与肿瘤排斥抗原前体mage-1结合的单克隆抗体，重组的mage-1，和衍生于mage-1的免疫原性肽的制作方法

专利名称：与肿瘤排斥抗原前体mage-1结合的单克隆抗体，重组的mage-1，和衍生于mage-1的免疫原性肽的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及适用于肿瘤学研究的免疫遗传学领域，更具体地说，本发明涉及对生物体免疫系统通过例如所谓的肿瘤排斥抗原的呈递，和本文中被称作“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”的表达以识别肿瘤之机理的研究和分析，更具体地说，本发明涉及一个这种TRAP，即重组产生的MAGE-1，和抗MAGE-1的单克隆抗体和抗血清，以及它们的用途。
背景和现有技术从多个不同方向对宿主生物体识别或不识别癌细胞进行了研究。对本领域的理解意味着对基础免疫学和肿瘤学的一些理解。
对小鼠肿瘤的早期研究揭示了这些研究显示出当移植到同系动物体内可导致肿瘤细胞排斥的分子。这些分子由受体动物的T细胞“识别”，促进了伴随移植细胞裂解的溶细胞T细胞反应。通过用化学致癌剂，如甲基胆蒽体外诱导肿瘤首次得到这一证据。经发现由肿瘤表达并可引起T细胞反应的抗原对于各种肿瘤而言是不同的。Prehn、et al.J.Natl.Canc.Inst.18769-778(1957)；Klein et al.，Cancer Res.201561-1572(1960)；Gross Cancer Res.3326-333(1943).Basombrio.Cancer Res.302458-2462(1970)一般性教导了用化学致癌剂诱导肿瘤以及细胞表面抗原的差异，逐渐知道这类抗原为“肿瘤特异性移植抗原”或“TSTA”。当通过化学致癌剂诱导观察到这种抗原的呈递之后，通过紫外线照射在体外诱导肿瘤也可得到类似的结果。例见Kripke.J.Natl.Canc.Inst.53333-1336(1974)。
当观察到上述文献所述肿瘤类型的由T细胞介导的免疫应答时，可认为自发的肿瘤一般是非免疫原性的。因此据信它们并不将可引发反应的抗原呈递给携有肿瘤之受试者的肿瘤。例见Hewitt et al.，Brit.J.Cancer 33241-259(1976)。
如Boon et al.，J.Exp，Med.1521184-1193(1980)中的描述(此处引入参考文献)，呈递tmu-抗原族的细胞系是通过诱变小鼠肿瘤细胞或细胞系所得的免疫原性变异体。为了验证，可通过突变不会在同系小鼠中产生免疫应答并可形成肿瘤的肿瘤细胞(即″tum+″细胞)以得到tum-抗原。当诱变这些tum+细胞时，它们将被同系小鼠排斥，而且不会形成肿瘤(因此为“tum-”)。例见Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74272(1977)。此处被编入参考文献。已发现许多肿瘤类型都呈现出这种现象，例见Frostet al.，Cancer Res 43125(1983)。
由于tum-变异体可引发免疫排斥过程，因而它们似乎不能形成进行性肿瘤，有利于此假说的证据包括肿瘤“tum-”变异体，即那些在小鼠体内不能正常形成肿瘤的变异体，在免疫系统受亚致死照射的抑制的小鼠中不能形成进行性肿瘤，Van Pel et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA765282-5285(1979)；以及下述的观察结果腹膜内注射的肥大细胞瘤P815 tum-细胞呈指数增长达12-15天，而在淋巴细胞和巨噬细胞流入当中仅几天后，它们即消失(Uyttenhove et al.，J.Exp，Med.1521175-1183(1980)).进一步的证据包括下列的观察结果即使当给小鼠施用免疫抑制量的照射以及细胞随后的攻击时，小鼠仍获得了免疫记忆以允许它们抵抗对相同tum-变异体的随后的攻击(Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74272-275(1977)；Van Pel et al.，Supra；Uyttenhove et al.，Supra)。后来的研究发现当自发肿瘤经受诱变时，产生了能产生反应的免疫原性变异体。事实上，这些变异体能引发抗原先肿瘤的免疫保护性应答，例见Van Pel et al.，J.Exp.Med.1571992-2001(1983)。因此，已显示出在肿瘤中引发所谓的“肿瘤排斥抗原”的呈递是可能的，所述肿瘤是同系排斥反应的靶子。当将外源基因转染进自发性肿瘤时也得到类似的结果，例见Fearson et al.，Cancer Res，482975-1980(1988)。
