纯化血小板生成素的方法

专利名称：纯化血小板生成素的方法
技术领域：
本发明的背景技术血细胞生成是一个在骨髓中血细胞从多能干细胞发育和分化的过程。这一过程包括借助于靶细胞上的膜结合受体的多肽生长因子(细胞因子)之间复杂的相互作用。细胞因子的作用导致对通常为谱系特异性和/或阶段特异性的特定细胞因子产生应答的细胞增殖和分化。来自于干细胞的单一细胞类型，例如血小板的发育可能需要多种细胞因子以适当顺序协调作用。
已知的细胞因子包括白介素，例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，IL-8等；和集落刺激因子，例如G-CSF，M-CSF，GM-CSF，红细胞生成素(EPO)等。通常，白介素起免疫和炎症反应的介体的作用。集落刺激因子刺激骨髓来源的细胞的增殖，活化成熟的白细胞，和另外形成宿主对炎症，感染和免疫攻击发生反应的一内在部分。
已开发多种细胞因子作为治疗剂。例如，刺激红细胞发育的红细胞生成素被用于治疗由肾脏疾病导致的贫血症。一些集落刺激因子与癌症化疗结合被用于加快病人免疫系统的恢复。白介素-2，α-干扰素和γ-干扰素被用于治疗某些癌症。
在血小板减少动物的流体中已鉴定出一种刺激巨核细胞生成和血小板生成的活性，并在文献中被称为“血小板生成素”(最近由McDonald发表，实验血细胞学16201-205，1988和McDonald，Am.J.Ped.Hematol.Oncol.148-21.1992)。最近有几组已分离和/或克隆了血小板生成素(TPO)，这基于其结合细胞mpl受体和刺激巨核细胞生成的能力。参见de Sauvage等，自然369533-538，1994；Lok等，自然369565-568，1994；Kaushansky等，自然369568-571，1994；Wendling等，自然369571-574，1994和Bartley等，细胞771117-1124，1994。
人和小鼠TPO cDNA的初级翻译产物的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中。分析和实验证据表明成熟蛋白从残基Ser-22(人)和Ser-45(小鼠)开始。TPO经受蛋白水解并已被异源或降解形式分离(deSauvage等，自然369533-538，1994；Bartley等，细胞771117-1124，1994)。已发现小到25kD的分子种类在体外具有活性(Bartley等ibid)，并且已报道，象全长人cDNA的表达产物那样(Bartley等，ibid)，153(de Sauvage等ibid)和174个氨基酸(Bartley等ibid)的重组人TPO氨基末端多肽在体外具有活性。
虽然至少一些蛋白水解产物具有生物活性，但就组合物和各种分子种类的相对活生而言，科技文献中报道的血小板生成素的制备并没有因此被很好地表述。然而，很少有工作进行血小板生成素大规模生产，在本领域中仍需要以经济的方式大量制备该蛋白质的方法。尤其是，需要从生物流体中纯化血小板生成素的方法，并以适用于药物制剂的形式生产它。还需要制备无包括TPO片断和聚集物的污染物蛋白的血小板生成素的方法。本发明提供这些方法以及其它相关的优点。
本发明的概述本发明提供从包含血小板生成素和蛋白质污染物的溶液中去除蛋白污染物的方法，所述污染物包括血小板生成素的聚集物。这些方法包括将该溶液暴露于羟基磷灰石中，从而使蛋白质污染物与羟基磷灰石结合，血小板生成素基本上保持未结合，并回收未结合的血小板生成素。在本发明的一个实例中，通过离子交换层析，配体亲合层析或疏水相互作用层析分级分离含TPO的液体组合物来制备含TPO的溶液。在另一个实例中，通过阳离子交换层析或超滤浓缩回收的血小板生成素。
