用于抑制血管发生的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于抑制血管发生的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及医学领域，并且具体地涉及使用玻连蛋白受体αvβ3的拮抗剂抑制组织血管发生的方法和组合物。发明背景整联蛋白是已知结合胞外基质蛋白并因此介导细胞-细胞和细胞-胞外基质相互作用(一般称为细胞粘连事件)的一类细胞受体。然而，尽管在文献中描述了许多整联蛋白以及结合整联蛋白的配体，仍然难以理解许多整联蛋白的生物学功能。整联蛋白受体构成了一个蛋白家族，这些蛋白具有共享的由α和β亚基组成的非共价异二聚体糖蛋白复合物的结构特征。
目前已知以其优先结合玻连蛋白的原始特征命名的玻连蛋白受体指称为αvβ1、αvβ3和αvβ5的三个不同的整联蛋白。Horton,Int.J.Exp.Pathol.,71:741-759(1990)。αvβ1结合纤连蛋白和玻连蛋白。αvβ3结合种类繁多的配体，包括血纤蛋白、血纤蛋白原、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、玻连蛋白、威勒布兰特因子、骨桥蛋白和骨唾液蛋白Ⅰ。αvβ5结合玻连蛋白。目前仍在研究这三种整联蛋白在组织中的许多细胞相互作用中所起的特异性细胞粘连作用，然而，已知有许多具有不同生物学功能的不同的整联蛋白。
许多整联蛋白的配体内的一个重要识别位点是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列。在以上鉴别为玻连蛋白受体整联蛋白的所有配体中都发现了RGD。可以用含有该RGD序列的多肽(“肽”)模拟该RGD识别位点，并且这种肽是整联蛋白功能的已知抑制剂。然而，重要的是注意到，根据该RGD肽的序列和结构，可以改变该抑制的特异性以导向特定的整联蛋白。
有关该RGD识别位点的讨论，参见Pierschbacher等，Nature,309:30-33(1984)和Pierschbacher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:5985-5988(1984)。整联蛋白特异性不同的各种RGD多肽亦描述于Grant等，Cell,58:933-943(1989)、Cheresh等，Cell,58:945-953(1989)、Aumailley等，FEBS Letts.,291:50-54(1991)和Pfaff等，J.Biol.Chem.269:20233-20238(1994)和美国专利4,517,686、4,578,079、4,589,881、4,614,517、4,661,111、4,792,525、4,683,291、4,879,237、4,988,621、5,041,380和5,061,693。
血管发生，亦称为新血管形成，是涉及新发育血管生长进入组织的组织血管形成的过程。该过程由内皮细胞和平滑肌细胞的浸润介导。据信该过程以以下三种方式之一进行所述脉管可以从先前存在的脉管出芽、可以从前体细胞发生脉管的从头发育(血管发生)、或现存的小脉管的直径可以扩大。Blood等，Bioch.Biophys.Acta,1032:89-118(1990)。已知血管内皮细胞含有至少五种RGD依赖性整联蛋白，包括玻连蛋白受体(αvβ3或αvβ5)、胶原蛋白Ⅰ型和Ⅳ型受体(α1β1)、层粘连蛋白受体(α2β1)、纤连蛋白/层粘连蛋白/胶原蛋白受体(α3β1)和纤连蛋白受体(α5β1)。Davis等，J.Cell.Biochem.,51:206-218(1993)。已知平滑肌细胞含有至少六种RGD依赖性整联蛋白，包括α5β1、αvβ3和αvβ5。
血管发生是新生儿生长中的重要过程，但在伤口愈合和在包括组织炎症、关节炎、肿瘤生长、糖尿病性视网膜病、由视网膜新血管形成引起的黄斑变性和类似疾病的种类繁多的临床疾病的病理学中亦很重要。这些与血管发生相关的临床表现被称为生血管性疾病(angiogenicdisease)。Folkman等，Science,235:442-447(1987)。在成人和成熟组织中一般没有血管发生，尽管它的确在伤口愈合和在黄体生长周期中发生。参见，例如，Moses等，Science,248:1408-1410(1990)。
已提出抑制血管发生将对限制肿瘤生长是有用的治疗法。已提议通过(1)抑制释放诸如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的“生血管分子”，(2)诸如通过使用抗bFGF抗体中和生血管分子和(3)抑制内皮细胞对生血管刺激物应答而抑制血管发生。后一策略受到了注意，并且Folkman等，Cancer Biology,3:89-96(1992)已描述了几种内皮细胞应答抑制剂，包括胶原酶抑制剂、基膜更新抑制剂、血管抑制性(angiostatic)类固醇、真菌源血管发生抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、诸如D-青霉胺和硫代苹果酸金的关节炎药物、维生素D3类似物、α-干扰素等等可以用于抑制血管发生的抑制剂。有关其它建议的血管发生抑制剂，参见Blood等，Bioch.Biophys.Acta.,1032:89-118(1990)、Moses等，Science,248:1408-1410(1990)、Ingber等，Lab.Invest.,59:44-51(1988)和美国专利5,092,885、5,112,946、5,192,744和5,202,352。先前参考文献中描述的任一种血管发生抑制剂均未针对抑制αvβ3。
亦描述了抑制玻连蛋白受体αvβ3的含RGD肽。Aumailley等，FEBSLetts.,291:50-54(1991),Choi等，J.Vasc.Surg.,19,125-134(1994),Smith等，J.Biol.Chem.,265:12267-12271(1990),和Pfaff等，J.Biol.Chem.,269:20233-20238(1994)。但是，在本发明之前，从未建议或鉴别整联蛋白αvβ3在血管发生中的作用。
例如，Hammes等，Nature Med.,2:529-53(1996)确认了本发明的发现。具体而言，该论文显示包括环状RGDfV(其结构和功能已在本申请基于的在先申请中描述)的环状肽在缺氧诱导的视网膜新血管形成小鼠模型中抑制视网膜新血管形成。在亦支持本发明以及所述在先申请的独立研究中，Luna等，Lab.Invest.,75:563-573(1996)描述了两个特殊的环状甲基化含RGD肽，它部分有效地抑制缺氧诱导的局部缺血视网膜病小鼠模型中的视网膜新血管形成。与之相对比，本发明的肽表现出几乎完全抑制本文描述的模型系统中的新血管形成。
使用对各种整联蛋白α或β亚基免疫特异性的单克隆抗体体外抑制细胞粘连，已将αvβ3与包括微血管内皮细胞在内的各种细胞类型的细胞粘连相关连。Davis等，J.Cell.Biol.51:206-218(1993)。另外，Nicosia等，Am.J.Pathol.,138:829-833(1991)描述了使用RGD肽GRGDS体外抑制从在胶原蛋白凝胶中培养的大鼠主动脉形成“微脉管”。但是，体外抑制胶原蛋白凝胶培养中的“微脉管”形成不是抑制组织中血管发生的模型，因为未显示所述微脉管结构与毛细管出芽相同或在胶原蛋白凝胶培养物中微脉管的形成等同于新血管生长进入完整的组织，例如需要抑制血管发生的关节炎组织、肿瘤组织或疾病组织。
为发生血管发生，内皮细胞必须首先退化，并以与肿瘤细胞在侵入和转移形成时采用的类似方式穿过血管基底膜。
