜上电印迹，用生物素化的各抗体作为第一抗体，进行常规的Western检测。印迹后，马上用TBS将膜洗5分钟，再用TTBS洗2次，每次5分钟，接着用阻断剂(Block Ace)处理60分钟。然后，用含1μg/ml生物素化的抗-TPO肽抗体、0.05％ BSA和10％Block Ace的TTBS溶液处理60分钟，然后用TTBS洗涤2次，每次5分钟。接着再用由含10％Block Ace之TTBS溶液以1/5000稀释的碱性磷酸酶-标记的抗生物素蛋白(由LeincoTechnologies Co.生产的，商品号A108)处理30分钟，其后用TTBS洗涤2次，每次5分钟，再用TBS洗涤5分钟。用碱性磷酸酶底物(由Bio-Rad Co.生产的，商品号170-6432)显色。在室温下完成上述的Western检测，确证，由纯化的抗体可识别并检测人TPO。
<实施例71>
制备抗-TPO肽抗体柱并检测人TPO确证在实施例69中得到的抗-人TPO肽抗体识别人TPO。将这些抗体分别偶联到层析载体上以制备抗-TPO肽抗体柱。作为一个实例，下面说明抗-HT1-2肽抗体柱的制备。
(1)制备含50mM磷酸钠和0.15M NaCl(pH8.0)以及5mg/ml抗体的溶液。将0.8ml该溶液然后将1.54ml肿胀的甲酰基活化的凝胶(Formyl-Gellulofine，由Chisso Co.生产)于4℃混合并偶联2小时。接着，向其中加入1.1ml含10mg/升还原剂(三甲胺甲硼烷(TMAB)，由Seikagaku Kogyo K.K.生产的，商品号为680246)溶液，使其与之再偶联4小时。然后离心从反应混合物中只回收凝胶部分。向其中加入10ml纯水，经离心只回收凝胶部分。将该过程重复4次以除去未反应的抗体。然后用2.1ml阻断缓冲剂(0.2M磷酸钠，1M乙醇胺，pH7.0)和已加入其中的1.1ml还原剂溶液于4℃将由此回收的凝胶处理2小时，以阻断未反应凝胶中的活性基团。最后，用一离心机，由水、20mM Tris-HCl和0.15M NaCl(pH8.0)洗涤所得的凝胶。将所得凝胶填于小柱试管中，用3M硫氰酸钠和0.1MGly-HCl(pH2.5)溶液洗涤并用20mM Tris-HCl和0.15M NaCl(pH8.0)平衡。贮存所得的平衡柱。
在抗-HT1-2抗体柱中，抗-TPO肽抗体凝胶对于各IgG级分的偶联率高达94.2％。偶联到每单位体积凝胶上的IgG级分的量为1.9mg/ml-凝胶。用与上述相同的方法，制备在每ml凝胶上偶联有21.8mg IgG的凝胶，所述IgG不含作为抗原的TPO。用其作为前一柱(下文称为前抗体柱)以便按(2)中所述，从TPO抗体柱中除去非特异性结合的分子。
(2)下文说明制备抗-MT1-2抗体柱的另一个实例。
将从CHO细胞培养物上清液部分纯化的重组人TPO的标准样品加到(1)中制备的前一抗体柱(含1ml凝胶)，用10倍凝胶体积的20mM Tris-HCl(pH8.0)和0.15M NaCl通过该柱，收集通过该柱的级分，所述CHO细胞中已导入并表达编码SEQ ID NO119-124之任何氨基酸序列的基因。接着，用10倍于凝胶体积的酸性洗脱剂(0.1M Gly-HCl，pH2.5)洗脱吸附到前一抗体柱上的级分。然后，将已从前一抗体柱流出的级分加到(1)中制备的抗-HT1-2抗体柱(含2ml凝胶)中，用10倍凝胶体积的20mM Tris-HCl(pH8.0)和0.15M NaCl洗涤该柱，同时收集流过抗-HT1-2抗体柱的级分。用8倍凝胶体积的酸性洗脱剂(0.1M Gly-HCl；pH2.5)洗脱吸附到抗-HT1-2抗体柱上的级分。用SDS-PAGE分析这些级分，证明TPO并未吸附到前一抗体柱上，而是与抗-HT1-2抗体柱特异性结合，而且所加入样品中的几乎所有TPO均与后者柱结合。由此证实，在后一种柱中，至少200到300μg/ml-凝胶的TPO与凝胶结合。
<实施例72>
TPO对于增加血小板数的作用将20只8周龄的正常ICR株雄性小鼠，(已从其眼眶静脉收集血液；且用Toa Iyo Denshi制造的微细胞计数计F-800已测量血小板数)随机分成四组。用100μl PBS静脉内注射四组之中的一组(对照-iv组)，每天一次连续5天。用100μl溶液(通过经NAP-25柱[Pharmacia Biotech；商品号17-0852-02]的PBS取代实施例56中得到的SP Sepharose Fast Llow之TPO活性级分F2的浓缩溶液，然后用PBS稀释而制备的，经M-07e检测相对活性为211，900)静脉内注射另一组(TPO-iv组)，每天注射一次，连续5天。用100μl PBS皮下注射另一组(对照-SC组)，每天一次连续5天，同时用与TPO-iv组中相同的方法，用100μl皮下注射剩下的一组(TPO-SC组)，每天一次，连续5天。从开始施用的6，8，10，13和15天后，从各小鼠的眼眶静脉收集血液并用微细胞计数器(F-890，由Toa Iyo Denshi制造)计数血小板数。图24中给出了血小板数的变化情况。因此，在对照-iv组中，甚至在血小板数量高的第6天(施用的那天为0天)，与施用前相比，血小板数增加了44％，在对照-sc组中，即使在数目最高的第8天，也只增加了47％，另一方面，在TPO-iv组中，在第6天，与施用前的数目相比，增加了177％，在TPO-sc组中，在第6天已增加了347％，在第8天，最高增加了493％。
从上述结果看，可以证实人TPO增加血小板数，不依赖于类型和施用途径的不同。
<实施例73>
TPO对于增加血小板数的作用将16只11周龄的正常C3H/HeJ株雄性小鼠(已从其眼眶静脉收集血液并用Tao Iyo Denshi制造的微细胞计数器F-800型测量了血小板数)随机分成4组。用100μl PBS皮下注射1组(对照组)每天一次，连续5天。用100μl溶液(通过用经NAP-25的PBS取代实施例56中得到的Sepha cryl S-200HR的TPO活性级分，再用PBS稀释而制备的，经M-07e检测，相对活性为83,000)皮下注射另一组(TPO-1组)，每天一次，连续5天。用100μl溶液(通过用PBS将TPO-1组所用的TPO活性级分稀释2倍而制备的；经M-07e检测，相对活性为41,500)皮下注射另-组(TPO-2组)，每天一次，连续5天。用100μl溶液(通过将TPO-2组所用的TPO活性级分稀释2倍以上而制备的；经M-07e检测，相对活性，20,750)皮下注射最后一组(TPO-3组)，每天一次，连续5天。
在注射后的第6，8，10和12天，从小鼠的眼眶静脉收集血液并用微细胞计数器(F-800型，由Toa Iyo Denshi制造)计数血小板数。
图25中给出了血小板数的变化情况。因此，在对照组中，血小板数几乎没有变化，在注射TPO的组中，在注射后的第8天，所有组中的血小板数均增加到数目最高的程度。另外，在各组之间，存在剂量反应的差异。因此，在TPO-1组中，在第6天，已有约200％的增加，在第8天，增加达到约270％，然后既使在第12天有所降低，但仍有约65-％的增加，因此与对照组有显著的差异(p＜0.01；由Dunnet多比较检验得出)。在TPO-2组中，尽管增加作用小于TPO-1组，但仍发现了相同的增加，在第6和8天，分别增加了约140％和约160％。在第12天，数目降低到与对照组几乎相同的水平。TPO-3组的增加作用弱于TPO-2组，在数目最高的第8天，约有11O-％的增加，与对照组仍有显著性差异(p＜0.01)。
从上述结果看，可以确定人TPO独立于小鼠的种系而增加小鼠的血小板数，而且其作用有剂量反应特性。
<实施例74>
TPO对因施用抗癌剂而导致的血小板减少症的抑制作用用200mg/kg 5-FU静脉内注射30只8周龄的雄性ICR小鼠，然后随机分成2组(每组15只小鼠)。下一天开始(第1天)，一组(对照组)用100μl PBS皮下注射，每天一次，连续5天，而另一组(TPO组)用100μl实施例72中所用的TPO活性级分(经M-07e检测相对活性为211,900)皮下注射，每天一次，连续5天。在第4、6和8天，从每组中随机选5只小鼠，然后从眼眶静脉收集血液并用微细胞计数器(E-2500型，由Toa Iyo Denshi制造)对血小板计数。图26中列出了血小板数的变化情况。因此，在对照组中，施用5-FU后，随着时间的推移，血小板数而降低，在第6天，血小板数值最低(为施用5-FU之前的值的28％)，而在第8天，因降低反应而增加约1.3倍。甚至在TPO组中，施用5-FU后，随时间的推移，血小板数降低，而且在第6天，数值最低(为施用5-FU之前的值的约52％)。然而，在第4和6天，血小板数之间的差异很小，而在第6天与对照组相比，保持了明显(p＜0.05；因Dunnet Multiple比较检验测得)的高值。在第8天，与施用5-FU前的值相比，增加约200％。
从上述结果可以确定，人TPO抑制由抗癌剂引起的血小板数降低。
<实施例75>
TPO对血小板减少症的治疗作用将盐酸嘧啶哑硝脲(ACNU)(50mg/kg)静脉内注射给36只7周龄的ICR雄性小鼠，然后将小鼠随机分成2组(每组18只小鼠)。从下一天起(第一天)，用200μl PBS皮下注射一组(对照组)，每天两次，连续数天，用200μl实施例73中所用的TPO活性级分(未用PBS稀释)注射另一组(TPO组)，每天2次，连续数天，所述TPO活性级分中加有0.04％的Tween80(经M-07e检测，相对活性为380,000)。
注射后，将各组中的小鼠随机分成3组-在第5天和12天从一组中收集血液；在第8天和14天，从另一组中收集；在第10天，从剩下的组中收集。从眼眶静脉收集血液并用微细胞计数器(F-800型，由Toa Iyo Denshi制造)计数血小板数。图27中列出了血小板数的变化情况。因此，在对照组中，施用ACNU后，随时间的推移，血小板数降低，而在第8-10天，数值最低(为施用ACNU前之值的约29％)，但在第12和14天，只分别恢复到约49％和约74％。另一方面，在TPO组中，在第5天，降低到施用ACNU前之值的约38％，然后开始逐渐增加。因此，在第8天，恢复到ACNU施用前之值的约63％，而在第10天，血小板数大于施用ACNU前的值。在第12和14天，分别增加了约300％和约400％。
