专利名称：炎症疾病的诊断和介体的制作方法
本申请属于用于诊断和治疗炎症疾病，包括心血管疾病的方法领域。
在许多疾病中涉及氧化性应激。看来介导氧化诱导疾病的氧化性应激产物为过氧化的脂质。生物系统中脂质过氧化物的形成是一个复杂的过程，它可由许多方法产生，包括通过酶(如脂肪氧合酶、环氧合酶、过氧化物酶和其它加氧酶)以及通过借助于产生细胞内，细胞外或细胞表面活性氧类的非酶方法。细胞膜和细胞外环境的氧化脂质可诱导细胞行为很大的改变。在关节硬化的发病机理中已清楚地认识到了过氧化的脂质和它们的降解产物的有害作用(Herttuala等，临床研究杂志(Journal of Clinical Investigation)，841086-1095(1989)；Gonen等，关节硬化(Atherosclerosis)，65265-272(1987)；和Jurgens等，生物化学生物物理进展(Biochim.Biophys Acta)，875104-114(1986))。目前已认识到氧化作用是心血管疾病的一个可能的危险因子(Palinski等，关节硬化，10325-335，(1990))。
由于脂质的氧化与炎症和心血管疾病有关，具有一个可靠的试验方法来定量并分析在宿主中，尤其是在人中的脂质氧化程度是一个非常重要的医学目标。
在宿主中脂质氢过氧化物可以基于对氢过氧化物的直接测定或基于氢过氧化物的降解或反应产物而定量测定。多不饱和脂肪酸(“PUFAs”)具有至少两个双键，15～20％具有三个或更多的双键。天然产生的不饱和脂肪酸是不共轭的；双键被至少一个亚甲基基团分开。在氧化成脂质氢过氧化物的过程中，PUFAs的双键可变为共轭的，这是一个主要的损伤氧化途径。PUFAs氧化的最初产物看来是脂质氢过氧化物(LOOH)和脂质氢过氧化物游离基(LOOH·或LOO·)，它们大多数已被改变为包含共轭双键。这些产物或它们进一步反应或降解的产物已被用来分析生物样品中的脂质氧化的程度。
例如，在体内，LOOH可被还原为惰性的醇LOH。可通过任何用于分析醇的方法，并且如果LOH是共轭的，可使用任何检测双键共轭的方法来检测LOH。然而，由于在生物样品中，可能存在多种醇或含共轭双键的分子，因此，没有一种方法具有非常高的特异性。
另一方面，在体内，LOOH可被金属氧化，在双键的位置上形成游离基(LOOH·)，它是反应性非常高的基团。该分子经常在氧化位置上分解，形成包含两个醛的片段，或如果它不分解，它通常形成酮。该分子可分解成不对称部分，并且如果LOOH具有多于两个的双键，它可形成多种产物。如果LOOH具有三个或多个双键，丙二醛(MDA)是一种分解产物。可用硫代巴比土酸(TBA)分析丙二醛的存在，其中TBA与MDA反应，产生可容易地测定和定量的荧光化合物。TBA反应性物质被称为“TBARS”。由于它有可能与其它醛，糖和氨基酸产生假阳性，TBA试验不适宜于用作宿主脂质氧化状态的诊断试验。它只可用在慎重使用对照样品的研究试验中。而且，它仅测量具有三或多个双键的脂质过氧化物的量。
另一种测定样品中LOOH的方法是直接将它与碘化钾反应，形成有色络合物，(I2)KI，它可容易地被测量和定量。对该方法的一种改进是使用无色亚甲基(leukomethylene blue)，它与LOOH反应，形成有色产物。该分析试剂可从Kamiya Biomedical Company购置。类似于TBA方法，此方法仅可用于实验室样品，不能被用来分析可包含许多交叉反应物质的生物液体或细胞培养物。
在脂质氧化期间，产生的醛与体液和组织反应。醛很容易修饰蛋白质的硫醇，赖氨酸，组氨酸和其它残基(Jurgens等，生物化学杂志(Biochemical Journal)265605-608(1990)；Jessup，生物化学杂志234245-248(1986)；Steinbrecher等，脂质研究杂志(J.Lipid Res.)251109-1116(1984))。这些醛修饰的蛋白质为抗原。这些表位的抗体提供一种用于检测和定位粥样硬化动脉中的醛修饰的蛋白质的有效工具(Boyd，美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)135815-825(1989)；Haberland等，科学(Science)241215-218(1988)；Jurgens，血栓凝血(Atheroscler.Throm.)131689-1699(1993))。然而，在正常或甚至粥样硬化的病人中，在血浆中一般不可能发现醛修饰的蛋白质抗原，而在组织中仅为低水平。
由于它们内在的不稳定性，并且醛的产生仅为LOOH分解的许多代谢途径中的一个，且其产生需要一定时间，不稳定的LOOH本身与附近化合物的反应产物可能以大于醛的量出现，并可能代表一引人注意的诊断目标。例如，脂质过氧化物活跃地与蛋白质的氨基，脂质和亲脂分子反应。它与膜蛋白和脂蛋白的脱辅基蛋白距离靠近可能表明在生物系统中这些修饰可能比醛诱导的修饰更为相关。因此细胞膜或脂蛋白上的LOOH的产生至少在最初阶段相对于产生由它们的大量降解产物如醛修饰的蛋白质而言，更有可能产生直接由LOOH修饰的蛋白质。Fruebis，Parthasarathy和Steinberg在1992公开的证据表明在脂质过氧基和多肽或磷脂酰乙醇胺的游离氨基之间发生协同反应，产生未知结构的荧光加合物。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910588-10592(1992)。Fruebis在不存在金属离子时，将亚油酸油酰氢过氧化物单独与多肽，或不饱和磷脂酰乙醇胺保温。荧光产物的产生比通过将多肽或磷脂酰乙醇胺与醛，4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal)(它产生荧光希夫碱)保温产生的产物多许多倍。Fruebis等提出两个可能的反应途径，它们均由游离氨基与过氧基相互作用而引发。这些推想的反应途径被推测产生五、六或七元环结构。这些文章没有提出这些假设结构的活性，也没有在体内的确鉴定出了这一推想的结构。
由Emory大学申请的PCT/US95/05880公开了多元不饱和脂肪酸(“PUFAs”)和它们的氢过氧化物(“ox-PUFAs”)在人主动脉内皮细胞中诱导内表细胞表面粘附分子VCAM-1，但不是细胞内粘附分子(ICAM-1)或E-选择蛋白的表达，其中它们的表达通过不由细胞因子或其它非细胞因子信号介导的机理而完成。具体地说，它公开了亚油酸，花生四烯酸，亚油基氢过氧化物和花生四烯酸氢过氧化物诱导VCAM-1而非ICAM-1或E-选择蛋白的细胞表面基因表达。饱和脂肪酸(如硬脂酸)和单不饱和脂肪酸(如油酸)不诱导VCAM-1，ICAM-1或E-选择蛋白的表达。还报导了PUFAs和它们的脂肪酸氢过氧化物对VCAM-1的诱导被二硫代氨基甲酸酯，包括二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)抑制，这支持了这样一个结论，即诱导由氧化的信号分子所介导，并当该分子的氧化被阻断，逆转时，或当被氧化还原修饰的信号以其它方式被阻止与其调节目标相互作用时，诱导被制止。
仍由Emory大学申请的PCT/US93/10496公开了二硫代羧酸酯，尤其是二硫代氨基甲酸酯阻断被诱导的内皮细胞表面粘附分子VCAM-1的表达，并因此可用于治疗心血管疾病，包括粥样硬化，成血管后再狭窄，冠状动脉疾病和心绞痛以及由VCAM-1介导的非心血管性炎症疾病。
本发明的一个目的是提供一种作为评价宿主患有氧化诱导的疾病的危险性的手段的用于确定宿主脂质过氧化状态的方法和试剂盒。
本发明的另一个目的是提供用于确定宿主脂质过氧化状态的商业上可行的方法和试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种作为评价医学上治疗氧化诱导的疾病的治疗功效的手段的用于确定宿主脂质过氧化状态的方法和试剂盒。本发明另外一个目的是提供用于诊断和定量宿主脂质过氧化状态的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供可用于诊断和定量宿主的脂质过氧化状态的物质。
本发明另一个目的是提供一种评价一种候选药物降低宿主的脂质过氧化状态能力的方法。
本发明的另一个目的是鉴定和提供细胞应答的新的介体。
本发明另外一个目的是提供用于介导炎症应答的新的治疗剂和方法。
本发明的另一个目的是提供用于鉴定和定量炎症疾病的推测的治疗剂和方法。