本发明人先前已报道血管发生取决于血管整联蛋白与胞外基质蛋白之间的相互作用。Brook等，Science,264:569-571(1994)。另外，据报道生血管血管细胞的程序性细胞死亡(细胞凋亡)由该相互作用起始，该相互作用可以由所述血管整联蛋白αvβ3的某些拮抗剂抑制。Brooks等，Cell,79:1157-1164(1994)。近期本发明人已报道基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与玻连蛋白受体(αvβ5)的结合可以使用αvβ5拮抗剂来抑制，并由此抑制该蛋白酶的酶功能。Brooks等，Cell,85:683-693(1996)。
除了本文报道的研究外，本申请人不知道任何其它的可以使用细胞粘连的抑制剂抑制组织中血管发生的证明。具体地说，先前从未有其它人证明组织中的血管发生需要αvβ3功能或αvβ3拮抗剂可以抑制组织中的血管发生。发明简述本发明说明书证明组织中的血管发生需要整联蛋白αvβ3，并且αvβ3抑制剂可以抑制血管发生。因此，本说明书亦证实其它整联蛋白诸如αⅡbβ3或αvβ1的拮抗剂不抑制血管发生，假设因为这些其它整联蛋白对发生血管发生不是必要的。
本发明因此描述了抑制组织中血管发生的方法，包括给予该组织包含血管发生抑制量的αvβ3拮抗剂的组合物。
欲处理的组织可以是需要抑制血管发生的任何组织，例如发生新血管形成的疾病组织。典型的组织包括炎症组织、实体瘤、转移瘤、进行再狭窄的组织等等组织。
用于本方法的αvβ3拮抗剂可以结合αvβ3，并竞争性地抑制αvβ3结合至天然配体的能力。优选地，该拮抗剂对αvβ3展示出超过其它整联蛋白的特异性。在特别推荐的实施方案中，该αvβ3拮抗剂抑制血纤蛋白原或其它含有RGD的配体与αvβ3的结合，但是基本上不抑制血纤蛋白原与αⅡbβ3的结合。优选的αvβ3拮抗剂可以是融合多肽、环状或线性多肽、衍生多肽、与αvβ3免疫反应的单克隆抗体、αvβ3的有机模拟物或其功能片段。附图简述附图构成本说明书的一部分

图1A-1D描绘整联蛋白亚基β3和β1在正常皮肤和称为肉芽发生组织的进行伤口愈合的皮肤中的组织分布。如实施例3A所述进行使用抗β3和β1抗体的免疫组织化学。图1A和1B分别描绘正常皮肤和肉芽发生组织中抗β3的免疫反应性。图1C和1D分别描绘正常皮肤和肉芽发生组织中抗β1的免疫反应性。
图2A-2D描绘分别结合β3和β1整联蛋白亚基的威勒布兰特因子和层粘连蛋白配体在正常皮肤和称为肉芽发生组织的进行伤口愈合的皮肤中的组织分布。如实施例3B所述进行使用抗威勒布兰特因子(抗-vWF)和层粘连蛋白(抗层粘连蛋白)抗体的免疫组织化学。图2A和2B分别描绘正常皮肤和肉芽发生组织中抗-vWF的免疫反应性。图2C和2D分别描绘正常皮肤和肉芽发生组织中抗层粘连蛋白的免疫反应性。
图3A-3D描绘玻连蛋白整联蛋白受体αvβ3分别在膀胱癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌组织活检中的组织分布。如实施例3C所述进行使用抗αvβ3抗体LM609的免疫组织化学。
图4描绘未处理10日龄鸡胚中缺乏血管的本发明CAM的典型的显微照片。该制备物描述于实施例5B。
图5A-5C描绘整联蛋白β1和αvβ3在本发明的CAM制备物中的组织分布。图5A显示由与抗β1抗体CSAT的免疫荧光免疫反应性检测的未处理10日龄CAM制备物中β1亚基的分布。图5B显示由与抗αvβ3抗体LM609的免疫荧光免疫反应性检测的未处理10日龄CAM制备物中αvβ3受体的分布。图5C显示由与抗αvβ3抗体LM609的免疫荧光免疫反应性检测的、用bFGF处理的10日龄CAM制备物中αvβ3受体的分布。所述处理和结果描述于实施例5C。
图6在矩形图中描绘了如实施例6A中所述的未处理和bFGF处理的10日龄CAM中αvβ3和β1的相对表达的定量。将平均荧光强度在Y轴上作图，将整联蛋白分布情况描绘于X轴上。
图7A-7C分别描绘了未处理10日龄CAM、bFGF处理的CAM和TNFα处理的CAM的外观，其程序和结果描述于实施例6A。
图8A-8E描绘了局部抗体处理对第10天CAM中bFGF诱导的血管发生的影响，如实施例7A1)中所述。图8A显示缺乏血管的未处理CAM制备物。图8B显示由bFGF处理诱导的新血管系统浸润入先前缺乏血管系统的区域。图8C、8D和8E分别显示抗β1(抗β1；CSAT)、αvβ5(抗αvβ5；PSG2)和αvβ3(抗αvβ3；LM609)抗体的作用。
图9A-9C描绘如实施例7E2)中描述的静脉内注射合成肽66203对由肿瘤诱导的血管发生的影响。图9A显示用对照肽(对照肽肿瘤)静脉内处理对产生自肿瘤诱导的血管发生缺乏抑制效果。由静脉内注射肽66203(环状RGD肿瘤)对这种血管发生的抑制示于图9B。图9C显示，在邻近该肿瘤处理区的区内静脉内输注肽66203后，对成熟的预先存在的脉管缺乏抑制效果或细胞毒性(环状RGD邻近CAM)。
图10A-10C描绘如实施例7B1)中所述的静脉内使用单克隆抗体对生长因子诱导的血管发生的效果。图10A显示未暴露给抗体处理(对照)的bFGF诱导的血管发生。如图10B中所示用抗αvβ5抗体P3G2处理类似的制备物时未导致抑制血管发生。如图10C中所示用抗αvβ3抗体LM609处理导致抑制血管发生。
图11A-11C描绘如实施例7C中所述局部使用抗整联蛋白抗体后对胚胎血管发生的影响。用抗β1和抗αvβ5抗体处理6天的CAM未抑制血管发生，分别示于图11A和11B。与之对照，如图11C中所示用抗αvβ3抗体LM609处理导致抑制血管形成。
图12描绘如实施例7D1)中所述进入CAM制备物中肿瘤的脉管数量的定量。该图显示由局部使用或者CSAT(抗β1)、LM609(抗αvβ3)或PSG2(抗αvβ5)导致的绘制于Y轴上的脉管数量。
图13A-13D描绘处理7天后肿瘤湿重与起始肿瘤重量之间的比较，如实施例9A1)a中所述。每个条块代表每组5-10个肿瘤的平均值±S.E。肿瘤源自人黑素瘤(M21-L)(图13A)、胰腺癌(Fg)(图13B)、肺癌(UCLAP-3)(图13C)和喉癌(HEp3)(图13D)CAM制备物，并用PBS、CSAT(抗β1)或LM609(抗αvβ3)静脉内处理。图显示由在X轴上标明的静脉内使用或者CSAT(抗β1)、LM609(抗αvβ3)或PBS导致的绘制在Y轴上的肿瘤重量。
图14A和14B描绘如实施例9A1)b中所述的用P3G2(抗αvβ5)(图14A)和LM609(抗αvβ3)(图14B)处理并用苏木精和曙红染色的肿瘤组织切片。如图14A中所示，用对照抗体(P3G2)处理的肿瘤显示，由有丝分裂图象(箭头)以及由遍及肿瘤基质的多个血管(箭号)表明的大量的生存的和活跃分裂的肿瘤细胞。与之相反，在图14B中用LM609(抗αvβ3)处理的肿瘤中检测到的生存的肿瘤细胞或血管即使有，也很少。
图15A-15E对应于用如实施例9A2)中所述的肽处理的M21L肿瘤并如下图15A，对照环状RAD肽(69601)；图15B，环状RGD肽(66203)；图15C，从用环状RGD肽(66203)处理的相同胚胎取出的邻近CAM组织和图15D用对照RAD(69601)或图15E用环状RGD肽(66203)处理的肿瘤的高倍放大(13x)。图15D描绘RAD对照肽(69601)处理的肿瘤的正常脉管。图15E描绘环状RGD肽(66203)处理的肿瘤(箭头)的破坏的血管。
图16A-16E代表如实施例10中所述体内兔眼模型检测中由血管发生拮抗剂引起的血管发生抑制。图16A和16B描绘存在bFGF和mAbP1F6(抗αvβ5)时兔眼的血管发生。图16C、16D和16E描绘存在bFGF和mAb LM609(抗αvβ3)时兔眼的血管发生抑制。
图17代表如实施例11中所述的制备体内小鼠人嵌合小鼠模型的流程图。用人新生儿包皮替换SCID小鼠皮肤的一部分并使之愈合4周。在该移植物愈合后，用人肿瘤细胞接种该人类包皮。在以后4周内，建立了可检测的肿瘤，它包含有从该人类皮肤生长进入该人类肿瘤的人血管系统的人类肿瘤。
