专利名称：增强了锌结合力的胰岛素衍生物的制作方法
皮下施药胰岛素的药物动力学依赖于其缔合性质。胰岛素在中性水溶液中形成六聚体。如果胰岛素从组织进入血流而到达作用部位，它必先经过毛细血管壁。据推测只有单分子的或二聚的胰岛素才有可能、而六聚的胰岛素或较高分子量的相关物则不可能或可能性很小(Brange et al.，Diabetes Care13(1990)，pp 923-954；Kanget al.，Diabetes Care14(1991)，pp 942-948)。因此六聚体的解离是从皮下组织迅速经过进入血流的先决条件。
胰岛素的缔合性质和聚集特性受Zn++的影响，它会导致六聚体的稳定化并在中性点附近的pH值时导致生成较高分子量的聚集体直至出现沉淀。Zn++作为添加剂被加入未缓冲的人胰岛素溶液(pH4)却只是稍微影响作用的形式。尽管这种溶液在注射时在皮下组织中被迅速中和并形成胰岛素-锌复合体，但是人胰岛素自然的锌结合力不足以稳定六聚体和更高的聚集体。通过添加Zn++，胰岛素的释放不被显著延迟而且不会达到强的储存效果。已知胰岛素六聚体的含锌量是每mol的胰岛素六聚体含大约2mol Zn++(Blun-dell et al.，Adv.Protein Chem.26(1972)，pp 323-328)。每个胰岛素六聚体的2个Zn++离子与胰岛素六聚体牢固结合并且不能被通常的透析除去。所谓的4-锌胰岛素晶体已被公认地描述，但这些晶体平均每mol的胰岛素六聚体只含有少于3mol的Zn++(G.D.Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，pp 7093-7097)。
本发明的目的是找出这种胰岛素衍生物它与人胰岛素相比，具有增强了的锌结合力，形成含胰岛素六聚体和Zn++的稳定的复合体，并在皮下注射时出现延迟的作用形式。
式I的胰岛素
和/或式I的胰岛素的生理上耐受的盐业已被发现，它们基本符合上述条件并且其中R1表示苯丙氨酸残基或氢原子，R3表示基因可编码的氨基酸残基，Y表示基因可编码的氨基酸残基，Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有2～35个基因可编码的氨基酸残基的肽，它含1～5个组氨酸残基，而残基A2～A20相应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素衍生物的A链的氨基酸序列，并且残基B2～B29相应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素衍生物的B链的氨基酸序列。
这样的式I胰岛素是特别优选的，其中R1表示苯丙氨酸残基，R3表示选自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸残基，Y表示选自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸残基，Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有4～7个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
这样的式I胰岛素是更优选的，其中R1表示苯丙氨酸残基，R3表示选自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸残基，Y表示选自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸残基，Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有2～7个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
这样的式I胰岛素是特别优选的，其中Z表示具有1～5个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
这样的式I胰岛素是特别优选的，其中R1表示苯丙氨酸残基，R3表示选自Asn和Gly的氨基酸残基，Y表示选自Thr和His的氨基酸残基，而Z表示具有1～5个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
这样的式I胰岛素是更优选的，其中R1表示苯丙氨酸残基，R3表示甘氨酸残基，Y表示苏氨酸残基而Z表示具有1～5个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
这样的式I胰岛素是尤为优选的，其中Z表示具有序列His His、His His Arg、Ala His His、Ala His His Arg、Ala Ala His His Arg或Ala Ala His His的肽。
肽和蛋白质的氨基酸序列从氨基酸链的N端算起。式I中括号内的说明例如A1、A6、A7、A11、A20、B1、B7、B19或B30，对应于胰岛素的A链或B链中氨基酸残基的位置。
“基因可编码的氨基酸残基”这个用词表示氨基酸Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Arg、Lys、His、Tyr、Phe、Trp、Pro和硒代半胱氨酸的残基。
动物胰岛素的“残基A2～A20”和“残基B2～B29”这些用词应理解为例如，得自牛、猪或鸡的胰岛素的氨基酸序列的意思。
胰岛素衍生物的“残基A2～A20”和“B2～B29”表示相应的人胰岛素的氨基酸序列，这些序列是通过由其它基因可编码的氨基酸置换其中的氨基酸而形成的。
人胰岛素的A链具有下述序列(序列1)
Gly，Ile，Val，Glu，Gln，Cys，Cys，Thr，Ser，Ile，Cys，Ser，Leu，
Tyr，Gln，Leu，Glu，Asn，Tyr，Cys，Asn.
