专利名称：新的莽草酸酯(Shikimate)类化合物的制作方法
技术领域：
本发明人从植物山椒子(Uvaria grandiflora)中分离得到的新化合物山椒子烯酮(式I)有抗肿瘤活性，其特点对多药抗性肿瘤细胞有显著杀伤作用，能明显增强阿霉素对多药抗性肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明化合物有以下结构 其中R1、R2、R3可相同或不同，各为氢(H)，羟基(OH)，脂肪酸酯基(-O-CO-R′)，芳香酸酯基(-O-CO-Ar)，卤素(-X)，氰基(-CN)，硫氰基(-SCN)，硝基(-NO2)，亚硝酸酯基(-ONO)，烷磺酰基(-SO2R′)，芳香磺酰基(-SO2Ar)，烷氧基(-OR′)，芳香氧基(-OAr)，氨基(-NH2)，亚氨基[-NHR′(Ar)]，次氨基[-NR′2(Ar)]，巯基(-SH)，烷硫化基[-SR′(Ar)]，羰基(＝O)，与邻位形成含氧三元环。
R4为羰基(＝O)，腙基(＝N-NH-Ar)和碱金属磺酸盐基( )。
本发明化合物可按下述方法制备1.提取分离，植物山椒子(Uvaria grandiflora)乙醇浸膏中，酸不溶部分用溶剂洗脱，其中二氯甲烷部分经硅胶柱层析，分得本发明化合物式I1。
2.合成a.从天然存在的已知化合物，制备本发明化合物式I1①从植物中提取分离得到已知化合物Zeylenol(式II)，用Zeylenol作为原料，与新制备的二氧化锰试剂反应生成本发明化合物式I1。
②从植物中提取分离得到已知化合物Pipoxide chlorohydrin(式III)，用Pipoxide chlorohydrin作为原料与丙酮反应生成缩酮(式IV)，然后在碱性条件下水解得到羟基化合物(式V)。然后该羟基化合物再与苯甲酰氯反应，使之生成二苯甲酸酯化合物(VI)，该苯甲酸酯化合物用二氧化锰试剂氧化生成羰基化合物(式VII)，最后再用弱酸水解该羰基化合物，生成本发明化合物式I1。 b.全合成，从简单有机化合物制备本发明化合物式I1第一步，原料丙炔与NBS试剂反应生成1-溴代-2-丙炔(式VIII)，经碱水解得到2-丙炔-1-醇(式IX)。
第二步，该化合物与顺丁二烯加成，生成1，4-环己二烯基甲醇(式X)。
第三步，上步产物再与NBS试剂反应，生成二溴代化合物(式XI)，用碱水解得三羟基化合物(式XII)。
第四步，三羟基化合物与苯甲酰氯反应产生二苯甲酸酯产物(式XIII)，再用二氧化锰氧化得到羰基化合物(式XIV)。
第五步上步产物先与5％溴四氯化碳反应，保护2-位双键，然后与四氧化锇反应，使另一双键氧化成顺式二醇(式XV)，最后用亚铬酸盐处理，使双键再生，而得到化合物式I1 3.本发明其它化合物，可按下述方法制备①本发明式I2化合物，可由式I1化合物经碱水解生成。 ②本发明式I3化合物，可由式I2化合物与卤化剂反应生成。 其中X为F，Cl，Br，I。③本发明式I4化合物，可由式I3化合物与R′COO-反应生成。 其中X为F，Cl，Br，I。
R′为脂肪烃基或芳香烃基。④本发明式I5化合物，可由式I1化合物与氯化剂反应生成。 ⑤本发明式I6化合物，可由式I3化合物与硫氢化物反应生成。 其中X为F，Cl，Br，I，⑥本发明式I7化合物，可由式I3化合物与烷基硫化物反应生成。 其中X为F，Cl，Br，I，R′为脂肪烃基或芳香烃基。⑦本发明式I8化合物，可由式I3化合物与亚胺反应生成。 其中X为F，Cl，Br，I，R′为脂肪烃基或芳香烃基。⑧本发明式I9化合物，可由式I3化合物与氰化物反应生成。 其中X为F，Cl，Br，I。⑨本发明式I10化合物，可由式I3化合物与亚硝基盐反应生成。 其中X为F，Cl，Br，I。
⑩本发明式I11化合物，可由式I1化合物与苯肼反应生成。 (11)本发明式I12化合物，可由式I1化合物与亚硫酸氢钠反应生成。 本发明药物组合物含有有效量的本发明式I化合物和药学可接受的载体或稀释剂。优选的载体包括很多。
本发明化合物的药理活性，可由下述生物实验证明(1)用放射性同位素标记的核苷进行检测，药物与肿瘤细胞预先接触5分钟，加入标记的核苷后保温30秒，确定本发明化合物对肿瘤细胞的核苷转运有显著抑制作用。在艾氏腹水癌细胞检测结果，本发明化合物对胸苷转运的IC50(抑制转运50％的浓度)为9ug/ml，对尿苷转运的IC50为12ug/ml(附
图1)。