本发明的另一个目的是提供一种检测患有禁止自身抗体的疾病，包括子宫内膜异位的病人血浆中的自身抗体的方法和试剂盒。发明概述提供了用于诊断和定量宿主的氧化状态，更具体地说是脂质过氧化作用水平的方法和试剂盒，它包括将宿主生物样品与由脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原的抗体接触。该方法确定宿主中氧化损伤的危险或状况。本发明还包括可用于此方法和试剂盒的任选纯化或分离形式的单克隆和多克隆抗体以及抗体片段。
本方法基于这样一个发现，即通过脂质氢过氧化物对蛋白质和其它包含伯胺的化合物进行修饰导致了抗原表位的产生。目前已发现这些抗体甚至存在在正常血浆中，并在患有氧化诱导疾病状态的病人的血浆中可升高至高于正常水平。用于分析病人生物样品中的脂质过氧化物水平的这个试验优于目前所知道的那些试验，这是由于分析了在宿主血浆中大量存在的抗原，并且在体内对样品进行的操作可靠。相反，除开在一些特定情况下，如不稳定的心绞痛外，通过醛修饰的蛋白质的抗体未在血浆中检测出抗原性的醛修饰的蛋白质。而且，针对由脂质氢过氧化物修饰的蛋白质和其它含伯胺的化合物的抗体不与醛修饰的蛋白质发生交叉反应。
作为对构成本发明基础的发现的说明，将兔血清清蛋白用脂质过氧化物修饰，产生一多克隆抗体。该多克隆抗体识别脂质过氧化物修饰的蛋白质，但不能识别未修饰的蛋白质。使用免疫组织化学，已确定该抗体识别存在于人粥样硬化病灶，胆固醇过高的猴子的粥样硬化的动脉，和用脂质过氧化物预保温的RAW巨噬细胞中的表位。该抗体在蛋白质印迹分析中有效，并甚至可用来检测正常血浆中的被修饰的表位的存在。
本发明包括用于分析宿主中脂质过氧化状态的方法和试剂盒，该状态包括适宜量的可被固定在固体载体上，优选用可检测试剂标记的抗体。抗体可通过已知方法被固定至各种固体底物上。适宜的固体载体底物包括具有膜的物质或由棒，珠，杯，平板或其它固体载体支撑或与它们相连的涂层物质。其它固体底物包括细胞培养平板，ELISA平板，试管和聚合物膜。抗体可用可检测的试剂标记，如荧光染料，放射性标记，生物素，或其它酶，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶和2-半乳糖苷酶，如果可检测试剂为酶，可将检测可检测试剂的物质配以试剂盒，用于检测可检测试剂的优选方法采用作为可检测试剂的酶及在与酶接触时改变颜色的酶底物。该试剂盒还包含一个评价分析产物的装置，如颜色记录或数字参比记录。
该试剂盒可被设计成为定量或定性的，它可用在科研实验室，医学实验室或野外。
进一步已发现脂质氢过氧化物和伯胺的一些反应产物在作为细胞应答介体时显示出独立的生物活性。术语“oxykine”在本文中用作指由脂质氢过氧化物和伯胺的反应产生的并可引发来自靶细胞的应答的荧光蛋白质或脂质。Oxykines可在细胞外产生或可在细胞膜上形成或甚至在细胞内形成以介导细胞应答。具有伯胺的许多生物活性分子可被转化为具有生物活性的Oxykines。
Oxykine的一个非限制性实施例是亚油酸氢过氧化物(13-HPODE)和清蛋白或多赖氨酸中适宜氨基酸基团，如赖氨酸，或小分子量化合物，如磷脂酰乙醇胺之间发生反应的稳定的荧光产物。这些Oxykines起潜在的炎症信号的作用，其中这些信号通过被选择性抗氧剂抑制的机理诱导内皮细胞VCAM-1的基因表达。其它可由Oxykines引发的细胞应答包括，但不局限于MCP-1，IL-1，TNF-α，ICAM，MCSF和E-选择蛋白的产生或活化。
虽然所有伯胺与脂质氢过氧化物反应，形成可被用来产生确定宿主氧化状态的抗体的抗原种类，但不是所有的肽或生物发生的伯胺均形成Oxykines。这是由于需要用来引发抗体应答的物质不同于被需要用来介导细胞应答的物质。
在另一个实例中，提供了用于确定生物样品中氧化损伤的方法，包括步骤(i)分离脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原，和接着(ii)鉴定伯胺。在一些环境下，胺的特性可能提供关于氧化紊乱定位的信息。
附图简要说明
图1为通过实施例4的抗体识别兔血清清蛋白和脂质氢过氧化物修饰的兔血清清蛋白的条线图。以作为405nm的光密度函数的纳克蛋白测定。
图2为通过实施例4的抗体识别氧化的LDL的条线图，以作为光密度单位函数的毫克浓度测定。
图3为通过以最大TNF-α诱导的信号的百分数形式表达的氧化的牛血清白蛋白的VCAM-1(A)和ICAM-1(B)的剂量依赖型诱导。
图4为采用脂质过氧化物产生体系大规模合成13-HpODE修饰的Oxykine的示意图。将靶蛋白放置在10kDa分子量的截止膜上，每8-16小时改变一次13-HpODE产生体系。
图5为蛋白质印迹图谱，它表明形成oxSLO所需的sLO和亚油酸的最小量。
图6为蛋白质印迹图谱，它表现在大规模反应96小时之后，对免疫反应性的13-HpODE处理的样品的检测。
图7为图示随时间而变化的TNF诱导百分数的形式的13-HpODE处理的sLO对ICAM-1的诱导。
图8为HPLC色谱，它表明13-HpODE修饰的sLO疏水性大于未处理的sLO。
图9为图示通过凝胶过滤色谱收集的oxSLO级分对ICAM-1的诱导。该图表明级分10最强烈地诱导ICAM-1。
图10为图示作为通过凝胶过滤色谱收集的oxSLO级分的函数的吸光率(280nm)，它表明生物活性级分9和10仅包含通过凝胶过滤色谱溶解的整个蛋白质的一部分。
图11为作为TNF诱导ICAM的百分数形式的，通过大豆脂氧合酶，亚油酸和氧化的大豆脂氧合酶对ICAM-1的诱导的条线图。
图12为通过在人主动脉内皮细胞(HAEC)中大规模方法合成的大豆脂氧合酶和氧化的大豆脂氧合酶对ICAM-1的诱导(作为TNF诱导的百分数的函数)的条线图。
图13为通过大豆脂氧合酶和氧化的大豆脂氧合酶对ICAM-1的诱导(作为TNF诱导的百分数的函数)的条线图，它表明oxSLO以剂量依赖的方式激活细胞表面ICAM的表达。
图14为通过氧化的大豆脂氧合酶对ICAM-1的诱导(作为TNF诱导的百分数的函数)的条线图。该图表明oxSLO诱导ICAM的程度大于它诱导VCAM的程度。
图15为RNA印迹，它表明oxSLO而非SLO诱导人主动脉内皮细胞(HAEC)中VCAM，ICAM和MCP-1mRNA的积累。
图16为RNA印迹，它表明在人主动脉内皮细胞中VCAM，ICAM和MCP-1迅速积累。
发明的详细描述I.确定宿主氧化状态的方法A.抗体的产生(i)脂质氢过氧化物脂质是可通过非极性溶剂，如氯仿和乙醚从细胞和组织中提取的不溶于水，油状或脂肪状有机物质。最广泛形式的脂质为三脂酰基甘油。脂肪酸是特征性的脂质的构建单元。脂肪酸为通常具有4-24个碳原子的长链有机羧酸。脂肪酸在细胞或组织中通常不能游离地或未结合地形成，但代之的是与较大分子结合，如脂蛋白质，清蛋白，三脂酰基甘油，蜡，磷酸甘油酯(如磷脂酰乙醇胺，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇或心磷脂)，鞘脂类(如鞘磷脂，脑苷脂类，或神经节苷脂)或甾醇和其脂肪酸酯。从种属上被称为蜡质和脂褐质的物质包括脂肪酸。
本文所用术语多不饱和脂肪酸(PUFA)指具有至少两个链烯基键的脂肪酸(通常为C8-C24)，包括但不局限于亚油酸(C18Δ)，亚麻酸(C18Δ)，花生酸(C20Δ)和二十碳二烯酸(C20Δ)。
本文采用的术语脂质氢过氧化物，指1.(i)多不饱和脂肪酸；或(ii)含有多不饱和脂肪酸残基的分子；2.其中至少一个链烯基键已被转化为氢过氧化物。
非限制性的脂质氢过氧化物的例子为15-HPETE
13-HPODE
脂质氢过氧化物在体内可从多不饱和脂肪酸或包含PUFA残基的脂质，通过脂氧合酶，环氧合酶，过氧化物酶或其它氧合酶酶促形成，以及通过借助于产生细胞内，细胞外或细胞表面反应性氧物质的非酶方式形成。脂质过氧化物可通过使用标准方法氧化包含PUFA残基的多不饱和脂肪酸或脂质经化学途径产生。
看来许多脂类氢过氧化物可被用来产生与选择的胺反应产生表位的抗体。看来该反应选择性极小；最终任何脂类氢过氧化物将与伯胺发生抗原性反应。
(ii)伯胺任何伯胺可被用来与形成抗原物质的脂质氢过氧化物反应。已发现胺疏水性和亲核性越大，反应越容易。例如，苄胺比乙胺与脂质氢过氧化物反应更迅速。在此基础上，小分子的胺，如C1-C3烷基胺和氨不是优选的。为了对宿主施用，优选的胺是单独或在与脂质氢过氧化物反应后显示很小毒性的胺。如果需要，该胺可与大分子相连，如半抗原相连以增加抗原性应答。
优选天然产生的含伯胺分子，如肽和蛋白质的合成方式。实例包括具有末端氨基，赖氨酸残基(如清蛋白和多赖氨酸)或组氨酸残基的肽或蛋白质。磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸和末端为胺的激素也是适宜的。