在一个相关的方面，本发明提供从生物流体中分离血小板生成素(TPO)的方法。这些方法包括步骤(a)通过选自配体亲合层析，离子交换层析，疏水相互作用层析和超滤的方法减少含TPO的生物流体的体积以提供浓缩的级分；(b)调节浓缩的级分的盐浓度，以提供一调整溶液；(c)酸化调整溶液以沉淀污染蛋白质，提供一清除溶液；(d)通过阴离子交换层析分级分离清除溶液以提供TPO富集级分；(e)将TPO富集级分暴露于羟基磷灰石中，从而使蛋白质污染物与羟基磷灰石结合，TPO基本上保持未结合；(f)回收未结合的TPO；和(g)通过阳离子交换层析或超滤浓缩回收的TPO。在一个实例中，生物流体为细胞决定的培养基或其一部分。在另一个实例中TPO为人TPO。在另一个实例中，减少步骤包括通过染料-配体亲合层析直接捕获，例如通过在衍生交联的琼脂糖珠基质上的直接捕获。在另外一个实例中，调节步骤包括超滤。在另一些实例中，浓缩步骤包括阳离子交换层析或阴离子交换层析。
在本发明优选的一个实例中，从羟基磷灰石中回收的TPO在变性条件下，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的分子量为70,000±10,000道尔顿，基本上没有低分子量(≤55kD)的蛋白质污染物和高分子量的聚集物。
本发明的这些和其它方面将通过下面的实施例变得显而易见。
本发明的详细描述在详细描述本发明之前，理解本文所用的某些术语的定义可能是有邦助的“生物流体”指来自或包含细胞，细胞成分或细胞产物的任何流体。生物流体包括，但不局限于细胞培养物上清，细胞溶胞产物，清除的细胞溶胞产物，细胞提取物，组织提取物，血液，血浆，血清，乳汁和其部分。
“细胞决定的培养基”指细胞培养在其中并包含细胞产物的营养培养基。
本发明提供从包括细胞决定的培养基的生物流体中纯化TPO的方法。这些方法尤其有用是在于它们提供基本上没有包括蛋白水解降解产物和高分子量的TPO的聚集物的蛋白质污染物的TPO均一制剂。
本发明的方法可用于人和非人(例如鼠，犬，猪，牛，羊)血小板生成素的制备。这些方法尤其非常适宜于从细胞决定的培养基或其级分(即已通过其它分离方法预先富集了TPO的细胞决定的培养基的级分)中纯化TPO。因此优选在根据本领域熟知的方法用遗传改造的培养细胞中制备血小板生成素。总结这些方法，将编码TPO的DNA分子连接到使其在宿主细胞中保存和转录的其它的DNA序列上。将产生的表达载体插入宿主细胞中，并在适宜的营养培养基中培养产生的“转化”细胞。虽然TPO可从细胞溶胞产物中回收并在体外加工产生活性蛋白质，但优选改造细胞使其将TPO分泌到培养基中。通常参见de Sauvage等，自然369 533-538，1994；Lok等自然369565-568，1994；Kaushansky等，自然369568-571，1994；Wendling等，自然369571-574，1994；Bartley等，细胞771117-1124，1994；和悬而未决，共同转让的美国专利申请号O8/366,859和08/347,029，它们全文被本文引作参考。
还可通过转基因动物制备TPO。当使用转基因动物时，在它们的乳汁中产生异源蛋白质是尤其有利的。因此产奶的动物，例如奶牛，绵羊和山羊为优选的宿主。参见例如，WIPO公开WO88/00239，WO 90/05188，WO91/02318，和WO92/11757；以及美国专利号4,873,191；4,873,316；和5,304,489，它们全文被本文引作参考。
本发明部分以该发现为基础，即血小板生成素和蛋白质污染物的溶液可通过将该溶液暴露于羟基磷灰石中而被有效地分级分离。包括高分子量的TPO聚集物的蛋白质污染物优先与羟基磷灰石结合，而完好的具有生物活性的血小板生成素基本保持未结合。羟基磷灰石的应用可有利地与其它纯化和浓缩方法结合，包括离子交换层析，配体-亲合层析，疏水相互作用层析，超滤和分级沉淀。
优选在暴露于羟基磷灰石之前，浓缩和/或分级分离复杂的含有血小板生成素的溶液(例如细胞决定的培养基)。可通过使用配体-亲合层析，离子交换层析，疏水相互作用层析，超滤或这些方法的结合产生的直接捕获而降低体积的方法来达到浓缩。在将溶液暴露于羟基磷灰石中之前，阴离子交换层析是优选的分级分离(富集)方法。