图18描绘源自mAb处理的和肽处理的CAM并用Apop Tag染色的的单细胞的百分比它通过FACS分析并如实施例12中所述测定的。该黑色条块和打点条块分别代表在检测前24小时和48小时处理的胚胎的细胞。每个条块代表三次重复的平均值±S.E.。用mAb LM609(抗αvβ3)或CSAT(抗β1)或PBS处理CAM。亦用环状肽66203(环-RGDfV，标明为肽203)或对照肽69601(环-RADfV，标明为肽601)处理CAM。
图19A和19B描绘如实施例12C中所述的、源自或者CSAT(抗β1)(图19A)或者LM609(抗αvβ3)(图19B)处理的胚胎CAM的单细胞悬浮液的组合结果，所述胚胎CAM用Apop Tag和碘化丙锭染色并通过FACS进行分析。Y轴代表Apop Tag染色的细胞数量(凋亡)，X轴代表碘化丙锭染色(DNA含量)。水平线代表Apop Tag染色的阴性门控。左图和右图分别标明CSAT(抗β1)(图19A)和LM609(抗αvβ3)(图19B)处理的胚胎的CAM细胞。通过每种条件分析约8,000个事件进行细胞周期分析。
图20A-20C代表如实施例12C中描述制备的CSAT(抗β1)处理的胚胎的CAM组织，图20D-20F代表LM609(抗αvβ3)处理的胚胎的CAM组织。图20A和20D描绘用Apop Tag染色并在D.I.C.图象上重叠的荧光(FITC)显象的组织。图20B和图20D描绘用mAb LM609(抗αvβ3)染色并通过荧光(若丹明)显象的相同组织。图20C和20F代表用Apop Tag和LM609染色的相同组织的重合图象，其中黄色染色代表共定位。该条带在左和右图中分别代表15和50μm。
图21显示如实施例4A中所述的用肽85189的细胞粘连抑制检测的结果。以在X轴上绘制的剂量范围.001-100uM评价该肽拮抗剂的效果。将以600nm光密度(D.D.)测定的细胞粘连绘制于Y轴。在玻连蛋白-(虚线)对层粘连蛋白-(实线)包被表面上测定细胞粘连。
图22A和22B显示鸡MMP-2的连续cDNA序列以及显示于第二行的推测氨基酸序列。第三和第四行分别显示如实施例4A中描述的人和小鼠的推测氨基酸序列。该鸡cDNA序列亦列于SEQ ID NO 29中，以及编码的氨基酸序列做为SEQ ID NO 30独立地显示。做为负数的5’非翻译区和编码示于图22A中的酶原的区的第一个核苷酸的编号实际在序列表中作为1号显示，使得后者看起来比该图长；但是，该图中的该核苷酸序列除了编号之外，在长度和序列上与展示于序列表中的核苷酸序列是相同的。因此，有关本说明书中鸡或人MMP-2核苷酸位置的参考(例如用于扩增MMP-2片段的引物中)是基于该图中标明的核苷酸位置，而不是列于序列表中的核苷酸位置。
图23显示如在实施例4B中进一步描述的在有或无抑制剂存在时，碘化MMP-2与αvβ3结合的固相受体结合检测的矩形图结果。以Y轴上的结合CPM对各种潜在的抑制剂和对照将该数据作图。
图24显示如在实施例4B中进一步描述的在有MMP-2抑制剂存在时鸡源MMP-2组合物对整联蛋白受体αvβ3和αⅡbβ3的特异性。如图23中的说明所述展示该数据。
图25显示如实施例7A3)中所述的鸡MMP-2(410-637)GST融合蛋白对bFGF诱导的血管发生的影响。图25A-B和25C-D分别显示对照(含非MMP-2片段的融合蛋白)和MMP-2片段GST融合蛋白的影响。
图26和27以矩形图的格式描绘如实施例7A3中所述的鸡MMP-2(410-637)GST融合蛋白(标记为CTMMP-2)对比对照(RAP-GST或GST-RAP)对bFGF处理的CAM影响的血管发生指数(分枝点测定)。相对于X轴上的独立处理在Y轴上描绘血管发生指数。
图28显示如实施例7B和14中所述的、对X轴上的各种处理在Y轴上作图的对分枝点的影响测定的肽和有机化合物对bFGF诱导的血管发生的影响，所述各种处理包括仅bFGF、bFGF处理的CAM加肽69601或66203和有机化合物96112、96113和96229。
图29图示如实施例7B2)中进一步描述的肽85189对抑制bFGF诱导的血管发生的剂量反应，其中将分枝点数量在Y轴上对在X轴上的给予胚胎的肽量作图。
图30显示如实施例7B2)中所述的肽66203(标记为203)和85189(标记为189)在CAM检测中的bFGF诱导的血管发生中的抑制活性。对照包括在bFGF处理的CAM中无肽和肽69601(标记为601)。如图27中的说明所述绘制该数据。
图31A-L显示如实施例7B3)中进一步所述的、在起始于24小时结束于72小时的时间进程中，各种处理对未处理CAM制备物的影响。标记为未处理、bFGF、bFGF+MAID(bFGF处理接着暴露给鸡MMP-2(2-4)GST融合蛋白)和bFGF+对照(bFGF处理接着暴露给鸡MMP-2(10-1)的各类型的照片分别示于图31A-C、31D-F、31G-I和31J-L。
图32、33和34分别显示如实施例9A中进一步描述的、静脉内暴露给对照肽69601和拮抗剂85189后UCLAP-3、M21-L和FgM肿瘤的肿瘤重量的减少。将该数据以Y轴上的肿瘤重量对X轴上的肽处理作图。
图35描绘如实施例11B中进一步描述的肽和抗体对嵌合小鼠人模型中黑素瘤肿瘤生长的影响。评价的肽包括对照69601(标记为601)和拮抗剂85189(标记为189)。测试的抗体是LM609。将肿瘤体积以mm3计在Y轴上对X轴上的各种处理作图。
图36A和B分别显示与对照肽69601(标记为601)相比、剂量范围为10、50和250μg/注射的拮抗剂85189(标记为189)降低M21L肿瘤体积和湿重的效果，如实施例11C中进一步所述。
图37A和37B显示拮抗剂肽85189(用实线和实心圆标记189)对比对照肽69601(用虚线和空心方块标记601)、以两种不同处理制度在小鼠人类模型中抑制M21L肿瘤体积的效力，如实施例11C中进一步所述。以mm3计的肿瘤体积于Y轴上对X轴上的天数作图。
图38至42图释如在实施例13中进一步描述的有机分子αvβ3拮抗剂的各种化学合成。
图43和44显示各种有机分子对CAM检测中bFGF诱导的血管发生的影响，如实施例14中进一步所述。将分枝点在Y轴上对X轴上的各种化合物作图，在图43中所用的化合物为250ug/ml，在图44中所用的化合物为100ug/ml。发明详述A．定义氨基酸残基在其肽键处化学消化(水解)多肽形成的氨基酸。本文描述的氨基酸残基最好是“L”异构型。但是，可以用“D”异构型的残基置换任何L氨基酸残基，只要该多肽保留所需功能性质。NH2指多肽氨基末端存在的游离氨基。COOH指多肽羧基末端的游离羧基。与标准多肽命名法(描述于J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)并于37CFR§1.822(b)2)采用)保持一致，在以下对应表中显示氨基酸残基的缩写对应表符号 氨基酸单字母三字母Y Tyr 酪氨酸G Gly 甘氨酸F Phe 苯丙氨酸M Met 甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer丝氨酸IIle异亮氨酸LLeu亮氨酸TThr苏氨酸VVal缬氨酸PPro脯氨酸KLys赖氨酸HHis组氨酸QGln谷氨酰胺EGlu谷氨酸ZGlxGlu和/或GlnWTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺BAsxAsn和/或AspCCys半胱氨酸XXaa未知或其它另外，以下具有以下含义BOC 叔丁酯基DCCI 二环己基碳二亚胺DMF 二甲基甲酰胺OMe 甲氧基HOBt 1-羟基苯并三唑应注意本文以分子式提出的所有的氨基酸残基序列的左右定向是常规的氨基末端至羧基末端方向。再者，应注意氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号表明与一或多个氨基酸残基的再一序列的肽键。