正如上述所述，在对照组中观察到降低的第8-10天，在TPO组中已观察到增加，而在第10天，血小板数就高于施用ACNU前的值。因此，可以确定，人TPO可以促使因抗癌剂引起的血小板减少症的恢复。
在同样考虑实施例74中的结果后，现在可以期望，人TPO可独立于抗癌剂的类型抑制血小板数的降低并促进血小板减少症的恢复。
<实施例76>
在BMT后，TPO对血小板减少症的治疗作用用10Gy的放射性辐射对48只7周龄的C3H/HeN株雄性小鼠进行全身照射，接着立即用来自相同株之小鼠的1×106骨髓细胞静脉内注射。然后将小鼠随机分成2组，从下一天(第1天)起，用PBS注射一组(对照组)，而用实施例73中所用的TPO活性级分(经M-07e检测，相对活性为44,000)注射另一组(TPO组)，两组均是经皮下注射，剂量100ml，每天一次，连续20天。
注射开始后，在第5，10，14和21天，每次随机选6只小鼠，从其眼眶静脉收集血液，用微细胞计数器(E-2500型，由ToaIyo Denshi制造)计数血小板数。
图28中列出了血小板数的变化情况。因此，在所有组中，在应用BMT后，随时间的推移，血小板数降低，而在第10天，数目最低(为应用BMT前数的约3％)。此后，逐渐恢复，第14天时，对照组和TPO组中的数目分别为约11％和约13％。在第21天，对照组中只恢复到约37％，而在TPO组中，恢复到约65％，因此，观察到显著的恢复促进作用。从上述结果可以得出实施例56中制备的人TPO促进应用BMT后血小板数的恢复。
<实施例77>
用射线照射后，TPO对血小板减少症的治疗作用用5Gy的X-射线对36只8周龄的ICR株雄性小鼠进行全身照射，然后随机分成2组。从下一天(第一天)开始，用PBS注射一组(对照组)，用实施例73中所用的TPO活性级分(经M-07e检测，相对活性为1,440,000)注射另一组(TPO组)，两组均是皮下注射，每天一次，连续3天，然后，从下一天开始，皮下注射(由M-07e检测，相对活性为360,000)，每天一次连续7天。注射开始后，将每组再随机分成3组-在第4，11和12天从一组中收集血液，在第7和13天，从另一组中收集；在第9和15天从剩下的一组中收集。从眼眶静脉收集血液并用微细胞计数器(F-800型；由Toa Iyo Denshi制造)计数血小板数。在图29中列出了血小板数的变化情况。在对照组中，用X射线照射后，随时间的推移，血小板数降低，在第9天，数目最小(是用X射线照射前之数目的约25％)。在第11和13天，数目分别恢复到约38％和约67％，在第15天，恢复到用X射线照射前的值。在TPO组中，在第7天，数目降低到用X射线照射前之数目的约24％。此后，开始增加，第9天数目恢复到约82％。在第11天和以后的时间里，血小板数超出了用X射线照射前的数，而且到第21天，均保持了这种趋势。如上所述，在对照组中，其数目仍趋于降低的第9天，在TPO组中的血小板数已开始增加，并且在第11天，血小板数目超过了用X射线照射前的数目，而且在此后均保持增加。另一方面，在对照组中，恢复到用X射线照射前的数目需15天。从这些结果可以得出在实施例56中生产的人TPO缩短了用X射线照射后，从血小板数目减少开始恢复所需的时间，而且对于用X射线照射后的血小板减少症有治疗作用。
<实施例78>
hTPO163增加血小板数的作用将15只已从其眼眶静脉收集过血液并用微细胞计数器(F-800型；由Toa Iyo Denshi制造)测量过血小板数的15只C3H/HeN株健康雄性小鼠随机分成四组-一组为对照组，剩下的为A、B和C组。用含0.1％来自小鼠的血清的PBS皮下注射第一组(对照组)，每天一次，连续5天。以约40,000,000，约8,000,000和约1,600,000/kg体重/天(以经M-07e检测的hTPO163的相对活性计)的剂量，用实施例65中得到的SP Sepharose Fast Flow的TPO活性级分皮下注射A、B和C组，连续5天，所述TPO活性级分用含0.1％小鼠血清的PBS稀释。
在注射后的第6，8，10和12天，从各小鼠的眼眶静脉收集血液，用微细胞计数器(F-800型由Toa Iyo Denshi制造)计数血小板数。在图30中列出了血小板数的变化情况。
因此，在对照组中，血小板数目几乎没有变化，而在TPO组中，注射后第8天所有小鼠血小板数目增加达到最高值。在每个TPO组中，均观察到剂量反应关系。在A组中，在第6和8天，分别有约88％和约100％的增加，甚至在第10天，仍有约97％的增加，因此，所有数据均与对照组有显著差异(p＜0.01，经Dunnet多比较检验)。在B组中也观察到相似的增加，但增加的程度低于A组，在第6和8天，分别增加约65％和约84％，表明与对照组有显著差异(p＜0.01或0.05，经Dunnet多比较检验得到)。在C组中的增加低于B组中的。在数目最高的第8天仍有约31％的增加。从上述结果可以证实实施例65中制备的hTP0163可增加血小板数，而且其作用表现为剂量反应关系。
<实施例79>
hTPO163对血小板减少症的治疗作用用50mg/kg的盐酸嘧啶哑硝脲(ACNU)静脉内注射100只8周龄的C3H/HeN株雄性小鼠，然后随机分成四组-一个对照组，和A、B、C组，每组25只小鼠。从下一天(第1天)，用5ml/kgPBS皮下注射对照组，每天一次，连续几天，以约16,000,000，约48,000,000和160,000,000/kg体重/天(以经M-07e检测的hTPO163的相对活性计)的剂量，用实施例65中得到的用PBS稀释之SP Sepharose Fast Flow的TPO活性级分皮下注射A、B、C组，每天一次，连续几天。注射开始前，将每组小鼠再分成5组，然后在第5，8，10，12和14天收集血液。从其眼眶静脉收集血液，用微细胞计数器(E-2500型；由Toa Iyo Denshi制造)计数血小板数。在图31中列出了血小板数的变化情况。在对照组中，施用ACNU后，随时间的推移，血小板数减少，在第8-10天，达到最低值(是ACNU施用前之值的约15-16％)，在12和14天，只有很小的恢复，分别为约28％一约51％。另一方面，在A组中，第8天时，数目减少到施用ACNU前的约25％。但此后，逐渐增加并在第10天和12天分别恢复到约34％和约89％。在第14的数目大于施用ACNU前的数目。
如上所述，尽管在所有组中，第8天观察到最少的血小板数目，而在施用了人TPO的组中，在血小板数最低时，降低的程度低于对照组。在对照组中，甚至在第10天，血小板数也几乎没有恢复，而在施用TPO的组中，尽管程度不同，但在所有组中均有血小板数的恢复。在施用50μg/kg的组中，均有恢复，在第12天，已经比施用ACNU前的数目高了。经过比较，在对照组中，甚至在第14天，只恢复到ACNU施用前的约51％，因此清楚地表明，实施例65中产生的hTPO163有利促进从血小板数的减少的恢复。这样，也证明hTPO163对因抗癌剂引起的血小板减少症有治疗作用。
下面是药物制剂的实施例。
<实施例80>
将实施例56中得到的人TPO级分浓缩，经灭菌处理并在-20℃冷冻以得到用作注射制剂的冷冻产物。
<实施例81>
将实施例56中得到的人TPO级分浓缩，将其5ml用无菌操作装在10ml小瓶中，于-20℃冻干，用橡胶塞子塞上小瓶以得到用作注射制剂的冻干物质。
<实施例82>
将实施例56中得到的人TPO级分浓缩，经无菌过滤并装在10ml小瓶中以得到可用作注射制剂的产品。
<实施例83>
浓缩实施例65中得到的hTPO163级分，经无菌处理并于-20℃冻干以得到可用作注射制剂的冷冻产品。
<实施例84>
浓缩实施例65中得到的hTPO163级分，用无菌操作将其5ml装在10ml小瓶中，于-20℃冻干，然后用橡胶塞密封小瓶以得到可用作注射制剂的冻干产品。
<实施例85>
浓缩实施例65中得到的hTPO163级分，经无菌过滤并装在10ml小瓶中以得到可用作注射制剂的产品。
<实施例86>
浓缩实施例57中得到的人TPO级分，经无菌处理并于-20℃冷冻以得到可用作注射制剂的冷冻产品。
<实施例87>
浓缩实施例57中得到的人TPO级分，用无菌操作，将其5ml装在10ml小瓶中，于-20℃冻干并用橡胶塞密封以得到可用作注射制剂的冻干产品。
<实施例88>
浓缩实施例57中得到的人TPO级分，经无菌过滤并装在10ml小瓶中以得到可用作注射制剂的产品。
<实施例89>
再生障碍的犬血浆除对受者进行450拉德的全身放射外，按[Mazur，E.andSouth，K.Exp.Hematol.131164-1172(1985)；Arriaga，M.，South K.，Cohen J.L.and Mazur，E.M.Blood69486-492(1987)；Mazur，E.，Basilico，D.，Newton，J.L.，Cohen，J.L.，Charland，C.，Sohl，P.A.，and Narendran，A.Blood761771-1782(1990)]所述生产肝素化的再生障碍的犬血浆(“APK9”)或正常的犬血浆(“NK9”)。
<实施例90>
人巨核细胞检测在广为人知的分子生物学手册，如Sambrook等人(Eds)的Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1987)和Ausubel等人(编)的Current Protocols inMolecular Biology，Green associates/Wiley Interscience，New York(1990)中提供了在下列实施例中描述的许多过程的标准方法或其它适宜的方法。