已识别了一类抗原，所述抗原被呈递于肿瘤细胞的表面，并由导致裂解的细胞毒性T细胞识别。此类抗原在下文中被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。TRA会或不会引起抗体反应。这些抗原被研究的程度取决于溶胞T细胞的体外鉴定研究，即由特殊的溶细胞性T细胞(下文的“CTL”)子集鉴定抗原的研究。所述子集通过识别呈递的肿瘤排斥抗原而增殖，呈递抗原的细胞被裂解。鉴定研究已鉴定出可特异性地裂解表达抗原之细胞的CTL克隆。在Levy et al.，Adv，Cancer Res 241-59(1977)；Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)；Brunner et al.，J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.12406-412(1982)；Palladino et al.，Canc.Res.475074-5079(1987)中可发现此类研究的例子。其它类型的由CTL识别的抗原，包括主要组织相容性抗原，雄性特异性H-Y抗原，以及本文所讨论的被称作“tum-”抗原的一类抗原都要求这种类型的分析。
上述文献中描述的受试者的肿瘤例子已知为P815，例见已引入参考文献的DePlaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274-2278(1988)；Szikora et al.，EMBO J91041-1050(1990)，和Sibille et al.，J.Exp.Med.17235-45(1990)。P815肿瘤是肥大细胞瘤，它是经用甲基胆蒽在DBA/2小鼠中诱导并作为体外肿瘤和细胞系培养。诱变后P815系产生了许多tum-变异体，包括称为P91A(Deplaen，文献同上)，35B(Szikora，文献同上)，和P198(Sibille，文献同上)的变异体。与肿瘤排斥抗原相反(这是主要的区别)；tum-抗原仅当肿瘤细胞被诱变之后才存在，而肿瘤排斥抗原不经诱变即存在于所给肿瘤的细胞上，因此参照参考文献，认为细胞系可以为tum+，如称为“P1”的细胞系，此细胞系可以诱发产生tum-变异体。由于tum-表型与亲本细胞系的不同，故预计tum-细胞系的DNA与它们的tum+亲本系相比有所不同，此差别可用于定位tum-细胞中感兴趣的基因。结果发现如P91A、35B和P198的tum-变异体的基因与正常的等位基因所不同的是基因编码区有点突变，例见Szikora and Sibille，文献同上，和Lurquin et al.，Cell58293-303(1989)。而本发明的TRA则情况不同。这些文献也阐明衍生于tum-抗原的肽类由Ld分子呈递以供CTL识别，P91A由Ld呈递，P35由Dd呈递，P198由Kd呈递。
都已列入参考文献的现有专利申请PCT/US92/04354，美国系列号807,043；764,364；728,838和707,702描述了特别涉及编码多种TRAP的基因和其它核酸分子，而TRAP随后被加工成肿瘤排斥抗原，或称“TRA”。
上述这些基因可用作分离和纯化的肿瘤排斥抗原前体和TRA本身的来源，这两者都可用作药剂以治疗以抗原为“标记物”的癌症，并可在下文讨论的肿瘤学多种诊断和监视方法中用作药剂。例如已知tum-细胞可用于产生CTL，所述CTL可裂解呈递不同tum-抗原的细胞以及tum+细胞。例见已列入参考文献的Maryanski et al.，Eur J.Immunol12401(1982)；和Van den Eynde et al.，Modern Trends in Leukemia IX(June1990)。肿瘤排斥抗原前体可在被基因转染的细胞中表达，然后可用于产生抗感兴趣之肿瘤的免疫应答。
在人肿瘤相似的病例中观察到自身混合淋巴细胞-肿瘤细胞培养物(下文中的“MLTC”)经常产生效应器淋巴细胞，所述细胞可裂解自身肿瘤细胞，但不会裂解天然的杀伤靶，自身EBV-转化的B细胞或自身成纤维细胞(例见Anichini et al.，Immunol.Today 8385-389(1987))。已特别详细地研究了黑素瘤的此反应，用外周血细胞或肿瘤浸润淋巴细胞进行MLTC。此领域参考文献的例子包括Knuth etal.，Proc Natl，Acad，Sci.USA 862804-2802(1984)；Mukherji et al.，J.Exp.Med，158240(1983)；Herin et al.，Int.J.Canc.39390-396(1987)；Topalian et al，J.Clin.Oncol 6839-853(1988)。已从MLTC效应器细胞中衍生出稳定的细胞毒性T细胞克隆(下文中的“CTL”)，这些克隆特异于肿瘤细胞，例见Makherji et al.，文献同上，Herin et al，文献同上，Knuth et al.，文献同上。由这些自身CTL识别的肿瘤细胞上的抗原看上去不能表示培养的人为假象，因为在体内的肿瘤细胞上发现了它们，Topalian et al.，文献同上；Degiovanni et al.，Eur.J.Immunol.201865-1868(1990)。这些观察结果，连同本文所用的分离特异性鼠肿瘤排斥抗原前体之基因的技术，已导致编码人肿瘤上呈递的TRA的肿瘤排斥抗原前体之核酸序列的分离。现在已可分离出编码肿瘤排斥抗原前体的核酸序列，包括但不局限于那些具有特殊肿瘤之大多数特征和下文所述之细节的序列。