(2)体外培养人体癌细胞，用MTT法(观察药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用)检测，药物与癌细胞接触时间为72小时，研究表明本发明化合物对癌细胞的增殖有显著作用，对口腔鳞癌KB细胞的IC50(抑制癌细胞增殖50％的浓度)为0.9ug/ml(附图2)，对乳腺癌MCF-7细胞的IC50为2.6ug/ml(附图3)。
(3)体外培养人体癌细胞，用MTT法检测，同时使用多药抗性细胞与非抗药性细胞进行比较。研究证明本发明化合物对多药抗性肿瘤细胞同样有显著抑制作用，未见交叉抗药性，本发明化合物对口腔鳞癌KB细胞和KB/VCR细胞(多药抗性细胞)的IC50分别为0.9ug/ml和1.0ug/ml，两者无明显差别(附图2)。本发明化合物对乳腺癌MCF-7细胞和MCF-7/ADM细胞的IC50分别为2.6ug/m和2.2ug/ml，两者无明显差别(附图3)。
(4)体外培养人体癌细胞，用MTT法检测，按药物相互作用系数(Coeffi-cient of drug interaction.简称CDI)判断结果，CDI＜1表示两药有协同作用，CDI＜0.7，表示显著协同作用。使用乳腺癌MCF-7细胞研究结果，本发明化合物可明显增强阿霉素的抗肿瘤活性，CDI＜0.7(附图4)。使用多药抗性的乳腺癌细胞MCF-7/ADM，本发明化合物亦可增强阿霉素的抗肿瘤活性，CDI＜0.7(附图5)，这表明，对于多药抗性肿瘤细胞，本发明化合物同样显示对于抗肿瘤药物的增效作用。
(5)动物体内试验，在昆明系小鼠皮下接种肉瘤180细胞，24小时后开始灌胃给予本发明化合物，隔天1次，共5次，按肿瘤重量计算抑制率。研究结果，本发明化合物剂量500mg/Kg和1000mg/Kg对肉瘤180的抑制率分别为32％(P＜0.05)和37％(P＜0.05)(附表1)，研究表明，本发明化合物对肿瘤有一定疗效。
下列实施例更清楚地说明本发明，不应将下列实施例看作是对本发明的限制。实施例1从植物山椒子(Uvaria grandiflora)提取分离化合物I1植物山椒子(Uvaria grandiflora)枝叶8.5公斤，用95％乙醇温浸三次(70000×3ml)，提取液减压浓缩得半干浸膏140(g)，用2％HCl研泡5次(200×5ml)，其中酸不溶部分，吸附在1公斤硅胶上，用溶剂回流洗脱，二氯甲烷洗脱部分34(g)，吸附在40(g)硅胶上经多次硅胶柱层(50倍量的硅胶)，以石油醚-乙醚溶剂系统梯度洗脱，分得本发明化合物I13(g)。本发明化合物I1，白色针状结晶。mp155-156℃，易溶于热丙酮、氯仿。[a]D20-126.5(c0.747，CHCl3).UV(CHCl3)nm224，268.CD(CH3CN)nm324(+)，240(-)，226(-).IR(KBr)cm-13405，3030，2945，1710，1700，1690，1600，1580，1495，1450，1275，1105，1100，710.EI-MS m/e(％)260(2.6)，219(1.1)，201(1.8)，188(2.6)，163(1.8)，138(3.2)，123(3.3)，110(2.6)，105(100)，97(20.8)，77(20.2).FAB-MS383(M+H)，405(M+Na).1H-NMR(CDCl3)ppm4.36(1H，dd，J＝4.2，1.2，H-2)， 5.94(1H，td，J＝4.2，1.0，H-3)，6.93(1H，ddd，J＝10，0，4.0 1.2，H-4)，6.30(1H，dd，J＝10.0，0.9，H-5)，4.82(1H，d，J＝11.6，H-7)，4.58(1H，d，J＝11.6，H-7′)，8.00(2H，m，H-6′，2′)， 7.91(2H，m，H-2″，6″)，7.38(4H，m，H-3′，5′，3″，5″)，7.52(2H，m，H-4′，4″).13C-NMR ppm77.2(C-1)， 71.7(C-2)， 69.4(C-3)， 142.7(C-4)，128.6(C-5)， 196.6(C-6)，65.3(C-7)， 129.1(C-1′)，129.6(C-2′，6′)， 128.6(C-3′，5′)， 133.7(C-4′)， 165.4(C-7′)，128.8(1″)， 129.7(C-2″，6″)， 128.4(C-3″，5″)， 133.4(C-4″)，166.2(C-7″).实施例2将已知化合物zeylenol(文献名称)100(mg)溶于甲醇中，加入新鲜制备的30(mg)二氧化锰氧化，产生本发明化合物式I142(mg)，按相同的方法，将zeylenol衍生物氧化，得到其它本发明式I化合物。实施例3 制药配方本发明有效化合物式I 5.0(g)，微晶纤维素 0.5(g)，淀粉5.0(g)，硬脂酸镁0.1(g)。将药品过筛，除去较大与较小的颗粒，加微晶纤维素、硬脂酸镁和淀粉混合均匀，干燥，再过筛，即压片。每片含本发明有效药物50(mg)。