检测APK9和分离的APK9刺激从CD34+祖代细胞发育成人巨核细胞的能力。按(Hokom，M.H.，Choi，E.Nichol，J.L.，Hornkohl，A.，Arakawa，T.and Hunt，P.Molecular Biologyof Haematopiesis315-31，1994)所述从外周血细胞得到的CD34筛选细胞并在下列培养基中培养用1％Glutamine Pen-strep(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)和10％肝素化的少血小板的人AB血浆补充的Iscove′s改良的Dulbecco′s培养基(IMDM；GIBCO，Grand Island，NY)。还包含2-巯基乙醇(10-4M)、丙酮酸(110μg/ml)、胆固醇(7.8μg/ml)、腺苷、鸟嘌呤、胞苷、尿苷、胸苷、2-脱氧胞嘧啶、2-脱氧腺苷、2-脱氧鸟苷(各10μg/ml，Sigma)、人重组胰岛素(10μg/m1)、人转铁蛋白(300μg/ml)、大豆脂(1％，Boehringer Mannheim Indianapolis，IN)、人重组碱性纤维细胞生长因子((2ng/ml)、Genzyme，Cambridge，MA)、人重组表皮生长因子(15ng/ml)、血小板衍生的生长因子(10ng/ml，Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA)。将CD34-筛选细胞以2×105ml铺在Terasaki-型微滴板(Vanguard，Inc.Neptune，NJ)孔中的培养(终体积15μl)。在37℃，将细胞在潮湿箱中的5％CO2空气中培养8天，用含1％戊二醛直接固定到培养孔中，然后与单克隆闪烁液(抗-GPIb，抗-GP IIB，(Biodesign)和抗-GpIb(Dako，Carpinteria，CA)一起保温。用抗生蛋白链菌素-β-半乳糖苷酶检测系统(HistoMark，Kirgegaard and Perry)使免疫反应显色。用一倒置相显微镜以100×放大计数兰色的巨核细胞。将结果表示成每孔巨核细胞的平均值+/-平均值的标准误(SEM)。在一些情况下，用“巨核细胞单位/ml”表示数据，其中，将所给样品诱导巨核细胞发育的程度标准化成那个实验的阳性APK9对照。1单位指使巨核细胞与1μl APK9标准物达到相同数目巨核细胞的物质量。如果可用5-10μg/ml MPL-X阻断活性，则可由MPL配体而表明其活性(可溶的MPI受体)。
在该系统中，已表明APK9含有刺激人巨核细胞发育的因子。CD34-筛选细胞与10％NK9一起培养8天，只有可忽视不计的兰色巨核细胞，而CD34-筛选细胞与10％ APK9一起培养8天有大量的兰色巨核细胞。
图32表明将浓度逐渐增加的MpI-X加到人巨核细胞培养系统中，其对巨核细胞发育的阻断作用也逐渐增加。在MpI-X的浓度大于5μg/ml时，为完全抑制。在该实验中，用5％APK9刺激CD34-筛选细胞。这表明，与MpI-X相互作用的活性(推测的MpI配体)对于人巨核细胞发育是必需的，而且表明在APK9中存在MpI配体。
本文还说明，对于人巨核细胞发育必需的MpI配体活性存在于APK9中。在Iscove′s培养基中，将APK9(135m1)稀释6倍，并用于MpI-X亲合柱。收集未结合的物质(流出物)并在检测前浓缩至原体积。用10ml 1M NaCl洗脱结合的物质，透滤20％的收集物并浓缩4倍用于检测。在培养基中单独培养CD34-筛选细胞并不能发育成巨核细胞。在5％APK9(与用于柱的相同的收集物)培养的细胞发育成48+/-8个巨核细胞/孔。在10％未结合物质中培养的细胞不能发育成巨核细胞。在10％洗脱收集物中培养的细胞发育为120+/-44个巨核细胞/孔。在检测中，用5μg/ml MpI-X就可基本完全抑制装样柱和洗脱收集物的活性。
<实施例91>
将鼠或人MpI受体转染到鼠细胞系中A.鼠MpI受体将全长鼠MpI受体cDNA亚克隆到含有得自Moloney鼠肉瘤肿瘤病毒之LTP的转录启动子的表达载体中。将5μg该构建体和1μg选择性标记质粒pWLNeo(Stratagene)共穿孔到IL-3依赖性小鼠细胞素(32 D，cline23；Greenberger et al，DNAS802931-2936(1983))中。将细胞培养5天后回收，然后在含800μg/mlGeneticin(G418，Sigma)和1ng/ml鼠IL-3的选择培养基中培养细胞。将存活的细胞以每个小库2×105个细胞分成多个小库，然后继续培养直到长出可进行进一步分析的数量。通过使用多克隆兔抗肽血清的FACS分析检测了6个细胞群表面表达MpI受体的情况。用与前述相同的抗肽血清，选择一个FACS分型的细胞群。通过在10％APK9和Geneticin中生长而筛选亲本细胞系的一个细胞克隆。在APK9中筛选35天后，将细胞保持在1ng/ml鼠IL-3中。用一个亚克隆1A6.1进行该工作。
B.人MpI受体将全长人MpI受体序列(Vigon，I et al，DNAS 895640-5644(1992))亚克隆到含有Maloney鼠肉瘤肿瘤病毒转录启动子的表达载体(与鼠受体的相同的载体)中。用CaPO4哺乳动物转染盒(Stratagene)，将6μg该构建体和6μg两性的反转录病毒的包装构建体(Landu N.R.Littman，D.R.，J.Virology 665110-5113(1992))转染到3×106293细胞中。2天后再转染相同的细胞，4天后再进行一次。最后一次转染后的那天，将293细胞与IL-3依赖性鼠细胞系(32D，clone23；Greenberger et al，PNAS802931-2936(1983))一起培养。24小时后，拯救32D细胞并在BSA梯度中(Path-o-cyte；Mills，Inc.)形成条带。在1ng/ml鼠IL-3中扩展细胞并于20％APK9中筛选生长。通过使用多克隆兔抗肽血清的FACS根据细胞受体的表面表达而对细胞进行分类。随后用这些细胞进行检测。
<实施例92>
MpI配体的1A6.1检测洗涤1A6.1细胞使之不含IL-3并以1∶1系列稀释受试样品将细胞再放在Terasaki-型微滴盘的补充有10％胎牛血清(FCS)、Geneticin(800μg/ml)和1％青霉素/链霉素(Gibco)αMEM(Gibco)中(1000细胞/15μl总col/孔)。48小时后，经显微镜确定每孔中的活细胞数。1个活性单位指每孔中得到200个活细胞的活性量。如果在检测中，加入5-10μg/ml MpI-X可完全阻断所述活性，则活性是指MpI配体的。在APK9中，MpI配体活性平均为4400+/-539单位/ml发育不全的血浆。除非特别说明，在1A6.1检测中定义了MpI配体活性的单位。
基本按与用1A6.1细胞相同的方法完成用人MpI受体基因转染的细胞进行的检测。
<实施例93>
证明MpI-配体存在于小鼠、狗、猪和人源之血清的再生障碍的血浆中MpI配体存在于鼠、犬、猪和人源之血清的再生障碍血浆中(表9)。在照射前和照射(500拉德)后12天从BDF1小鼠中收集血浆。在1A6.1检测中检测血浆，结果表明用MpI-X(10μg/ml)基本上可完全抑制2000单位/ml活性。在人巨核细胞检测中，照射的小鼠血浆也是阳性的，其活性为1833单位/ml，从照射前和照射(450拉德)10天后的狗中收集血浆。在1A6.1检测和人巨核细胞检测中检测活性。在两个检测中均可检出活性，且用MpI-X(10μg/ml)均可完全抑制活性。照射前和照射(650拉德)后10天从猪中收集血浆。在1A6.1检测和人巨核细胞检测中检测血浆。在这两个检测中，显示出MpI配体活性(由10μg/ml MpI-X可抑制)可与在再生障碍犬的血浆所见的相比。从再生障碍的人中得到其血清。从骨髓移植患者中收集该物质。在1A6.1检测中检测6个患者的血清，其活性为903单位/ml，其中的88％是由MpI配体(用10μg/mlMpI-X可抑制)造成的。在人巨核细胞检测中，检测14个再生障碍患者的血清。作为一组，它们表现出基本活性，为941巨核细胞单位/ml，可用10μg/ml MpI-X完全加以抑制。包括鼠IL-3数据以说明1A6.1检测特异性。尽管该重组细胞激活素诱导细胞的生长，但是10μg/ml MpI-X无法阻断它。
表9种 1A6.1细胞检测 人巨核细胞检测(单位/毫升) (巨核细胞单位/ml)基质+MpI-X基质 +MpI-X正常小鼠 0+/-0 0+/0 0+/-0 -0+/-O再生障碍小鼠 200001833 未作正常犬 0+/-0 0+/-00+/-0 0+/-0再生障碍犬 4400+/-539 0+/-0792+/-128 0+/-0正常猪 0+/-0 0+/-00+/-0 0+/-0再生障碍猪 3866+/-1136 0+/-01284+/-182 10+/-10正常人 0+/-0 0+/-00+/-0 0+/-0再生障碍人 903+/-64114+/-33 941+/-178 0+/-0鼠IL-3 6000+/-565 6000+/-565 未作 未作<实施例94>
制备在E.coli系统中表达的人TPO衍生物为了提高生物活性、稳定性和可溶性，设计几种TPO衍生物并在E.coli中表达。用前述SEQ ID NO11的氨基酸序列得到的衍生物包括Arg取代129位Leu的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg129]TPO(1-163)(也称为L129R)；Arg取代133位His的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg133]TPO(1-163)(也称为H133R)，Arg取代143位Met的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg143]TPO(1-163)(也称为M143R)，Leu取代82位Gly的[Net-2，Lys-1，Ala1，Val3，Leu82]TPO(1-163)(也称为G82L)，Leu取代146位Gly的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Leu146]TPO(1-163)(也称为G146L)，Pro取代148位Ser的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Pro148]TPO(1-163)(也称为S148P)，Arg取代59位Lys的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg59]TPO(1-163)(也称为K59R)，Arg取代115位Gln的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg115]TPO(1-163)(也称Q115R)。