多肽通过相邻氨基酸残基的氨基和羧基之间的肽键相互连接的氨基酸残基的线性序列。
肽本文用来指以多肽中的方式相互连接的不超过50个氨基酸残基的线性序列。
环肽指具有包含典型肽中的几个酰胺键的杂原子环的化合物。该环肽可以是“首尾相连”环化线性肽，其中线性肽的n-末端与该线性肽的末端羧酸盐形成酰胺键，或者它可以含有其中该聚合物为homodetic或heterodetic并包含酰胺键和/或其它键(例如二硫桥、硫酯、硫代酰胺、胍基等等键)以闭合该环的环结构。
蛋白以多肽中的方式相互连接的超过50个氨基酸残基的线性序列。
融合蛋白指含有通过典型的肽键可操作地连接(“融合”)的至少两个不同的多肽域的多肽，这两个域对应于自然中未发现融合的肽。
合成肽通过肽键连接的化学产生的氨基酸残基链，不含有天然存在的蛋白和其片段。
B．一般考虑本发明总的涉及血管发生由特异性玻连蛋白受体αvβ3介导以及抑制αvβ3功能抑制血管发生的发现。本发现由于血管发生在种种疾病过程中的作用而是重要的。通过抑制血管发生，可以干预疾病、减轻症状、并在一些病例中治愈疾病。
当新血管生长是与疾病相关的病理学起因或对其病理学起作用时，抑制血管发生将减轻该疾病的有害影响。实例包括类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、炎症疾病、再狭窄等等。当需要新血管生长支持有害组织生长时，抑制血管发生将降低对该组织的血液供应，并由此对降低基于血液供应需要的组织质量起作用。实例包括持续需要新血管形成以使肿瘤生长超过几毫米厚的肿瘤生长、以及建立实体瘤转移瘤。
本发明的方法是有效的，部分是因为该治疗法对血管发生有高度选择，而对其它生物学过程无高度选择。如实施例中所示，仅新脉管生长含有大量的αvβ3，因此该治疗方法不会不利地影响成熟脉管。另外，在正常组织中没有αvβ3广泛分布，而仅在新脉管中选择性地发现，因此确保该治疗法可以选择性地导向新脉管生长。
仅抑制αvβ3即有效地抑制血管发生的发现允许开发具有潜在高度特异性、并因此具有相对低毒性的治疗组合物。因此，虽然本发明公开了使用具有抑制一或多种整联蛋白能力的基于肽的试剂，但人们可以设计选择性更高地抑制αvβ3并因此不具有抑制由αvβ3介导的生物学过程之外的其它生物学过程的副作用的其它试剂。
例如，如本内容所示，可以制备对与αvβ3起免疫反应的高度选择性的单克隆抗体，它们对抑制αvβ3功能具相似选择性。另外，可以设计对抑制αvβ3具选择性的含RGD肽，如本文进一步所述。
在本发明的发现之前，不知道可以通过使用拮抗αvβ3生物学功能的试剂体内来抑制血管发生以及任何依赖血管发生的过程。
C．抑制血管发生的方法本发明提供在组织中抑制血管发生并由此抑制组织中依赖血管发生的事件的方法。一般而言，该方法包括给予该组织包含血管发生抑制量的αvβ3拮抗剂的组合物。
如先前所述，血管发生包括种种涉及组织新血管形成的过程，该过程包括“出芽”、血管发生或脉管变大，所有的血管发生过程都由αvβ3介导并依赖于αvβ3的表达。除了创伤伤口愈合、黄体形成和胚胎发生外，据信大多数血管发生过程与疾病过程相关，因此本治疗法的应用对疾病有选择性且无有害副作用。
有种种据信其中血管发生是重要的疾病，称为生血管性疾病，这类疾病包括但不限于诸如免疫性和非免疫性炎症、慢性关节风湿病和牛皮癣的炎症性疾病、诸如新血管性青光眼、再狭窄、动脉粥样硬化斑和骨质疏松中毛细管增生的与脉管不适当或不合适侵入相关的疾病、和诸如实体瘤、实体瘤转移瘤、血管纤维瘤、晶状体后纤维组织形成、血管瘤、卡波西肉瘤和需要新血管形成以支持肿瘤生长的类似癌等等癌症相关疾病。
因此，抑制疾病组织中血管发生的方法减轻该疾病的症状，并根据疾病可以对治愈该疾病起作用。在一个实施方案中，本发明考虑在组织中抑制血管发生本身。可以通过诸如在实施例中描述的、通过免疫组织化学检测αvβ3免疫阳性的未成熟的和新生脉管结构的种种方法，评价组织中血管发生的程度和由此本发明方法达到的抑制程度。
如本文所述，任何的各种组织或由器官化组织组成的器官都可以支持在疾病状态下的血管发生，它们包括皮肤、肌肉、肠、结缔组织、关节、骨骼等等在有生成血管刺激物时血管可以入侵的组织。
因此，在一个相关实施方案中，欲处理的组织是炎症组织，而欲抑制的血管发生是有炎症组织新血管形成的炎症组织新血管形成。在这一类中，该方法考虑了在诸如患有慢性关节风湿病的关节炎组织中、在免疫性或非免疫性炎症组织中、在牛皮癣组织等等之中抑制血管发生。
在本发明的许多实施方案中，治疗的患者最好是人类患者，尽管应理解本发明的原理表明本发明对所有的哺乳动物有效，所有的哺乳动物都包括于术语“患者”中。在此范围内，将哺乳动物理解为包括其中需要按照本发明的方法治疗疾病的任何哺乳动物物种，特别是农业和家养哺乳动物物种。
在另一相关实施方案中，欲处理的组织是患有诸如糖尿病性视网膜病、黄斑变性、新血管性青光眼的视网膜疾病的患者的视网膜组织，而欲抑制的血管发生是其中有视网膜组织新血管形成的视网膜组织血管发生。
在另一相关实施方案中，欲处理的组织是患有实体瘤、转移瘤、皮肤癌、乳腺癌、血管瘤或血管纤维瘤等等癌症的患者的肿瘤组织，而欲抑制的血管发生是有肿瘤组织新血管形成的肿瘤组织血管发生。可以被本方法治疗的典型的实体瘤组织包括肺、胰脏、乳腺、结肠、喉、卵巢等等组织。在实施例中描述了典型的肿瘤组织血管发生及其抑制。
由于新血管形成在肿瘤生长中的重要作用，抑制肿瘤组织血管发生是本发明的特别推荐实施方案。缺乏肿瘤组织新血管形成时，该肿瘤组织不会得到需要的营养、生长缓慢、停止额外的生长、退化并最终变为坏死，导致杀死该肿瘤。
换言之，本发明提供通过按照本方法抑制肿瘤血管发生而抑制肿瘤新血管形成的方法。类似地，本发明提供通过实践所述血管发生抑制方法而抑制肿瘤生长的方法。
所述方法亦对转移瘤形成特别有效，因为(1)它们的形成需要原发性肿瘤的血管形成，以使转移性癌症细胞可以逸出该原发性肿瘤，和(2)它们在第二位点的建立需要新血管形成以支持该转移瘤的生长。
在相关实施方案中，本发明考虑与其它诸如针对实体瘤和用于控制转移瘤建立的常规化疗的治疗法联合实践该方法。血管发生抑制剂的给予通常在化疗期间或之后进行，尽管最好在化疗制度后在该肿瘤组织通过诱导血管发生以通过对该肿瘤组织提供血液来源和营养以恢复而对该毒性攻击应答时抑制血管发生。另外，最好在切除实体瘤的手术后给予该血管发生抑制方法，做为对抗转移瘤的预防。
在本方法用于抑制肿瘤新血管形成的范围内，所述方法亦可以用于抑制肿瘤组织生长、抑制肿瘤转移瘤形成以及使已建立的肿瘤退化。实施例证实在单次静脉内给予本发明的αvβ3拮抗剂后已建立的肿瘤的退化。
再狭窄是阻碍血管成形术成功的、在经皮经腔冠状血管成形术位点平滑肌细胞(SMC)迁移和增殖的过程。可以将再狭窄过程中的SMC迁移和增殖考虑为由本方法抑制的血管发生过程。因此，本发明亦考虑通过按照本方法于血管成形术之后，在患者中抑制血管发生来抑制再狭窄。为抑制再狭窄，通常将αvβ3拮抗剂于血管成形术程序后给予约2至约28天，更通常在该程序后的约头14天给予。
抑制组织中血管发生的本方法以及因此实践治疗血管发生相关疾病的方法，包括用包含可以抑制αvβ3与其天然配体结合的治疗有效量的αvβ3拮抗剂的组合物，接触其中发生或有风险发生血管发生的组织。因此，该方法包括给予患者治疗有效量的含有本发明的αvβ3拮抗剂的生理上耐受的组合物。
给予该αvβ3拮抗剂的剂量范围取决于该拮抗剂的形式、其效力，如本文进一步描述的，所述剂量范围的量大到足以产生其中血管发生和由血管发生介导的疾病症状被减轻的所需效果。该剂量不应大至引起不良副作用，例如高粘滞性综合症、肺水肿、充血性心力衰竭等等。一般而言，该剂量根据病人年龄、病症、性别和疾病程度变化，并可以由本领域技术人员确定。亦可以由医生在有任何并发症时调整该剂量。
治疗有效量是足以在被处理的组织中产生可测定的血管发生抑制的αvβ3拮抗剂量，即血管发生抑制量。可以如本文所述，通过免疫组织化学或本领域技术人员已知的其它方法原位测定血管发生的抑制。
