专利名称：N－保护天冬甜肽的制备方法
技术领域：
本发明是N(N代表氨基，以下同)-保护天冬甜肽的制备方法，涉及多肽的合成方法，特别是关于二肽甜味剂的合成方法。
天冬甜肽(α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)是一种具有蔗糖甜度200倍的天然型二肽甜味剂，具有甜度高、热值低、口感佳、无毒副作用等优点，广泛的应用于食品、饮料领域。
自从1969年Muzar有关该二肽合成的第一篇文献报道(J.Am.Chem.Soc，1969；912684)以来，已经有大量的文献报道其合成。一类是酸酐法，将L-天冬氨酸制成N-保护的天冬氨酸酐，再与L-苯丙氨酸甲酯进行接肽反应，制成N-保护的天冬甜肽，然后脱除保护基而得天冬甜肽。如US 5,334,746；US 4,684,745；JP 56-75,053；EP 221,878等。其中的美国专利具有路线短的优点，但收率低，有β-异构体的产生，增加了分离、回收工序，不利于工业化生产。日本专利利用硫代羰基进行N-保护，虽然无β-异构体，但合成的天冬甜肽因含硫而具有不愉快的异味。欧洲专利用羰基进行N-保护，也无β-异构体，但因制备N-保护的天冬酸酐时需用剧毒的光气而限制了工业化生产。另一类是噁唑烷酮法，将L-天冬氨酸进行N-保护后，与醛类化合物反应制成噁唑烷酮，再经接肽反应，脱保护基而得天冬甜肽。如JP 87-164,692；JP 91-255,093。此法具有高选择性和高产率，但接肽反应是用苯、二氯甲烷等有毒溶剂，对环保和工人健康都不利，接肽产物用Pd/C还原，增加了生产成本。还有许多关于接肽中间体天冬氨酸的噁唑烷酮的研究，如Ber 95，1009-15；Khim.Geterotsikl Soedin 1978，(11)1472-3；Synthesis 1989，542等，但这些研究存在以下缺点1、将天冬氨酸经N-保护后再与醛类化合物反应制备噁唑烷酮，这种两步法使步骤及辅助试剂增多，因而总收率降低，生产成本增加；2.保护基试剂价格昂贵，不易脱保护；3.接肽产物中N-羟甲基在酸性条件下不易水解脱去。
本发明的目的在于提供一种无β-异构体生成的区域选择性合成N-保护的天冬甜肽的制备方法，从L-天冬氨酸出发一步合成N-保护的噁唑烷酮，形成肽键的反应中使用低毒或无毒溶剂，并同时脱去保护基，产物收率高，生产成本低。
本发明的目的是这样实现的以L-天冬氨酸、酰化剂、活性羰基化合物为原料，在醋酸酐、醋酸存在下，进行噁唑烷酮化反应，一步合成2-取代-3-N-酰基化-5-氧-4-噁唑烷乙酸，将此产物在低毒或无毒的极性溶剂中与L-苯丙氨酸甲酯或其盐、碱进行接肽反应，制得N-保护的天冬甜肽，其中a、噁唑烷酮化反应中，酰化剂为甲酸或醋酸酐，活性羰基化合物为三氯乙醛、三溴乙醛、六氯丙酮、六氟丙酮，其用量比为L-天冬氨酸(摩尔)∶酰化剂(摩尔)∶活性羰基化合物(摩尔)∶醋酸酐(摩尔)∶醋酸(升)＝1∶1.2～4.0∶1.2～4.0∶2.5～10.0∶0.5～2.0，反应温度为30℃～100℃，反应时间为6～30小时；b、接肽反应中溶剂为醋酸酯、乙醚、四氢呋喃、二氧六环，用量比为L-苯丙氨酸甲酯(摩尔)∶2-取代-3-N-酰基化-5-氧-4-噁唑烷乙酸(摩尔)∶溶剂(升)＝1∶1～1.5∶0.5～3，或L-苯丙氨酸甲酯盐(摩尔)∶碱(摩尔)∶2-取代-3-N-酰基化-5-氧-4-噁唑烷乙酸(摩尔)∶溶剂(升)＝1∶1～1.5∶1～1.3∶0.5～3。反应温度为20℃～100℃，反应时间为4～30小时。
其中的酰化剂用甲酸时产物N-保护基为甲酰基，可以直接使用的甲酸浓度为80％-98％。用醋酸酐时产物N-保护基为乙酰基。活性羰基化合物用于与天冬氨酸的氨基和α-羧基形成五元杂环化合物-噁唑烷酮，并决定2-取代基的种类。醋酸酐用于脱除甲酸中水份和反应过程中产生的水，同时将甲酸转化成甲酸乙酸酐，后者是更有效的甲酰化试剂；在进行乙酰化时，则直接作为酰化剂。
醋酸作为溶剂，同时还起催化作用。反应结束后醋酸可回收再利用。
L-苯丙氨酸甲酯盐为盐酸盐、硫酸盐。
碱为碱金属或碱土金属的有机酸盐、叔胺，如醋酸盐、三乙胺等。
噁唑烷酮化反应时的最佳温度为50℃～85℃。
本发明的具体操作为将L-天冬氨酸、酰化剂、活性羰基化合物、醋酸酐、醋酸按配比在搅拌下进行噁唑烷酮化反应，反应结束后除去醋酸，加入卤代烷烃溶解，冷冻结晶，过滤，洗涤，干燥得噁唑烷酮产物，将此产物与接肽溶剂、L-苯丙氨酸甲酯或其盐按配比在搅拌下进行接肽反应，反应结束后，除去溶剂，加水洗涤，干燥得N-保护的天冬甜肽。
本发明所制备的N-保护的天冬甜肽在醇、盐酸、水的混合溶液中很容易脱去保护基而得天冬甜肽。
本发明是将现有技术中的两步法并为一步制备噁唑烷酮，区域选择性合成N-保护的天冬甜肽，无β-异构体生成，合成路线短，反应产率高，所用溶剂低毒或无毒，生产成本低，有利于工业化生产。