为了制备TPO衍生物，用实施例42中描述的h6T(1-163)作为模板，合成有下列序列的oligo核苷酸L129R5′-ATCTTCCGTTCTTTCCAGCACCT-3′(用于制备由Arg取代SEQ ID N011所示之序列中的Leu-129的Arg-取代衍生物)；H133R5′-TCTTTCCAGCGTCTGCTGCGT-3′(用于制备由Arg取代SEQ ID N011所示之序列中的His-133的Arg-取代衍生物)；M143R5′-CGTTTCCTGCGTCTGGTTGGC-3′(用于制备由Arg取代SEQ ID N011所示之序列中的Met-143的Arg-取代衍生物)；G82L5′-GGCCAGCTTCTGCCGACCTGCCT-3′(用于制备由Leu取代SEQ ID NO11所示之序列中的Gly-82的Leu-取代衍生物)；G146L5′-ATGCTGGTTCTGGGTTCTACCCT-3′(用于制备由Leu取代SEQ ID NO11所示之序列中的Gly-146的Leu-取代衍生物)；S148P5′-GTTGGCGGTCCGACCCTGTGCG-3′(用于制备由Pro取代SEQ ID NO11所示之序列中的Ser-148的Pro-取代衍生物)；和K59R5′-GAAGAGACCCGCGCTCAGGACATCC-3′(用于制备由Arg取代SEQ ID NO11所示之序列中的Lys-59的Arg-取代衍生物)；Q115R；5′-CTGCCGCCACGTGGCCGTACCAC-3′(用于制备由Arg取代SEQ ID NO11所示之序列中的Gln-115的Arg取代衍生物)。
用Sculptor体外诱变盒(Amersham)构建突变质粒。将得自实施例42中所述之pCFM536/h6T(1-163)的XbaI-HindIII片段导入用XbaI和HindIII消化后的Bluescript II SK(-)噬菌粒载体(Stratagene，California USA)以得到质粒pSKTPO，然后转化到E.coli JM109中。用辅助噬菌体M13K07(Takara Shuzo，Japan)从pSKTPO制备用于诱变的单链DNA。用上述的oligo核苷酸，按供应商的说明，将突变导入TPO基因。按供应商的说明用DNA测序盒(Applied Biosystems，USA)完全测序分析并确定了TPO的突变。
将从突变的pSKTPO制备的XbaI-HindIII片段导入用XbaI和HindIII消化的pCFM536中。将携带突变基因的质粒pCFM536转化到E.coli#261中以得到表达TPO衍生物基因的转化体。
按前述实施例43，培养用突变的pCFM536转化的E.coli#261。收集纯化体的细胞颗粒并在冷冻器中贮存至少1天。将冷冻的细胞颗粒(3g)悬浮在含10mM EDTA、10mM DTT和1mM PMSF的30ml 20mMTris缓冲液(pH8.5)中。将悬浮液放在冰上并以1分(至少)的间隔声波处理5次。以15000rpm经10分钟离心收集经声波处理的细胞。
将颗粒悬浮在含8M盐酸胍、5mM EDTA、1mM PNSF的30ml10mM Tris缓冲液(pH8.7)中，加入50mg DTT面使其还原。搅拌1-1.5小时后，用稀释的HCl将溶液的pH调至5.0，然后稀释前冷却到4℃。
用含30％甘油、3M脲、3mM胱胺和1mM L-Lys的1.5L 10mMCAPS缓冲液(pH10.5)逐渐稀释样品溶液并过夜。将样品搅拌至少2天后，以8000rpm离心45分钟除去沉淀。用6M磷酸将溶液的pH调至6.8，然后稀释2倍。用2张#2滤纸(φ＝90mm，Toyo滤纸，日本)过滤溶液，然后上样到CM-Sepharose Fast Flow柱(2.6×10cm)(Pharmacia)上。用含15％甘油和1M脲的400ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)洗涤该柱，然后用含15％甘油的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)平衡。用线性梯度从含15％甘油的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)到含0.5M NaCl之相同缓冲液以1.0ml/min的流速从柱上洗脱蛋白质。通过280nm的吸收值监测蛋白质洗脱液；用SDS-PAGE确定含TPO衍生物的级分并收集。
用Centriprep10(Amicon)将TPO级分(约30ml)浓缩到2ml后，通过用μBondasphere C4柱(3.9×150mm)的反相HPLC(Waters)进一步纯化突变TPO。用线性梯度从H2O中的0.05％TFA到含30％CH3CN和0.02％TFA的2-丙醇以0.5ml/分的流速经40分钟洗脱蛋白质。在该条件下，约30分钟后，洗脱出TPO衍生物。
为了进行生物检测，将所纯化的TPO样品对1L 10mM磷酸盐缓冲液2天透析2次。用Centriprep10(Amicon)浓缩到约0.1mg/ml后，按前述用M-07e检测系统评估衍生物的生物活性。发现所有突变体均有等同于h6T(1-163)，TPO的参考样品的活性(见图33和34)。保藏清单Escherichia coli(pHT1-231/DH5)FERM BP-4564和CCTCC-M95001Escherichia coli(pEF18S-A2α/DH5)FERM BP-4565和CCTCC-M95002Escherichia coli(pHGT1/DH5)FERM BP-4616和CCTCC-M95003Escherichia coli(pHTF1/DH5)FERM BP-4617 AND CCTCC-M95004小鼠-小鼠杂交瘤P55FERM BP-4563和CCTCC-C95001CHO28/1/1/3-C6FERM BP-4988和CCTCC-C95004CHO163T-63-79-C1FERM BP-4989和CCTCC-C95005
序列表(1)一般信息(i)申请人MIYAZAKI，HiroshiKATO，TakashiOHGAMI，KinyaIWAMATSU，AkihiroAKAHORI，HiromichiKUROKI，RyotaSHIMIZU，ToshiyukiMUTO，Takanori(ii)发明题目具有TPO活性的蛋白质(iii)序列数197(iv)相应地址(A)收件人Marshall，O′Toole，Gerstein，Murray&
Borun(B)街道6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive(C)城市Chicago(D)州Illinois(E)国家美国(F)邮编60606-6402(v)计算机可读形式(A)介质类型Floppy disk(B)计算机IBM PC compatible(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)现申请资料(A)申请号(B)申请人(C)分类号(vii)在先申请资料(A)申请号JP39090/94(B)申请日14-FEB-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP79842/94(B)申请日25-MAR-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP155126/94(B)申请日01-JUN-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP167328/94(B)申请日15-JUN-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP227159/94(B)申请日17-AUG-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP304167/94(B)申请日01-NOV-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP UNKNOWN(B)申请日28-DEC-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP193169/94(B)申请日17-AUG-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP298669/94(B)申请日01-DEC-1994(vii)在先申请资料(A)申请号JP193916/94(B)申请日18-AUG-1994(vii)在先申请资料(A)申请号US08/212,164(B)申请日14-MAR-1994(vii)在先申请资料(A)申请号US08/221,020(B)申请日01-APR-1994(vii)在先申请资料(A)申请号US08/278,083(B)申请日20-JUL-1994(vii)在先申请资料(A)申请号US08/320,300(B)申请日11-OCT-1994(vii)在先申请资料(A)申请号US08/361,811(B)申请日22-DEC-1994(viii)代理人/代理资料(A)姓名Borun，Michael F.