就αvβ3拮抗剂可以采用αvβ3模拟物、含RGD肽、抗αvβ3单克隆抗体或其片段所及的范围内，应理解其效力和因此“治疗有效”量的表达可以变化。但是，如本检测方法所示，本领域技术人员可以容易地评价本发明的候αvβ5拮抗剂的效力。
可以通过种种方法测定αvβ5拮抗剂的效力，所述方法包括在CAM检测中、在体内兔眼检测中、在体内嵌合小鼠人检测中抑制血管发生，通过测定天然配体与αvβ3结合的抑制等在本文中描述的以及诸如此类的检测。
优选的αvβ3拮抗剂具有在拮抗剂浓度低于0.5微摩尔浓度(nm)、优选地低于0.1um、更优选地低于0.05um时，大体上抑制诸如血纤蛋白原或玻连蛋白的天然配体与αvβ3在溶液中结合的能力。“大体上”指在存在该αvβ3拮抗剂时，观察到通过抑制使血纤蛋白原的结合减少至少50％，本文将50％抑制称为IC50值。
更优选的αvβ3拮抗剂表现出对αvβ3超出其它整联蛋白的选择性。因此，优选的αvβ3拮抗剂大体上抑制血纤蛋白原与αvβ3结合，但大体上不抑制血纤蛋白原与诸如αvβ1、αvβ5或αⅡbβ3的另一整联蛋白的结合。特别优选的是与抑制血纤蛋白原与另一整联蛋白结合时的IC50活性相比，在抑制血纤蛋白原与αvβ3结合时表现出IC50活性低10倍至100倍的αvβ3拮抗剂。在实施例中描述了测定抑制血纤蛋白原与整联蛋白结合的IC50活性的典型检测。
单克隆抗体形式的本发明αvβ3拮抗剂的治疗有效量的通常是这样的量，它使得当以生理上耐受组合物给予时足以达到的血浆浓度为从约0.01微克(μg)/毫升(ml)至约100μg/ml，优选从约1μg/ml至约5μg/ml并通常为约5μg/ml。换言之，剂量可以变化，从约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选从约0.2mg/kg至约200mg/kg，最优选从约0.5mg/kg至约20mg/kg，每天给予一或多剂量，给予一天或几天。
当该拮抗剂采取单克隆抗体的片段形式时，可以根据相对于完整抗体质量的该片段的质量容易地调整该量。推荐的血浆摩尔浓度是从约2微摩尔浓度(μM)至约5毫摩尔浓度(mM)，优选地为约100μM至1mM抗体拮抗剂。
多肽或其它类似大小的小分子αvβ3模拟物形式的本发明αvβ3拮抗剂治疗有效量的通常是这样的多肽量，它使得当以生理上耐受组合物给予时足以达到的血浆浓度为从约0.1微克(μg)/毫升(ml)至约200μg/ml，优选从约1μg/ml至约150μg/ml。基于每摩尔约500克质量的多肽，优选的血浆摩尔浓度是从约2微摩尔浓度(μM)至约5毫摩尔浓度(mM)，优选地为约100μM至1mM多肽拮抗剂。换言之，按照体重的剂量可以变化，从约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选从约0.2mg/kg至约200mg/kg，每天给予一或多剂量，给予一天或几天。
本发明的单克隆抗体或多肽可以通过注射或通过长时间(overtime)逐渐输注非肠道地给予。尽管欲处理的组织可以通常通过系统给予在体内被接触，并因此最常通过静脉内给予治疗组合物治疗，但考虑了有可能该被导向的组织含有靶分子的其它组织和传递方法。因此，本发明的单克隆抗体或多肽可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮给予，亦可以通过蠕动(peristaltic)方法传递。
含有本发明的单克隆抗体或多肽的治疗组合物常规静脉内给予，例如通过注射单位剂量。术语“单位剂量”当与本发明的治疗组合物相关使用时，指适于做为受治疗者单位剂量的物理上独立的单位，每单位含有预定量的计算用以产生目的治疗效果的、与所需稀释剂(即溶媒)或载体连用的活性物质。
在示于实施例中的一个推荐实施方案中，以单剂量静脉内给予该αvβ3拮抗剂。
以与剂量制剂相匹配的方式和治疗有效量给予所述组合物。给予的量和给予的时间取决于欲治疗的受治疗者、受治疗者的系统利用该活性成分的能力、和所需治疗效果的程度。所需给予的活性成分的精确量取决于医生的判断，并对每个人都是特别的。不过，本文公开了系统应用的合适剂量范围并取决于给药途径。给药的适当制度亦可变化，但通常为首次给予后通过后续注射或其它给予以一小时或几个小时的间隔重复给药。另一方面，考虑了足以保持体内治疗法规定的血液浓度范围的连续静脉内输注。
如本实施例所证实的，早至在用拮抗剂初次接触后7天时即发生血管发生抑制和肿瘤退化。优选额外或延长暴露给拮抗剂7天至6周，更优选为14-28天。
在一相关实施方案中，所述实施例证实抑制αvβ3与在具有αvβ3的新血管系统细胞中诱导凋亡之间的关系。因此，本发明亦考虑在组织的新血管系统中抑制凋亡的方法。大体上按照本文所述实践该方法，以在所有组织及其所述病症中抑制血管发生。如本文所述，仅有的值得注意的区别是作用的时间，即凋亡表现很快，通常在接触拮抗剂后48小时起作用，而血管发生抑制和肿瘤退化则表现较慢。该区别在给药时间和所需作用方面影响治疗制度。通常，新血管系统凋亡的给药可以是24小时至约4周，尽管优选48小时至7天。
D．治疗组合物本发明考虑了用于实践本文描述的治疗方法的治疗组合物。本发明的治疗组合物含有生理上耐受的载体以及本文描述的、溶解于或分散于该载体中做为活性成分的αvβ3拮抗剂。在推荐实施方案中，当给予哺乳动物或人类患者用于治疗目的时，该治疗性αvβ3拮抗剂化合物不具免疫原性。
本文使用的术语“药学上可接受的”、“生理上耐受的”以及其语法变化，当其指组合物、载体、稀释剂和试剂时可以互换使用，并代表该物质可以给予哺乳动物，或给予哺乳动物时不会产生不良生理效果，例如恶心、头晕、胃不适等等。
含有溶解于或分散于其中的活性成分的药用组合物的制备是本领域非常清楚的，并且不需要基于配方而受限制。通常这种组合物做为或者液体溶液或者悬浮液的注射剂制备，但是，亦可以制备适于在使用前在液体中的溶液或悬浮液的固体形式。该制剂亦可以乳化。
该活性成分可以与药学上可接受的和与该活性成分相容的赋形剂混合，并且其量适于本文描述的治疗方法使用。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或诸如此类的赋形剂及其组合物。另外，如果需要，该组合物可以含有少量增强该活性成分效力的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等等。
本发明的治疗组合物可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与诸如盐酸或磷酸的无机酸或诸如乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等等的有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成的)。亦可以从例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁的无机碱以及例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因的有机碱等等衍生与游离羧基形成的盐。
当用于制备环状多肽αvβ3拮抗剂时，特别推荐TFA盐和盐酸盐。在实施例中描述了肽的代表性盐。
生理上耐受的载体是本领域众所周知的。典型的液体是除了该活性成分和水之外不含任何物质的无菌水溶液、或含有诸如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或含有这二者的诸如磷酸缓冲盐水的无菌水溶液。而且，水性载体可以含有超过一种缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。
液体组合物亦可以含有除水外的液相和不包含水的液相。这种其它液相的典型是甘油、诸如棉籽油的植物油和水-油乳液。