人胰岛素的B链具有下述序列(序列2)
Phe，Val，Asn，Gln，His，Leu，Cys，Gly，Ser，His，Leu，Val，Glu，
Ala，Leu，Tyr，Leu，Val，Cys，Gly，Glu，Arg，Gly，Phe，Phe，Tyr，
Thr，Pro，Lys，Thr.
式I的胰岛素衍生物可借助于基因工程构建物的多重性在微生物中形成(EP 0489780，EP0347781，EP0368187，EP0453969)。基因工程构建物在发酵期间在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或链霉菌(Streptomycetes)的微生物中得以表达。形成的蛋白质被贮存于微生物内(EP 0489780)或分泌入发酵液。
式I的胰岛素实例有
Gly(A21)-人胰岛素-His(B31)-His(B32)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OH
式I的胰岛素衍生物主要是按标准方法通过基因工程采用定点诱变制备的。为此，编码期望的式I的胰岛素衍生物的基因结构被构建并表达于宿主细胞-优选是如大肠杆菌的细菌内或酵母、尤其是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)内-而且-如果基因结构编码融合蛋白-式I的胰岛素衍生物就从融合蛋白中释放；类似的方法被描述于例如EP-A-0211299、EP-A-0227938、EP-A-0229998、EP-A-0286956和DE专利申请P3821159中。
细胞破裂后，融合蛋白部分可以通过化学法利用卤化氰-参见EP-A-0180920-或者通过酶促法利用溶葡萄球菌素或胰蛋白酶-参见DE-A-3739347而得以裂解。
然后胰岛素前体用已述方法例如按R.C.Marshall and A.S.In-glis在“Practical Protein Chemistry-A Handbook”(Editor A.Darbre)1986，pp 49-53中描述的进行氧化亚硫酸解；接着，例如按G.H.Dixon and A.C.Wardlow在Nature(1960)，pp 721-724中描述的方法在硫醇存在下形成恰当的二硫键而被复性。但胰岛素前体还可被直接折叠(EP-A-0600372；EP-A-0668292)。
通过胰蛋白酶解-例如按Kemmler et al.，J.B.C.(1971)，pp6786-6791的方法除去C肽以及存在的话除去前序列(式II的R2)，并利用已知技术例如色谱法-如EP-A-0305760和结晶作用将式I的胰岛素衍生物纯化。
本发明还涉及含胰岛素六聚体和每mol胰岛素六聚体大约5～9mol Zn++、优选是每mol胰岛素六聚体5～7mol Zn++的复合体，该胰岛素六聚体由六个式I的胰岛素分子构成。
锌与胰岛素六聚体结合得如此牢固，以至每mol胰岛素六聚体的5～9mol Zn++不能用例如pH7.4的10mM Tris/Hcl缓冲水溶液进行40小时的常规透析而除去。
皮下施药后，存在于基本上不含锌的制剂(pH4)中的式I的胰岛素，与人胰岛素相比显示很小的作用延迟。加入大约20μg Zn++/ml制剂后，皮下施药之后，观察到更迟的作用开始。最好是在40μgZn++/ml时观察作用的延迟，更高的锌浓度可增强该效果。
本发明还涉及式II的前胰岛素原
R2-R1-B2-B29-Y-Z1-Gly-A2-A20-R3(II)其中R3和Y同权利要求1～6的一或多项中提出的式I中的定义，和R1表示苯丙氨酸残基或共价键，和R2表示a)基因可编码的氨基酸残基或
b)具有2～45个氨基酸残基的肽，且残基A2～A20和B2～B29相应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素衍生物的A和B链的氨基酸序列，而且Z1表示具有2-40个基因可编码的氨基酸残基的肽，它具有1-5个组氨酸残基。
式II的胰岛素原适于用作制备式I的胰岛素的中间体。
优选的式II的胰岛素原是那些其中R2表示具有2～25个氨基酸残基的肽。
特别优选的式II的胰岛素原是那些其中R2表示具有2～15个氨基酸残基的肽，其中一个选自Met、Lys和Arg的氨基酸残基在羧基端。