(B)登记号25，447(C)文献/摘要号01017/32425(ix)电讯资料(A)电话312/474-6300(B)电传312/474-0448(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度261个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(vi)原始来源(A)生物Rattus norvegicus(B)细胞系McA-RH8994(xi)序列描述SEQ ID NO1GGTGTACCTG GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA CCTGGATAGA TTCCTTGGCC CACCTGTCCC60CACCCCACTC TGTGCAGAGG TACAAAAGCT CAAGCCGTCT CCATGGCCCC AGGAAAGATT 120CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA GA 172ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GTG GCC ATA CTT CTC CTC ACC GCA 220Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Val Ala Ile Leu Leu Leu Thr Ala1 5 10 15AGA CTA ACT CTG TCC AGC CCA GTT CCT CCC GCC TGT GAC CC 261Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp20 25(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度147个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Val Ala Ile Leu Leu Leu Thr Ala-21 -20 -15 -10Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu-5 1 5 10Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Ser Arg Leu Ser15 20 25Gln Cys Pro Asp Val Asn Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala30 35 40Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys45 50 55Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met60 65 70 75Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly80 85 90Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu95 100 105Leu Gly Thr Gln Val Ser Pro Gln Thr Tyr Arg Asn Tyr Pro Leu Thr110 115 120Gln Phe Leu125(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度580个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(vi)原始来源(A)生物Homo Sapiens(F)组织类型肝(xi)序列描述SEQ ID NO3CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG 48Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro1 5 10 15GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC 96Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp20 25 30TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT 144Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro35 40 45TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA 192Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu50 55 60TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA 240Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala65 70 75 80GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA 288Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly85 90 95CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT 336Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg100 105 110CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG NNN NNN NNN 384Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Xaa Xaa Xaa115 120 125NNN NNN NNN NCC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC 432Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser130 135 140TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA 480Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly145 150 155 160GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC 528Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro165 170 175AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT 576Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr180 185 190TCT G 580Ser(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度253个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala-21 -20 -15 -10Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val-5 1 5 10Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser15 20 25Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala30 35 40Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys45 50 55Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met60 65 70 75Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly80 85 90Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu95100 105Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp110 115 120Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140 145 150 155Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu160 165 170Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr175 180 l85Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly190 195 200Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu205 210 215Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu220 225 230(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度576个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(vi)原始来源(A)生物Homo Sapiens(F)组织类型肝(xi)序列描述SEQ ID NO5AG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG47Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg1 5 10 15TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG 95Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu20 25 30AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA 143Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu 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Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp110 115 120CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 480Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 528Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140 145 150 155CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC TGA 555Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser160(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特征(A)长度1043个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型合成DNA(vi)原始来源(A)生物Homo Sapiens(xi)序列描述SEQ ID NO14CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA52Met Lys Ser Pro Ala Pro Pro Ala-2 1 5TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG 100Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu10 15 20CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG 148His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro25 30 35GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG 196Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln40 45 50ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT 244Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Tle Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu55 60 65 70CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG 292Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu75 80 85TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC 340Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly90 95 100GCT CTG CAG TCT CTG CTT GGC ACC CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC 388Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr105 110 115ACT GCT CAC AAG GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG 436Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu120 125 130CTG CGT GGC AAA GTT CGT TTC CTG ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG 484Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ger Thr Leu135 140 145 150TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT CGT ACC TCT 532Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser155 160 165CTG GTT CTG ACC CTG AAC GAG CTC CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG 580Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu170 175 180GAA ACC AAC TTT ACC GCG AGC GCG CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG 628Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu185 190 195AAA TGG CAG CAG GGC TTT CGT GCG AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG 676Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln200 205 210ACC AGC CGT AGC CTG GAT CAG ATC CCG GGC TAT CTG AAC CGT ATC CAT 724Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His215 220 225 230GAA CTG CTG AAC GGC ACC CGT GGC CTG TTT CCG GGC CCG AGC CGT CGC 772Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg235 240 245ACC CTG GGC GCG CCG GAT ATC AGC TCT GGC ACC AGC GAT ACC GGC AGC 820Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ger Asp Thr Gly Ger250 255 260CTG CCG CCG AAC CTG CAG CCG GGC TAT AGC CCG AGC CCG ACC CAT CCG 868Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro265 270 275CCG ACC GGC CAG TAT ACC CTG TTT CCG CTG CCG CCG ACC CTG CCG ACC 916Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr280 285 290CCG GTG GTT CAG CTG CAT CCG CTG CTG CCG GAT CCG AGC GCG CCG ACC 964Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr295 300 305 310CCG ACC CCG ACC AGC CCG CTG CTG AAC ACC AGC TAT ACC CAT AGC CAG 1012Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln315 320 325AAC CTG AGC CAG GAA GGC TAATGAAGCT TGAAsn Leu Ser Gln Glu Gly 1043330(2)SEQ ID NO15的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO15AACTGGAAGA ATTCGCGGCC GCAGGAATTT TTTTTTTTTT TTTTT 45(2)SEQ ID NO16的资料(i)序列特征(A)长度13个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO16AATTCGGCAC GAG13(2)SEQ ID NO17的资料(i)序列特征(A)长度9个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO17CTCGTGCCG 9(2)SEQ ID NO18的资料(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO18Ile Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID NO19的资料(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQID NO19Thr Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID NO20的资料(i)序列特征(A)长度12个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID N021的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(ix)特征(A)名称/关键词修饰的_碱基(B)位置12&15(D)其它资料/修饰的_碱基＝i(xi)序列描述SEQ ID N021ACGCTGGGGG CNGANGA 17(2)SEQID N022的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(ix)特征(A)名称/关键词修饰的_碱基(B)位置12&15(D)其它资料/修饰的_碱基＝i(xi)序列描述SEQ ID NO22ACACTAGGAT CNAANAA 17(2)SEQ ID NO23的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(ix)特征(A)名称/关键词修饰的_碱基(B)位置12&15(D)其它资料/修饰的_碱基＝i(xi)序列描述SEQ ID NO23ACGCTGGGTG CNGANGA17(2)SEQ ID NO24的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(ix)特征(A)名称/关键词修饰的_碱基(B)位置12&15(D)其它资料/修饰的_碱基＝i(xi)序列描述SEQ ID NO24ACGCTGGGCG CNGANGA 17(2)SEQ ID NO25的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO25GGGGGGCGGA CGCTGGG 17(2)SEQ ID NO26的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO26GGAGGACGAA CACTAGG 17(2)SEQ ID NO27的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO27GGTGGTCGTA CGCTGGG 17(2)SEQ ID NO28的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO28GGCGGCCGCA CGCTGGG17(2)SEQ ID NO29的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO29GGATCTTGGT TCATTCTCAA G 21(2)SEQ ID NO30的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO30CCTCAGACAG TGGTTCAAAG 20(2)SEQ ID NO31的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO31CGAGGGTGTA CCTGGGTCCT G21(2)SEQ ID NO32的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO32CAGAGTTAGT CTTGCGGTGA G 21(2)SEQ ID NO33的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO33CCTGTCCTGC TGCCTGCTGT G 21(2)SEQ ID NO34的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO34TGAAGTTCGT CTCCAACAAT C 21(2)SEQ ID NO35的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO35ATGGAGCTGA CTGATTTGCT C 21(2)SEQ ID NO36的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO36TGAAGTTCGT CTCCAACAAT C 21(2)SEQ ID NO37的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO37TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21(2)SEQ ID NO38的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO38TGACGCAGAG GGTGGACCCT C 21(2)SEQ ID NO39的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO39AGCAGAACCT CTCTAGTCCT C 21(2)SEQ ID NO40的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO40ACACTGAACG AGCTCCCAAA C 21(2)SEQ ID NO41的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO41AACTACTGGC TCTGGGCTTC T 21(2)SEQ ID NO42的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO42AGGGATTCAG AGCCAAGATT C 21(2)SEQ ID NO43的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO43TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTGGG G31(2)SEQ ID NO44的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO44TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTAAA A31(2)SEQ ID NO45的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO45TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTCTT T31(2)SEQ ID NO46的资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO46TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTGCC C31(2)SEQ ID NO47的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO47TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT T 21(2)SEQ ID NO48的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO48TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21(2)SEQ ID NO49的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO49AGGATGGGTT GGGGAAGGAG A 21(2)SEQ ID NO50的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO50TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21(2)SEQ ID NO51的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO51AGGGAAGAGC GTATACTGTC C 21(2)SEQ ID NO52的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO52GGCCAGCCAG ACACCCCGGC C 21(2)SEQ ID NO53的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO53ATGGGAGTCA CGAAGCAGTT T 21(2)SEQ ID NO54的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO54TGCGTTTCCT