另外的研究致力于由已知为人白细胞抗原或称“HLA”的一类分子对TRA的呈递，此研究已导致几个有关此领域的意想不到的发现，具体地见于已列入参考文献的美国专利申请系列号938,334，该文献公开了由HLA-A1分子呈递的九肽，此文献教导如给出特定肽类对特定HLA分子的已知特异性，即可期望特定肽与一个HLA分子结合，而不与其它分子结合。这一点很重要，因为不同个体具有不同的HLA表型。结果，尽管鉴定出特定肽作为特异性HLA分子的配体(Partner)具有诊断和治疗的结果，但这些仅与具有特定HLA表型的个体相关。需对此领域进行进一步的研究，因为细胞异常并不局限于某一特定的HLA表型，定向疗法需要一些争论中的异常细胞表型的知识。
在已列入参考文献的1993年1月22日递交的美国专利申请系列号008,446中，公开了MAGE-1表达产物被加工成二级TRA的事实。此二级TRA由HLA-C-克隆-10分子呈递，此公开表明所给TRAP可产生多种TRA。
在已列入参考文献的1992年12月22日递交的美国专利申请系列号994,928中，酪氨酸酶被描述成肿瘤排斥抗原前体，此文献公开了由一些正常细胞(如黑素细胞)产生的分子在肿瘤细胞中被加工以产生由HLA-A2分子呈递的肿瘤排斥抗原。
上述文献中提到的现有申请中讨论了一般抗肿瘤排斥抗原前体的抗体。本研究者已利用编码MAGE-1的分离核酸分子以产生重组的MAGE-1蛋白质，以及衍生于此蛋白质的肽类。这些已被用来产生与MAGE-1特异性结合的多克隆和单克隆抗体。这些抗体及其用途构成了本发明及权利要求。
附图的简述

图1图示了MAGE-1基因，衍生于重组MAGE-1蛋白质的寡肽，并将MAGE-2和MAGE-3推导的氨基酸序列中的相应序列进行了比较。
图2A表示亲和纯化的MAGE-1重组蛋白质的银染SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图2B表示免疫印迹研究，其中重组MAGE-1蛋白质被用来抗衍生自三种肽(SEQ ID NOs2，3和4)免疫接种的兔抗血清。印迹于1∶1000的稀释度下进行，重组小鼠p53被用作对照。
图3A表示MAb MA454抗六个黑素瘤系的反应性模式，图3B表示使用抗相同系的兔多克隆抗血清所得的结果，图3C表示用MAGE-1转染的细胞系(MZ2-MEL2.2-ET.1)及其亲本(MZ2-MEL2.2)所得的结果。
图4表示使用抗组织裂解物抗体的免疫印迹分析。
优选实施方案的详细描述已鉴定了许多不同的“MAGE”基因，这一点可从上文提到的申请和文献中看出。目前对MAGE-1基因有所争议，它是下文中所讨论的唯一基因。为方便起见，本文中将之表示为SEQ ID NO1。
本文所用的“MAGE”指的是从人细胞中分离的核酸序列。
当本文讨论“TRAP”或“TRA”特异于肿瘤类型时，意味着所述的分子与肿瘤类型相关，尽管不必要排除其它肿瘤类型。实施例1使用Van den Eynde et al.，J.Cancer 44634-640(1989)和以上提到的母申请中描述的，先前已观察到可表达MAGE-1的细胞系MZ2-MEL3.1作为总RNA的来源，从细胞中提取总RNA，再如Van der Bruggen et al.，Science 2541643-1647(Dec，13，1991)(已列入参考文献)所述，使用CH08和CH09作为引物进行逆转录/聚合酶链式反应。此文献描述了如Brasseur et al.，Int.J.Cancer 52839-841(1992)中所进行的“RT-PCR”技术。然而，应理解MAGE-1的序列是本领域已知的，除了CH08和CH09外还可使用其它引物。
一旦完成RT-PCR方案，即参照构成已知技术的制造商的教导将产物直接克隆到质粒pT7 Blue(Novagen，Madison WI)中。克隆后，用限制性内切核酸酶处理重组质粒DNA以产生包括含有MAGE-1基因之片段的片段，例见Van der Bruggen et al.文献同上。
使用pT7 Blue中的BamHI和HindIII克隆位点将适当的cDNA插入片段单向亚克隆到质粒pQE9，pQE10和pQE11中。将质粒转染到大肠杆菌中，由于宿主质粒含有lac操纵子，故可通过IPTG诱导重组蛋白质的产生。可产生含有MAGE-1多肽序列的融合蛋白质，此蛋白质可通过Ni2+离子亲和层析纯化。