本发明的式I的胰岛素衍生物和/或含胰岛素六聚体和5～9mol Zn++/mol六聚体的复合体和/或其生理上耐受的盐(例如其碱金属盐或铵盐)，主要是用作治疗多尿症、尤其是糖尿病用的药物制剂的活性化合物。
该药物制剂最好是注射用的溶液或悬浮液；它包括至少一种本发明的式I的胰岛素衍生物和/或复合体和/或至少一种其生理上耐受的盐，该盐为溶解的、无定形的和/或晶态一最好是溶解的形式。
该制剂的pH优选是约为2.5～8.5，特别是约为4.0～8.5，它含合适的等渗剂、合适的防腐剂且适当时还含合适的缓冲剂，而且最好还具有一定的锌离子浓度；当然，所有这些溶液均为无菌的水溶液。除活性化合物之外的全部制剂组分构成药物载体溶液。
含式I的胰岛素溶液的制剂pH为2.5～4.5，特别是3.5～4.5，优选是4.0。
含式I的胰岛素悬浮液的制剂pH为6.5～8.5，特别是7.0～8.0，优选是7.4。
合适的等渗剂例如有甘油、葡萄糖、甘露糖醇、NaCl、钙化合物或镁化合物如CaCl2或MgCl2。
由于等渗剂和/或防腐剂的选用，在弱酸性的pH值下胰岛素衍生物或其生理上耐受的盐的溶解性会受影响。
合适的防腐剂例如有苯酚、间甲酚、苯甲醇和/或对-羟基苯甲酸酯。
可用的缓冲剂物质、特别是用于调节大约为4.0～8.5间的pH的缓冲剂物质例如有乙酸钠、柠檬酸钠或磷酸钠。此外，生理上可接受的稀酸(以HCl为典型)或碱(以NaOH为典型)也适于调节pH。
如果制剂中存在含Zn++量，一个含量为1μg～2mg的Zn++/ml，尤以5μg～200μg的Zn++/ml为优选的。
为改变本发明的制剂的作用形式，还可掺合未修饰的胰岛素，优选是牛的、猪的或人的胰岛素，最好是人胰岛素；或者掺合修饰的胰岛素例如单一的胰岛素、快速作用(rapid-acting)胰岛素或Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰岛素。
优选的活性化合物浓度是大约1～1500，更优选大约为5～1000且最优选大约为40～400国际单位/ml。
实施例1Gly(A21)-人胰岛素-His(B31)-His(B32)-OH的制备
该表达系统的制备基本按US5,358,857中描述的进行。其中还描述了载体pINT 90d和pINT 91d(参见实施例17)和PCR引物TIR和Insu11。将这4种组分特别用作下述载体构建物的起始原料。
首先，将Gly(A21)的密码子插入编码小胰岛素原(miniproin-sulin)的序列中。为此，以pINT 91d为模板并用引物TIR和Insu31进行PCR反应。
Insu31(序列10)
5′TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3′
PCR循环的进行如下第1分钟94℃，第2分钟55℃，第3分钟72℃。该循环被重复25次然后将该混合物在72℃下培养7分钟，接着在4℃下过夜。
使所得PCR片段在乙醇中沉淀以纯化它，干燥，然后按制造商的说明利用限制酶Nc01和Sal1在限制缓冲液中消化，接着用凝胶电泳将反应混合物分离而Nc01-前胰岛素原-Sal1片段被分离出。同样利用Nc01和Sal1使质粒pINT90d的DNA裂解，且猴胰岛素原(the monkey proinsulin)片段以这种方式从pINT残余质粒中被释放出来。两种片段通过凝胶电泳被分离，而残余质粒DNA被分离出。该DNA在连接酶反应中与Nc01-Sal1 PCR片段反应，由此得到质粒pINT 150d，它被大肠杆菌转化后被复制然后再次分离出来。
将质粒pINT 150d的DNA用作质粒pINT302的起始原料，利用后者可制备所需的胰岛素变体。
为了构建该质粒，可采用US5,358,857(参见实施例6)中描述的路线。为此进行彼此独立的两个PCR反应，质粒pINT 150d的DNA被用作模板。其中一个反应的进行用到引物对TIR和pINTB5(序列11)
5′GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3′而另一个反应用到引物对Insu11和pINTB6(序列12)
5′A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′.