在本发明的一个优选实例中，以一系列步骤从包含TPO和蛋白质污染物的生物流体中纯化TPO，开始步骤为通过配体-亲合层析，离子交换层析，疏水相互作用层析或超滤降低流体样品的体积以提供与起始原料相比具有减少体积的浓缩级分。接着调节浓缩级分中的盐浓度以提供一调节溶液。调节盐浓度的方法包括透滤，稀释，透析和疏水相互作用层析。接着酸化调节溶液以分级沉淀通过过滤或其它方法从溶液中去除的污染蛋白质。通过阴离子交换层析分级分离产生的清除溶液以提供TPO富集的级分。任选地，可在阴离子交换层析之前，将pH调至5-9，优选为约pH7-8。接着将TPO富集级分与羟基磷灰石混合，从而使蛋白质污染物与羟基磷灰石结合，TPO基本上保持未结合。接着收集未结合的TPO并通过例如阳离子交换层析或超滤浓缩。本领域技术人员应理解，对于常规的实验，这些步骤的顺序可以改变。通过步骤的顺序以及具体方法和分级分离介质的选择按需要调节缓冲液组成，离子强度和pH。
当用含有细胞，细胞碎片等的生物流体进行实验时，优选首先过滤流体以去除这些颗粒污染物。
如上所述，体积减少步骤可采用配体-亲合层析，离子交换层析，疏水相互作用层析或超滤。优选使用通过配体亲合层析产生的直接捕获来减少体积，并尤其优选使用染料-配体亲合介质。适宜的染料-配体亲合介质包括MIMETIC RedTM2A6XL，MIMETIC RedTM3 A6XL，MIMETIC BlueTM1 A6XL，MIMETIC BlueTM2 A6XL，MIMETIC OrangeTM1 A6XL，MIMETIC OrangeTM2 A6XL，MIMETIC OrangeTM3 A6XL，MIMETIC YellowTM1A6XL，MIMETIC YellowTM2 A6XL，和MIMETIC GreenTM1 A6XL(亲合层析有限公司，Freeport，英国)这些介质为45-164μm的6％的交联琼脂糖珠，染料配体借助于间隔臂与其相连。尤其优选使用柱大小为1.0ml树脂/300ml样品体积的MIMETICGreenTM1 A6XL。在生理条件下(弱碱pH和盐浓度≈150mM)，TPO与MIMETICGreenTM1 A6XL，MIMETIC BlueTM1 A6XL，MIMETIC BlueTM2 A6XL，和MIMETICRedTM3 A6XL结合，在将生理流体加入到介质中之前，不需要调节它的pH和离子强度。可使用增加的盐浓度，增加的pH，变性剂或其组合来洗脱结合的TPO。例如，可用3M NaCl的1％NH4OH或4M胍溶液洗脱与MIMETICGreenTM1 A6XL结合的TPO。其它适宜的染料-配体亲合介质包括BlueSepharoseR(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)等。优选在冷(4-10℃)下进行该步骤以减少细菌污染的可能性。现有技术中已知确定染料-配体亲合介质的结合特异性的方法以及适宜于TPO的洗脱条件，包括使用商业可购得的分析盒(例如可从亲合层析有限公司购得的PIKSITM试验盒)。参见例如，Kroviarski等，层析杂志449403-412，1988和Miribel等，生物化学和生物物理学方法杂志161-16，1988。
还可采用其它减少含TPO的生物流体的体积的方法。可在适当调节流体pH和导电率之后通过在阴离子或阳离子交换介质上捕获TPO来减少体积。捕获后，可将TPO用盐或pH梯度进行洗脱。在第二种方法中，可在适当调节流体盐浓度之后通过疏水相互作用层析(HIC)来捕获TPO。可用低离子强度缓冲液将TPO从HIC柱中洗脱。还可用超滤来减少体积。也可使用这些方法的各种组合。