治疗组合物含有血管发生抑制量的本发明的αvβ3拮抗剂，通常配制为含有占总治疗组合物重量的至少0.1％的拮抗剂。重量百分比是抑制剂与总组合物的重量比。因此，例如，0.1％(重量)是每100克总组合物0.1克抑制剂。
E．整联蛋白αvβ3的拮抗剂αvβ3拮抗剂用于本方法以抑制组织中的血管发生，并可以采取各种形式，该形式包括以使得与天然αvβ3配体的功能性相互作用受到干扰的方式与αvβ3相互作用的化合物。典型的拮抗剂包括衍生自αvβ3上的配体结合位点的αvβ3类似物、模拟参与αvβ3-配体结合相互作用的结构区的或者αvβ3或者αvβ3天然配体的模拟物、具有对应于αvβ3特异性天然配体的功能结合域、特别是对应于αvβ3天然配体的含RGD域序列的多肽和与或者αvβ3或者天然配体免疫反应的抗体，它们均表现出本文定义的拮抗剂活性。
1．多肽在一个实施方案中，本发明考虑了多肽形式的αvβ3拮抗剂。多肽(肽)αvβ3拮抗剂可以在参与αvβ3-配体相互作用的区具有或者αvβ3天然配体或者αvβ3自身的序列特征，并且表现出本文描述的αvβ3拮抗剂活性。优选的αvβ3拮抗剂肽含有该RGD三肽，并在该含RGD区中在序列上对应于天然配体。
优选的含RGD多肽的序列对应于诸如的血纤蛋白原、玻连蛋白、威勒布兰特因子、层粘连蛋白、血小板反应蛋白等等配体的αvβ3天然配体的含RGD区的氨基酸残基序列。这些αvβ3配体的序列是众所周知的。因此，αvβ3拮抗剂肽可以源自任何所述天然配体，尽管优选血纤蛋白原和玻连蛋白。
如先前所述，与其它整联蛋白相比，特别优选的αvβ3拮抗剂肽优先抑制αvβ3与其天然配体的结合。这些αvβ3特异性肽是特别优选的，至少是因为对αvβ3的特异性降低了诸如抑制其它整联蛋白的不良副作用的发生。可以在诸如实施例中描述的ELISA检测的典型结合抑制检测中，容易地鉴别优选的具有对αvβ3选择性的αvβ3拮抗剂肽的身份。
本发明的多肽通常包含不超过约100个氨基酸残基，优选地不超过约60个残基，更优选地不超过约30个残基。肽可以是线性或环状，尽管特别优选的肽是环状。
当该多肽超过100个残基时，如本文所述，通常以融合蛋白或蛋白片段的形式提供。
优选的环状和线性肽及其命名示于实施例的表1。
应理解，主题多肽不需要与αvβ3天然配体的氨基酸残基序列相同，只要它包括必需的序列并且可以在诸如本文描述的那些检测中做为αvβ3拮抗剂起作用。
主题多肽包括其氨基酸残基序列示于本文的多肽的任何类似物、片段或化学衍生物，只要该多肽是αvβ3拮抗剂。因此，对本多肽可以进行各种改变、置换、插入和缺失，只要这种改变对其使用提供某些优点。在此方面，本发明的αvβ3拮抗剂多肽相当于而不是等同于列举的肽的序列，其中制造了一或多个变化并且它保留在本文定义的一或多个检测中做为αvβ3拮抗剂起作用的能力。
因此，多肽可以采用肽衍生物的各种形式的任何形式，包括酰胺、与蛋白的缀合物、环状肽、聚合肽、类似物、片段、化学修饰肽等等衍生物。
术语“类似物”包括其氨基酸残基序列与本文具体所示的序列大体上相同、其中一个或多个残基已被功能类似的残基保守置换的并且展示本文描述的αvβ3拮抗剂活性的任何多肽。保守置换的实例包括诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的一个非极性(疏水性)残基置换另一非极性残基、诸如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、甘氨酸与丝氨酸之间的一个极性(亲水性)残基置换另一个残基、诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸的一个碱性残基置换另一碱性残基、或诸如天冬氨酸或谷氨酸的一个酸性残基置换另一酸性残基。
短语“保守置换”亦包括使用化学衍生的残基置换非衍生的残基，只要这种多肽展示必要的抑制活性。
“化学衍生物”指具有一个或多个通过侧链官能团反应而化学衍生的残基的主题多肽。除了侧链基团衍生外，化学衍生物可以具有一或多个主链修饰，包括诸如N-甲基、N-乙基、N-丙基等等的α-氨基取代和诸如硫酯、硫代酰胺、胍基等等的α-羧基取代。这种衍生分子包括例如其中游离氨基已被衍生形成盐酸胺、对甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁酯基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以被衍生形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可以被衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以被衍生形成N-im-苄基组氨酸(N-im-benzylhistidine)。亦做为化学衍生物包括的是含有一或多个20个标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如4-羟脯氨酸可以置换脯氨酸；5-羟赖氨酸可以置换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以置换组氨酸；高丝氨酸可以置换丝氨酸；和鸟氨酸可以置换赖氨酸。本发明的多肽亦包括相对于本文所示序列的多肽序列具有一或多个残基添加和/或缺失的任何多肽，只要保留必要的活性。
特别优选的衍生物是按照分子式环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal)简写为c(RGDf-NmeV)的环状肽，其中在该肽的缬氨酸上有一个N-甲基取代的α-氨基，并且环化将该肽的伯氨基和羧基末端连接起来。
术语“片段”指具有的氨基酸残基序列短于其氨基酸残基序列示于本文的多肽的任何主题多肽。
当本发明多肽的序列与αvβ3天然配体的序列不同时，通常是因为已进行了一或多个保守或非保守置换，通常不超过30％(数量)，并且优选地不超过氨基酸残基数量的10％被置换。亦可以在多肽的任一端添加额外的残基以提供“接头”，通过“接头”可以将本发明的多肽方便地添加至标记或固体基质或载体上。
在以下描述了可以与本发明的多肽一起使用的标记、固体基质和载体。
氨基酸残基接头一般至少为一个残基，可以为40或更多个残基，更常见为1-10个残基，但不形成αvβ3配体表位。用于连接的典型的氨基酸残基为酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸或诸如此类的。另外，主题多肽除了其它另外具体说明之外，可以由于序列被修饰而与αvβ3配体的天然序列不同，这种修饰通过末端NH2酰化作用例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化、通过例如用氨、甲胺的末端羧基酰胺化等等的末端修饰进行。如众所周知的，末端修饰可以用于降低对蛋白酶消化的易感性，并因此延长该多肽在溶液中、特别是可能存在蛋白酶的生物体液中的半衰期。在此方面，多肽环化亦是有用的末端修饰，并且因为环化形成稳定结构以及本文描述的观察到的这种环状肽生物学活性，多肽环化亦是特别优选。
本发明的任何肽均可以以药学上可接受的盐的形式使用。可以与本发明的肽形成盐的合适的酸包括无机酸，诸如三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、甲磺酸、乙酸、phosphoricacetic acid、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等等。特别优选HCl盐和TFA盐。
可以与本发明的肽形成盐的合适的碱包括诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等等的无机碱；和诸如单、双和三烷基和芳基胺(例如三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺等等)和可选取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺等等)的有机碱。