得到重组克隆的DNA序列，并证实它可编码163个氨基酸，其相当于预测的MAGE-1氨基酸序列之推导的57-219位氨基酸以及来自质粒自身的30个残基。图1显示了它，预期的分子量约为20-22KDa。
事实上，当研究pQE10中的克隆时，经IPTG诱导后产生了约为20KDa的重组蛋白质。如图2A所示，也发现了其它较少量的蛋白质种类，如70KD、43KDa、17KDa和15KDa。实施例2以下描述了用于生产MAGE-1抗体的方法，根据预测的MAGE-1氨基酸序列，制备了三个寡肽Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser Ser(SEQ ID NO2)Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp(SEQ ID NO3)Asp Val Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr(SEQ ID NO4)用这些肽免疫兔，然后经处理收集抗血清。
在免疫印迹实验中，使用所制备的抗这三个肽的抗血清以及由大肠杆菌产生的重组MAGE-1蛋白质。图2B所示的结果表明仅有抗第一个肽，即SEQID NO2产生的抗血清才强烈反应。与20KDa融合蛋白质共同纯化的其它蛋白质种类也显示出反应性的事实表明它们是融合蛋白质的聚集体。所用的肽相当于预测的MAGE-1蛋白质的MAGE-1的68-81位推导氨基酸。
当使用黑素瘤细胞系MZ2-MEL3.1的裂解物进行免疫印迹时，未发现可测的MAGE蛋白质。实施例3然后制备单克隆抗体，用按以上文献所述产生的纯化重组蛋白质免疫BALB/C小鼠。产生并克隆了杂交瘤。所使用的方法同Dippold et al.，Proc Natl Acad Sci USA776114-6118(1980)(已列入参考文献)的描述。当然主要区别是免疫接种用的免疫原。
一旦产生了杂交瘤，可使用免疫接种的融合蛋白质作为靶抗原，使用标准的固相ELISA在微量滴定板上筛选它们的上清液，发现有5个克隆可以反应，在免疫印迹中它们都表现出温和至强反应性。
作为对照，还试验了在相同质粒载体中表达的小鼠p53蛋白质，未见有反应性，下表1中概况了这些结果表1小鼠抗重组MAGE-1的mAb对重组MAGE-1蛋白质和对照p53蛋白质的反应性
*使用杂交瘤上清液的ELISA效价-、＜1∶16；+、1∶64；++、1∶256。#免疫印迹信号强度-、阴性；+、微弱；++、中等；+++，强烈。实施例4然后试验抗黑素瘤细胞系裂解物的如以上文献所述的mAb。所试验的细胞系，即MZ2-MEL3.1，MZ2-MEL2.2和SK-MEL-187都是已知的。MZ2-MEL2.2是经CTL选择从MAGE-1阳性亲代MZ2-MEL3.1中衍生的MAGE-1缺失变异体(Van der Bruggen et al.，Int.J.Cancer 44634-640(1989))。这些细胞已经由RT-PCR“定型”为MAGE-1+2+3+(MZ2-MEL3.1)，MAGE-1-2+3+(MZ2-MEL2.2)，和MAGE1-2-3-(SK MEL-187)。通过在Nonidet P40(NP-40)缓冲液(1％NP-40，50mMTris-HCl，PH8.0，150mMNaCl)中匀浆细胞可制备裂解物，结果示于图3A。
与46KDa蛋白质反应的单克隆抗体MA454存在于MZ2-MEL3.1裂解物中，但不存在于其它两个细胞系的裂解物中。当试验三个其它的黑素瘤系时，仅有那些被定型为MAGE-1阳性的系才能与mAb反应，MAGE-2或MAGE-3的表达是无关的。
还试验了抗这些裂解物的以上文献所述的多克隆抗血清，结果示于图3B，对于MZ2-MEL3.1和经MAGE-1转染的细胞系MZ2-MEL2.2-ET.1而言为阳性，但对于亲代系MZ2-MEL2.2而言为阴性。实施例5从肝、肾和睾丸组织中制备裂解物，并从包括一个MAGE-1+2+3+系，两个MAGE-1-2+3+和一个MAGE-1-2-3-系的四个黑素瘤细胞系中也制备裂解物。如以上文献所述制备裂解物，当进行免疫印迹时，睾丸裂解物与mAb 454为阳性反应，正如MAGE-1阳性黑素瘤。其它裂解物都不呈阳性，这与mRNA表达数据完全符合。
使用多克隆抗血清进行相同的实验，结果与单克隆抗体的相似，图4表示了这些结果。
以上进行的实验描述了与肿瘤排斥抗原前体TRAP特异性结合的单克隆抗体的生产。此研究表明可与“野生型”MAGE-1分子和其重组形式结合，但不能与MAGE-2或MAGE-3结合。结合MAGE-1的mAb的特别优选的种类，即mA454已被保藏于美国典型培养物保藏中心，登记号为HB11540。
因此本发明涉及MAGE-1特异性的单克隆抗体以及产生它们的杂交瘤，已发现mAb可用于测定细胞裂解物中MAGE-1的表达。具体地说，例如可以标记的形式、与固相结合或其它经处理的形式加入mAb以增加MAGE-1检测的敏感性。有关mAb被使用的方法包括任何一种标准类型的免疫测定法，这些方法包括ELISA、RIA，竞争性试验，凝集试验和所有其它试验。本文使用的“细胞裂解物”不仅指表达裂解的样品，也指那些含有可在体内被裂解之细胞的样品或正常含有细胞内部物质的任何样品。MAGE-1表达产物的检测在例如诊断或监测癌症的存在或进展中是有用的。
