专利名称：含磷的金雀花碱衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的化学化合物，特别涉及有保肝和抗酶活性的的含磷cythesine衍生物。
背景技术：
已知生物碱cythesine(1)最初从金雀花和野决明的种子里提取出来，它现在被广泛地作为医用，以0.15％水溶液(金雀花碱)的状态作为兴奋剂(anaelepticagent)(Mashkovsky,M.D.,“药物治疗(Medicine remedies)”,M.,1977,卷Ⅰ,123页)
其中R=C2-5cythesine典型的性质是它能引起呼吸，这与通过来自颈动脉球加强的搏动对呼吸中枢的反射刺激有关。同时刺激交感神经结和肾上腺体导致动脉血压上升。在此情况下，cythesine被用于中毒时呼吸和心脏活动停止的病例，cythesine广泛存在于自然界。业已发现，许多植物和用离子交换方法得到的来自植物原材料的萃取物是获得cythesine的主要工业途径。
在著作(Uzbek SSR科学院报告，1978,N9,p.p.39-42；Uzbek SSR科学院报告，1977,N7,p.p.40-43)中已报道了含磷的N-[β-(二烷氧基氧膦基(dialkocsiphosphenyl))巯基乙基]cethysine(2)和它们的碘甲基化物(3)。
作者已显示，所有的合成化合物对乙酰胆碱酯酶具有不可逆转的抑制活性，并显现对丁酰胆碱酯酶催化活性的选择性抑制作用。
我们在文献中没有发现其它含磷的cethysine衍生物。
发明综述由于原初的cethysine生物碱显示了明显的生物活性，人们可推测其它含磷的cethysine衍生物也有类似的优点。
本发明的目的是得到具有增高的生物活性的新颖的含磷的cethysine衍生物。
这样达到了本发明的目的得到下列通式的含磷的cethysine衍生物
其中n=0,1；n=0时，X=S；OR=CH3(a)；C2H5(b)；C3H7(c)；1-C3H7(d)；C4H9(9)n=1时，X=OR1-1-C3H7(a)；C6H5(6)；
(3)通过使二烷基亚磷酸酯中间体与cethysine在下式Todde-Aterton反应条件下反应来合成O,O-二烷基-N-cethysinyl磷酸酯(n=0,X=O，化合物4a-e)
O,O-二烷基-N-cethysinyl磷酸酯(n=0,X=S,化合物5a-e)的合成分两步进行。第一步骤，在cethylsine与二烷基亚磷酸酯反应阶段(该合成如E.V.Nifantyev的文章，“含磷化合物的化学 ”科学杂志(M.Science)1983,85页所述)，在苯介质中，中间体O,O-二烷基-N-cethysenyl亚磷酸酯(它然后与摩尔当量元素硫O,O-二烷基-N-cethysenyl磷酸酯)在干氩气流和三乙胺存在下反应形成。
通过cethysine与醛和二甲基亚磷酸酯在Kabachnic-Fild反应条件下反应得到二甲基-(N-cethysenyl)烷基(芳基)膦酸酯(n=1,X=O,R-CH3化合物6A-c)
实施本发明的变体下列实施例更详尽地解释了本发明，但不为其限制。
实施例1．合成O,O-二甲基-N-cethysine磷酸酯(4a)将含2.86克(0.026摩尔)二甲基亚磷酸酯和15.5毫升(0.16摩尔)四氯化碳在100毫升苯中的混合物放进烧瓶中，搅拌时，以使溶液温度不超过20℃的速率加入含5克(0.026摩尔)cethysine和2.63克(0.026摩尔)三乙胺在230毫升无水苯中的混合物。
加料完成后，使反应混合物在室温下搅拌6小时。滤出析出的盐酸三乙胺晶体，真空蒸发器上蒸去溶剂。晶体物质(从苯中过结晶化)有5.64克(为理论得率的72.5％)，熔点为Tm:158-159℃。
IR光谱，νcm-1:1270(P-O),1050(P-O-C),830(P-N-C),1658(N-CO)。
EPR光谱，δ,m,d 6.23d(1H,CHα,3JNH5.0Hz),7.23d,d,(！H,CHβ,3JNH3.2Hz),6.12d(1H,CHγ)3.34d(6H,CH3O,JCH3P13.2Hz)NMR31P；δp=9.1m.d.测定值，％:C52.05；H6.24；N9.30；P10.36；C13H19N2O4O4P计算值，％:C52.36；H6.37；N9.40；P10.40。