在体内脂质氢过氧化物和蛋白质自然发生反应被这一事实证实，即可商购的蛋白质，如牛血清清蛋白包含脂质氢过氧化物/胺表位。由于这一事实，可优选使用合成的肽或蛋白质来制备抗原，并最终制备抗体用于质量控制目的。
(iii)脂质氢过氧化物与伯胺的反应脂质氢过氧化物与蛋白质的反应能力由Fruebis，Parthasarathy和Steinberg在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷89，p.10588-10592，1992，11，医学科学所证实。在此文中，通过将亚油酸或亚油酸的磷脂与大豆脂氧合酶反应，并接着在不存在金属离子时将氢过氧化物与多肽保温来制备脂质氢过氧化物。在此文中提出的一般方法和实验条件可被用来制备多种脂质氢过氧化物/胺加合物。
脂质氢过氧化物与伯胺之间的化学反应可在实验室或生产车间中，在室温下，在中性或接近中性pH下模拟体内的条件下进行。优选含水条件，然而如果反应物和产物有机可溶性足够大，则反应可在有机溶剂中进行。LOOH在有机溶剂中的稳定性小于在含水溶剂中的稳定性。如果需要，反应温度可被升至高达该溶剂的沸点。反应历程可通过荧光分光光度法来监测。产物的激光通常在330与360之间，发射通常在420-450之间。当样品中荧光不再进一步增加时，则反应进行完毕。在一个典型的反应中，脂质氢过氧化物和胺以约1.5∶1的比例存在，然而，可如所期望地使用其它比例以达到最佳产率或用于其它目的。
(iv)抗体的产生和使用用于确定宿主脂质氢过氧化状态的方法和试剂盒可包括单克隆或多克隆抗体或抗体片段。
本文所用的术语“抗体”包括与所述表位特异性但可逆地结合的单克隆和多克隆抗体以及抗体片段。优选的是抗体或抗体片段来自于单克隆抗体或抗体片段。可使用任何已知方法完成由脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原的单克隆和多克隆的制备。如在Zola，H(1988)“单克隆抗体-技术手册”CRC出版，和抗体实验手册，Harlow和Lane；Cold Spring Harbor(1988)中描述的那些方法，它们被本文引作参考。
在一个具体实例中，主要用于实验用途，将动物用抗原，优选用佐剂免疫。任选继续用混有佐剂的抗原的PBS溶液以周期性的间隔进行加强免疫。免疫后对动物抽血。去除血块和碎片后，血清可用ELISA分析。在起始免疫后可获得每月的或其它周期的效价。
另一种方法，从优选具有佐剂的抗原免疫的动物中收集脾。分离脾细胞并使用聚乙二醇与无限增殖的骨髓瘤细胞融合。选择融合的杂交瘤细胞并在体外培养。检测杂交瘤细胞培养物液体的具有所需特异性的杂交瘤抗体的存在。用于鉴定适宜的单克隆或多克隆抗体的选择方法是获得所需免疫特异性的一个重要方面。可用如通过标准方法进行的ELISA来检测杂交瘤细胞中的抗原特异性的抗体的存在。
通常，如果选择的脂质氢过氧化物和选择的胺的产物包含具有一个表位的抗原，则抗原将引发产生单或多克隆抗体。如果使用多个抗原或具有多个表位的抗原，将获得多克隆抗体。例如，当LOOH与血清清蛋白反应时，由于清蛋白在分子中的不同位置具有多个赖氨酸残基，因此产生具有多个表位的抗原。该抗原将引发产生多克隆抗体。相反，如果单个胺与LOOH的反应产物被用作抗原，则抗原可诱导单克隆或多克隆抗体的形成。例如，如果选择包含不饱和脂质部分的磷脂酰乙醇胺，则它可起脂质成分和胺成分的作用。该分子可引发产生单克隆或多克隆抗体。
已观察到来自天然来源的蛋白质可包含少量LOOH/胺抗原。由于这些，对于用于质量控制目的而言，优选让含合成肽或合成胺的分子与LOOH反应形成用于产生抗体的抗原。
抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)的区域参与抗原识别，这一事实首先通过早期的蛋白酶消化实验而认识到。通过啮齿类抗体的“人源化”找到了进一步的证据。可将啮齿类复制起点的可变区融合至人的复制起点的恒定区，这样得到的抗体保留了啮齿类亲本抗体的抗原特异性(Morrison等(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81，6851-6855)。“CDR移植”可被用来人源化啮齿类抗体。另外或另一方面，重组单克隆抗体可被“灵长类化”，即形成的抗体其中可变区来自两个不同的灵长类种类，优选抗体的可变区来自恒河猴，和恒定区来自人类。这种抗体的好处包括与人免疫球蛋白的高度同源性，存在人效应物作用，降低的免疫原性和延长的血清半衰期(Newman等(1992)生物技术(Biotechnology)10，1455)。
抗原的特异性区可使用如McCafferty等(1990)自然348552-554的方法表达为噬菌体的一部分。使用Griffiths等(1993)EMBOJ.12，725-734中描述的方法，本发明的抗体样分子可选自噬菌体显示文库，其中抗原被固定并被用来选择噬菌体。而且，可用单层生长并用甲醛或戊二醛固定或未固定的适宜细胞来结合噬菌体。洗去不相关的噬菌体，通过打破它们与抗原的结合并重新在细菌中扩增来回收结合的噬菌体。将选择和扩增过程进行数次以富集用于为本发明的抗体样分子的那些分子的噬菌体群体。
抗体片段包括Fab样分子(Better等(1988)科学(Science)240，1041)；Fv分子(Skerra等(1988)，科学240，1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL相伴区借助于灵活的寡肽相连(Bird等(1988)科学242，423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,5879)和单区域抗体(dAbs)包括分离的V区(Ward等(1989)自然(Nature)341,544)。有关参与合成保留它们的特异性结合位点的抗体片段的方法的综述参见Winter和Wilstein(1991)自然349，293-299)。
抗体片段，包括但不局限于Fab，(Fab)2，Fv，ScFv和dAb片段包括在本发明中。使用WO 84/03712的重组DNA技术可制备类抗体分子。
可有利地使用抗体片段而非整个抗体。Fab，Fv，ScFv和dAb抗体片段均可由大肠杆菌表达并分泌，因此使得能够容易地产生大量的片段。
整个抗体和F(ab′)2片段为“二价”。“二价”指抗体和F(ab′)2片段具有两个抗原结合位点。相反，Fab，Fv，ScFv和dAb片段为一价，仅具有一个抗原结合位点。
“抗体工程”技术发展迅速，如Tan L.K.和Morrison，S.L.(1988)Adv.Drug Deliv.Rev.2129-142，Williams，G.(1988)Tibtech 636-42和Neuberger，M.S.等(1988)第8届国际生物技术讨论会第2部分，792-799中所描述的(所有均被本文引作参考)，并且非常适宜于制备来自本发明抗体的类抗体分子。
抗体可用于与研究，与它们特异性结合的抗原的定位，分离和纯化相关的各种目的。尤其是，该抗体可用在显示和处理表现抗原的细胞中。本发明的抗体可被偶联至闪烁放射性标记，放射性表位，心血管，抗炎症或其它药物，与前药一起将前药转化为心血管，抗炎症或其它所需药物的酶，或其它细胞过程介导化合物上。这些结合物具有一个“结合部分”，它由本发明抗体和由放射性标记，药物或酶等组成的“功能性部分”组成。结合部分和功能性部分可通过连接部分被隔开。
结合物(如果还为肽或多肽)的结合部分和功能性部分可通过任何常规的交联多肽的方法连在一起，如通常在O′Sullivan等(1979)Anal.Biochem.100，100-108中描述的那些方法。例如，一部分可用巯基富集，其它部分与能与那些巯基反应的双功能试剂反应，例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)。例如用间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯获得的酰胺和硫醚键在体内通常比二硫键更稳定。
另一方面，如果结合部分含有碳水化合物，这是抗体或一些抗体片段的情况，则功能区可使用EP 0088695中的连接方法借助于碳水化合物部分连接。
结合物的功能部分可为用于将前药转化为药物的酶，其中使用类似于Bagshawe和他的同事(Bagshawe(1987)英国癌症杂志(Br.J.Cancer)56，531；Bagshawe等(1988)英国癌症杂志58，700；WO 88/07378)中描述的方法。