下面是本发明的实施例。实施例一在250毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，11毫升(0.248摩尔)85％甲酸和60毫升(0.64摩尔)乙酸酐，室温搅拌15分钟后，加入19.5毫升(0.2摩尔)三氯乙醛和100毫升乙酸，油浴加热，升温至75℃，反应15小时得一淡黄色澄明液，50℃以下减压除去溶剂，得一棕色油状液，加入30毫升二氯甲烷溶解，-10℃冷冻，析出晶体，过滤，石油醚洗涤，干燥得白色的2-三氯甲基-3-N-甲酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸20.5克，产率70.6％。MP125～127℃(分解)。
在100毫升三颈瓶中加入上述的噁唑烷酮11.62克(0.04摩尔)和40毫升四氢呋喃，机械搅拌下，室温滴加7.16克(0.04摩尔)L-苯丙氨酸甲酯，滴加完毕，40℃恒温反应12小时，减压除去溶剂，残渣加水20毫升，稀氢氧化钠溶液中和至PH9，乙醚20毫升×2洗涤，水层用稀盐酸中和至PH2-3，冷冻，过滤，冰水洗涤，干燥得白色的N-甲酰基-天冬甜肽9.92克，产率77.0％。MP∶132～135℃。
在2毫升甲醇、3.5毫升水和1.8毫升37％盐酸的混合溶剂中，加入上述的N-甲酰基-天冬甜肽6.44克(0.02摩尔)，于55℃反应1小时，-10℃下冷却析出晶体，过滤，得天冬甜肽盐酸盐。将此盐酸盐溶于4毫升水，用碳酸钠调PH值为4.8，析出固体。过滤，干燥，得天冬甜肽4.41克，产率75％，MP240～243℃，[α]20D＝15.0(4％，甲酸)。实施例二在100毫升三颈瓶中加入8.62克(0.04摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、40毫升四氢呋喃和3.28克(0.04摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟后，加入11.62克(0.04摩尔)按实施例一制的噁唑烷酮，25℃恒温反应23小时，反应条件、操作按实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽10.26克，产率79.7％。实施例三在250毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，7毫升(0.158摩尔)85％甲酸和40毫升(0.42摩尔)乙酸酐，室温搅拌15分钟后，加入19.5毫升(0.2摩尔)三氯乙醛和60毫升乙酸，油浴加热，升温至60℃，反应24小时，反应条件、操作按实施例一得2-三氯甲基-3-N-甲酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸16.0克，产率55.1％。
在100毫升三颈瓶中加入40毫升乙酸乙酯和5.81克(0.02摩尔)上述的噁唑烷酮化合物，机械搅拌下，室温滴加3.58克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯，滴加完毕，25℃恒温反应23小时，直接过滤，冰水洗涤，得N-甲酰基-天冬甜肽4.60克，产率71.4％。实施例四在100毫升三颈瓶中加入60毫升乙酸乙酯、12.93克(0.06摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和4.92克(0.06摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入17.45克(0.06摩尔)按实施例三制备的噁唑烷酮化合物，60℃恒温反应7小时，反应条件、操作按实施例三得N-甲酰基-天冬甜肽14.3克，产率74.0％。实施例五在250毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，8.5毫升(0.198摩尔)88％甲酸和50毫升(0.53摩尔)乙酸酐，室温搅拌15分钟后，加入19.5毫升(0.2摩尔)三氯乙醛和100毫升乙酸，油浴加热，升温至75℃，反应15小时反应条件、操作按实施例一得2-三氯甲基-3-N-甲酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸18.9克，产率65.1％。