另外，如实施例中所述，可以制备不包括游离离子盐的本发明的肽，其中存在于氨基酸残基侧链基团(例如，Arg、Asp等等)的带电荷酸或碱基团相互结合并中和形成“内盐”化合物。
可以通过多肽领域技术人员已知的任何技术包括重组DNA技术合成亦称为主题多肽的本发明的肽。因为纯度、抗原特异性、不含不需要的副产物、生产容易等等原因，优选诸如固相Merrifield型合成的合成化学技术。许多可利用技术的优秀的概括可以参考Steward等，“Solid Phase Peptide Synthesis”,W.H.Freeman Co.,San Francisco,1969；Bodanszky等，“Peptide Synthesis”,John Wiley & Sons，第二版，1976；J.Meienhofer,“Hormonal Proteins and Peptides”，第2卷，第46页，AcademicPress(New York),1983；Merrifield,Adv.Enzymol.,32:221-96,1969；Fields等，Int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214,1990；和有关固相肽合成的美国专利4,244,946和有关经典溶液合成的Schroder等，“ThePeptides”，第1卷，Acadmeic Press(New York),1965，它们均通过引用结合到本文中。可用于这种合成的适当的保护基团描述于上述文献中和J.F.W.McOmie,“Protective Groups in Organic Chemistry”,PlenumPress,New York,1973中，该文献通过引用结合到本文中。
一般而言，所考虑的固相合成方法包括向一生长中的肽链顺序添加一或多种氨基酸残基或适当保护的氨基酸残基。正常情况下，第一个氨基酸残基的或者氨基或者羧基由合适的、选择性可除去的保护基团保护。利用一个不同的选择性可除去的保护基团用于含有反应性侧链基团的氨基酸，例如赖氨酸。
使用固相合成做为典型，将受保护的或衍生的氨基酸通过其未保护的羧基或氨基连接至惰性固相支持体。然后选择性地除去该氨基或羧基的保护基团，并在适于与已连接至该固相支持体的残基形成酰胺键的条件下，将具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中的下一个氨基酸混合和反应。然后从该新加入的氨基酸残基除去氨基或羧基的保护基团，然后加入下一个氨基酸(适当保护)并如此继续。所有需要的氨基酸已按正确序列连接后，顺序或同时除去任何存留的末端和侧链基团保护基团(和固相支持体)，以提供最终线的性多肽。
可以例如使如上述制备产生的线性多肽反应，形成其相应的环状肽。Zimmer等，Peptides 1992，第393-394页，ESCOM Science Publishers,B.V.,1993描述了制备环状肽的典型方法。通常，将叔丁酯基保护的肽甲酯溶解于甲醇中，加入氢氧化钠溶液，并将该混合物于20℃(20C)反应，以水解除去该甲酯保护基团。将溶剂蒸发后，用乙酸乙酯从酸化的水性溶剂抽提该叔丁酯基保护的肽。然后于温和酸性条件下，在二氧杂环己烷共溶剂中除去该叔丁酯基保护基团。在存在1-苯并三唑和N-甲基吗啉的存在下，通过将该线性肽的稀释溶液与二环己基碳二亚胺在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合物中反应，将如此得到的具有游离氨基和羧基末端的未保护的线性肽转化成为其相应的环状肽。然后通过层析纯化得到的环状肽。
Gurrath等，Eur.J.Biochem.,210:911-921(1992)描述了环状肽合成的替代方法，在实施例中有描述。
另外，可以以融合蛋白的形式提供该αvβ3拮抗剂。融合蛋白是通过本文描述的重组DNA方法产生的蛋白，其中该主题多肽做为与诸如谷胱甘肽巯基转移酶(GST)或其它众所周知的载体的第二个载体蛋白的融合物表达。优选的融合蛋白包含本文描述的MMP-2多肽。在实施例中描述了MMP-2融合蛋白的制备。
特别推荐用于本方法的肽和衍生肽是c-(GrGDFV)(SEQ ID NO4)、c-(RGDfV)(SEQ ID NO 5)、c-(RADfV)(SEQ ID NO 6)、c-(RGDFv)(SEQ ID NO 7)、c-(RGDf-NMeV)(SEQ ID NO 15)和线性肽YTAECKPQVTRGDVF(SEQ ID NO 8)，其中“c-”表示环状肽，大写字母是L氨基酸的单字母代码，小写字母是D-氨基酸的单字母代码。这些肽的氨基酸残基序列亦分别示于SEQ ID NO 4、5、6、7、15和8。
亦优选源自本文描述的MMP-2的多肽，其具有示于SEQ IDNo:17-28和45的序列。
2．单克隆抗体本发明在一个实施方案中描述了单克隆抗体形式的αvβ3拮抗剂，如本文所述，所述抗体与αvβ3免疫反应并抑制αvβ3与其天然配体结合。本发明亦描述产生所述抗体的细胞系、产生所述细胞系的方法和产生单克隆抗体的方法。
本发明的单克隆抗体包含抗体分子，抗体分子1)与分离的αvβ3免疫反应，和2)抑制血纤蛋白原与αvβ3结合。优选的优先与αvβ3结合的单克隆抗体包括具有由杂交瘤细胞系ATCC HB 9537分泌的mAb LM609的免疫反应特征的单克隆抗体。按照布达佩斯特条约的要求，将杂交瘤细胞系ATCC H3 9537于1987年9月15日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),1301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA。
各种语法形式的术语“抗体或抗体分子”在本文中做为指免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即含有抗体结合位点或互补位的分子)群的集合名词使用。
“抗体结合位点”是由特异性结合抗原的重链和轻链可变区和超可变区组成的抗体分子的结构部分。
用于本发明的典型抗体是完整的免疫球蛋白分子、大体上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有所述互补位的那些部分(包括本领域已知为Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)的那些部分)，这些部分亦称为抗体片段。
在另一推荐实施方案中，本发明考虑包含源自本发明单克隆抗体的Fab片段的截短的免疫球蛋白分子。该缺失Fc受体的Fab片段是可溶性的，并提供在血清半衰期方面的治疗优点和在使用该可溶性Fab片段的模式方面的诊断优点。可溶性Fab片段的制备是免疫学领域一般已知的并可以通过各种方法完成。
例如，通过众所周知的方法，通过分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对大体上完整抗体的蛋白水解反应，制备抗体的Fab和F(ab’)2部分(片段)。参见例如授予Theofilopolous和Dixon的美国专利4,342,566号。Fab’抗体部分亦是众所周知的，并从F(ab’)2部分产生，接着用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，并接着用诸如碘乙酰胺的试剂烷基化产生的蛋白硫醇。优选含有完整免疫球蛋白分子的抗体，并如本文描述的加以使用。
各种语法形式的短语“单克隆抗体”指仅含有一种抗体结合位点、可以与一特定表位免疫反应的抗体分子群。因此单克隆抗体通常展示对与其免疫反应的任何表位的单一结合亲和性。因此单克隆抗体可以含有具有许多抗体结合位点的抗体分子，每个位点对不同表位有免疫特异性，例如双特异性单克隆抗体。