接着如所需，调节浓缩级分的盐浓度以用于下面的分级分离。例如，通过阴离子交换层析进行的分级分离通常需要将导电率调节到约3-6mS/cm以避免不能接受的损失。优选的调节方法为通过透滤的缓冲液交换。调节盐浓度的其它方法包括稀释到所需导电率，调节pH，疏水相互作用层析，凝胶过滤，反相层析。优选的HIC介质包括PhenylSepharose(Pharmacia Biotech)，Butyl Sepharose(PharmaciaBiotech)，和FractogelEMD Propyl 650(S)和FractogelEMD Pheny 1650(S)，20-40μm(EM Science，Gibbstown，NJ)。使用HIC通常需要首先通过加入盐增加富集级分的导电率。接着使用低离子强度缓冲液将TPO从HIC介质中洗脱。如果需要，在另外的分级分离之前进一步调节洗脱物的离子强度。优选的凝胶过滤介质包括交联的琼脂糖珠，聚丙烯酰胺或其它聚合物，例如SephacrylS-200 HR或S-300HR(Pharmacia Biotech)和Superdex(Pharmacia Biotech).优选的反相介质包括多孔树脂Oligo R2和Oligo R3(PerSeptive Biosystems，Inc.，Framingham，MA)。
通过温和酸沉淀和过滤可从得到的调节溶液中去除污染蛋白质。当在调节步骤中使用透滤时，使用酸性交换缓冲液(例如25mM乙酸钠缓冲液，pH5.0)是很方便的，从而将盐浓度调节和污染物的分级沉淀结合起来。
使用通常包括用叔或季胺基衍生的不可溶的粒状载体的介质进行阴离子交换层析。在这方面适宜的载体包括琼脂糖珠，葡聚糖珠，聚苯乙烯珠等。优选用三甲基氨基乙基衍生的载体。适宜的阴离子交换介质包括Macro-PrepQ(Bio-Rad实验室，Hercules，CA)，Q-HyperDTM(BioSepra，Inc.，Marlborough，MA)，Q Sepharose(Pharmacia)等。尤其优选的阴离子交换介质为 FractogelEMD TMAE-650(S)(EMScience，Gibbstown，NJ)。阴离子交换层析通常在温度为约18-25℃，优选约20℃(室温)下，pH5-9，优选6.5-8.0时，在Tris或磷酸缓冲液中进行。优选柱大小为1.0ml树脂/20-30mg总蛋白。
接着将来自阴离子交换柱的洗脱物暴露于羟基磷灰石中，这样蛋白污染物与羟基磷灰石结合，TPO基本上保持未结合。在一个优选的方法中，羟基磷灰石以柱的形式制备，使用1.0ml树脂/4.0-8.0mg样品总蛋白。用低离子强度缓冲液在弱酸性至接近中性的pH下将柱平衡，例如pH为5.5-7.5的10mM磷酸钠缓冲液。将来自阴离子交换步骤的洗脱物级分的导电率调节为约10-30mS/cm，优选约11mS/cm，室温下，将溶液上样到柱中，收集流通的包含TPO的级分。
接着浓缩包含未结合TPO的流通级分。适宜的浓缩方法包括阳离子交换层析和超滤。使用通常包括用磺基丙基或羧甲基衍生的不溶的粒状载体的介质进行阳离子交换层析。在这方面适宜的载体包括珠状、交联的琼脂糖，丙烯酰胺，异丁烯酸酯等。优选用磺基丙基衍生的载体。这种类型的商业可购得的阳离子交换介质包括S-HyperDTM(BioSepra)，TSK-GelS(TosoHaas，Montgomeryville，PA)，SP Sepharose(Pharmacia Biotech)等。尤其优选的磺基丙基衍生的介质为FractogelEMD SO3--650(S)(EMScience)。在一典型方法中，在室温下，以1.0ml树脂/3.0-6.0mg总蛋白(通过A280测得)将具有酸性pH(例如4.0-5.0)和低离子强度(例如3-6mS/cm)的含TPO的溶液加入FractogelEMD SO3--650(S)的柱中。洗涤柱以除去未结合的物质，并用高离子强度缓冲液(例如0.1-0.5M NaCl，pH6-9)洗脱TPO。优选的洗脱缓冲液为含有0.28M NaCl的40mM磷酸钠缓冲液，pH9。
虽然上面描述的方法以及下面的实施例使用柱层析，本领域普通技术人员应该理解还可使用批处理。