在100毫升三颈瓶中加入上述的噁唑烷酮6.4克(0.022摩尔)和40毫升乙酸丁酯，机械搅拌下，室温滴加3.58克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯，滴加完毕，40℃恒温反应12小时，反应条件、操作按实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽5.28克，产率82.0％。实施例六在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸丁酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入8.12克(0.028摩尔)按实施例五制备噁唑烷酮化合物，25℃恒温反应24小时，反应条件、操作按实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽5.51克，产率85.5％。实施例七在500毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，11毫升(0.255摩尔)88％甲酸和80毫升(0.85摩尔)乙酸酐，室温搅拌15分钟后，加入24.5毫升(0.25摩尔)三氯乙醛和150毫升乙酸，油浴加热，升温至85℃，反应10小时，反应条件、操作按实施例一得2-三氯甲基-3-N-甲酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸21.8克，产率75.0％。
在100毫升三颈瓶中加入40毫升乙酸乙酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入6.39克(0.022摩尔)上述的噁唑烷酮化合物，40℃恒温反应12小时，反应条件、操作按实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽5.06克，产率78.6％实施例八在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸乙酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入6.97克(0.024摩尔)按实施例七制备的噁唑烷酮化合物，60℃恒温反应7小时，反应条件、操作按实施例三得N-甲酰基-天冬甜肽5.32克，产率82.6％。实施例九在250毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，13.3毫升(0.30摩尔)85％甲酸和50毫升(0.53摩尔)乙酸酐，室温搅拌15分钟后，加入14.7毫升(0.15摩尔)三氯乙醛和100毫升乙酸，油浴加热，升温至80℃，搅拌12小时得一淡黄色澄明液，低于50℃减压除去溶剂，得一棕色油状液，加入30毫升1，2-二氯乙烷溶解，-10℃冷冻，析出晶体，过滤，石油醚洗涤，干燥，得白色的2-三氯甲基-3-N-甲酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸14.8克，产率50.8％。
在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸丁酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和2.02克(0.02摩尔)三乙胺，室温机械搅拌15分钟，加入5.82克(0.02摩尔)上述的噁唑烷酮化合物，60℃恒温反应8小时，反应条件、操作按实施例三得N-甲酰基-天冬甜肽4.86克，产率75.5％。实施例十在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸乙酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和2.85克(0.02摩尔)醋酸镁，室温机械搅拌15分钟，加入5.82克(0.02摩尔)按实施例九制备的噁唑烷酮化合物，40℃恒温反应10小时，反应条件、操作按实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽3.56克，产率55.2％。实施例十一在500毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，50毫升(0.53摩尔)乙酸酐和150毫升乙酸，室温搅拌15分钟后，加入24.5毫升(0.25摩尔)三氯乙醛，油浴加热，60℃反应15小时，反应条件、操作按实施例九得2-三氯甲基-3-N-乙酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸19.6克，MP130～133℃，产率64.4％。