分离的重组MAGE-1蛋白质也是本发明的特征，此分子的分子量经SDS-PAGE测定约为20-22KDa，它作为免疫原是有用的，例如实施例中表明SEQ ID NOs2，3和4的肽类具有免疫原性。优选地，它们可与适当的佐剂联合使用。通过非重组方法得到的此分子的分离形式的分子量径SDS-PAGE测定约为43KD，它可以与重组蛋白质相同的方法被使用。如以上文献所述，重组形式仅含有MAGE-1序列的57-219位氨基酸。本发明的一部分也包括经SDS-PAGE测定其分子量约为34.3kd的全长分离重组MAGE-1蛋白质，此蛋白质含有由SEQ ID NO1之核苷酸3931-4761位所编码的氨基酸序列。
本发明的其它特征对于本领域技术人员是显而易见的，因而不需在此重复。
所用术语和表达方式在此仅用作描述性而非限制性的术语，在使用这种术语和表达方式时并不想排斥所示和所述特征或其它部分的任何相同方式，应理解多种修改也可包括在本发明的范围内。
序列表(1)一般信息(i)申请人Chen，Yao-Tseng；Stocket，Elisabeth；Chen，Yachi；Garin-Chesa，Pilar；Rettig，Wolfgang J.；Van der Bruggen，Pierre；Boon-Falleur，Thierry；Old，Lloyd J.
(ii)发明名称与肿瘤排斥抗原前体MAGE-1结合的单克隆抗体，重组的MAGE-1，和衍生于MAGE-1的免疫原性肽(iii)序列数4(iv)联系地址(A)联系人Felfe&Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市纽约市(D)州纽约(F)邮编10022(v)计算机可读形式(A)媒介类型5.25寸磁盘，360kb存储(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(vi)本申请资料(A)申请号08/190,411(B)申请日1994年2月1日(C)分类424(vii)在先申请资料(A)申请号037,230(B)申请日1993年3月26日
(vii)在先申请资料(A)申请号PCT/US92/04354(B)申请日1992年5月22日(viii)在先申请资料(A)申请号07/807,043(B)申请日1991年12月12日(ix)在先申请资料(A)申请号07/764,364(B)申请日1991年9月23日(x)在先申请资料(A)申请号07/728,838(B)申请日1991年7月9日(xi)在先申请资料(A)申请号07/705,702(B)申请日1991年5月23日(xii)律师/代理人信息(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)注册号30,946(C)文档号LUD5354(xiii)通讯信息(A)电话(212)688-9200(B)传真(212)838-3884(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度5674bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA
(ix)特征(A)名称/关键词MAGE-1基因(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCGGGGCAC CACTGGCATC CCTCCCCCTA CCACCCCCAA TCCCTCCCTT 50TACGCCACCC ATCCAAACAT CTTCACGCTC ACCCCCAGCC CAAGCCAGGC 100AGAATCCGGT TCCACCCCTG CTCTCAACCC AGGGAAGCCC AGGTGCCCAG 150ATGTGACGCC ACTGACTTGA GCATTAGTGG TTAGAGAGAA GCGAGGTTTT 200CGGTCTGAGG GGCGGCTTGA GATCGGTGGA GGGAAGCGGG CCCAGCTCTG 250TAAGGAGGCA AGGTGACATG CTGAGGGAGG ACTGAGGACC CACTTACCCC 300AGATAGAGGA CCCCAAATAA TCCCTTCATG CCAGTCCTGG ACCATCTGGT 350GGTGGACTTC TCAGGCTGGG CCACCCCCAG CCCCCTTGCT GCTTAAACCA 400CTGGGGACTC GAAGTCAGAG CTCCGTGTGA TCAGGGAAGG GCTGCTTAGG 450AGAGGGCAGC