在需要增加骨髓中细胞增殖时，可将本发明方法制备的血小板生成素用于治疗用途，例如治疗如由再生障碍性贫血，myelodisplasticsyndromes，化学疗法或先天性白细胞减少症诱导的白细胞减少症。TPO尤其可用于增加例如在治疗血小板减少症中的血小板的产生。血小板减少症与可单独或一齐起作用产生这种疾病的多种疾病和临床状况相关。例如，血小板生成缺陷，异常血小板分布，由于大量输血导致的稀释损失，或血小板的异常破坏可造成降低的血小板计数。例如，用于癌症治疗的化疗药物可抑制骨髓中血小板先祖细胞的发育，并且导致的血小板减少症限制了化疗，可能必需输血。此外，一些恶性肿瘤可削弱血小板的生成和血小板的分布。用于杀伤恶性肿瘤细胞的放射疗法也杀伤血小板先祖细胞。血小板减少症也可从由药物，新生儿异源免疫或血小板输血异源免疫诱导的各种血小板自身免疫紊乱所造成。TPO可降低或减少输血的要求，从而降低血小板异源免疫的发生。血小板的异常破坏可来自(1)血管移植或创伤组织中的增加的血小板消耗；或(2)与例如，药物诱导的血小板减少症，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，自身免疫疾病，血液病，例如白血病和淋巴瘤或涉及骨髓的转移性癌症相关的免疫机制。其它TPO的指征包括由例如化疗或用AZT治疗HIV感染导致的再生障碍性贫血和药物诱导的骨髓抑制。
血小板减少症表现为增加的出血，例如来自鼻-口区域或胃肠道的粘膜出血，以及从伤口，溃疡或注射部位的渗出。
为了药物应用，将TPO制成胃肠外，尤其是根据常规方法的静脉内或皮下施用。静脉施用通过丸剂注射或一到数小时期间内的输液进行。通常，药物制剂包括TPO和药物上可接受的媒介物，例如生理盐水，缓冲生理盐水，5％葡萄糖水溶液等。制剂进一步包括一种或多种赋形剂，保存剂，稳定剂，缓冲剂，和防止蛋白质在小瓶表面损失的清蛋白等。此外，TPO可与其它细胞因子结合，尤其是早期作用细胞因子，例如干细胞因子，IL-3，IL-6，IL-11或GM-CSF。当使用这一组合治疗时，细胞因子可以单一剂型组合或以单独剂型给药。本领域已熟知制剂方法并公开在，例如被本文引作参考的Remingtonis Pharmaceutical Science，Gennaro，编，Mack Publishing CO.，Easton PA，1990。治疗剂量通常为0.1-100μg/kg病人体重/天，优选0.5-20μg/kg/天，准确的剂量由临床医生根据可接受的标准，考虑治疗疾病的特点和严重性，病人特质等来决定。剂量的确定在本领域普通技术人员的水平内。TPO给药通常在化疗或骨髓移植后或达到血小板计数＞20,000/mm3，优选＞50,000/mm3多达28天内进行。较通常地，TPO给药在一周或更少，通常在1至3天期间进行。通常治疗有效量的TPO为足以产生淋巴或骨髓祖先细胞的增殖和/或分化的临床显著增加，这种增加表现为成熟细胞(例如血小板或噬中性白细胞)的循环水平的增加。血小板疾病的治疗将持续至血小板计数达到至少为20,000/mm3，优选50,000/mm3。TPO也可与其它细胞因子，例如IL-3，-6和-11；干细胞因子；红细胞生成素(EPO)；G-CSF和GM-CSF一起组合给药。在组合治疗的方案中，其它细胞因子的每日剂量通常为EPO，≤150U/kg；GM-CSF，5-15μg/kg；IL-3，1-5μg/kg；和G-CSF，1-25μg/kg。与EPO的组合治疗，例如被用在具有低水平的TPO的贫血病人中。
TPO还可作为体外研究血细胞生成细胞的分化和发育的有益手段，例如用于阐明细胞分化的机制和确定成熟细胞谱系，并还发现可用作细胞培养中的增殖剂。
TPO还可体内使用，例如在自体骨髓培养物中。简而言之，在化疗之前，从病人体内取骨髓并用TPO处理，任选与一或多种其它细胞因子组合。接着在化疗后将处理的骨髓放回到病人体内以加速病人的恢复。此外，TPO可用于骨髓的体内扩展或外周血液先祖(PBPC)细胞。在化疗处理之前，可将骨髓用干细胞因子(SCF)或G-CSF刺激以将早期先祖细胞释放到外周循环中。可从外周血液中收集这些先祖细胞并浓缩，接着在培养基中用TPO处理，任选与一或多种其它细胞因子组合，包括，但不局限于SCF，G-CSF，IL-3，GM-CSF，IL-6或IL-11，以分化和增殖为高密度巨核细胞培养物，在高剂量化疗后该培养物可被接着送回病人体内。