在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸丁酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.62克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入6.1克(0.02摩尔)上述的噁唑烷酮化合物，40℃恒温反应12小时，反应条件、操作按实施例三得N-乙酰基-天冬甜肽4.46克，产率66.4％。MP140～142℃。实施例十二在250毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，30毫升(0.32摩尔)乙酸酐和50毫升乙酸，室温搅拌15分钟后，加入17.5毫升(0.18摩尔)三氯乙醛，油浴加热，85℃反应10小时，反应条件、操作按实施例一得2-三氯甲基-3-N-乙酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸16.0克，产率52.4％。
在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸乙酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入6.1克(0.02摩尔)上述的噁唑烷酮化合物，60℃恒温反应8小时，反应条件、操作按实施例三得N-乙酰基-天冬甜肽4.85克，产率72.2％。实施例十三在250毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，16毫升(0.37摩尔)88％甲酸和70毫升(0.74摩尔)乙酸酐，室温搅拌15分钟后，加入53克(0.2摩尔)六氯丙酮和100毫升乙酸，油浴加热，升温至50℃，反应15小时.反应条件、操作按实施例一得2，2-二-三氯甲基-3-N-甲酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸14.8克，产率36.3％。
在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸丁酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入8.12克(0.02摩尔)上述的噁唑烷酮化合物，60℃恒温反应8小时，反应条件、操作按实施例三得N-甲酰基-天冬甜肽4.68克，产率72.7％。实施例十四在250毫升圆底烧瓶中加入13.4克(0.1摩尔)L-天冬氨酸，11毫升(0.255摩尔)88％甲酸和50毫升(0.53摩尔)乙酸酐，室温搅拌15分钟后，加入66.3克(0.25摩尔)六氯丙酮和120毫升乙酸，油浴加热，升温至90℃反应8小时，反应条件、操作按实施例九得2，2-二-三氯甲基-3-N-甲酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸21.8克，产率53.4％。
在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸乙酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入8.12克(0.02摩尔)上述的噁唑烷酮化合物，35℃恒温反应12小时，反应条件、操作按实施例三得N-甲酰基-天冬甜肽4.16克，产率64.6％。实施例十五在2000毫升圆底烧瓶中加入134克(1摩尔)L-天冬氨酸，110毫升(2.55摩尔)85％甲酸和700毫升(7.4摩尔)乙酸酐，室温搅拌15分钟后，加入195毫升(2.0摩尔)三氯乙醛和800毫升乙酸，油浴加热，升温至75℃，反应15小时得淡黄色澄明液，50℃以下减压除去溶剂，得一棕色油状液，加入250毫升二氯甲烷溶解，-10℃冷冻析出晶体，过滤，石油醚洗涤，干燥得白色的2-三氯甲基-3-N-甲酰基-5-氧-4-噁唑烷乙酸210克，产率72.3％。
在100毫升三颈瓶中加入上述的噁唑烷酮5.82克(0.02摩尔)和30毫升乙醚，机械搅拌下，室温滴加3.58克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯，滴加完毕，40℃恒温反应12小时，反应条件、操作按实施例一得白色的N-甲酰基-天冬甜肽3.53克，产率54.8％。实施例十六在100毫升三颈瓶中加入按实施例十五制备的噁唑烷酮5.82克(0.02摩尔)和30毫升二氧六环，机械搅拌下，室温滴加3.58克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯，滴加完毕，40℃恒温反应10小时，反应条件、操作同实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽4.90克，产率76.1％。实施例十七在100毫升三颈瓶中加入30毫升二氧六环、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入5.82克(0.02摩尔)按实施例十五制备的噁唑烷酮化合物，60℃恒温反应8小时，反应条件、操作按实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽5.22克，产率81.1％。