根据X-射线衍射分析的数据，在O,O-二甲基-N-cethysinyl磷酸酯分子中的磷原子的配位被扭曲了，通常对磷酸酯而言是四面体。二氢吡啶环被展平到±0.01A的精度，羰基氧原子稍偏离该平面(0.07A)。
四氢吡啶环取椅型构象(ΔC8s2.7°)，其通路e原子的出口与来自中间平面的其它C原子差0.75A。六氢吡啶环具有几乎是理想的椅取型构象(ΔC8s0.5)。甲基CH3基团相对于相应的P-O和P-O键具有Rosh取向。
可相似地得到该系列的其它化合物4b-c(表1)。
2.O,O-二甲基-N-cethysinylthio磷酸酯(5a)的合成将5克(0.026摩尔)cethysine和2.63克(0.026摩尔)三乙胺在200毫升无水苯中的混合物放进烧瓶中，在干燥氩气流下和室温下强烈搅拌的同时向该混合物中加入3.33克(0.026摩尔)二甲基氯亚磷酸酯。使混合物搅拌5小时。滤出所得的三乙胺氢氯化物沉淀，用无水苯分批冲洗。滤液和计算量的硫0.83克(0.026摩尔)被放入烧瓶中，在室温下再持续搅拌2小时。然后，在旋转蒸发器上蒸发混合物，沉淀物用苯重结晶。得到8.01克(得率97％)晶体物质，Tm为164-165℃。IR光谱，νcm-1:1030(P-O-C),1670(N-CO),820(P-S)。EPR光谱，δ,m,d 6.23d(1H,CHα,3JNH6.0Hz),7.16d,d,(1H,CHβ,3JNH3.2Hz),5.8d(1H,CHγ)3.40d(6H,CH3O,JCH3P12.0Hz)NMR31P；δp=10.22m.d.测定值，％:C49.91；H6.13；N8.87；P9.69；C13H19N2O3SP计算值，％:C49.68；H6.05；N8.91；P9.87。
可相似地得到该类的化合物5B-E。结果如表1所示。
表1所述化合物的理化常数和元素分析数据
3．二甲基-2-(N-cethysinyl)-2-异丁基膦酸酯(6a)。
使含3.8克(0.02摩尔)亚磷酸二甲酯和催化量18-冠-6在100毫升苯中的混合物一起沸腾3小时同时蒸出反应进程中形成的水。反应结束并蒸出溶剂后，残留物用己烷洗涤，用苯-乙醚混合物重结晶，得到5.52克(得率78.1％)结晶物，熔点为138℃。
IR光谱，νcm-1:1220(P-O),1070(P-O-C)。
EPR光谱，δ,m,d 6.72d(1H,CHα,3JNH866Hz),7.10d,d,(1H,CHβ,3JNH664Hz),6.51d(1H,CHγ)3.31d(6H,CH3O,JCH3P12.6Hz)；0.50d(3H,CH3-C),0.87d(3H,CH3-C)。
测定值，％:C57.70；H7.72；N8.03；P8.67；C17H27N2O4P计算值，％:C57.56；H7.58；N7.90；P8.52。
可相似地得到这类化合物的其它化合物6B-C(表1)。
工业实用性所述化合物的生物活性药理研究显示所合成的化合物具有保肝和抗酶活性。
1．保肝活性研究。
1．化合物的急毒性。
对随意哺养的小白鼠(320头，每个为18-20克)测定平均致死剂量LD50。将制剂放在生理溶液中一次静注或放在1％淀粉悬浮液里口服。观察14天。每天检查动物的一般状态，观察期间对动物称重3次，解剖死亡的动物并进行宏观描述。
通过分析方法来决定LD50。
如实验结果所示，现已发现口服摄入化合物的LD50=4300mg/kg(3200-5800)，静注的LD50=1800mg/kg(1250-2550)。算术平均值和置信半区间为P=95％。
对急性中毒性大鼠肝炎的保肝活性根据药理学家的意见，目前最有效的保肝剂是”Essentisialle”(FRG)制剂，它被用于下列实验作为比较制剂。该制剂是复杂的物质，含类黄酮、磷脂、烟酰胺和各种维生素。
用4组，每组10个样本的随意哺养的体重为120-150克的雄性大鼠研究所述制剂对急性中毒性肝炎的保肝活性。
第一组，用0.1毫升氯化物等渗溶液对动物进行静注，然后(1小时内)再用0.4毫升40％四氯化碳在石油胶状物中的溶液进行腹腔内注射。
第二组，用0.1毫升氯化钠等渗溶液对动物进行静注，然后1小时后再用0.4毫升40％亲肝的毒物-四氯化碳在石油胶状物中的溶液进行腹腔内注射。
第三组，用0.1毫升“Essentsialle”溶液(50mg/kg)对动物进行静注，然后1小时后再用0.4毫升40％四氯化碳在石油胶状物中的溶液进行腹腔内注射。
第四组，用0.1毫升所述物质的水溶液(50mg/kg)对动物进行静注，然后1小时后再用0.4毫升40％四氯化碳在石油胶状物中的溶液进行腹腔内注射。