通过下面非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例实施例1制备MIMETIC GreenTM1 A6XL(亲合层析有限公司，Freeport，GreatBritain)(9cm直径×12cm高)。在4℃下进行柱操作。以1cm/分流速将柱用5倍柱体积的磷酸缓冲盐水(PBS，120mM NaCl，2.7mM KCl，10mM磷酸盐，pH7.2)平衡。
将由人TPO表达载体转染的幼年仓鼠肾脏细胞调节的并包含TPO的200升细胞培养基用0.22μm乙酸纤维素或polysufon滤膜过滤。过滤后的培养基以1cm/分钟的速率加到柱上。用5倍柱体积的PBS洗涤或直至吸光度(280nm)达到基线。使用1％的氢氧化铵，3M NaCl溶液将结合蛋白从柱中洗脱下来。通过280nm的吸光度监测柱洗脱液的蛋白含量。收集峰级分。峰蛋白通常洗脱在约2倍柱体积中。
在4℃下让洗脱峰静置15分钟，接着用50％乙酸将pH调至5.0。形成奶白色沉淀，在-80℃下，在洗脱液中贮存。
将柱用3体积的1.0M NaOH清洗。让NaOH在树脂上停留2小时，接着将树脂用5体积的水洗涤并贮存在20％乙醇中。
在四批中将700升调节介质(起始体积)通过MIMETIC GreenTM柱处理，接着收集被洗脱物。收集物中含有约总共6g蛋白。
室温下将来自MIMETIC GreenTM柱(约2升体积)的洗脱液/沉淀融化过夜，然后用155cm2，3μm聚氨基甲酸乙酯膜被膜滤器(#12116折叠被膜，Gelman Science，Ann Arbor，MI)以去除任何沉淀。当过滤完成后，将被膜用300ml 25mM乙酸钠，pH5.0洗涤。
通过使用来自AG/Technology(Needham，MA)的透滤空心纤维膜(30,000分子量截止)和箱大小为6(0.28m2面积；来自AG/Technology的#UFP-30-E-6A)的超滤调节清亮滤液的盐浓度。交换缓冲液为25mM乙酸钠，pH5.0。滤液流出速率为在20psi下约60ml/分。在约3体积的透滤后，物质变得混浊。在约7体积后，导电率达到约4mS/cm。pH为5.0，物质为奶白色混浊外观。4℃下将该物质贮存过夜。
通过用水冲洗，用0.5M NaCl在系统中循环1小时，并再用水冲洗来清洗透滤装置。将系统贮存在20％乙醇或0.1M NaOH中。
用1M Tris pH8.0将透滤物质调节至20mM Tris，用2M NaOH将产生的溶液的pH调至8.0。接着用0.45μm聚氨基甲酸乙酯膜被膜滤器(#12131VersaflowTM被腊，Gelman Science，Ann Arbor，MI)过滤溶液。
接着通过在FractogelEMD TMAE-650(S)的颗粒大小为0.025-0.04mm(EM Science)的9cm直径×11cm高的柱(约700ml树脂)上的阴离子交换层析将过滤物质分级分离。首先将柱用3倍柱体积的20mM Tris，pH8.0平衡。以1cm/分的线性速率将蛋白溶液上样到柱上。将上样柱用3倍柱体积的20mM Tris，pH8.0洗涤，接着用10倍柱体积的0-0.3M NaCl梯度的20mM Tris pH8.0溶液，接着是2倍柱体积的0.3M NaCl的20mM TrispH8.0溶液洗脱结合蛋白。在约30mM NaCl时TPO开始从柱中洗脱。
用3倍柱体积的1M NaCl的20mM Tris pH8.0溶液清洗Fractogel柱，用3倍柱体积的0.5M NaOH去除有害成分，接着在0.5M NaOH中静置2小时。用5倍体积的水洗涤柱并贮存在20％乙醇中。
通过在还原条件下在10-20％梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Novex，San Diego，CA)后进行蛋白质印迹分析来分析来自柱的级分。收集在蛋白质印迹中显示为阳性的70kD的级分。
通过测定280nm的吸光度定量TMAE洗脱液的蛋白含量。用0.5M磷酸钠pH6.8将洗脱液调节为10mM磷酸钠，用2N NaOH将该溶液的pH调至6.8。通过用水(约稀释两倍)稀释将导电率调至10mS/cm，按需要将pH重新调至6.8。