所得PCR片段是部分互补的，所以在第3个PCR反应中它们导致生成一个片段，它编码被位置B31和B32增长的Gly(A21)小胰岛素原。用Nc01和Sal1使该片段裂解，然后在连接酶反应中使之与所述pINT 90d残余质粒的DNA反应而得质粒pINT302。
将用该质粒转化过的大肠杆菌K12 W3110发酵，再按US5,227,293的实施例4中的方法操作。作为中间体(在胰蛋白酶裂解前)而得到的前胰岛素原衍生物具有下述氨基酸序列
前胰岛素原1(序列3)
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
前胰岛素原1符合式II，此时
R2表示具有11个氨基酸残基的肽，R1表示Phe(B1)，Y表示Thr(B30)，Z表示His His Arg(B31～B33)，R3表示Gly(A21)和A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～20)，而B2～B29表示人胰岛素的B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～29)。
按US5,227,293中的实施例4用胰蛋白酶将前胰岛素原裂解，然后按实施例11将所得产物与羧肽酶B反应而得胰岛素1。胰岛素1符合式I，此时
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示His His(B31～B32)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～20)，而B2～B29表示人胰岛素的B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～29)。
胰岛素1具有下述氨基酸序列
胰岛素1(序列4)B链 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
His HisA链 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly形成如式I所述的二硫键。实施例2Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH的制备
按实施例1构建表达载体。
将质粒pINT150d作为模板用于两个彼此独立的PCR反应，利用引物对TIR和pINT B7(序列13)
5′GAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3′或Insu11和pINTB8(序列14)
5′ACCC AAG ACC GCG CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′.
两个反应中生成的PCR片段是部分互补的，且在第3个PCR反应中产生完整的序列，它编码所需的胰岛素变体。用酶Nc01和Sal1处理该反应的片段，然后将其连接到pINT90d DNA的Nc01/Sal1-开放式残余质粒(opened residual plasmid)中。生成的质粒pINT303用大肠杆菌K12 W3110转化后被用作表达所需的前小胰岛素原(pre-miniproinsulin)的基础。按实施例1进行发酵和操作，省去羧肽酶B反应。
所得前胰岛素原衍生物具有下述氨基酸序列
前胰岛素原2(序列5)
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
前胰岛素原2符合式II，此时
R1表示Phe(B1)，
R2表示具有11个氨基酸残基的肽，
Y表示Thr(B30)，
Z1表示Ala His His Arg(B31～B34)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～20)，而B2～B29表示人胰岛素B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～29)。
然后将前胰岛素原2与胰蛋白酶反应而得胰岛素2。胰岛素2符合式II，此时
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示Ala His His Arg(B31～B34)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～20)，而B2～B29表示人胰岛素B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～29)。
胰岛素2具有下述氨基酸序列
胰岛素2(序列6)B链 Phe Val Ash Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His His ArgA链
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly形成如式I所述的二硫健。实施例3Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH的制备
按实施例1构建表达载体。
将质粒pINT150d作为模板用于两个彼此独立的PCR反应，利用引物对TIR和pINT 316a(序列15)
5′GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3′或Insu11和pINT316b(序列16)
5，A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3′.