所有的注射每天重复一次，持续4天，然后在醚麻醉下杀死动物。
在表征细胞毒害损伤率的生物化学和组织学因子改变基础上评估所述制剂和比较制剂对用四氯化碳毒害的大鼠的保肝活性。
研究了血中丙氨酸氨基转移酶(alaninaminotranspherase,ALAT)活性和总胆红素水平，红血球化学发光渗透，肝脏组织切片中再生的和营养不良的细胞。
在研究化学发光时，从血液中萃取的红血球被悬浮在氯化钠等渗溶液(每个样品1毫升10％红血球悬浮液)，用0.1毫升5％H2O2刺激发红光，测定化学发光曲线下积分面积的平均数。
组 ALAT胆红素化学发光曲线下面积毫摩尔 小时/升 微摩尔/升1215 8.1 8.06 0.4 4.342182834.631.12 1.099.3953129110.520.84 0.257.354445.4 11.712.90 0.325.386组营养不良％坏疽％渗透％再生％1 2.6 0.2 0.35 1.42 20.5 4.3 0.6 0.6523 12.8 0.9 0.4 1.034 8.2 0.5 0.3 1.48
数据表明，所述物质对被四氯化碳毒害的大鼠有保肝活性，其作用比用作对比的“Essentsiallye”制剂更强大。
所述物质对用亲肝毒物毒害的大鼠存活率的影响为了研究制剂对用亲肝毒物毒害的小鼠存活率的影响，使用随意哺养的雄性，18-20克小鼠，每组10个，共3组。
第一组动物被腹腔内注射0.1毫升氯化钠等渗溶液。第二组动物被静注0.1毫升“Essentsialle”溶液，剂量为50毫克/千克。第三组动物被腹腔内注射0.1毫升本发明物质的水溶液(100毫克/千克)。
第一次注射后一小时，所有的动物被腹腔内注射0.1毫升在石油胶状物中的50％四氯化碳溶液。
注射进行一次。观察5天。5天里的存活率如下组存活动物量存活率10 022 2038 80所得的结果显示，本发明化合物对保护动物由于被亲肝毒物毒害而死亡的程度比“Essentsialle”的大。
这样，我们发现，本发明化合物具有适度毒性，其保肝作用在动物实验中明显超过“Essentsialle”制剂的作用。
另一个本发明含磷cethysine衍生物显示出对被保肝毒物毒害的大鼠的存活率有良好的作用结果。
该化合物在实验中使大鼠的存活率相似于上述的80％。
Ⅱ．抗酶活性研究。
研究本发明合成化合物的抗酶活性，它们与乙酰胆碱酯酶(ACT)和丁酰胆碱酯酶(BCE)的相互作用。使用特异性为1.2单位/毫克的来自人血红血球的ACE和来自马血清的BCE，其特异性为9.6单位/毫克。用Ellman量热方法在25℃0.2MNa-磷酸盐缓冲液(pH=7.5)里测定ACE和BCE活性。“Chemapol”公司出售的碘化乙酰硫代胆碱被用作底物。可逆转抑制剂的作用用A.P.Brestking方法测定，用归纳化的抑制常数(Ki)表征，在混合型抑制作用中Ki与竞争组分(Ki)和未竞争组分(K'i)有关，等式如下l/Ki=l/Ki+l/K’i
用两种方法测定P450细胞色素活性对于3,4-苯并/a/芘的羟基化速率，通过用荧光测定法来测定形成的4-羟基苯并/a/芘，对于7-乙氧基香豆素(qumarine)二乙基化的速率，使用荧光测定法测定所形成的7-羟基香豆素。
通过PJ50(使活性减少50％时试剂浓度对数的负数)来评定被研究的物质对P450细胞色素的抑制影响。
现已发现cethysinyl磷酸酯和cethysinyl硫代磷酸酯是ACE具有平均效力的抑制剂，是极有效的BCE抑制剂。对于硫代磷酸酯衍生物观察到了相对于BCE的最大选择性(pK1=6.7和pK1=6.1)。
本发明也揭示了P450细胞色素的能量抑制剂，它们有生可供实用，PJ50=5.55和pJ50=5.70的化合物在这之中。
权利要求
1．一种含磷的cethysine衍生物，具有下列通式
其中n=0,1.n=0时，X=S；OR=CH3；C2H5；C3H7；1-C3H7；C4H9；n=1时，X=OR=CH3,R1=1-C3H7；C6H5，正-CH3O-
全文摘要
本发明揭示了近来合成的含磷cethysine衍生物,具有通式(Ⅰ),其中n=0,1;n=0时,X=S;R=CH
文档编号C07F9/6561GK1224425SQ96180381
公开日1999年7月28日 申请日期1996年5月20日 优先权日1996年5月20日
发明者A·M·加扎利耶夫, A·E·古利亚耶夫 申请人:A·Z·韦季克