实施例十八在100毫升三颈瓶中加入按实施例十五制备的噁唑烷酮5.82克(0.02摩尔)和30毫升乙酸甲酯，机械搅拌下，室温滴加3.58克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯，滴加完毕，30℃恒温反应15小时，反应条件、操作按实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽5.06克，产率78.6％。实施例十九在100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸甲酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入5.82克(0.02摩尔)按实施例十五制备的噁唑烷酮化合物，60℃恒温反应8小时，反应条件、操作按实施例一得N-甲酰基-天冬甜肽5.20克，产率80.7％。实施例二十100毫升三颈瓶中加入40毫升乙酸丙酯、4.32克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.97克(0.024摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入5.82克(0.02摩尔)按实施例十五制备的噁唑烷酮化合物，40℃恒温反应12小时，反应条件、操作按实施例三得N-甲酰基-天冬甜肽5.34克，产率82.9％。实施例二十一在100毫升三颈瓶中加入按实施例十五制备的噁唑烷酮8.12克(0.028摩尔)和30毫升乙酸丙酯，机械搅拌下，室温滴加3.58克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯，滴加完毕，40℃恒温反应10小时，反应条件、操作按实施例三得N-甲酰基-天冬甜肽5.46克，产率84.7％。实施例二十二100毫升三颈瓶中加入30毫升乙酸丙酯、4.31克(0.02摩尔)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和1.64克(0.02摩尔)醋酸钠，室温机械搅拌15分钟，加入5.82克(0.02摩尔)按实施例十五制备的噁唑烷酮化合物，90℃恒温反应5小时，反应条件、操作按实施例三得N-甲酰基-天冬甜肽4.43克，产率68.8％。
权利要求
1.一种N(N代表氨基，以下同)-保护的天冬甜肽的制备方法，其特征在于以L-天冬氨酸、酰化剂、活性羰基化合物为原料，在醋酸酐、醋酸的存在下，进行噁唑烷酮化反应，一步合成2-取代-3-N-酰基化-5-氧-4-噁唑烷乙酸，将此产物再于低毒或无毒的极性溶剂中与L-苯丙氨酸甲酯或其盐、碱进行接肽反应，制得N-保护的天冬甜肽，其中a、噁唑烷酮化反应中，酰化剂为甲酸、醋酸酐，活性羰基化合物为三氯乙醛、三溴乙醛、六氯丙酮、六氟丙酮，其用量比为天冬氨酸(摩尔)∶酰化剂(摩尔)∶活性羰基化合物(摩尔)∶醋酸酐(摩尔)∶醋酸(升)＝1∶1.2～4.0∶1.2～4.0∶2.5～10.0∶0.5～2.0，反应温度为30℃～100℃，反应时间为6～30小时。b、接肽反应中溶剂为醋酸酯、乙醚、四氢呋喃、二氧六环，用量比为L-苯丙氨酸甲酯(摩尔)2-取代-3-N-酰基化-5-氧-4-噁唑烷乙酸(摩尔)∶溶剂(升)＝1∶1～1.5∶0.5～3，或L-苯丙氨酸甲酯盐(摩尔)∶碱(摩尔)∶2-取代-3-N-酰基化-5-氧-4-噁唑烷乙酸(摩尔)∶溶剂(升)＝1∶1～1.5∶1～1.3∶0.5～3 反应温度为20℃～100℃，反应时间为4～30小时
2.根据权利要求1所述的N-保护的天冬甜肽的制备方法，其特征在于接肽反应中的L-苯丙氨酸甲酯盐为盐酸盐、硫酸盐，碱为碱金属或碱土金属的有机酸盐，叔胺，如醋酸盐，三乙胺。
3.根据权利要求1所述的N-保护的天冬甜肽的制备方法，其特征在于噁唑烷酮化反应时的最佳温度为50℃～85℃。
4.根据权利要求1所述的N-保护的天冬甜肽的制备方法，其特征在于甲酸的浓度可用80％～98％
5.根据权利要求1所述的N-保护的天冬甜肽的制备方法，其特征在于噁唑烷酮化反应时噁唑烷酮的析出试剂为卤代烷烃。
全文摘要
本发明是N(N代表氨基,以下同)－保护天冬甜肽的制备方法,从L－天冬氨酸出发,一步合成N－保护的噁唑烷酮,在接肽反应中使用醋酸酯等低毒或无毒溶剂,该方法无β－异构体生成,合成路线短,生产成本低,反应产率高,有利于工业化生产。
文档编号C07K5/00GK1174844SQ9611768
公开日1998年3月4日 申请日期1996年8月28日 优先权日1996年8月28日
发明者杨桂树, 李艳, 陈志勇, 岳智洲, 宓爱巧, 蒋耀忠 申请人:中国科学院成都有机化学研究所