附表1 D6对小鼠肉瘤180的抑制作用剂量动物数 休重改变 瘤重(g) 抑制率(mg/kg) 开始/结束 (g) 均数±SD (g)对照 10/10 +4.1 3.17±0.47D650010/10 +3.5 2.16±0.67 32*对照 10/10 +9.4 2.67±0.92D61000 10/10 +9.4 1.6711.08 37**P＜0.05D6代表山椒子烯酮(式I1)。(以下相同)
权利要求
1.式I所示的化合物或其药学上可接受的盐或酯， 其中取代基R1、R2、R3可相同或不同，各为氢(H)，羟基(OH)，脂肪酸酯基(-O-CO-R′)，芳香酸酯基(-O-CO-Ar)，卤素(-X)，氰基(-CN)，硫氰基(-SCN)，硝基(-NO2)，亚硝酸酯基(-ONO)，烷磺酰基(-SO2R′)，芳香磺酰基(-SO2Ar)，烷氧基(-OR′)。芳香氧基(-OAr)，氨基(-NH2)，亚氨基[-NHR′(Ar)]，次氨基[-NR′2(Ar)]，巯基(-SH)，烷硫化基[-SR′(Ar)]，羰基(＝O)，与邻位形成含氧三元环；R4为羰基(＝O)，腙基(＝N-NH-Ar)和碱金属磺酸盐基( )。
2.权利要求1的化合物，其中R1为脂肪酸酯基，芳香酸酯基；R2为羟基，脂肪酸酯基，芳香酸酯基，巯基；R3为羟基，脂肪酸酯基，芳香酸酯基，巯基，卤素；R4为羰基，腙基，碱金属磺酸盐基。
3.权利要求1的化合，其中R1为苯甲酸酯基，R2为羟基，R3为羟基， R4为羰基。
4.式I化合物的制备方法，其中包括(1)式I1化合物，可按如下方法，从植物中提取分离得到 将植物山椒子(Uvaria grandiflora)乙醇浸膏的酸不溶部分用溶剂洗脱，其中二氯甲烷部分经硅胶柱层析，分得本发明化合物式I1。(2)式I1化合物，可按如下方法合成a.式II化合物与新制备的二氧化锰试剂反应生成化合物式I1； b.式III化合物与丙酮反应生成式IV化合物，然后在碱性条件下水解得到式V化合物。然后该化合物再与苯甲酰氯反应，使之生成式VI化合物，该化合物用二氧化锰试剂氧化，生成式VII化合物，最后再用弱酸水解式VII化合物，生成本发明化合物式I1； c.式VIII化合物与亚铬酸盐反应，生成化合物式I1； (3)式I2化合物，可由式I1化合物经碱水解生成； (4)式I3化合物，可由式I2化合物与卤化剂反应生成； 其中X为F，Cl，Br，I(5)式I4化合物，可由式I3化合物与R′COO-反应生成； 其中X为F，Cl，Br，IR′为脂肪烃基或芳香烃基(6)式I5化合物，可由式I1化合物与氯化剂反应生成； (7)式I6化合物，可由式I3化合物与硫氢化物反应生成； 其中X为F，Cl，Br，I(8)式I7化合物，可由式I3化合物与烷基硫化物反应生成； 其中X为F，Cl，Br，I，R′为脂肪烃基或芳香烃基(9)式I8化合物，可由式I3化合物与亚胺反应生成； 其中X为F，Cl，Br，I，R′为脂肪烃基或芳香烃基(10)式I9化合物，可由式I3化合物与氰化物反应生成； 其中X为F，Cl，Br，I(11)式I10化合物，可由式I3化合物与亚硝基盐反应生成； 其中X为F，Cl，Br，I(12)式I11化合物，可由式I1化合物与苯肼反应生成； (13)式I12化合物，可由式I1化合物与亚硫酸氢钠反应生成。
5.一种药物组合物，其中含有效量的式I化合物，与药学上可接受的载体或稀释剂。
6.式I化合物治疗人或哺乳动物肿瘤细胞的方法，其中包括给患者使用有效量的式I化合物。
全文摘要
本发明人从植物山椒子(Uvaria grandiflora)中分离得到的新化合物山椒子烯酮(式I)有抗肿瘤活性。本发明化合物有以下结构其中RR
文档编号C07C49/00GK1138571SQ96100318
公开日1996年12月25日 申请日期1996年1月19日 优先权日1996年1月19日
发明者徐丽珍, 廖永红, 甄永苏, 戴洁 申请人:中国医学科学院药用植物研究所