不必需整个酶存在于结合物中，但当然必然存在催化部分。可使用所谓“抗体酶”，其中形成针对参与希望催化通常是反应性中间产物状态的反应的化合物的单克隆抗体。那么产生的抗体可起作为反应的酶的作用。
可通过大小排阻或亲和层析纯化结合物，并检测双重生物活性。可使用固定抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)和活细胞放射免疫测定来测定抗原的免疫反应性。可使用一底物将酶测定用于β-葡糖苷酶，其中该底物当葡萄糖残基被水解时吸光率发生变化，例如在405nm用分光光度法测得释放2-硝基苯酚的oNPG(o-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷)。
可在体外首先在37℃下在血清中保温，接着通过大小排阻FPLC测定来检测结合物的稳定性。可以相同方法在小鼠中通过在注射结合物后的各个时间分析血清来检测体内稳定性。此外，可在结合前用125I放射性标记抗体，131I标记酶，并测定小鼠中结合物，游离抗体和游离酶的生物分布。
另一方面，可通过重组DNA技术将结合物制备成融合化合物，其中DNA长度包含编码结合物的两个部分的各个区，该结合物的两个区互相相邻或通过编码不破坏结合物所需性质的接头肽的区域分开。可以想像的，化合物的两个功能部分可完全或部分重叠。然后，DNA可以已知方法在适宜宿主中表达。
抗体或它们的结合物可以任何适宜方式，通常是胃肠外的方式，如静脉内或腹膜内方式，以标准灭菌的，稀释剂和载体的非热原制剂的形式给药，例如等渗盐溶液(当为静脉内注射时)。一旦结合物与靶细胞结合，并从血流中清除，如果必需，它通常需一天左右或靶区域可以显像时，如果需要，可通常以单注射剂量给药前药。如果需要，由于结合物可以是免疫原性的，可以给药环孢菌素或一些其它的免疫抑制剂以提供较长的治疗时间，但通常这不是必需的。
给药结合物和前药的时间选择可用非创造性方式最优化，因为在几天后疾病组织/正常组织的结合物比例(至少在静脉内给药之后)是最高的，而此时根据每克的注射剂量，与靶组织结合的组合物的绝对量比早些时期要低。因此，给药结合物和前药之间的最佳间隔将在抗体/酶的高峰组织浓度与被损害和正常组织之间的最佳分配比例之间综合考虑。结合物的剂量由医生根据一般标准选择。任何结合物的剂量将根据正常标准来选择，尤其参考靶组织的种类，情况和位置以及病人的体重。治疗期部分取决于对结合物的任何免疫反应的速度和程度。
当结合物被用于诊断炎症时，结合物的功能部分通常包括并且可以由用于闪烁照相研究的放射性原子组成，如锝99m(99mTc)或碘-123(123I)或核磁共振(nmr)成像(也己知为磁共振成像，mri)的自旋标记，如仍为碘-123，碘-13 1，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
当以结合物形式用于选择性的损伤组织中时，功能性部分可包含高度放射性的原子，如碘-131，铼-186，铼-188，钇-90或铅-212，它们放射足够的能量来损伤邻近细胞，放射性标记或其它标记可被以已知方式掺入结合物中。例如，标记可使用包含如以氟-19代替氢的适宜的反应物来合成。标记，如99mTC，123I，186Rh，188Rh和111In可借助于半胱氨酸残基肽连接。钇-90可借助于赖氨酸残基连接。IODOGEN法(Fraker等，(1978)生物化学生物物理研究通讯(Biochem.BiophysRes.Commun.)8049-57)可被用来掺入碘-123。“免疫闪烁照相中的单克隆抗体”(Chatal，CRC出版1989)详细描述了其它方法。B.检测抗原的方法本发明包括检测由脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原的方法。该试验可对实验室样品或生物样品进行。本文所采用的术语生物样品指从宿主，通常为人中分离的组织或体液样品，包括，但不局限于如血浆，血清，脊髓液，淋巴液，眼泪，皮肤组织，腹膜液，尿液，胆汁，心血管，呼吸，肠，生殖，泌尿或中枢神经系统道，泪状物，胎盘，脐带，乳汁，内皮细胞，子宫内膜细胞，上皮细胞，肿瘤和器官，并且还有体外细胞培养组分样品，包括，但不局限于来自于细胞培养基中的细胞生长的条件培养基。
根据本发明，宿主的氧化状态，尤其是脂质过氧化状态通过检测宿主的生物样品的下列一种物质的存在和水平来进行评价(I)与如I.A节的描述所形成的抗体结合的抗原；或(ii)与如I.A节的描述所形成的抗体发生交叉反应的抗体。已确定每个宿主，甚至是健康的人在他们的组织和体液中均具有变化量的(I)和(ii)。实际上，商业可购得的牛血清清蛋白包含(I)，因此当暴露于根据节I.A.形成的抗体时显示出阳性反应。因此，宿主中少量的(I)或(ii)的存在实质上不是氧化诱导的疾病状态的指征。相反，宿主中的(I)或(ii)水平应被认为是种群和个体的标准。因此，诊断极其类似于胆固醇的诊断，其中将宿主的水平与统计标准进行比较。而且，如胆固醇试验，在一些情况下，个体水平的变化比个体水平本身更能提供更重要的诊断信息。
通常，如果胆固醇试验表明病人可能处于患心脏病的危险时，则进行第二水平组的试验以获得更加具体的诊断信息，包括绝对血清HDH，LDL和三脂酰甘油酯的水平。在相同的胆固醇水平时，各成分的不同的比例提供不同的诊断和预测性的提示。本试验类似于它，在于如果脂质氢过氧化物水平表明病人处于将要患有的危险中或已患有炎症疾病，包括心血管疾病，则可适当地进行一系列第二水平的试验以证实诊断和获得有关疾病的进一步信息。这些第二水平的试验可评价推测疾病的其它代替性标记的存在和或它们的量。代替性标记包括，但不局限于LDL，HDL，三脂酰甘油酯，L(P)A(由LDL与蛋白质a反应形成)，VCAM(可溶的，在患有系统性炎症疾病的病人的血清中循环的VCAM-1水平升高)，ICAM，E-选择蛋白，MCSF，G-CSF，TNF-α，IL-1和MCP-1。其它具体的疾病的代替性标记为已知的，用于这些标记的分析试剂可商购或从医学实验室获得。
另一方面，靶蛋白和氧化的代替性标记的特异性抗体可被用来分析脂质过氧化物修饰的样品本身的特异性成分，以获得更多关于伯胺参与氧化过程的信息。这提供了另外的对于粥样硬化和其它炎症疾病诊断的特异性和敏感性，并且可提供用于确定，如果存在的话，是那种脂质过氧化的物质可起Oxykines的作用的信息。使用标准的双抗体检测技术(如免疫沉淀和蛋白质印迹)，可鉴定和定量来自组织或体液的脂质氧化物修饰的胺，包括LDL，HDL，三脂酰甘油酯，L(P)A，VCAM，ICAM，E-选择蛋白，MCSF，G-CSF，TNF-α，IL-1和MCP-1。全部脂质过氧化物状态的这个组分可能代表脂质过氧化物介导的特征为动脉粥样硬化的血管炎症事件的敏感和特异性标记。相似地，可使用阿扑-B抗体和LOOH/胺抗体来检测阿扑-B的脂质过氧化物修饰。
测定抗原与抗体的结合的任何试验可被用来评价根据本发明的宿主生物样品中的抗原或抗体的水平。已知许多这种试验并且通常在商业上使用。
免疫细胞化学和免疫组织化学为使用抗体分别识别位于溶液细胞表面或组织切片上的抗原的方法。免疫细胞化学被用来按照表面标记定量各个细胞种群。免疫组织化学被用来定位特定的细胞种群或抗原。使用包含推测的自体抗原作为底物的组织或细胞，这些技术还可用于识别自体抗体。通常使用最初抗体的酶结合的抗体，接着通过在细胞或组织上沉积不溶性的着色最终产物的产色原来识别抗体。
另一个常用的评价方法是放射免疫法，其中放射性标记的试剂被用来检测抗原或抗体。可使用用抗原敏化的平板来检测抗体。通过加入抗体特异性的放射性标记的配体来应用和检测试验抗体。与平板结合的配体的量与试验抗体的量成比例。该试验可反过来用于检测抗原。放射免疫法的变化为竞争性RIA，直接结合RIA，捕获RIA，夹层RIA和免疫放射性分析(RMA)。
酶联免疫吸附测定(ELISA)为一类广泛用于检测抗原和抗体的方法。原理类似于放射免疫测定，除开酶与检测系统结合而不是与放射性分子结合。采用的典型的酶为过氧化物酶，碱性磷酸酶和2-半乳糖苷酶。这些可被用来从无色底物产生有色反应产物。颜色密度与所研究的反应物的量成正比。这些测定法比RIA更方便，便灵敏性较差。
蛋白质印迹(免疫印迹)法被用来鉴定未知抗原。通过凝胶电泳分离生物样品的各组分。SDS凝胶电泳根据分子量分离，IEF凝胶电泳根据电荷特性分离样品。将分离的蛋白质转移至膜(被印迹)上并通过免疫细胞化学鉴定。