接着将稀释的洗脱液通过使用约1ml树脂/6mg总蛋白的陶瓷羟基磷灰石柱(Macro-Prep陶瓷羟基磷灰石，40μm；Bio-Rad实验室，Hercules，CA)。700升被在150ml树脂上(柱大小为4.4cm直径×15cm)进行处理的调节至这一点的条件培养基包含约900mg蛋白。将柱用10mM磷酸钠pH6.8平衡，接着以1.5cm/分流速上样。收集流通级分。接着将柱用4倍柱体积的10mM磷酸钠pH6.8洗涤，并将洗涤的第一柱体积与流通级分混合。用0.5M磷酸钠pH6.8将残留的污染物和剩余TPO(为全部TPO的约10-20％)从柱中洗涤。将柱用3倍柱体积的0.5M NaOH去除有害成分，让柱在NaOH中静置2小时，此后用5倍柱体积的水洗涤。将柱贮存在20％乙醇中。
通过使用C-18柱和乙腈梯度的反相HPLC分析在羟基磷灰石上纯化之前和之后的产物流。结果表明基本上所有存在于TMAE洗脱收集物中的杂质结合到羟基磷灰石上。来自羟基磷灰石柱的流通级分包含HPLC单峰。
来自羟基磷灰石柱的含TPO的级分含有约250mg总蛋白(A280下测定)。通过加入粉状乙酸钠将物质调节为20mM乙酸钠，pH被调至5.0，用水稀释溶液至导电率为6mS/cm。
将含有约30ml FractogelEMD SO3---650(S)(EM Science)的3.2cm直径×3.7cm柱用3倍柱体积的20mM乙酸钠，pH5.0平衡。以2cm/分的流速上样TPO溶液。将柱用5倍柱体积的20mM乙酸钠，pH5.0洗涤。用含有0.5MNaCl的20mM乙酸钠pH5.0从柱中将TPO洗脱。洗脱液的蛋白浓度为约1mg/ml。
将柱用3倍体积的0.5M NaOH清洗，并在NaOH中静置2小时，随后用5倍体积的水洗涤，贮存在20％乙醇中。
实施例2通过在4-20％Tris-甘氨酸凝胶(从Novex，San Diego，CA获得)上电泳，接着银染或蛋白质印迹来分析基本上按实施例1所公开的内容制备的人TPO。在还原条件下将1μg蛋白进行电泳，将凝胶用考马斯兰染色及脱染色，接着用Daiichi银染盒(Integrated Separation Systems，Natick，MA)。具有这一非常重的凝胶负荷，单一黑色宽带集中在Mr≈70kD。在非还原条件下将100ng蛋白进行电泳并转移到硝酸纤维素膜上。用抗-TPO单克隆抗体的混合物(cocktail)，接着进行辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠抗体和ECLTM检测试剂(Amersham Corp.)探测印迹。将印迹对X-射线膜曝光。出现集中在约70kD的一条宽带。还检测到一些仅在250kD处以下开始的较浅的带。
在使用用编码人MPL受体(Vigon等Proc.Natl.Acad.Sci.USA895640-5644，1992)的表达载体转染的BaF3细胞作靶细胞的有丝分裂分析中分析TPO的生物活性。BaF3是来源于鼠骨髓的白介素-3依赖型前淋巴样细胞系(Palacios和Steinmetz，细胞41727-734，1985；Mathey-Prevot等分子细胞生物学64133-4135，1986)。在存在3H-胸苷时将细胞暴露于试验样品中。通过与人TPO标准曲线比较来定量掺入到细胞DNA中的3H-胸苷的量。发现制备物具有1.77×106单位/ml的活性，其中10U/ml被定义为在有丝分裂分析中产生最大刺激的一半的量。通过氨基酸分析，制备物中的蛋白质浓度为0.41mg/ml，产生的比活为4.32×106U/mg。
此上可见，应该理解，虽然为了说明的目的在此描述了本发明的具体实例，但可在不偏离本发明实质和范围的情况下作出各种改变。因此，除了所附权利要求外本发明不受任何限定。
序列表(1)一般信息(i)申请人ZymoGenetics，Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattleWAUSA98102(ii)纯化血小板生成素的方法(iii)序列数目2(iv)通讯地址(A)地址ZymoGenetics，Inc.
