专利名称：分离自肠粘膜的抗肿瘤剂、其分离方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从猪肠粘膜中分离有抑制细胞生长作用的两种抑制剂的方法。实验显示这两种抑制剂有抑制细胞增殖作用。我们先前的研究[1]已经显示，细胞分化造成特异性形态发生刺激剂和抑制剂即通常所指的个体发生素的出现；特别是，肠细胞发生刺激剂(SEG)和抑制剂(IEG)是从生理性再生粘膜细胞中分离出的[2]。在新近的研究中，我们所报导的数据指出，在结肠粘膜中有抑制型成分存在，其专门抑制结肠细胞增殖[3]。
本发明的目的是1.详述在工业条件下生产这两种肠细胞发生抑制剂(IEG1和IEG2)的方法。
2.用化学法鉴定这些肠细胞发生抑制剂。
3.针对实验动物检测IEG1和IEG2对形态发生和生物合成过程的作用。
4.检测体外正常和恶性细胞培养物中的IEG1，研究体内外和仅在体内IEG1对可移植的试验性肿瘤的效果。
第一个目的是通过提供一种从猪肠粘膜分离肠细胞发生抑制剂的方法而实现的。工业条件下的生产流程包括1.将得自肠粘膜的废细胞物质分级分离成特殊细胞类型；2.用2％的乙酸提取出高分子聚合体，再经乙醇沉淀；3.分离并经过滤后，轻级分再经DDS滤器(10kDa)超滤；4.超滤物经冻干，再经分子筛分离。
第二个目的是通过在实验室条件下用FPLC和HPLC方法获取高度纯化的制剂而实现的。所采用的化学性质和谱图分析证实IEG1和IEG2是核肽；用氨基酸分析仪测定其氨基酸含量。
第三个目的是通过进行关于制剂对生物合成过程的效果的实验而实现的，该效果是通过被测小鼠肠的不同部位中掺入的H3-胸苷(DNA-合成)和C14-尿苷(RNA合成)而评估的。制剂的形态发生作用是通过相同部位中肠细胞构成和DNA浓度而评估的。
第四个目的是通过研究IEG1在体外对6个正常细胞系和7个恶性细胞系的细胞培养物的作用、体内外对可移植的实性肿瘤的作用和仅在体内对肿瘤的作用而实现的。
本发明将用下述实例描述实例1。目的1(
图1)。收集从屠宰场毛肠清洗间中Biterling机的2号毛肠去粘膜挤压辊上取下的细胞物质，加入浓乙酸，持续搅拌，达到相对于整个细胞物质而言乙酸最终浓度为2％。将如此制备的物质用粉碎机将细胞破碎，接着将与3体积96％乙醇一起在反应器中加热的聚合物沉淀。在分离器中分离出轻级分再过滤；将其pH值调至6.5-7.0，经DDS滤器超滤至6000-1000Da。收集到的滤过物经冻干，就可以储存在-10℃的温度下而能保持生物活性达五年之久。使用时，将0.1g冻干剂溶解在0.5ml水中，再额外经Sephadex G-25(中级)上凝胶过滤而纯化。
实例1。目的2(图2a和2b)。目的1中纯化的生物活性级分的分子量是采用HPLC仪器在Sorbax硅胶柱上测定的(图2a)。测得IEG1分子量为4450±180Da，IEG2分子量为950±120Da。 UV光谱分析揭示了两个吸收最大点IEG1在220nm和248nm，IEG2在220nm和245nm。两种IEG都有鸟嘌呤核苷证实它们具有核肽性质。氨基酸分析仪(图2b)显示，IEG1包含谷氨酰胺(13.33％)、然后是赖氨酸(10.95％)、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸和精氨酸。半胱氨酸(Cyctine)、蛋氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸可能以一种混合状态存在(＜1.5％，表1)。IEG2是一种有下述氨基酸序列的六肽Arg-Arg-Asp-Asp-His-Arg-NH2。
权利要求
1.分离自肠粘膜的抗肿瘤剂，它们是分子量分别为4450±180Da和950±120Da的两种核肽，即IEG1和IEG2；IEG1是与2个鸟嘌呤(guanile)残基结合的、包括2个Thr、4个Glu、5个Gly、2个Asp、2个Ser、4个Ala、2个Val、1个Ile、1个Try、3个Lys、1个His、1个Arg、2个Leu和3个Pro的肽；IEG2是与一个鸟嘌呤残基结合的、有下述氨基酸序列的六肽Arg-Arg-Asp-Asp-His-Arg-NH2。
2.一种从猪肠粘膜获得如权利要求1的抗肿瘤剂的方法，该方法包括废肠粘膜物质的分级分离、用酸提取、用乙醇沉淀、1-6kDa范围内的超滤、冻干和附加凝胶过滤。
3.通过“体内外”联合方式应用剂量为1050μg/l的IEG1抑制实验性Lewis肺癌的生长，以及通过“体内”方式应用剂量为4×10-3g/kg体重的IEG1抑制IC-Sofia-7系扁平细胞癌。实验性应用IEG1作为正常和恶性细胞系的细胞培养物生长的抑制剂，IEG1和IEG2作为肠道内DNA生物合成的抑制剂。
全文摘要
本发明涉及获取在实验条件下测试的两种抗肿瘤剂(IEG
文档编号C07K7/06GK1168143SQ96191463
公开日1997年12月17日 申请日期1996年3月4日 优先权日1995年10月20日
发明者B·B特里弗诺, G·K·路萨, N·A·布施 申请人:C·A·阿菜克桑德罗夫