通常使用较少但适宜的评价方法包括Farr测定(其中放射性标记的配体与溶液中的特异性抗体结合并检测它，该放射性的配体被沉淀和定量)，沉淀反应(其中抗体和抗原交联至大的网格中以形成不溶性的免疫复合物；仅仅在如果抗原和抗体以接近相等的足够量存在，并当具有足够的可获得表位以形成网格时才可行)；浊度测定法(通过它们散射光的能力测定在溶液中形成的免疫复合物)；免疫扩散法(检测琼酯凝胶中的抗原和抗体)；逆流电泳(类似于免疫扩散，除开用电流将抗体和抗原推进到一起；可用于低浓度的抗原或抗体)；单辐射免疫扩散(SRID)(通过让它们从井扩散到含抗体的凝胶来定量抗原；该方法可反过来由未知抗体溶液向含抗原的井扩散)；火箭电泳(类似于SRID，除开通过电场将试验抗原移至凝胶中)；和免疫荧光(类似于免疫化学，除开它使用荧光而非酶结合物)。优选将用于与生物体液样品接触的抗体固定至固体底物上。可使用各种方法固定抗体，如描述在上文引用的抗体实验室手册中的方法。适宜的固体底物包括具有膜或由棒，合成玻璃珠，琼酯糖珠，杯，平皿或其它固体载体支撑或与它们相连的涂层的材料。其它固体底物包括细胞培养平板，ELISA平板，试管和聚合物膜。
用可检测试剂标记抗体的方法也描述在上文引用的抗体实验室手册中。宿主生物样品中的抗原的量可通过任何与选择的测定法相关的方法来测定。例如，可使用已知的增加量的抗原来进行选择免疫测定以产生标准曲线或着色图表，并可接着通过将试验结果与标准曲线或图表比较来确定试验抗原的量，其中标准曲线或图表使抗原抗体复合物的量与抗原的已知量相关联。被确定存在于宿主生物样品中的抗原的量可被以多种方式用来评价病人的情况。首先，可将抗原水平与基于统计数据的人群标准进行比较。第二，可根据病人本身抗原水平的历史来考虑抗原的水平。C.试剂盒本发明还包括用于诊断样品中脂质过氧化状态的试剂盒。该试剂盒优选包括与由在生物样品中发现的脂质氢过氧化物与胺的反应而形成的表位反应的抗体。抗体以能有效地与样品中基本上全部抗原结合并对它们进行检测的量存在于试剂盒中。优选的试剂盒包含在约10分钟或更短的时间内基本上结合样品中全部的抗原的足够的抗体。抗体可被固定在固体载体上，并可如上所述被用可检测试剂标记。试剂盒任选包含用于检测可检测试剂的物质。如果抗体被用荧光染料或放射性标记标记，通常不提供用于检测试剂的方法，因为使用者被预期使用适宜的分光光度计，闪烁计数器或显微镜。如果可检测试剂为酶，用于检测可检测试剂的物质可被辅助以试剂盒，并通常包括足够定量检测所有抗原-抗体复合物的量的酶底物。一个优选的检测可检测试剂的物质为被通过酶转化为有色产物的底物。一个常用的实例为对2，2′-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)使用辣根过氧化物酶。
试剂盒可任选包含一种溶胞剂，它将存在于生物体液样品中的细胞溶胞。适宜的溶胞剂包括表面活性剂，如Tween-80，Nonidet P40和Triton X-100。优选地，溶胞剂与抗体一起被固定至固体载体上。
试剂盒还可包含用于在各步之间洗涤底物的缓冲溶液。缓冲溶液通常为生理溶液，如磷酸盐缓冲液，生理盐水，柠檬酸盐缓冲液或Tris缓冲液。
试剂盒任选包含不同浓度的预成抗原以校准测定。试剂盒可另外包含在校准的标准测定中用于参考目的的目测或数值表示量的抗原。例如，如果使用产生有色产物的测定法，可包括提供对与不同量的抗原相关的增加的强度的描述的图表。
另一方面，试剂盒可包括用于评价生物样品中的抗体水平的由脂质氢过氧化物与胺反应形成的抗原。
试剂盒可任选包括检测系统中的两种抗体。第一种以少量存在的抗体对于正测定的抗原具有特异性。第二种被以较大量提供的抗体被用来检测第一种抗体。例如，兔抗体可被用来检测LOOH/胺抗原，接着抗兔IgG抗体可被用来检测结合的兔抗体。山羊抗体和抗-抗体也是常用的。
作为非限制性实例，提供一种用于检测病人的脂质过氧化状态的试剂盒，它包括对LOOH/胺抗原特异性的兔抗体，足够量的抗-兔IgG抗体以检测结合的一抗，与二抗结合的酶以及在暴露于酶中时改变颜色的酶底物。D.诊断试剂盒的应用本文描述的诊断方法和试剂盒可被用来评价许多由氧化诱导事件尤其是脂氢过氧化物介导的医学疾病。例如，脂质氢过氧化物的存在和升高的浓度，或脂质氢过氧化物与伯胺的反应产物可被用作心血管疾病的最初诊断标记，包括动脉粥样硬化，炎症疾病，子宫内膜异位，glymerol肾炎，子痫前期，由脂质过氧化介导的中枢神经系统疾病，阿尔茨海默疾病，牛皮癣，喘哮，特应性皮炎，实体癌，卡波济肉瘤，神经变性疾病，炎症性肠疾病(节段性回肠炎)，类风湿性关节炎和局限缺血性reperfusion。可根据待治疗的疾病选择生物样品。例如如果疾病是组织特异性的，患病区域的组织样品可能是最佳的。如果该方法和试剂盒表明了宿主中增加或反常水平的脂质过氧化，可采用另外的试验来证实特异性疾病。E.确定宿主氧化状态的实例兔血清清蛋白(RSA)，大豆脂氧合酶，亚油酸，与碱性磷酸酶结合的山羊抗兔IgG，辛基葡糖苷，四甲氧基丙烷和磷酸对硝基苯酯从Sigma化学公司购得(St.Louis，Missouri)。壬烯醇购自Aldrich化学公司(Milwaukee，WI)。脱脂奶粉购自Bio-Rad化学公司(Hercules，CA)。Tween-20和96井微量滴定平板购自Fisher化学公司(Pittsburgh，PA)。得到20个氨基酸的肽序列，YVTKSYNETKIKFDKYKAEKSHEDEL(其中K代表赖氨酸)(SEQ ID NO.1)。
实施例1 脂质过氧化物修饰的蛋白质的制备如上文由Fruebis，Parthasarathy和Steinberg所描述的，通过用大豆脂氧合酶(SLO)处理，将亚油酸转化为13-氢过氧化亚油酸酯。立即将亚油酸氢过氧化物与无免疫球蛋白的RSA反应，37℃下保温2天。在一个常规反应中，将100nmol亚油酸用30单位SLO的1ml磷酸盐缓冲液(PBS)处理，接着测定反应在234nm的吸光率的增加。通常，30分钟内完成反应。37℃下，接着将脂质氢过氧化物(13-HpODE)用100μg无脂质，IgG和其它蛋白质的血清在存在50μM EDTA时处理2天。通过在330nm的激发波长和430nm的发射波长下测定荧光来确定荧光产物的形成。通过Bligh和Dyer的方法(Bligh等，加拿大生物化学生物物理杂志(Can.J.Biochem.Physiol.)37911-917(1959))，将产物用氯仿和甲醇提取以除去未反应的LOOH，接着用冰冷却的丙酮洗涤数次。最终产物，LOOH修饰的RSA(LOOH/RSA)可溶解于水溶液中，并具有类似于氧化的低密度脂蛋白(Ox-LDL)的荧光特性。在不存在任何加入的金属以限制形成醛的情况下完成LOOH的产生以及蛋白质的修饰。实施例2 氧化的LDL的制备使用台式Beckman TL-100超速离心机和TLA-100.4转子(Santanam等，临床研究杂志(J.Clin.Invest)952594-2600；1995)从肝素化的正常人供血者的血浆中分离LDL。单自旋梯度被用来从清蛋白污染物中纯化LDL。在获得血浆的三个小时内完成分离。4℃下，得分离的LDL对磷酸盐缓冲液(PBS)透析6小时(200×体积)。通过在琼酯糖凝胶电泳上出现单一的带和在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上出现完整的阿扑脂蛋白B来证实分离的LDL的纯度。37℃下，将分离的LDL(100μg/ml)与含有5μM铜的磷酸盐缓冲液在50mm平板中保温。保温24小时后，将溶液转移至玻璃试管中并根据Bligh和Dyer的方法，通过提取脂质而脱脂。将脱脂LDL蛋白溶解在辛基葡糖苷(100μl 10mg/ml与5μl 1N NaOH一起被加入蛋白中)中，如Parthasarathy等(Parthasarathy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84537-540；1987)所述。实施例3 醛修饰的蛋白质的制备制备含1mg蛋白(或其它蛋白)而不含球蛋白的RSA的100μl PBS溶液，接着用PBS将总体积增加至1ml。将壬烯醇或己醇(100μl25mμM的乙醇溶液)加入蛋白中，混合均匀，并在37℃下保温24小时。向溶液中加入4ml冰冷却丙酮，并将试管置于冷冻机中1小时。4℃下，1500rpm离心10分钟后，除去上清。将此步骤重复三次，接着将沉淀真空干燥。向试管中加入1ml PBS，混合后，此溶液被用于酶联免疫吸附测定(ELISA)中。