GTCCAGGCTC TGCCAGACAT CATGCTCAGG ATTCTCAAGG 500AGGGCTGAGG GTCCCTAAGA CCCCACTCCC GTGACCCAAC CCCCACTCCA 550ATGCTCACTC CCGTGACCCA ACCCCCTCTT CATTGTCATT CCAACCCCCA 600CCCCACATCC CCCACCCCAT CCCTCAACCC TGATGCCCAT CCGCCCAGCC 650ATTCCACCCT CACCCCCACC CCCACCCCCA CGCCCACTCC CACCCCCACC 700CAGGCAGGAT CCGGTTCCCG CCAGGAAACA TCCGGGTGCC CGGATGTGAC 750GCCACTGACT TGCGCATTGT GGGGCAGAGA GAAGCGAGGT TTCCATTCTG 800AGGGACGGCG TAGAGTTCGG CCGAAGGAAC CTGACCCAGG CTCTGTGAGG 850AGGCAAGGTG AGAGGCTGAG GGAGGACTGA GGACCCCGCC ACTCCAAATA 900GAGAGCCCCA AATATTCCAG CCCCGCCCTT GCTGCCAGCC CTGGCCCACC 950CGCGGGAAGA CGTCTCAGCC TGGGCTGCCC CCAGACCCCT GCTCCAAAAG 1000CCTTGAGAGA CACCAGGTTC TTCTCCCCAA GCTCTGGAAT CAGAGGTTGC 1050TGTGACCAGG GCAGGACTGG TTAGGAGAGG GCAGGGCACA GGCTCTGCCA 1100GGCATCAAGA TCAGCACCCA AGAGGGAGGG CTGTGGGCCC CCAAGACTGC 1150ACTCCAATCC CCACTCCCAC CCCATTCGCA TTCCCATTCC CCACCCAACC 1200CCCATCTCCT CAGCTACACC TCCACCCCCA TCCCTACTCC TACTCCGTCA 1250CCTGACCACC ACCCTCCAGC CCCAGCACCA GCCCCAACCC TTCTGCCACC 1300TCACCCTCAC TGCCCCCAAC CCCACCCTCA TCTCTCTCAT GTGCCCCACT 1350CCCATCGCCT CCCCCATTCT GGCAGAATCC GGTTTGCCCC TGCTCTCAAC 1400CCAGGGAAGC CCTGGTAGGC CCGATGTGAA ACCACTGACT TGAACCTCAC 1450AGATCTGAGA GAAGCCAGGT TCATTTAATG GTTCTGAGGG GCGGCTTGAG 1500ATCCACTGAG GGGAGTGGTT TTAGGCTCTG TGAGGAGGCA AGGTGAGATG 1550CTGAGGGAGG ACTGAGGAGG CACACACCCC AGGTAGATGG CCCCAAAATG 1600ATCCAGTACC ACCCCTGCTG CCAGCCCTGG ACCACCCGGC CAGGACAGAT 1650GTCTCAGCTG GACCACCCCC CGTCCCGTCC 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GTAGCACTGA GAAGCCAGGG CTGTGCTTGC GGTCTGCACC 3400CTGAGGGCCC GTGGATTCCT CTTCCTGGAG CTCCAGGAAC CAGGCAGTGA 3450GGCCTTGGTC TGAGACAGTA TCCTCAGGTC ACAGAGCAGA GGATGCACAG 3500GGTGTGCCAG CAGTGAATGT TTGCCCTGAA TGCACACCAA GGGCCCCACC 3550TGCCACAGGA CACATAGGAC TCCACAGAGT CTGGCCTCAC CTCCCTACTG 3600TCAGTCCTGT AGAATCGACC TCTGCTGGCC GGCTGTACCC TGAGTACCCT 3650CTCACTTCCT CCTTCAGGTT TTCAGGGGAC AGGCCAACCC AGAGGACAGG 3700ATTCCCTGGA GGCCACAGAG GAGCACCAAG GAGAAGATCT GTAAGTAGGC 3750CTTTGTTAGA GTCTCCAAGG TTCAGTTCTC AGCTGAGGCC TCTCACACAC 3800TCCCTCTCTC CCCAGGCCTG TGGGTCTTCA TTGCCCAGCT CCTGCCCACA 3850CTCCTGCCTG CTGCCCTGAC GAGAGTCATC3880ATG TCT CTT