两个反应中生成的PCR片段是部分互补的，且在第3个PCR反应中产生完整的序列，它编码所需的胰岛素变体。用酶Nc01和Sal1处理该反应的片段，然后将其连接到pINT90d DNA的Nc01/Sal1-开放式残余质粒中。生成的质粒pINT316用大肠杆菌K12W3110转化后被用作表达所需的前小胰岛素原的基础。按实施例1进行发酵和操作，省去羧肽酶B反应。
所得前胰岛素原3具有下述氨基酸序列
前胰岛素原3(序列7)
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala Ala His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
前胰岛素原3符合式II，此时
R1表示Phe(B1)，
R2表示具有11个氨基酸残基的肽，
Y表示Thr(B30)，
Z表示Ala Ala His His Arg(B31～B35)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～20)，而B2～B29表示人胰岛素B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～29)。
然后将前胰岛素原3与胰蛋白酶和实施例11的羧肽酶B反应而得胰岛素3。胰岛素3符合式I，此时
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示Ala Ala His His(B31～B34)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～20)，而B2～B29表示人胰岛素B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～29)。
胰岛素3具有下述氨基酸序列
胰岛素3(序列8)B链 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala Ala His HisA链 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly形成如式I所述的二硫键。实施例4
将按实施例2制备的胰岛素2与实施例11的羧肽酶B反应而得胰岛素4。
胰岛素4符合式I，此时
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示Ala His His(B31～B33)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～20)，而B2～B29表示人胰岛素的B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～29)。
胰岛素4具有下述氨基酸序列
胰岛素4(序列9)B链 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His HisA链
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly形成如式I所述的二硫键。实施例5胰岛素衍生物的锌结合
在15℃下将胰岛素的制剂(0.243mM人胰岛素，0.13M NaCl，0.1％苯酚，80μg/ml(1.22mM)的Zn++，10mMTris/Hcl，pH.7.4)用10mM Tris/HCl pH7.4透析共40小时(16小时和24小时后更换缓冲液)。然后酸化透析液，用HPLC测定胰岛素的浓度并用原子吸收光谱测定锌。用不含胰岛素的对照组的锌含量校正锌值，表1给出了结果表1按本发明的式I的胰岛素实施例6人胰岛素对狗的作用形式的锌依赖性
施药法皮下
剂量0.3IU/kg，制剂的pH为4.0
每组实验的狗数目(n)为6只表2显示以起始值的％表示的血液萄萄糖表2实施例7Gly(A21)Ala(B31)His(B32)，His(B33)，Arg(B34)人胰岛素对狗的
作用形式(胰岛素2)
按实施例2制备的胰岛素2被用于下述配方
甘油20mg/ml；间甲酚2.7mg/ml，胰岛素2 40IU/ml
IU表示国际单位且相当于大约6nmol的胰岛素，例如人胰岛素或式I的胰岛素。用NaOH或HCl调节pH。
施药法皮下；剂量0.3IU/kg；
受试验的狗数为6，制剂的pH为4.0
表3显示以起始值的％表示的血液葡萄糖
表3实施例8G1y(A21)Ala(B31)His(B32)，His(B33)人胰岛素对狗的作
用形式(胰岛素4)
将按实施例4制备的胰岛素4如实施例7中那样配方和应用。
施药法皮下；剂量0.3IU/kg；
n＝6；制剂的pH为4.0
表4显示以起始值的％表示的血液葡萄糖表4实施例9Gly(A21)His(B31)，His(B32)人胰岛素对狗的作用形式
(胰岛素1)将按实施例1制备的胰岛素1如实施例7那样配方和应用。施药法皮下；剂量0.3IU/kg；n＝6；制剂的pH为4.0表5显示了以起始值的％表示的血液葡萄糖表5实施例10Gly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B34)人胰岛素
对狗的作用形式(胰岛素3)
将按实施例3制备的胰岛素3如实施例7那样配方和应用。
施药法皮下；剂量0.3IU/kg；
n＝6；制剂的pH为4.0
表6显示以起始值的％表示的血液萄萄糖表6实施例11由前胰岛素原1制备胰岛素
将200mg按实施例1制备的、其中一个Arg在B链的羧基端的胰岛素溶于95ml 10mM HCl中。加入5ml pH为8的1M Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)/HCl后，用HCl或NaOH调节pH至8。
加入0.1mg羧肽酶B，90分钟后，精氨酸裂解基本。加入HCl调节混合物的pH至3.5，泵入反相柱(PLRP-SRP300 10μ，2.5×30cm，Polymer Laboratories Amherst，MA，USA)。流动相A为含0.1％三氟乙酸的水，相B由含0.09％三氟乙酸的乙腈构成。在5ml/min的流速下操作柱子。加样后，用150ml A洗柱子，用22.5～40％B的线性梯度在400分钟内进行分级洗脱，采用分析用反相HPLC分析各级分，合并足够纯的含Des-Arg-胰岛素的级分。用NaOH将pH调至3.5，通过旋转式蒸发器除去乙腈。然后将pH定到6.5使Des-Arg-胰岛素沉淀。离心出沉淀物，用50ml水洗涤二次，最后冻干。胰岛素1的产率为60～80％。
序列表(1)一般信息
(i)申请人
(A)名称Hoechst Aktiengesellschaft
(B)街—
(C)城市Frankfurt am Main
(D)州—
(E)县Bundesrepublik Deutschland
(F)邮政编码65926
(G)电话069-305-6047
(H)传真069-35-7175
(I)电报041234-700 hod
(ii)发明名称增强了锌结合力的胰岛素衍生物
(iii)序列数16
(iv)计算机可读形式
(A)介质类型软盘