丙二醛修饰的蛋白如下制备。制备1个100μl的四甲氧基丙烷样品，并将0.5ml 6N HCl加入试管中。60℃下将试管加热30分钟，用4NNaOH将pH调至6.4，使用PBS将总体积调至2.7ml。随后将25μl制备的溶液加入到2mg无球蛋白的兔血清清蛋白或其它蛋白中，并在37℃下保温。保温3小时后，将溶液对PBS透析并用于ELISA中。实施例4 抗体的制备3只体重为3-4kg的雄兔购自Myrtle Rabbitry(Thompson Station，TN)。为了初次免疫，将1.5mg/ml脂质过氧化物修饰的兔血清清蛋白溶解在PBS中，混合以弗氏完全佐剂(Sigma，St.Louis，MO)，并接着进行皮下注射。继续用混合以弗氏不完全佐剂的抗原的PBS溶液以4周的间隔进行加强免疫。免疫后将兔取血10-14天，并让血液在室温下静置4小时及4℃下过夜。3000rpm离心20分钟除去血块和碎片后，血清通过ELISA分析并贮存于-20℃下。接着测定月效价，在最初免疫6个月时取最后一次血。动物中的LOOH/RSA抗体效价随时间而增大并在约4个月时到达稳定。实施例5 LOOH修饰的蛋白的ELISA分析使用ELISA研究LOOH/RSA抗体能否识别LOOH/修饰的蛋白和未修饰的蛋白，未修饰的无IgG的RSA用作对照。
用50μl/井的不同稀释度的脂质过氧化物修饰的RSA包被ELISA平板的各井并在37℃下保温3小时。将平板用0.05％Tween 20的PBS溶液洗涤三次，并用300μl 1％脱脂奶粉和0.05％Tween 20的PBS溶液封闭3小时。封闭后，将平板用0.05％Tween 20的PBS溶液洗涤3次，并将抗-LOOH/RSA血清以1∶250稀释。将50μl加入各井中并在37℃下保温3小时或过夜。在用0.05％Tween 20的PBS溶液洗涤3次后，与碱性磷酸酶结合的抗-兔IgG被以1∶38000稀释，50μl被加入至各井中，37℃下保温2小时。在用0.05％Tween 20的PBS溶液洗涤6次后，将50μl磷酸对硝基苯酯加入各井中并在37℃下保温。每隔15分钟检查平板持续2小时。通过作出作为LOOH/RSA浓度的函数的OD读数图来建立曲线。
室温下将抗原(LOOH/RSA，RSA，Ox-LDL和其它修饰蛋白)放置于96井平板中过夜。将各井用3％BSA的PBS溶液封闭2小时并用PBS洗涤三次。将抗-LOOH/RSA抗体以1∶250用含有3％BSA的PBS溶液稀释，并加到各井中。37℃下保温2小时后，各井用PBS洗涤三次。将与碱性磷酸酶结合的山羊抗-兔IgG以1∶38,000稀释并加入其中。37℃下，保温2小时后，再洗涤各井并加入磷酸对硝基苯酯。通过平板计数器(Anthos II)确定颜色的变化。
图1为以作为405nm光密度函数的纳克蛋白测得的对兔血清清蛋白和脂质氢过氧化物修饰的兔血清清蛋白的识别的条线图。如所示，以1∶250稀释的抗体以浓度依赖方式选择性识别修饰的蛋白。在明显高于对照蛋白的水平上识别少至10ng的RSA(小于2nM修饰的RSA)。甚至在高浓度时，未修饰的对照蛋白几乎不能被抗体所识别。没有一抗或二抗的对照未被抗体所识别。抗体也可识别其它修饰的蛋白(LOOH-修饰的牛和人血清清蛋白，过氧化氢酶和细胞色素C)。在LDL的氧化期间，LDL的阿扑蛋白B100(阿扑B)组分经历了广泛的修饰。许多研究已证实修饰包括由醛对赖氨酸残基的共价修饰所产生的新的抗原表位。
为了确定是否Ox-LDL还包含由完整LOOH修饰的赖氨酸，研究了LOOH/RSA的抗体是否能识别LDL或Ox-LDL。图2为以作为光密度单位的函数的毫克浓度所测得的表明实施例4的抗体识别Ox-LDL的条线图。如图2所示，Ox-LDL被抗体以浓度依赖方式所识别。抗体能识别少至0.25μg Ox-LDL蛋白(＞0.5nM阿扑B)。在存在丁基化羟基甲苯(BHT)时所制备的天然LDL甚至在2.5μg浓度时也未能被识别。在单独的实验中，已证实Ox-LDL的脂质成分也被抗体识别，这表明Ox-LDL的氨基磷脂，如磷脂酰乙醇胺可被类似地修饰。实施例6 免疫组织化学在两种条件下测定抗体识别组织中的修饰的蛋白的能力。在第一个实验中，采用与LOOH预保温的RAW细胞。在第二个实验中，来自胆固醇饲养的猴子的粥样硬化的动脉被用抗体进行免疫染色。
如下将未处理的巨噬细胞与100μM 13-HpODE保温1，2或3天。在无血清的DMEM中(Dulbecco′s改进的Eagle′s基本必需培养基)，将6井中的铺满细胞用13-HpODE处理1，2或3天。在第2，3天，将新鲜的13-HpODE加入到各细胞培养皿中。在第1，2或3天的最后将细胞用Bouins溶液固定10分钟，并使用LOOH/RSA抗体进行免疫细胞化学。固定后，将细胞用PBS洗涤3次。将抗-LOOH/RSA抗体用含有3％被BSA的PBS溶液以1∶250稀释，并加入到各井中。对于阴性对照，不加入一抗。室温下保温2小时后，各井用PBS洗涤三次，并将与碱性磷酸酶结合的山羊抗兔IgG以1∶100稀释并加入其中。室温下保温2小时后，再洗涤各井并与固红一起保温。在产生颜色后，终止反应，使用带有照相装置的Nikon显微镜将细胞照相。
通过免疫组织化学评价来自一组雄性cynomolgus猴的腹主动脉的冷冻切片。动物五年多被喂养适度高脂肪饲料，其中该饲料由补充有8.2％干蛋黄和10％猪油的高蛋白猴混合饲料组成。最后的饲料含37.5％饱和脂肪，44.9％单不饱和脂肪，17.5％多不饱和脂肪及0.25％胆固醇。这些动物的平均血清水平为306mg/dL。这些胆固醇水平足以在猴子中产生一定范围的粥样硬化的伤害。显示出不同程度的粥样硬化的发生的人的主动脉在组织收集时从器官捐赠者获得，并在Emory UniversityHuman Subjects Committee的批准下而进行收集。在恒冷切片机上被切至5μm之前，将人和Cynomologus猴子的主动脉在仲甲醛中固定并在O.C.T.中冷冻。接着将组织切片使用1∶500稀释的抗体，随后用1∶200稀释的生物素化的山羊抗-兔IgG(Fisher Scientific)进行免疫染色，通过使用Vector Red作为产色原的Vector ABC-AP系统(Vector实验室)进行肉眼观察。免疫组织化学表明与LOOH保温的细胞被抗体进行了免疫染色，并且抗原表位存在于细胞内。缺乏一抗的对照细胞和对照没有显示出免疫反应性。这些主动脉显示强的免疫反应性。如对巨噬细胞进行染色的计数器所测定的，免疫反应性位于富含泡沫巨噬细胞的区域。实施例7 蛋白质印迹分析在7.5％交联的丙烯酰胺凝胶上，使用2.5μg蛋白对蛋白进行分离后进行蛋白质印迹分析。使用1∶250稀释的抗-LOOH/RSA作为一抗，过氧化物酶结合的山羊抗-兔IgG作为二抗检测转印的样品，通过化学发光检测装置肉眼观察交叉反应的带。
使用LDL和Ox-LDL的蛋白质印迹分析，证实实施例4的抗体能识别Ox-LDL，但不能识别天然LDL。对正常人血浆的蛋白质印迹分析表明抗体识别至少三种不同的蛋白。在存在BHT时制备血浆样品，这些表位不太可能在体外产生。这些蛋白的性质是未知的，虽然从凝胶上的迁移率来看这些蛋白被推测可能代表清蛋白和阿扑B产物。实施例8 实施例7的抗体与醛修饰的蛋白的交叉反应已描述了许多醛修饰的蛋白的抗体。由于LOOH与蛋白的保温时间大，醛可能对产生抗原表位起作用。为了确定是否LOOH/RSA抗体能识别由醛修饰的蛋白，制备了20个氨基酸的肽序列YVTKSYNETKIKFDKYKAEKSHEDEL(其中K代表赖氨酸)(SEQ ID NO1)。使用该肽是因为来自商业来源的血浆蛋白，如清蛋白作为体内产生的结果或作为体外纯化过程中产生的结果可能已经具有类似的表位。MDA，己醛，壬烯醛和LOOH-修饰的合成肽的ELISA数据提供在表1中。抗体未能在任何显著的程度上识别合成肽或其醛修饰的衍生物。相反，LOOH-修饰的合成肽容易被抗体识别。
表1抗-LOOH/RSA抗体对LOOH-修饰的肽和未被醛修饰的肽的识别
将微量滴定井用增加浓度的未被修饰或修饰的肽包被。在用脱脂奶粉封闭各井后，向各井中加入100μl以1∶250稀释的抗-LOOH/RSA抗体。洗涤后，向各井中加入与碱性磷酸酶结合的抗-兔IgG。在加入底物磷酸对硝基苯酯后，使用微量平板计数器测定405nm的OD。数值代表三次重复组的来自至少2个独立实验的一个的各井的光密度数值的平均值。
醛和LOOH-修饰的肽的蛋白质印迹分析证实在任何显著程度上没有醛修饰的合成蛋白被识别，而LOOH-修饰的肽被抗体识别。II.Oxykines的生物学活性A.Oxykines的定义已发现一些脂质氢过氧化物与伯胺的反应产物作为细胞应答的介体显示出独立的生物学活性。本文所采用的术语“Oxykine”指由脂质氢过氧化物与伯胺反应产生的并且可引发来自靶细胞的应答的荧光蛋白或脂质。Oxykines可在细胞外产生或在细胞膜上形成以介导细胞应答。Oxykines还可在细胞内产生。