GAG CAG AGG AGT CTG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 3922GCC CTT GAG GCC CAA CAA GAG GCC CTG GGC CTG GTG TGT GTG 3964CAG GCT GCC ACC TCC TCC TCC TCT CCT CTG GTC CTG GGC ACC 4006CTG GAG GAG GTG CCC ACT GCT GGG TCA ACA GAT CCT CCC CAG 4048AGT CCT CAG GGA GCC TCC GCC TTT CCC ACT ACC ATC AAC TTC 4090ACT CGA CAG AGG CAA CCC AGT GAG GGT TCC AGC AGC CGT GAA 4132GAG GAG GGG CCA AGC ACC TCT TGT ATC CTG GAG TCC TTG TTC 4174CGA GCA GTA ATC ACT AAG AAG GTG GCT GAT TTG GTT GGT TTT 4216CTG CTC CTC AAA TAT CGA GCC AGG GAG CCA GTC ACA AAG GCA 4258GAA ATG CTG GAG AGT GTC ATC AAA AAT TAC AAG CAC TGT TTT 4300CCT GAG ATC TTC GGC AAA GCC TCT GAG TCC TTG CAG CTG GTC 4342TTT GGC ATT GAC GTG AAG GAA GCA GAC CCC ACC GGC CAC TCC 4384TAT GTC CTT GTC ACC TGC CTA GGT CTC TCC TAT GAT GGC CTG 4426CTG GGT GAT AAT CAG ATC ATG CCC AAG ACA GGC TTC CTG ATA 4468ATT GTC CTG GTC ATG ATT GCA ATG GAG GGC GGC CAT GCT CCT 4510GAG GAG GAA ATC TGG GAG GAG CTG AGT GTG ATG GAG GTG TAT 4552GAT GGG AGG GAG CAC AGT GCC TAT GGG GAG CCC AGG AAG CTG 4594CTC ACC CAA GAT TTG GTG CAG GAA AAG TAC CTG GAG TAC GGC 4636AGG TGC CGG ACA GTG ATC CCG CAC GCT ATG AGT TCC TGT GGG 4678GTC CAA GGG CCC TCG CTG AAA CCA GCT ATG TGA 4711AAGTCCTTGA GTATGTGATC AAGGTCAGTG CAAGAGTTC 4750GCTTTTTCTT CCCATCCCTG CGTGAAGCAG CTTTGAGAGA GGAGGAAGAG 4800GGAGTCTGAG CATGAGTTGC AGCCAAGGCC AGTGGGAGGG GGACGGGGCC 4850AGTGCACCTT CCAGGGCCGC GTCCAGCAGC TTCCCCTGCC TCGTGTGACA 4900TGAGGCCCAT TCTTCACTCT GAAGAGAGCG GTCAGTGTTC TCAGTAGTAG 4950GTTTCTGTTC TATTGGGTGA CTTGGAGATT TATCTTTGTT CTCTTTTGGA 5000ATTGTTCAAA TGTTTTTTTT TAAGGGATGG TTGAATGAAC TTCAGCATCC 5050AAGTTTATGA ATGACAGCAG TCACACAGTT CTGTGTATAT AGTTTAAGGG 5100TAAGAGTCTT GTGTTTTATT CAGATTGGGA AATCCATTCT ATTTTGTGAA 5150TTGGGATAAT AACAGCAGTG GAATAAGTAC TTAGAAATGT GAAAAATGAG 5200CAGTAAAATA GATGAGATAA AGAACTAAAG AAATTAAGAG ATAGTCAATT 5250CTTGCCTTAT ACCTCAGTCT ATTCTGTAAA ATTTTTAAAG ATATATGCAT 5300ACCTGGATTT CCTTGGCTTC TTTGAGAATG TAAGAGAAAT TAAATCTGAA 5350TAAAGAATTC TTCCTGTTCA CTGGCTCTTT TCTTCTCCAT GCACTGAGCA 5400TCTGCTTTTT GGAAGGCCCT GGGTTAGTAG TGGAGATGCT AAGGTAAGCC 5450AGACTCATAC CCACCCATAG GGTCGTAGAG