(B)计算机IBM PC兼容机
(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS
(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)序列1的信息
(i)序列特征
(A)长度21个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型蛋白质
(vi)来源
(A)生物大肠杆菌(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..21(xi)序列1描述Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln15 10 15Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20(2)序列2的信息
(i)序列特征
(A)长度30个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型蛋白质
(vi)来源
(A)生物大肠杆菌
(ix)特征
(A)名称/键蛋白质
(B)位置1..30
(xi)序列2描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30(2)序列3的信息(i)序列特征(A)长度65个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(vi)来源(A)生物大肠杆菌(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..65(xi)序列3描述Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu
35 40 45Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55 60Gly65(2)序列4的信息
(i)序列特征
(A)长度53个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(vi)来源(A)生物大肠杆菌(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..53(xi)序列4描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His
20 25 30Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
35 40 45Glu Asn Tyr Cys Gly
50(2)序列5的信息
(i)序列特征
(A)长度66个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型蛋白质
(vi)来源
(A)生物大肠杆菌
(ix)特征
(A)名称/键蛋白质
(B)位置1..66
(xi)序列5描述Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val
35 40 45Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
50 55 60Cys Gly65(2)序列6的信息
(i)序列特征
(A)长度55个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型蛋白质
(vi)来源
(A)生物大肠杆菌
(ix)特征
(A)名称/键蛋白质
(B)位置1..55
(xi)序列6描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His
20 25 30His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
35 40 45Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50 55(2)序列7的信息
(i)序列特征
(A)长度67个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型蛋白质
(vi)来源
(A)生物大肠杆菌
(ix)特征
(A)名称/键蛋白质
(B)位置1..67
(xi)序列7描述Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile
35 40 45Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
50 55 60Tyr Cys Gly65(2)序列8的信息
(i)序列特征
(A)长度55个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(vi)来源(A)生物大肠杆菌(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..55(xi)序列8描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala
20 25 30His His Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
35 40 45Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50 55(2)序列9的信息
(i)序列特征
(A)长度54个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型蛋白质
(vi)来源
(A)生物大肠杆菌
(ix)特征
(A)名称/键蛋白质
(B)位置1..54(xi)序列9描述Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His
20 25 30His Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
35 40 45Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50(2)序列10的信息
(i)序列特征
(A)长度39个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(基因组的)
(ix)特征
(A)名称/键外显子
(B)位置1..39
(xi)序列10描述
TTTTTTGTCG ACCTATTAGC CGCAGTAGTT CTCCAGCTG 39(2)序列11的信息
(i)序列特征
(A)长度31个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(基因组的)
(ix)特征
(A)名称/键外显子
(B)位置1..31
(xi)序列11描述
GATGCCGCGG TGGTGGGTCT TGGGTGTGTA G31(2)序列12的信息