(B)街道1201 Eastlake Avenue East(C)城市Seattle(D)州 WA(E)国家USA(F)ZIP 98102(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(Viii)代理人信息(A)名称Parker，Gary E
(B)登记号31-648(C)查询/记录号95-04(ix)通讯地址(A)电话206-442-6600 ext 6673(B)传真206-442-6678(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度353个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID N01Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala1 5 10 15Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val20 25 30Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser35 40 45Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala50 55 60Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65 70 75 80Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met85 90 95Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly100 105 110Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu115 120 125Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp130 135 140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145 150 155 160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala165 170 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu180 185 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr195 200 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly210 215 220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225 230 235 240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly245 250 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro260 265 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu275 280 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr290 295 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305 310 315 320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser325 330 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu340 345 350Gly(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度379个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Pro Gly Lys Ile Gln Gly Arg Gly Pro Ile Gln Gly Ala Thr1 5 10 15Ser Val Arg His Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala20 25 30Ala Met Leu Leu Ala Val Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala35 40 45Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His50 55 60Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser65 70 75 80Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys85 90 95Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser100 105 110Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser115 120 125Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu130 135 140Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly145 150 155 160Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln165 170 175Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro180 185 190Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser195 200 205Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly210 215 220Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly225 230 235 240Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln245 250 255Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn260 265 270Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr275 280 285Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn290 295 300Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro305 310 315 320Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu325 330 335Pro Thr Thr His Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp340 345 350Pro Ser Thr Thr Net Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met355 360 365Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr370 37权利要求
1.一种从生物流体中纯化血小板生成素(TPO)的方法，包括通过选自配体亲合层析，离子交换层析，疏水相互作用层析和超滤的方法减少含有TPO的生物流体的体积以提供一浓缩级分；调节浓缩级分的盐浓度以提供一调节溶液；酸化调节溶液以沉淀污染蛋白并提供一清除溶液；通过阴离子交换层析分级分离清除溶液以提供TPO富集级分；将TPO富集级分暴露于羟基磷灰石中，从而使蛋白污染物与羟基磷灰石结合，TPO保持基本上未结合；收集未结合的TPO；和通过阳离子交换层析或超滤浓缩收集到的TPO。
2.根据权利要求1的方法，其中生物流体为细胞决定的培养基或其级分。
3.根据权利要求1的方法，其中TPO为人TPO。
4.根据权利要求1的方法，其中减少步骤包括通过染料-配体亲合层析的直接捕获。
5.根据权利要求4的方法，其中减少步骤包括在衍生交联的琼脂糖珠的基质上的直接捕获。
6.根据权利要求1的方法，其中调节步骤包括超滤。
7.根据权利要求1的方法，其中浓缩步骤包括阳离子交换层析。
8.根据权利要求7的方法，其中浓缩步骤采用用磺基丙基衍生的不溶性载体。
9.根据权利要求1的方法，其中分级分离步骤包括阴离子交换层析。
10.根据权利要求9的方法，其中分级分离步骤采用用三甲基氨基乙基衍生的不溶性载体。
11.根据权利要求1的方法，其中通过变性条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得收集到的TPO分子量为70,000±10,000道尔顿。
12.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白污染物包括血小板生成素的聚集物。
13.一种从生物流体中纯化血小板生成素(TPO)的方法，包括通过染料-配体亲合层析进行的直接捕获而减少含有TPO的生物流体的体积以提供一浓缩级分；通过超滤调节浓缩级分的盐浓度以提供一调节溶液；通过阴离子交换层析分级分离调节溶液以提供TPO富集级分；将TPO富集级分暴露于羟基磷灰石中，从而使蛋白污染物与羟基磷灰石结合，TPO被洗脱；和通过阳离子交换层析浓缩洗脱的TPO。
14.一种从包含血小板生成素和蛋白污染物的溶液中去除蛋白污染物的方法，包括将该溶液暴露于羟基磷灰石中，从而使所述蛋白污染物与所述羟基磷灰石结合，所述血小板生成素保持基本上未结合，并回收未结合的血小板生成素。
15.根据权利要求14的方法，其中所述蛋白污染物包括血小板生成素的聚集物。
16.根据权利要求14的方法，其中所述溶液通过用离子交换层析，配体亲合层析或疏水相互作用层析分级分离含有TPO的液体组合物来制备。
17.根据权利要求16的方法，其中所述溶液通过用阴离子交换层析分级分离含有TPO的液体组合物来制备。
18.根据权利要求16的方法，其中所述溶液通过用阴离子交换层析和配体亲合层析的组合分级分离含有TPO的液体组合物来制备。
19.根据权利要求14的方法，其中回收的血小板生成素通过阳离子交换层析或超滤来浓缩。
全文摘要
公开了从包括血小板生成素的溶液中去除蛋白污染物的方法。将溶液暴露于羟基磷灰石中,从而使蛋白污染物与羟基磷灰石结合,血小板生成素基本上保持未结合,并回收未结合的血小板生成素。将羟基磷灰石与包括离子交换层析,配体亲合层析,疏水相互作用层析,超滤和分级沉淀的其它纯化和浓缩方法结合使用是有利的。
文档编号C07K14/435GK1187202SQ96194563
公开日1998年7月8日 申请日期1996年5月22日 优先权日1996年5月22日
发明者A·R·阿拉斯卡, J·J·常, W·道尼, J·W·福斯特罗姆, L·帆 申请人:津莫吉尼蒂克斯公司