TCTAGGAGCT GCAGTCACGT 5500AATCGAGGTG GCAAGATGTC CTCTAAAGAT GTAGGGAAAA GTGAGAGAGG 5550GGTGAGGGTG TGGGGCTCCG GGTGAGAGTG GTGGAGTGTC AATGCCCTGA 5600GCTGGGGCAT TTTGGGCTTT GGGAAACTGC AGTTCCTTCT GGGGGAGCTG 5650GCTGGGGCAT TTTGGGCTTT GGGAAACTGC AGTTCCTTCT GGGGGAGCTG 5700ATTGTAATGA TCTTGGGTGG ATCC 5724(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser Ser5 10(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp5 10(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Val Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr5 10
权利要求书按照条约第19条的修改1、与肿瘤排斥抗原前体MAGE-1特异性结合的单克隆抗体。
2、如权利要求1的被称作MA454的单克隆抗体。
3、产生如权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
4、如权利要求3的杂交瘤细胞系，其中所述单克隆抗体是MA454。
5、测定样品中肿瘤排斥抗原前体MAGE-1的方法，包括使所说样品与权利要求1的单克隆抗体接触，并测定所说单克隆抗体与所说样品成分的结合，以测定所说样品中的MAGE-1。
6、如权利要求5的方法，其中所说单克隆抗体与固相结合。
7、如权利要求5的方法，其中所说单克隆抗体用可检测的标记物标记。
8、分离的MAGE-1肿瘤排斥抗原前体衍生物，它是分子量约为20kda至约22kda的蛋白质。
9、分离的蛋白质，它由SEQ ID NO1核苷酸序列的3931-4761位核苷酸编码的57-219位氨基酸组成。
10、选自下列一组的分离肽SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4。
11、含有如权利要求8的至少一种分离蛋白质和佐剂的免疫原性组合物。
12、含有如权利要求9的至少一种分离蛋白质和佐剂的免疫原性组合物。
13、含有如权利要求10的至少一种分离肽和佐剂的免疫原性组合物。
权利要求
1.与肿瘤排斥抗原前体MAGE-1特异性结合的单克隆抗体。
2.如权利要求1的被称作MA454的单克隆抗体。
3.产生如权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
4.如权利要求3的杂交瘤细胞系，其中所述单克隆抗体是MA454。
5.测定样品中肿瘤排斥抗原前体MAGE-1的方法，包括使所说样品与权利要求1的单克隆抗体接触，并测定所说单克隆抗体与所说样品成分的结合，以测定所说样品中的MAGE-1。
6.如权利要求5的方法，其中所说单克隆抗体与固相结合。
7.如权利要求5的方法，其中所说单克隆抗体用可检测的标记物标记。
8.分离的MAGE-1肿瘤排斥抗原前体。
9.如权利要求8的分离的MAGE-1肿瘤排斥抗原前体，它是分子量经SDS-PAGE测定约为46kda的糖蛋白。
10.如权利要求8的分离的MAGE-1肿瘤排斥抗原前体，它是分子量经SDS-PAGE测定约为34.3kda的重组产生的蛋白质。
11.分离的蛋白质，它含有由SEQ ID No1核苷酸序列的3931-4761位核苷酸所编码的57-219位氨基酸。
12.选自下列一组的分离肽SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4。
13.含有如权利要求9的至少一种分离蛋白质和佐剂的免疫原性组合物。
14.含有如权利要求10的至少一种分离蛋白质和佐剂的免疫原性组合物。
15.含有如权利要求11的至少一种分离蛋白质和佐剂的免疫原性组合物。
16.含有如权利要求12的至少一种肽和佐剂的免疫原性组合物。
全文摘要
本发明涉及与肿瘤排斥抗原前体分子MAGE-1特异性结合的单克隆抗体，产生这些单克隆抗体的杂交瘤，以及它们的用途。本发明也描述了MAGE-1的重组体形式，可用作免疫原的肽类，以及含有此肽类和佐剂的免疫原性组合物。
文档编号C07K14/47GK1145032SQ95191450
公开日1997年3月12日 申请日期1995年1月5日 优先权日1994年2月1日
发明者陈耀成, 伊莉莎白·斯多克特, 陈亚奇, 皮拉尔·加林-凯萨, 沃尔夫冈·J·雷蒂希, 皮埃尔·范德布吕根, 蒂尔瑞·布恩-法勒尔, 劳埃德·J·奥德 申请人:路德维格癌症研究所, 纪念斯隆-凯特林癌症中心