GATGCTTGTA G 21(2)SEQ ID NO55的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO55AACCTTACCC TTCCTGAGAC A 21(2)SEQ ID NO56的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO56TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC30(2)SEQ ID NO57的资料(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO57TTTGCGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT 39(2)SEQ ID NO58的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO58TTTGCGGCCG CTCATTACAG TGTGAGGACT AGAGAGGTTC TG 42(2)SEQ ID NO59的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID N059TTTGCGGCCG CTCATTATCT GGCTGAGGCA GTGAAGTTTG TC 42(2)SEQ ID N060的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID N060TTTGCGGCCG CTCATTACAG ACCAGGAATC TTGGCTCTGAA T 42(2)SEQ ID NO61的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO61TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC30(2)SEQ ID NO62的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO62TTTGCGGCCG CTCATTAGAG GGTGGACCCT CCTACAAGCA T41(2)SEQ ID NO63的资料(i)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO63TTTGCGGCCG CTCATTAGCA GAGGGTGGAC CCTCCTACAA 40(2)SEQ ID NO64的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO64TTTGCGGCCG CTCATTACCT GACGCAGAGG GTGGACCC38(2)SEQ ID NO65的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO65TTTGCGGCCG CTCATTACCG CCTGACGCAG AGGGTGGA 38(2)SEQ ID NO66的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO66TTTGCGGCCG CTCATTAGGC CCGCCTGACG CAGAGGGT 38(2)SEQ ID NO67的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO67TTTGCGGCCG CTCATTATGG GGCCCGCCTG ACGCAGAG 38(2)SEQ ID NO68的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO68TTTGCGGCCG CTCATTAGGG TGGGGCCCGC CTGACGCA 38(2)SEQ ID NO69的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO69TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30(2)SEQ ID NO70的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO70TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41(2)SEQ ID NO71的资料(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO71TTTGCGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT 39(2)SEQ ID NO72的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO72AGTAAACTGC TTCGTGACTC CCATGTCCTT CACAGCAGAC TGAGCCAGTG 50(2)SEQ ID NO73的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO73CATGGGAGTC ACGAAGCAGT TTACTGGACA GCGTTAGCCT TGCAGTTAG49(2)SEQ ID NO74的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ IDNO74TGTGACCTCC GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGTGACTCCC ATGTCCTTC 49(2)SEQ ID NO75的资料(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO75TTTACTGAGG ACTCGGAGGT CACAGGACAG CGTTAGCCTT GCAGTTAG48(2)SEQ ID NO76的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO76GACCTCCGAG TCCTCAGTAA ACTGCTTCGT GACTCCCATG TCCTTCACA49(2)SEQ ID NO77的资料(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO77CAGTTTACTG AGGACTCGGA GGTCGGACAG CGTTAGCCTT GCAGTTAG 48(2)SEQ ID NO78的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO78TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21(2)SEQ ID NO79的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO79CAGGTATCCG GGGATTTGGT C 21(2)SEQ ID NO80的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO80TGCGTTTCCT GATGCTTGTA G 21(2)SEQ ID NO81的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO81GAGAGAGCGG CCGCTTACCC TTCCTGAGAC AGATT35(2)SEQ ID NO82的资料(i)序列特征(A)长度6个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO82GAGAGA 6(2)SEQ ID NO83的资料(i)序列特征(A)长度70个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO83CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT GTGACCTTCG60TGTTCTGTCT 70(2)SEQ ID NO84的资料(i)序列特征(A)长度72个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO84CAGTTTAGAC AGAACACGAA GGTCACAAGC TGGCGGAGCC GGGCTCATTA TTTATTACCT60CCTTGGTTTT TT72(2)SEQ ID NO85的资料(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO85AAACTGCTTC GCGACTCTCA CGTGCTGCAC TCTCGTCTGT CCCAGTGCCC GGAAGTTCAC60CCGCTGCCG69(2)SEQ ID NO86的资料(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO86CGGGGTCGGC AGCGGGTGAA CTTCCGGGCA CTGGGACAGA CGAGAGTGCA GCACGTGAGA 60GTCGCGAAG 69(2)SEQ ID NO87的资料(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO87ACCCCGGTTC TGCTTCCGGC TGTCGACTTC TCCCTGGGTG AATGGAAAAC CCAGATGGAA 60GAGACCAAA 69(2)SEQ ID NO88的资料(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO88CTGAGCTTTG GTCTCTTCCA TCTGGGTTTT CCATTCACCC AGGGAGAAGT CGACAGCCCG 60AAGCAGAAC 69(2)SEQ ID NO89的资料(i)序列特征
(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO89GCTCAGGACA TCCTGGGTGC AGTAACTCTG CTTCTGGAAG GCGTTATGGC TGCACGTGGC 60CAGCTTGGC 69(2)SEQ ID NO90的资料(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO90GGTCGGGCCA AGCTGGCCAC GTGCAGCCAT AACGCCTTCC AGAAGCAGAG TTACTGCACC 60CAGGATGTC 69(2)SEQ ID NO91的资料(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO91CCGACCTGCC TGTCTTCCCT GCTTGGCCAG CTGTCTGGCC AGGTTCGTCT GCTGCTCGGC 60GCTCTGCAG 69(2)SEQ ID NO92的资料(i)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO92CAGAGACTGC AGAGCGCCGA GCAGACGAAC CTGGCCAGAC AGCTGGCCAA GCAGGGAAGA 60CAGGCA66(2)SEQ ID NO93的资料(i)序列特征(A)长度70个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO93TCTCTGCTTG GCACCCAGCT GCCGCCACAG GGCCGTACCA CTGCTCACAA GGATCCGAAC 60GCTATCTTCC70(2)SEQ ID NO94的资料(i)序列特征
(A)长度70个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO94AAGACAGGAA GATAGCGTTC GGATCCTTGT GAGCAGTGGT ACGGCCCTGT GGCGGCAGCT 60GGGTGCCAAG70(2)SEQ ID NO95的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO95GGAGGAGACC AAGGCACAGG A 21(2)SEQ ID NO96的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO96CCGGAATTCT TACCCTTCCT GAGACAGATT 30(2)SEQ ID NO97的资料(i)序列特征(A)长度8个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO97CTAATGAG 8(2)SEQ ID NO98的资料(i)序列特征(A)长度16个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO98AATTCTCATT AGAGCT 16(2)SEQ ID NO99的资料(i)序列特征(A)长度8个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO99CTAATGAG 8(2)SEQ ID NO100的资料(i)序列特征(A)长度16个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO100AATTCTCATT AGAGCT 16(2)SEQ ID NO101的资料(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO101ATCGCCGGCT CCGCCAGCTT GTGAC 25(2)SEQ ID NO102的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO102GCCGAATTCT CATTAGAGCT CGTTCAGTGT 30(2)SEQ ID NO103的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO103GATCCGAACG CTATCTTCCT GTCTTTCCAG CACCTGCTGC GT42(2)SEQ ID NO104的资料(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO104TTTGCCACGC AGCAGGTGCT GGAAAGACAG GAAGATAGCG TTCG 44(2)SEQ ID NO105的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO105GGCAAAGTTC GTTTCCTGAT GCTGGTTGGC GGTTCTACCC TG 42(2)SEQ ID NO106的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO106ACGCACAGGG TAGAACCGCC AACCAGCATC AGGAAACGAA C 41(2)SEQ ID NO107的资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO107TGCGTTCGTC GGGCGCCGCC AACCACTGCT GTTCCGTCTT AATGAA 46(2)SEQ ID NO108的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO108ACCTTTCATT AAGACGGAAC AGCAGTGGTT GGCGGCGCCC GACGA 45(2)SEQ ID NO109的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO109AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG 24(2)SEQ ID NO110的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO110AGAAGCTTTC ATTAAGACGG AACA 24(2)SEQ ID NO111的资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEO ID NO111CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT GTACCA46(2)SEQ ID NO112的资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO112CAGGTGGTAC AGGTGCTTTC ATTATTTATT ACCTCCTTGG TTTTTT 46(2)SEQ ID NO113的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO113CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG38(2)SEQ ID NO114的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQID NO114CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG 34(2)SEQ ID NO115的资料(i)序列特征(A)长度84个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO115CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT GTACCACCTG CATGTGATTT60ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG 84(2)SEQ ID NO116的资料(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO116Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Arg1 5 10 15Arg Leu Ser Gln20(2)SEQ ID NO117的资料(i)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQID NO117Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln1 5 10 15Asp Ile Leu Gly Ala20(2)SEQ ID NO118的资料(i)序列特征
(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO118Ser Arg Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Leu1 5 10 15Leu Asp(2)SEQ ID NO119的资料(i)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO119Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His1 5 10 15Ser Arg Leu Ser Gln20(2)SEQ ID NO120的资料(i)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO120Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO121的资料(i)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO121Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp1 5 10 15Pro Asn Ala(2)SEQ ID NO122的资料(i)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO122Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr1 5 10 15Ala Ser Ala(2)SEQ ID NO123的资料(i)序列特征(A)长度23个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO123Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His1 5 10 15Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr20(2)SEQ ID NO124的资料(i)序列特征(A)长度27个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO124Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser1 5 10 15Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly20 25(2)SEQ ID NO125的资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO125CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCA 46(2)SEQ ID NO126的资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO126CAGGTGGTGC AGGAGATTTC ATTATTTATT ACCTCCTTGG TTTTTT 46(2)SEQ ID NO127的资料(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO127CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG38(2)SEQ ID NO128的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO128CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG34(2)SEQ ID NO129的资料(i)序列特征(A)长度84个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO129CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCACCTG CATGTGATTT60ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG 84(2)SEQ ID NO130的资料(i)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO130CTCCCGAACC GTACCAGCGG CCTGCTGGAA ACCAACTTTA CCGCGAG47(2)SEQ ID NO131的资料(i)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO131GGTAAAGTTG GTTTCCAGCA GGCCGCTGGT ACGGTTCGGG AGCTCGT47(2)SEQ ID NO132的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO132CGCGCGTACC ACCGGCAGCG GCCTGCTGAA ATGGCAGCAG GGCTTTCGT 49(2)SEQ ID NO133的资料(i)序列特征
(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO133AGCCCTGCTG CCATTTCAGC AGGCCGCTGC CGGTGGTACG CGCGCTCGC49(2)SEQ ID NO134的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO134GCGAAAATCC CGGGCCTGCT GAACCAGACC AGCCGTAGCC TGGATCAGAT50(2)SEQ ID NO135的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO135ATCCAGGCTA CGGCTGGTCT GGTTCAGCAG GCCCGGGATT TTCGCACGAA50(2)SEQ ID NO136的资料(i)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO136CCCGGGCTAT CTGAACCGTA TCCATGAACT GCTGAACGGC ACCCGTG 47(2)SEQ ID NO137的资料(i)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO137GTGCCGTTCA GCAGTTCATG GATACGGTTC AGATAGCCCG GGATCTG 47(2)SEQ ID NO138的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO138GCCTGTTTCC GGGCCCGAGC CGTCGCACCC TGGGCGCGCC GGATATCAG49(2)SEQ ID NO139的资料(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO139ATCCGGCGCG CCCAGGGTGC GACGGCTCGG GCCCGGAAAC AGGCCACGG49(2)SEQ ID NO140的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO140ATCAGCTCTG GCACCAGCGA TACCGGCAGC CTGCCGCCGA ACCTGCAGCC50(2)SEQ ID NO141的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO141CAGGTTCGGC GGCAGGCTGC CGGTATCGCT GGTGCCAGAG CTGATATCCG50(2)SEQ ID NO142的资料(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO142GGGCTATAGC CCGAGCCCGA CCCATCCGCC GACCGGCCAG TATACCCTGT T51(2)SEQ ID NO143的资料(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO143GGTATACTGG CCGGTCGGCG GATGGGTCGG GCTCGGGCTA TAGCCCGGCT G51(2)SEQ ID NO144的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO144TCCGCTGCCG CCGACCCTGC CGACCCCGGT GGTTCAGCTG CATCCGCTGC50(2)SEQ ID NO145的资料(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO145GGATGCAGCT GAACCACCGG GGTCGGCAGG GTCGGCGGCA GCGGAAACAG50(2)SEQ ID NO146的资料(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO146TGCCGGATCC GAGCGCGCCG ACCCCGACCC CGACCAGCCC GCTGCTGAAC A51(2)SEQ ID NO147的资料(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO147AGCAGCGGGC TGGTCGGGGT CGGGGTCGGC GCGCTCGGAT CCGGCAGCAG C51(2)SEQ ID NO148的资料(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO148CCAGCTATAC CCATAGCCAG AACCTGAGCC AGGAAGGCTA ATGAAGCTTG A51(2)SEQ ID NO149的资料(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO149CTTCATTAGC CTTCCTGGCT