多种具有伯胺的生物活性分子可被转化为具有生物活性的Oxykines。Oxykine的一个实例为亚油酸氢过氧化物(13-HpODE)与清蛋白或多赖氨酸中的适宜氨基酸基团，如赖氨酸，或小分子量化合物如磷脂酰乙醇胺之间的稳定荧光反应产物。某些Oxykines起潜在的炎症信号的作用，该信号通过可被选择性的抗氧剂抑制的机制诱导内皮VCAM-1基因的表达，其它可由Oxykines引发的细胞应答为MCP-1，IL-1，TNF-α，ICAM，MCSF和E-选择蛋白的产生或活化。
由于脂质的氧化与炎症和心血管疾病有关，因此Oxykines可被用作细胞炎症反应的介体，包括心血管反应。自然界中炎症和心血管的具体的疾病状态包括动脉粥样硬化，子宫内膜异位，glymeral肾炎，子痫前期，由脂质过氧化作用介导的中枢神经系统疾病，阿尔茨海默疾病，自身免疫疾病，牛皮癣，喘哮，特应性皮炎，皮肤癌，神经变性疾病，炎症性肠道疾病(节段性回肠炎)，类风湿性关节炎，缺血性阻塞(reperfusion)，骨关节炎，气喘，皮炎，多发性硬化，血管成形术再狭窄，冠状动脉疾病和心绞痛。
虽然所有伯胺与脂质氢过氧化物反应以形成可被用来产生确定宿主氧化状态的抗体的抗原种类，但并非所有肽或生物学形成的伯胺都将形成Oxykines。这是由于仅需要一种表位来引发抗体应答，然而为了介导细胞应答，反应位点的数目和位置对于与受体的互补结合是至关重要的。
Oxykine表位的非限制性实例公开在被本文引作参考的Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷89，pp 10588-10592，1992，11，MedicalSciences中。尤其是，表位可包括
R＝烷基本发明的抗体可尤其是通过物理性干扰其介导细胞应答的能力被用来阻断抗原的损伤活性。B.Oxykine的体外合成和鉴定通过使用Freubis，Parthasarathy和Steinberg(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10588-10592)的改进方法，将脂质氢过氧化物与脂氧合酶一起保温来完成大豆脂氧合酶(sLO)的脂质修饰。对于此合成，保持高的脂质与蛋白比例是重要的。在小规模反应中(1ml)，室温下，将250μM亚油酸直接与sLO(50单位，80ng)一起保温3天；搅拌样品对让空气进入反应中是很重要的。所有反应在10mM Tris，pH 8.0，15mM氯化钠中进行。未纯化的反应混合物被用来产生抗氧化修饰的大豆脂氧合酶Oxykine(oxSLO)的兔多克隆抗体和小鼠单克隆抗体。
在扩大的反应中，由于不溶混性问题，不可能保持大的脂质对蛋白的比例。开发了一种用于合成13-HpODE修饰的脂氧合酶作用的Oxykine或修饰“靶”蛋白的方法(参见图4)。在体积高达1.5ml中的1-3mg靶蛋白在10kDa分子量截止值的膜上被多价螯合。这使得250ml脂质过氧化物产生系统与保留的蛋白靶连续交流。催化量的大豆脂氧合酶1,260单位和800μM亚油酸被用于过氧化物产生系统中以催化形成13-氢过氧-[S-(E，Z)]-9，11-十八碳二烯酸。在至少170小时期间，每8-16小时将产生系统用新鲜sLO/亚油酸交换一次。在10mMTris，pH 8.0，15mM氯化钠中伴随连续搅拌来进行反应。大规模方法的一个优点是任何大于10kDa的蛋白混合物可被用作靶蛋白。
形成13-HpODE氧化的Oxykines的判断标准包括在以内皮细胞为基础的测定中诱导ICAM-1(本文的后面章节将详细讨论)和与Oxykine抗体的免疫反应性。使用小规模反应估测形成Oxykine的最小需要量，如使用多克隆抗体的蛋白质分析所观察到的，对于第三天的反应最少需要sLO和亚油酸(见图5)。摇晃反应增加产率。当sLO单独与缓冲液保温时没有交叉反应性。在大规模反应中形成Oxykine过程之后接着是免疫反应性和生物学活性(ICAM-1的诱导，参见图6和7)。在生物学活性之前先观察免疫反应性活性。由蛋白质分析所观察到的最初产物为在约80kDa迁移的高分子量带。在后面的时间点观察到的反应产物形成了一个在约25kDa处具有显著的带的梯形。反应过程后的免疫反应性和生物学活性取决于脂质的浓度；增加亚油酸的浓度则增加了反应的速度。
通过分析反相高效液相色谱(RP-HPLC)和凝胶过滤来测定Oxykine反应产物。使用C18柱的HPLC分析表明反应产物比起始原料疏水性更大，这与向脂氧合酶中加入脂质一致(参见图8)。制备凝胶过滤被用来部分纯化oxykine(参见图9和10)。虽然大多数蛋白被在其它级分中发现，但在级分9和10中发现了生物学活性。
根据免疫反应性和生物学活性评价oxykine的稳定性。如蛋白质分析所观察到的，Oxykine对于许多酸性和碱性条件以及对于存在还原剂时都是稳定的。在与3.5M MgCl2，10mM磷酸钠，pH 7.2；5.0M LiCl，10mM磷酸钠，pH 7.2；100mM三乙胺，pH 11.5；和100mM甘氨酸，pH 2.5一起预保温时，保留了与多克隆和单克隆抗体的免疫反应性。相反，虽然其余贮存条件没有影响，但与3.5M MgCl2，10mM磷酸钠，pH 7.2一起保温时，导致了生物活性的损失。是否活性的损失是由于蛋白质构象的改变，氧化状态，或其它原因仍有待研究。在热变性和在存在二硫苏糖醇的热变性后生物学活性仍然保留。加入EDTA，Trolox和probucol对ICAM-1的诱导也没有影响。在蛋白质酸解以后，生物学活性丧失。实施例9 oxSLO的生物学活性的鉴定oxSLO诱导ICAM在人主动脉内皮细胞(HAEC)中的表达在小规模合成反应中，在室温下保温的第1个小时中，sLO将250μM亚油酸(LA)转化为13-HpODE。在后面3天的保温中，推测13-HpODE氧化性地修饰酶并在酶上产生可引发生物学活性，如在HAEC上的细胞表面ICAM的表达的表位，正如图11中所描述的ELISA测定所示。在ELISA测定之前，将微量滴定平板上生长的HAEC暴露于这种处理中16小时。保温3天后，单独的sLO或LA没有变得具有活性，这表明sLO的氧化修饰对于生物活性表位的产生是必需的。在大规模合成反应中，仅在存在13-HpODE产生系统时，sLO才变得具有活性，如图12所示。sLO阴性对照代表仅与缓冲液保温延长时间的sLO酶，我们证实了由任一种方法合成的oxSLO功能和免疫性相同。而且，我们已证明了生物学活性的形成是蛋白特异性的。使用大或小规模oxykine反应的兔血清清蛋白的反应产生免疫反应性但不具生物学活性的产物。
如图13所示，oxSLO激活细胞表面ICAM的表达是以剂量依赖方式进行。40ng/ml oxSLO对于标准ELISA分析中的明显信号来说足够了。另一方面，等量的未修饰的sLO不能活化HAEC。如图15所示，在RNA印迹中观察到类似结果。实施例10 oxSLO诱导VCAM，E-选择蛋白和MCP-1在HAEC中的表达oxSLO不仅诱导ICAM，而且诱导两种其它的粘附分子(图15中的VCAM，图16中的E-选择蛋白)和一种化学增活分子(图15和16中的MCP-1)。图14表明了在HAEC中对细胞表面VCAM表达的诱导，虽然程度比ICAM诱导小。如图15所示，ELISA数据得到了RNA印迹数据的支持。在oxSLO处理4小时后，VCAM mRNA积累的量少于ICAM mRNA。而且，MCP-1和E-选择蛋白的mRNA水平与TNF诱导一样高，表明MCP-1和E-选择蛋白可能是oxSLO介导的信号级联的关键成分。如图16所示，这些炎症原基因的诱导是非常迅速的。在2-6小时的刺激中，所述基因的mRNA水平均达到了稳定状态。实施例11 巨噬细胞中的oxSLO IL-1β的表达如表2中所总结的，除开对内皮细胞具有很大影响外，如图14所示，oxSLO还诱导在巨噬细胞系(RAW)中另一种细胞因子IL-1βmRNA的积累。将RAW细胞用oxSLO处理4小时，收集并分析所有RNA。在动脉粥样硬化的发展中，内皮细胞和巨噬细胞都显示出极其重要。我们的体外数据有力地支持这样一个看法，即一种独特类型的被称为oxykine的脂质氢过氧化物修饰蛋白，脂质或亲脂分子可介导粥样硬化损伤区域中的炎症原信号。表2oxSLO诱导HAEC中的VCAM-1，ICAM-1和MCP-1mRNA的积累