(i)序列特征
(A)长度31个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(基因组的)
(ix)特征
(A)名称/键外显子
(B)位置1..31
(xi)序列12描述
ACCCAAGACC CACCACCGCG GCATCGTGGA G 31(2)序列13的信息
(i)序列特征
(A)长度34个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(基因组的)
(ix)特征
(A)名称/键外显子
(B)位置1..34
(xi)序列13描述
GATGCCGCGG TGGTGCGCGG TCTTGGGTGT GTAG34(2)序列14的信息
(i)序列特征
(A)长度34个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(基因组的)
(ix)特征
(A)名称/键外显子
(B)位置1..34
(xi)序列14描述
ACCCAAGACC GCGCACCACC GCGGCATCGT GGAG 34(2)序列15的信息
(i)序列特征
(A)长度37个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(基因组的)
(ix)特征
(A)名称/键外显子
(B)位置1..37
(xi)序列15描述
GATGCCGCGA TGATGCGCCG CGGTCTTGGG TGTGTAG 37(2)序列16的信息
(i)序列特征
(A)长度37个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(基因组的)
(ix)特征
(A)名称/键外显子
(B)位置1..37
(xi)序列16描述
ACCCAAGACC GCGGCGCATC ATCGCGGCAT CGTGGAG 3权利要求
1.式I的胰岛素
或式I的胰岛素的生理上耐受的盐，其中R1表示苯丙氨酸残基或氢原子，R3表示基因可编码的氨基酸残基，Y表示基因可编码的氨基酸残基，Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有2～35个基因可编码的氨基酸残基的肽，它含1～5个组氨酸残基，而残基A2～A20相应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素衍生物的A链的氨基酸序列，并且残基B2～B29相应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素衍生物的B链的氨基酸序列。
2.权利要求1中要求的式I的胰岛素，其中Y表示选自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸残基，Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有4～7个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
3.权利要求1中要求的式I的胰岛素，其中R1表示苯丙氨酸残基，R3表示选自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸残基，Y表示选自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸残基，Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有2～7个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
4.权利要求3中要求的式I的胰岛素，其中Z表示具有1～5个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
5.权利要求1～4的一项或多项中要求的式I的胰岛素，其中R1表示苯丙氨酸残基，R3表示选自Asn和Gly的氨基酸残基，Y表示选自Thr和His的氨基酸残基，而Z表示具有1～5个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
6.权利要求1中要求的式I的胰岛素，其中R1表示苯丙氨酸残基，R3表示甘氨酸残基，Y表示苏氨酸残基而Z表示具有1～5个氨基酸残基的肽。
7.权利要求6中要求的式I的胰岛素，其中Z表示具有序列HisHis、His His Arg、Ala His His、Ala His His Arg、Ala Ala His His Arg或Ala Ala His His的肽。
8.含胰岛素六聚体和每mol胰岛素六聚体5～9mol Zn++、特别是每mol胰岛素六聚体5～7mol Zn++的复合体，该胰岛素六聚体由6个权利要求1～7中一项或多项要求的式I的胰岛素分子构成。
9.一种药物制剂，它含有效量的至少一种式I的胰岛素和/或至少一种生理上耐受的、权利要求1～7的一项或多项中要求的式I的胰岛素的盐，该盐以溶解的、无定形的和/或晶体形式存在。
10.权利要求9中要求的药物制剂，其中添加1μg～2mg、优选是5μg～200μg锌/ml的含锌量。
11.权利要求9或10中所要求的药物制剂，其pH为2.5～8.5。
12.权利要求9～11的一项或多项中要求的药物制剂，其pH为2.5～4.5。
13.权利要求9～12的一项或多项中要求的药物制剂，它具有附加含量的未修饰胰岛素、优选是未修饰人胰岛素，或修饰胰岛素、优选是Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰岛素。
14.式II的胰岛素原
R2-R1-B2-B29-Y-Z1-Gly-A2-A20-R3(II)其中R3和Y同权利要求1～7的一项或多项中提出的式I中的定义，和R1表示苯丙氨酸残基或共价键，和R2表示a)基因可编码的氨基酸残基或
b)具有2～45个氨基酸残基的肽，且残基A2～A20和B2～
B29相应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素衍生物的A和
B链的氨基酸序列。
Z1表示具有2～40个基因可编码的氨基酸残基的肽，它具有1～5个组氨酸残基。
15.权利要求14中要求的式II的胰岛素原，其中
R2表示具有2～25个氨基酸残基的肽。
16.权利要求14或15中要求的式II的胰岛素原，其中
R2表示具有2～15个氨基酸残基的肽，其中一个选自Met、Lys和Arg的氨基酸残基在羧基端。
全文摘要
增强了锌结合力的胰岛素衍生物适合于制备用于治疗多尿症的药物制剂,其中Z表示组氨酸残基或具有2～35个基因可编码的氨基酸残基的肽,后者含1～5个组氨酸残基。式Ⅰ的胰岛素与锌形成复合体,它含胰岛素六聚体和大约5～9mol锌/mol六聚体。
文档编号C07K14/575GK1172811SQ9710467
公开日1998年2月11日 申请日期1997年7月25日 优先权日1996年7月26日
发明者J·厄特, P·哈伯曼, K·盖森, G·塞普克 申请人:赫彻斯特股份公司