CAGGTTCTGG CTATGGGTAT AGCTGGTGTT C51(2)SEQ ID NO150的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO150ACGAGCTCCC GAACCGTACC A21(2)SEQ ID NO151的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO151CTGATATCCG GCGCGCCCAG G21(2)SEQ ID NO152的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO152CGGATATCAG CTCTGGCACC A 21(2)SEQ ID NO153的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO153TCAAGCTTCA TTAGCCTTCC T 21(2)SEQ ID NO154的资料(i)序列特征(A)长度490个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO154CTC CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG GAA ACC AAC TTT ACC GCG AGC48Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser1 5 10 15GCG CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG AAA TGG CAG CAG GGC TTT CGT96Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg20 25 30GCG AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG ACC AGC CGT AGC CTG GAT CAG 144Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln35 40 45ATC CCG GGC TAT CTG AAC CGT ATC CAT GAA CTG CTG AAC GGC ACC CGT 192Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg50 55 60GGC CTG TTT CCG GGC CCG AGC CGT CGC ACC CTG GGC GCG CCG GAT ATC 240Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile65 70 75 80AGC TCT GGC ACC AGC GAT ACC GGC AGC CTG CCG CCG AAC CTG CAG CCG 288Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro85 90 95GGC TAT AGC CCG AGC CCG ACC CAT CCG CCG ACC GGC CAG TAT ACC CTG 336Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu100 105 110TTT CCG CTG CCG CCG ACC CTG CCG ACC CCG GTG GTT CAG CTG CAT CCG 384Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro115 120 125CTG CTG CCG GAT CCG AGC GCG CCG ACC CCG ACC CCG ACC AGC CCG CTG 432Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu130 135 140CTG AAC ACC AGC TAT ACC CAT AGC CAG AAC CTG AGC CAG GAA GGC TAA 480Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser GLn Glu Gly145 145 150TGAAGCTTGA490(2)SEQ ID NO155的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO155AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG24(2)SEQ ID NO156的资料(i)序列特征(A)长度56个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO156GGGAGCTCGT TCAGGGTCAG AACCAGAGAG GTACGAGACG GAACAGCAGT GGTTGG56(2)SEQ ID NO157的资料(i)序列特征(A)长度157个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO157G GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC 46Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly1 5 10 15AAA GTT CGT TTC CTG ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT94Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg20 25 30CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT CGT ACC TCT CTG GTT CTG 142Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu35 40 45ACC CTG AAC GAG CTC 157Thr Leu Asn Glu Leu50(2)SEQ ID NO158的资料(i)序列特征(A)长度100个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO158CCTCGAGGAA TTCCTGCAGC CCGGGACTAG TATCGGCTAC CCCTACGACG TCCCCGACTA 60CGCCGGCGTC CATCACCATC ACCATCACTG AGCGGCCGCC 100(2)SEQ ID NO159的资料(i)序列特征(A)长度108个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO159AATTGGCGGC CGCTCAGTGA TGGTGATGGT GATGAGCGCC GGCGTAGTCG GGGACGTCGT 60AGGGGTAGCC GATACTAGTC CCGGGCTGCA GGAATTCCTC GAGGGTAC 108(2)SEQ ID NO160的资料(i)序列特征(A)长度70个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO160AATTCCAAGA TCTCACACTT GCTTTTGACA CAACTGTGTT TACTTGCAAT CCCCCAAAAC60AGACAGACCC 70(2)SEQ ID NO161的资料(i)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO161GGGTCrGTCT GTTTTGGGGG ATTGCAAGTA AACACAGTTG TGTCAAAAGC AAGTGTGAGA60TCTTGG 66(2)SEQ ID NO162的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO162GGCCCGGGAT GGAGCTGACT GAATTGCTC 29(2)SEQ ID NO183的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO163TCAAGCTTAC TAGTCCCTTC CTGAGACAGA TTCTG35(2)SEQ ID NO164的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO164TAATACGACT CACTATAGGG CG 22(2)SEQ ID NO165的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO165AATTCCAAGA TCACACACTT GC22(2)SEQ ID NO166的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO166TCAAGCTTAC TAGTCCCTTC CTGAGACAGA TTCTG35(2)SEQ ID NO167的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO167TGGGCACTGG CTCAGGTTGC TGTGAAGGAC ATGGG35(2)SEQ ID NO168的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO168TGTAGGCAAA GGGGTAACCT CTGGGCA 27(2)SEQ ID NO169的资料(i)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO169Thr Ser Ile Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Val His1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20(2)SEQ ID NO170的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO170TTTGAArTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30(2)SEQ ID NO171的资料(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO171TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41(2)SEQ ID NO172的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO172TGTAGGCAAA GGAACCTCTG GGCA24(2)SEQ ID NO173的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO173TGTAGGCAAA GGAGTGTGAA CCTCTGG27(2)SEQ ID NO174的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO174TGrAGGCAAA GGAGCGTGAA CCTCTGG 27(2)SEQ ID NO175的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO175TGTAGGCAAA GGTCCGTGAA CCTCTGG27(2)SEQ ID NO176的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO176AGCTGTGGTC CTCTGTGGAG GAAG24(2)SEQ ID NO177的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO177GTGAGCTGTG GTGCCCTGTG GAGG 24(2)SEQID NO178的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO178AGCTGTGGTC CTGTTGCCCT GTGGAGG 27(2)SEQ ID NO179的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO179AGCTGTGGTC CTAGCGCCCT GTGGAGG27(2)SEQ ID NO180的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO180AGCTGTGGTC CTTCCGCCCT GTGGAGG 27(2)SEQ ID NO181的资料(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO181CGGGCTGCAG GATATCCAAG ATCTCA 26(2)SEQ ID NO182的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO182TAATACGACT CACTATACGG CG 22(2)SEQ ID NO183的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO183GGGCGGCCGC TCAGCTGGGG ACAGCTGTGG TGGG34(2)SEQ ID NO184的资料(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词misc_特征(D)其它资料/注释＝“2位的氨基酸是Ala、Ser、Gly、Met或Gln”(ix)特征(A)名称/关键词misc_特征(D)其它资料/注释＝“7位的氨基酸是Glu或Lys”(xi)序列描述SEQ ID NO184Lys Xaa Tyr Tyr Glu Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO185的资料(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词misc_特征(D)其它资料/注释＝“6位上的氨基酸是Glu或Asp”(xi)序列描述SEQ ID NO185Lys Glx Arg Ala Ala Xaa1 5(2)SEQ ID NO186的资料(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO186Lys Ala Gly Xaa Cys Ser Gly1 5(2)SEQ ID NO187的资料(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词misc_特征(D)其它资料/注释＝“2位上的氨基酸是Ile、Thr或Ser”(xi)序列描述SEQ ID NO187Lys Xaa Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID NO188的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO188Lys Asp Ser Phe Leu Ala Asp Val Lys1 5(2)SEQ ID NO189的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词misc_特征(D)其它资料/注释＝“1位上的氨基酸为Lys或Arg”(xi)序列描述SEQ ID NO189Xaa Thr Leu Pro Thr Xaa Ala Val Pro1 5(2)SEQ ID NO190的资料(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO190Lys Asp Ser Phe Leu Ala Asp Val Lys Gln Tyr Tyr Glu Ser Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO191的资料(i)序列特征(A)长度332个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)来源(A)生物体Homo Sapiens(xi)序列描述SEQ ID NO191Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1 5 10 15Arg Asp Ser His Val Leu Mis Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val20 25 30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu35 40 45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu50 55 60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65 70 75 80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln85 90 95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu100 105 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys AsP Pro Asn Ala Ile Phe115 120 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu130 135 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145 150 155 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn165 170 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr180 185 190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile195 200 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly210 215 220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225 230 235 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly245 250 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser260 265 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu275 280 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro290 295 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305 310 315 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325330(2)SEQ ID NO192的资料(i)序列特征(A)长度1086个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA→mRNA(vi)来源(A)生物体Homo Sapiens(xi)序列描述SEQ ID NO192GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG51Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val-21 -20 -15GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT 99Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro-10 -5 1CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT 147Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His5 10 15 20GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT 195Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro25 30 35ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA 243Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys40 45 50ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC 291Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr55 60 65CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT 339Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr70 75 80TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 387Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu85 90 95 100CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC 435Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly105 110 115AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA 483Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln120 125 130CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC 531His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser135 140 145ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA 579Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg150 155 l60ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA 627Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly165 170 175 180TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG 675Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly185 190 195CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG 723Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu200 205 210AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG 771Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Ash Arg215 220 225ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA 819Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser230 235 240CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA 867Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr245 250 255 260GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC 915Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr265 270 275CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG 963His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu280 285 290CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT1011Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala295 300 305CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC1059Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His310 315 320TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAA1086Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325 330(2)SEQ ID NO193的资料(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO193Lys Gln Tyr Tyr Glu Ser Glu1 5(2)SEQ ID NO194的资料(i)序列特征(A)长度1663个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA→mRNA(vi)来源(A)生物体Rattus norvegicuS(H)细胞系McA-RH8994(xi)序列描述SEQ ID NO194GGTGTACCTG GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA CCTGGATAGA TTCCTTGGCC CACCTGTCCC 60CACCCCACTC TGTGCAGAGG TACAAAAGCT CAAGCCGTCT CCATGGCCCC AGGAAAGATT120CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA GA ATG175Met-21GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GTG GCC ATA CTT CTC CTC ACC GCA AGA 223Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Val Ala Ile Leu Leu Leu Thr Ala Arg-20 -15 -10 -5CTA ACT CTG TCC AGC CCA GTT CCT CCC GCC TGT GAC CCC AGA CTC CTA 271Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10AAT AAA CTG CTT CGT GAC TCC TAC CTC CrT CAC AGC CGA CTG AGT CAG 319Ash Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln15 20 25TGT CCT GAC GTC AAC CCT TTG TCT ATC CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG 367Cys Pro Asp Val Ash Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val30 