实施例12 由亚油酸氢过氧物氧化修饰的兔血清清蛋白产物的生物学活性研究是否由亚油酸氢过氧化物氧化修饰的兔血清清蛋白RSA改变该物质中一部分(肽或非肽)的结构或生物学性质，使其具有作为血管内皮细胞炎症信号的生物学作用。使用如实施例1中制备的氧化修饰的RSA(oxRSA)，将培养的人主动脉内皮细胞暴露于1-100nM(纳摩尔)范围的oxRSA浓度中达12小时，并通过ELISA分析测定可诱导的粘附分子VCAM-1，ICAM-1或组成表达的粘附分子ICAM-2的细胞表面表达。如图3中所示，以作为最大TNF-α诱导的信号的百分数表示，ox-RSA显示出的对VCAM-1的剂量依赖性诱导为最大TNF-α信号的40％，对ICAM-1为80％。对于VCAM-1和ICAM-1，oxRSA的近似的EC50为10-15nM。该诱导不是由于污染的脂多糖，因为多粘菌素B(10μg/ml)完全抑制LPS诱导，但对oxRSA活化没有影响。而且，对在oxRSA制备中的LPS的鲎分析低于检测值。组成表达的ICAM-2不受影响。这一结果表明oxRSA以剂量应答方式在低的纳摩尔范围内起着可能的内皮细胞的炎症因子的作用。实施例13由亚油酸氢过氧化物氧化修饰兔血清清蛋白的产物对mRNA积累的影响下一步研究是否ox-RSA对VCAM-1和ICAM-1细胞表面表达的诱导至少部分是由于mRNA积累的变化。用从暴露于TNFa(100U/ml)或oxRSA(25nM)4小时的HAEC分离的RNA进行RNA过滤分析。类似于在蛋白质水平上观察到的，ox-RSA诱导VCAM-mRNA水平为在TNFa观察到的水平的约30-40％。ICAM-1mRNA也被ox-RSA诱导。实施例14 亚油酸氢过氧化物氧化修饰兔血清清蛋白的产物对通过类NF-kB DNA结合复合物的VCAM-12启动子的转录活化的作用为了证实是否oxRSA调节与氧化还原敏感的VCAM-1基因表达相关的核调节事件，将培养的人主动脉内皮细胞暴露或不暴露于(CTL)TNFa(100U/ml)或25nM Oxykine RSA-LOOH(oxRSA)中达2小时，制备核提取物，使用为人VCAM-1启动子的串联类NF-kB结合位点的32P-标记的KLOKR进行凝胶迁移率分析。采用抗-p50和抗-p65抗血清(R&D Systems)进行适宜的冷的竞争物和超迁移对照以确定NF-kB复合物带的DNA序列结合的特异性。TNF和oxRSA引入类NF-kB DNA结合活性。这表明oxykines可能在维管结构中的NF-kB介导的转录激活途径中起作用。实施例15 来自子宫内膜异位和对照个体的血浆样品的自身抗体的效价发生子宫内膜异位个体的腹膜腔中发生的氧化作用可能导致被修饰的蛋白的抗体的出现，这些抗体可能在患有子宫内膜异位的病人中增加。为了确定这些自身抗体是否存在于被诊断患有子宫内膜异位的病人中，评价从这些病人抽取的血浆样品是否存在与三种抗原反应的抗体脂质氢过氧化物与兔血清清蛋白的反应产物，脂质氢过氧物与LDL的反应产物，与MDA的反应产物。
ELISA分析将10μg ox-LDL，MDA-LDL或脂质过氧化物修饰的清蛋白(LOOH-RSA)(阳性抗原)和LDL，人清蛋白和乙酰基LDL(阴性对照)以100μl体积放置于96井微量滴定平板中。4℃保温过夜后，通过与3％奶料保温2小时将平板封闭。洗涤后，使用过氧化物酶或与碱性磷酸酶结合的抗人IgG抗体检测结合的人IfF。使用特异性底物，通过比色检测定量测定结合的与酶结合的IgG。
结果示于表3-5中。如所示，患有子宫内膜异位的病人的反应性抗体的水平比对照有统计学增加。表3抗原LOOH/RSA(200μl血浆样品)。
结果以形成的对硝基苯酚的OD当量数表示t-试验假设不等方差的两个样品
表4抗原Ox-LDL(200μl)血浆样品)t-试验假设不等方差的两个样品
表5抗原MDA-LDL(200μl血浆样品)t-试验假设不等方差的两个样品
已参考其优选实例对本发明进行了描述。从前面对本发明的详细描述中可见，本发明方法，试剂盒和物质，包括抗体的变化和改变对于本领域技术人员来说均是显而易见的。应理解所有这些变化和修改都包括在所附权利要求书的范围内。序列表表1oxSLO诱导HAEC中的VCAM-1，ICAM-1和MCP-1mRNA的积累处理 VCAM-1 ICAM-1 MCP-1(任意单位) (任意单位) (任意单位)TNF(100units/ml) 82.06 71.92 101.65sLO(0.8μg/ml) 3.363.14 12.34sLO(0.08μg/ml)0.12-0.09 3.1sLO(0.008μg/ml) -0.14 -0.51 1.12修饰的sLO(1μg/ml) 24.17 19.74 116.62修饰的sLO(0.2μg/ml) 11.51 9.41 96.28修饰的sLO(0.04μg/ml) 9.382.06 37.3权利要求
1.一种评价生物样品中脂质过氧化作用的方法，包括将生物样品与一种与由脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原结合的抗体接触。
2.一种用于评价生物样品中脂质过氧化作用的试剂盒，包括(I)和脂质氢过氧化物与伯胺的反应产物结合的抗体或抗体片段；或(ii)与(I)的抗体结合的抗体。
3.一种分离的抗体，其与由脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原结合。
4.一种抗体片段，其与由脂质氢过氧物与伯胺反应形成的抗原结合。
5.权利要求3或4的抗体，被固定在固体载体上。
6.权利要求3或4的抗体，被用可检测试剂标记。
7.权利要求5的抗体，其中固体载体选自与棒，珠，杯或扁平容器相连或被它们支撑的膜和涂层。
8.权利要求5的抗体，其中固体载体选自细胞培养平板，ELISA平板，试管和聚合物膜。
9.权利要求3或4的抗体，它被可检测试剂标记，其中可检测试剂选自荧光染料，放射性标记，生物素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，2-半乳糖菌酶或其它酶。
10.权利要求3的抗体，为结合物。
11.权利要求3或4的抗体，其中抗原为亚油酸氢过氧化物与伯胺的反应产物。
12.权利要求11的抗体，其中伯胺为清蛋白或多赖氨酸中的适宜的氨基酸基团，如赖氨酸，或小分子量化合物，如磷脂酰乙醇胺。
13.权利要求3或4的抗体，它被人源化。
14.一种评价生物样品中脂质过氧化作用的方法，包括将样品与下面一种成分接触(I)与一种抗体结合的抗原接触，其中该抗体与脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原发生免疫反应或(ii)与一种抗体或抗体片段或结合物接触，其中它们与脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原发生免疫反应的抗体产生交叉反应。
14.权利要求13的方法，其中将宿主中(I)或(ii)的水平与人群的正常标准进行比较。
15.一种评价生物样品中氧化损伤的方法，包括步骤(I)分离由脂质氢过氧化物与伯胺反应形成的抗原；并接着(ii)鉴定伯胺。
16.一种用于诊断生物样品中与氧化作用相关的疾病的方法，包括评价脂质氢过氧化物与伯胺的反应产物的水平。
17.权利要求16的方法，其中与氧化作用相关的疾病选自心血管疾病，动脉粥样硬化，炎症疾病，子宫内膜异位，glymerol肾炎，子痫前期，由脂质氢过氧化作用介导的中枢神经系统疾病，阿尔茨海默疾病，牛皮癣，喘哮，特应性皮炎，实体癌，卡波济肉瘤，神经变性疾病，炎症性肠道疾病(节段性回肠炎)，类风湿性关节炎和缺血性阻塞。
18.一种在生物样品或宿主中诱导炎症作用的方法，包括将样品或宿主与诱导这一作用的脂质氢过氧化物与伯胺的荧光反应产物接触。
19.权利要求13的方法，其中亚油酸氢过氧化物为13-HPODE。
20.权利要求13的方法，其中胺选自氨基酸，蛋白质，肽或磷脂酰乙醇胺。
21.权利要求13的方法，其中炎症效果由介体诱导产生，该介体选自VCAM-1，MCP-1，IL-1，TNF-α，ICAM，MCSF和E-选择蛋白。
22.权利要求6的抗体，与用于检测可检测试剂的物质组合。
23.权利要求21的抗体，其中用于检测可检测试剂的组合物质采用作为可检测试剂的酶和在与酶接触时颜色变化的酶底物。
24.一种评价一种物质降低生物样品的脂质过氧化状态的能力的方法，包括在将样品与该物质接触之前和之后，比较宿主样品中的脂质氢过氧化物与伯胺的反应产物的水平。
全文摘要
公开了诊断和定量氧化状态,更具体地说,是宿主的脂质过氧化作用水平的方法和试剂盒,包括将宿主生物样品与由脂质氢过氧物与伯胺反应形成的抗原的抗体接触。该方法评价宿主中的氧化损伤的危险和现状。本发明还包括可用于该方法和试剂盒中的优选为纯化或分离形式的单克隆和多克隆抗体以及抗体片段。
文档编号C07K16/00GK1207175SQ97191618
公开日1999年2月3日 申请日期1997年9月19日 优先权日1997年9月19日
发明者S·帕塔萨拉思, R·M·梅德福尔德, W·R·阿勒克桑德 申请人:阿特罗吉尼克斯公司, 埃莫里大学