35 40GAC TTT AGC CTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ACG GAA CAG AGC AAG GCA 415Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala45 50 55 60CAG GAC ATT CTA GGG GCA GTG TCC CTT CTA CTG GAG GGG GTG ATG GCA 463Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala65 70 75GCA CGA GGA CAG TTG GAA CCC TCC TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGA CAG 511Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Sar Leu Leu Gly Gln80 85 90CTT TCT GGT CAG GTT CGC CTC CTC TTG GGA GCC CTG CAG GGC CTC CTA 559Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu95 100 105GGA ACC CAG GTA AGT CCC CAG ACC TAT AGA AAC TAC CCT CTT ACT CAG 607Gly Thr Gln Val Ser Pro Gln Thr Tyr Arg Asn Tyr Pro Leu Thr Gln110 115 120TTC CTC TAAGGACCTG GGAAAAGACA AGGGATTCTA GATTCTAGGT GTCTTCAGTG 663Phe Leu125TATGAAAGCT GGTCTATACG GAGTGATGCT TCTCAGCCAC AATACCTGGG TGCTGGCAGT 723AAATCTTTCC ACCTTAGTGA GAAGAGGCCT GATATGTGGG CCAACTCACT GGCCTCAGGC 783CCATCCTCTG CCTTCAGCTT CCTCCACAGG GCAGGACCAC AGCTCACAAG GACCCCAGTG 843CCCTCTTCTT GAGCTTGCAA CAACTGCTTC GGGGAAAGGT GCGCTTCCTG CTGCTGGTAG 903AAGGTCCCGC CCTCTGTGTC AGACGGACCC TTCCCACCAC AGCTGTCCCA AGCAGAACCT 963CTCAACTCCT CACACTAAAC AAGTTCCCAA ACAGACTTCT GGATTGTTGG AGACGAACTT 1023CAGTGTTGTA GCCAGAACTG CTGGCCCTGG ACTTCTGAAC AGGCTTCAAG GATTCAGAGC 1083CAAGATTATT CCTGGTCAGC TAAATCAAAC CTCCGGGTCC TTAGACCAAA TCCCTGGATA 1143CCTGAACGGG ACACACGAAC CTGTGAATGG AACTCATGGG CTCTTTGCTG GGACCTCACT 1203ACAGACCCTG GAAGCCCCAG ACGTTGTGCC AGGAGCTTTC AACAAAGGCT CCTTGCCACT 1263CAACCTCCAG AGTGGACTTC CTCCTATCCC AAGCCTTGCT GCTGATGGAT ACACACTTTT 1323CCCTCCTTCA CCTACCTTCC CCACCCCTGG GTCTCCACCC CAGCTCCCCC CCGTTTCCTG 1383ACCCCTCCAC CACCATACCT AACTCTACCA ACCCTCATCC AGGACTTGGT CTCAGTAAGC 1443GTCCCGTGCA CTGGCACGGA GCGCGATCGT CTGCAACATC TCTCAGGGGC AAGCTTCCTC 1503AGGAAGGCTC TGAGGCAGCT CACTAGACAT CCTGCTCTCG CCTAACGGGC CCTGGGAAAG 1563GGATACACAG GCCAGGACAC TGTACAACCT TAGGAGCGAT TTTTTTCTTA ACCTATCAAC 1623AATATTCATC AGAGCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1663(2)SEQ ID NO195的资料(i)序列特征(A)长度861个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA→mRNA(vi)来源(A)生物体Homo Sapiens(H)组织类型肝脏(xi)序列描述SEQ ID NO195GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG51Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val-21 -20 -15GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT 99Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro-10 -5 1CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT 147Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His5 10 15 20GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT 195Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro25 30 35ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA 243Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys40 45 50ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC 291Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr55 60 65CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT 339Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr70 75 80TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 387Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu85 90 95 100CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC 435Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly105 110 115AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA 483Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln120 125 130CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC 531His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser135 140 145ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA 579Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg150 155 160ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA 627Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly165 170 175 180TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG 675Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly185 190 195CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG 723Leu Leu Lys Trp Gln Gln G1y Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu200 205 210AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG 771Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg215 220 225ATA CAC GAA CTC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 823Ile His Glu Leu230AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA861(2)SEQ ID NO196的资料(i)序列特征(A)长度1267个碱基对(B)类型核酸
(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA→mRNA(vi)来源(A)生物体Homo Sapiens(H)组织类型肝脏(xi)序列描述SEQ ID NO196GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG 51Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val-21 -20 -15GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT99Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro-10 -5 1CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT 147Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His5 10 15 20GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT 195Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro25 30 35ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA 243Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys40 45 50ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC 291Thr Gln Men Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr55 60 65CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT 339Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr70 75 80TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 387Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu85 90 95 100CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC 435Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly105 110 115AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA 483Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln120 125 130CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC 531His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser
135 140 145ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA 579Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg150 155 160ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA 627Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Glyl65 170 175 180TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG 675Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly185 190 195CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG 723Leu Leu Lys Trg Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu200 205 210AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG 771Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asg Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg215 220 225ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA 819Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser230 235 240CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA 867Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr245 250 255 260GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC 915Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr265 270 275CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG 963His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu280 285 290CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT 1011Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala295 300 305CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC 1059Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His310 315 320TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA 1113Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325 330TTGTCTCATG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT1173TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA1233ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAA1267(2)SEQ ID NO197的资料(i)序列特征
(A)长度549个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO197CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GCT CCG CCA GCT TGT GAC CTT CGT GTT 48Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val-5 1 5 10CTG TCT AAA CTG CTT CCC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC 96Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser15 20 25CAG TGC CCG GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT 144Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala30 35 40GTC GAC TTC TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA 192Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys45 50 55GCT CAG GAC ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG 240Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met60 65 70 75GCT GCA CGT GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC 288Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly80 85 90CAG CTG TCT GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG 336Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu95 100 105CTT GGC ACC CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT 384Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp110 115 120CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 432Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 480Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140 145 150 155CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG 528Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu160 165 170AAC GAG CTC TAATGAGAAT TC549Asn Glu Leu
权利要求
1.一种具有特异性刺激或增加血小板生成之生物活性并含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-332的血小板生成素(TPO)多肽或其衍生物。
2.根据权利要求1的TPO多肽衍生物，含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-163。
3.根据权利要求1的TPO多肽衍生物，含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-232。
4.根据权利要求1的TPO多肽衍生物，含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-151。
5.根据权利要求1、2或3的TPO多肽衍生物，缺失1-6个N末端氨基酸。
6.根据权利要求2的TPO多肽衍生物，选自[ΔHis33]TPO(1-163)，[ΔArg117]TPO(1-163)和[ΔGly116]TPO(1-163).
7.根据权利要求2的TPO多肽衍生物，选自[His33，Thr33′，Pro34]TPO(1-163)，[His33，Ala33′，Pro34]TPO(1-163)，[His33，Gly33′，Pro34，Ser38]TPO(1-163)，[Gly116，Asn116′，Arg117]TPO(1-163)，[Gly116，Ala116′，Arg117]TPO(1-163)，[Gly116，Gly116′，Arg117]TPO(1-163)和[Ala1，Val3]TPO(1-163).
8.根据权利要求1的TPO多肽衍生物，选自[Thr33，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO和[Asn25，Lys231，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO.
9.根据权利要求1的TPO多肽衍生物，选自[Asn25]TPO和[Thr33]TPO。
10.根据权利要求2的TPO多肽衍生物，选自[Ala1，Val3，Arg129]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg133]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg143]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Leu82]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Leu146]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Pro148]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg59]TPO(1-163)和[Ala1，Val3，Arg115]TPO(1-163).
11.根据权利要求2的TPO多肽衍生物，选自[Arg129]TPO(1-163)，[Arg133]TPO(1-163)，[Arg143]TPO(1-163)，[Leu82]TPO(1-163)，[Leu146]TPO(1-163)，[Pro148]TPO(1-163)，[Arg59]TPO(1-163)和[Arg115]TPO(1-163).
12.根据权利要求1的TPO多肽，它与聚合物共价相连。
13.根据权利要求12的TPO多肽，其中所说的聚合物是聚乙二醇。
14.根据权利要求1-13的任一权项的TPO多肽，进一步含有氨基酸Met-2-Lys-1。
15.根据权利要求1-13的任一权项的TPO多肽，进一步含有Met-1。
16.根据权利要求1-13的任一权项的TPO多肽，进一步含有Gly-1。
17.含有SEQ ID NO2、4或6的成熟氨基酸序列的多肽。
18.编码权利要求1-11、14、15和17的任一权项的TPO多肽的DNA。
19.用于保证TPO多肽表达的DNA序列，所说的TPO多肽具有特异性刺激或增加血小板生成的生物活性，所说的DNA序列选自(a)SEQ ID NO194、195或196所示的DNA序列或其互补链；(b)在严格条件下与(a)中所定义的DNA序列杂交的DNA序列或其片段；(c)倘若没有遗传密码的简并性就将会与(a)和(b)中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。
20.根据权利要求19的cDNA序列。
21.根据权利要求19的基因组DNA序列。
22.根据权利要求19的制备的DNA序列。
23.生产TPO多肽的方法，包括下列步骤(a)在适宜宿主中表达由权利要求18、19、20、21或22中任一权项的DNA编码的多肽，(b)分离所说的TPO多肽。
24.根据权利要求23的方法，其中被表达的TPO多肽是Met-2-Lys-1多肽，并且进一步包括从所说的分离的TPO多肽中裂解Met-2-Lys-1的步骤。
25.用于保证TPO多肽表达的DNA序列，所说的TPO多肽具有特异性刺激或增加血小板生成的生物活性，所说的DNA进一步编码凝血酶识别肽5′至TPO多肽编码序列，并且编码谷胱甘肽-S-转移酶(GST)5′至凝血酶识别肽。
26.权利要求25的DNA序列，用于保证TPO多肽表达，所述TPO多肽含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-174。
27.生产具有特异性刺激或增加血小板生成之生物活性的TPO多肽的方法，包括下列步骤a)在适宜的宿主中表达由权利要求25或26的DNA编码的多肽，b)分离所说的GST-(凝血酶识别肽)-TPO多肽，c)用凝血酶处理所说的被分离的GST-(凝血酶识别肽)-TPO多肽，d)分离Gly-1-TPO多肽。
28.根据权利要求27的方法，其中Gly-1-TPO多肽是[Gly-1]TPO(1-174)。
29.根据权利要求27或28的方法，其中所分离的Gly-1-TPO多肽是TPO衍生物，含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-174。
30.由权利要求23、24、27、28或29的方法所获得的蛋白质产物。
31.用根据权利要求18、19、20、21、22、25或26的任一权项的DNA序列转化或转染的原核或真核宿主细胞，所说的转化或转染是以能使所说的宿主细胞表达一种具有特异性刺激或增加血小板生成之生物活性的多肽的方式进行的。
32.一种药物组合物，含有效量的权利要求1-16和30中的任一权项的多肽和药用载体。
33.根据权利要求32的药物组合物，用于治疗血小板紊乱。
34.根据权利要求32的药物组合物，用于治疗血小板减少症。
35.根据权利要求34的药物组合物，用于治疗由化疗、放疗或骨髓移植诱发的血小板减少症。
36.治疗血小板紊乱的方法，包括给患有所说紊乱的患者施用有效量的权利要求1-16和30中的任一权项的多肽。
37.治疗血小板减少症的方法，包括给血小板减少症患者施用有效量的权利要求1-16和30中的任一权项的多肽。
38.根据权利要求37的方法，治疗由化疗、放疗或骨髓移植所诱发的血小板减少症。
39.与权利要求1-16和30中的任一权项的多肽有特异性免疫反应的抗体。
40.权利要求39的抗体用于分离权利要求1-16和30中的任一权项的多肽的应用。
41.权利要求39的抗体用于定量分析权利要求1-16和30中的任一权项的多肽的应用。
全文摘要
本发明涉及具有特异性刺激或增加血小板生成之生物活性并含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-332的血小板生成素(TPO)多肽或其衍生物，涉及编码TPO多肽的DNA分子、生成所说多肽的方法、与所说多肽有特异性免疫反应的抗体以及用所说多肽治疗血小板紊乱如血小板减少症的方法。
文档编号C07K14/435GK1131438SQ95190305
公开日1996年9月18日 申请日期1995年2月14日 优先权日1994年2月14日
发明者宫崎洋, 加藤尚志, 大上钦也, 岩松明彦, 赤堀弘典, 黑木良太, 清水敏之, 武藤隆则 申请人:麒麟麦酒株式会社