单克隆抗体通常由称为杂交瘤的单细胞克隆产生的抗体组成，该杂交瘤仅分泌(产生)一种抗体分子。通过使抗体产生细胞和骨髓瘤细胞或其它自持细胞系融合，形成该杂交瘤细胞。这种抗体的制备首先由Kohler和Milstein,Nature,256:495-497(1975)描述，该文献的描述通过引用结合到本文中。其它的方法由Zola,Monoclonal Antibodies:AManual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)描述。然后可以筛选如此制备的存在与αvβ3免疫反应的抗体分子并抑制αvβ3与天然配体结合的杂交瘤上清液。
简言之，为形成产生该单克隆抗体组合物的杂交瘤，将骨髓瘤或其它自持细胞系与从用αvβ3源超免疫的哺乳动物脾脏得到的淋巴细胞融合，该αvβ3源例如为分离自M21人黑素瘤细胞的αvβ3，如Cheresh等，J.Biol.Chem.,262:17703-17711(1987)。
用于制备杂交瘤的骨髓瘤细胞系优选来自与所述淋巴细胞相同的物种。通常，129 GlX+品系小鼠是优选的哺乳动物。用于本发明的合适的小鼠骨髓瘤包括次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷-敏感型(HAT)细胞系P3X63-Ag8.653和Sp2/0-Ag14,它可以从美国典型培养物保藏中心，Rockville,MD分别以CRL 1580和CRL 1581的名称得到。
通常用聚乙二醇(PEG)1500将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过对HAT的敏感性选择融合的杂种。如实施例中所述，通过酶联免疫吸附检测(ELISA)鉴别产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
亦可以通过起始包含的营养培养基含有分泌恰当特异性抗体分子的杂交瘤的单克隆杂交瘤培养物，产生本发明的单克隆抗体。在足以使该杂交瘤将抗体分子分泌入培养基的条件下和时间内保持该培养物。然后收集含有抗体的培养基。然后可以通过众所周知的技术进一步分离该抗体分子。
用于制备这些组合物的培养基是本领域众所周知的并且是市售的，包括合成培养基、近交小鼠等等。典型的合成培养基是添加了4.5gm/l葡萄糖、20mM谷氨酰胺和20％胎牛血清的Dulbecco基本必需培养基(DMEM；Dulbecco等,Virol.,8:396,1959)。典型的近交小鼠品系是Balb/c。
产生单克隆抗体、杂交瘤细胞或杂交瘤培养物的其它方法亦是众所周知的。参见，例如，Sastry，等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:5728-5732(1989)和Huse等，Science,246:1275-1281(1989)描述的从免疫所有组成成分分离单克隆抗体的方法。
本发明亦考虑的是杂交瘤细胞和含有产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞的培养物。特别优选的是分泌单克隆抗体mAb LM609的命名为ATCC HB 9537的杂交瘤细胞系，如Cheresh等，J.Biol.Chem.,262:17703-17711(1987)所述制备mAb LM609,在实施例中描述了其制备。
本发明在一个实施方案中考虑了具有mAb LM609的免疫反应特性的单克隆抗体。
不需要过度实验，亦有可能确定单克隆抗体是否具有与本发明单克隆抗体相同(即，相等)的特异性(免疫反应特性)，即通过确定前者是否防止后者与预选择的靶分子结合来确定。如果被测试的单克隆抗体与本发明的单克隆抗体竞争，如在用于检测与处于固相的靶分子结合的标准竞争检测中本发明单克隆抗体的结合下降所示的，则有可能这两个单克隆抗体与同一或紧密相关的表位结合。
确定单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体的特异性的再一方法是，用与其正常反应的靶分子预温育本发明的单克隆抗体，然后加入测试的单克隆抗体，以确定被测试的单克隆抗体是否在其与该靶分子结合的能力方面受抑制。如果被测试的单克隆抗体受抑制，则多半它具有与本发明的单克隆抗体相同或功能相同的表位特异性。
确定单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体的特异性的另一方法是，测定所研究的抗体的CDR区的氨基酸残基序列。在其CDR区具有相同或功能相同氨基酸残基序列的抗体分子具有同样的结合特异性。多肽测序的方法是本领域众所周知的。
由抗体与其免疫反应的表位定义所述抗体的免疫特异性、其靶分子结合能力和抗体对该表位展示的伴随的亲和性。该表位的特异性至少部分由该免疫球蛋白抗体重链可变区的氨基酸残基序列限定，由部分由轻链可变区氨基酸残基序列限定。
使用术语“具有结合特异性”表明，相当的单克隆抗体展示同样或类似的免疫反应(结合)特性，并竞争结合预选择的靶分子。
人化单克隆抗体提供超出鼠单克隆抗体的特别的优点，特别是因为它们可以用于在人类中治疗。具体而言，人抗体不会象“外源”抗原那样快速地从循环中清除，并且不会以外源抗原和外源抗体的同样方式激活免疫系统。制备“人化”抗体的方法是本领域众所周知的，并可以容易地应用于本发明的抗体。
因此，本发明在一个实施方案中，考虑通过移植导入人类免疫系统的组分而大体上不影响该抗体结合抗原能力而人化的本发明的单克隆抗体。
3．αvβ3特异性模拟物本发明证实αvβ3拮抗剂一般可以用于本发明，所述拮抗剂可以包括多肽、抗体和其它命名为“模拟物”、具有干扰αvβ3功能能力的分子。特别优选的是特异性干扰αvβ3功能但不干扰其它整联蛋白功能的拮抗剂。
在此范围内，应理解各种试剂可以适于用于本方法中，只要这些试剂具有必要的生物学活性。这些试剂一般称为模拟物，因为它们具有“模拟”参与该受体与配体功能性相互作用的αvβ3或αvβ3配体上的结合域并因此干扰(即，抑制)正常功能的能力。
αvβ3模拟物是除了抗体或配体源肽之外的表现上述特性的任何分子。它可以是合成肽、肽的类似物或衍生物、诸如有机模拟分子或其它分子的形状象上述结合域的结合口袋的化合物。
优选的本发明模拟物是有机基分子，并因此称为有机模拟物。特别优选的通过做为αvβ3配体模拟物而做为αvβ3拮抗剂起作用的有机模拟物，是描述于实施例10中的化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18。
可以通过本领域已知的药物设计的各种结构分析方法的任一种进行αvβ3模拟物的设计，所述方法包括制作分子模型、二维核磁共振(2-D NMR)分析、X射线晶体学、肽随机筛选、肽类似物或其它化学聚合物或化合物文库等等药物设计方法学。
在本说明书中呈现的广泛结构证据显示αvβ3拮抗剂可以是融合多肽(例如，MMP-2融合蛋白)、小多肽、环状肽、衍生肽、有机模拟分子或单克隆抗体，它们是共享选择性抑制αvβ3功能特性的各种各样不同的化学结构，以所述结构证据的观点来看，可以用于本方法的目标αvβ3拮抗剂的结构不需要如此限制，但包括本文定义的任何αvβ3模拟物。
F．鉴别αvβ3拮抗剂的方法本发明亦描述鉴别按照本方法使用的候选αvβ3拮抗剂的检测方法。在这些检测方法中，评价候选分子的抑制αvβ3与天然配体结合的效力，并进一步评价其抑制组织中血管发生的效力。
第一种检测测定天然配体与αvβ3直接结合的抑制，在实施例中详细描述了一个推荐实施方案。该检测通常通过ELISA测定天然配体结合抑制的程度，所述结合例如为血纤蛋白原与固相中的分离αvβ3结合。
该检测亦可以用于鉴别表现出对αvβ3特异性并且不抑制天然配体结合其它整联蛋白的化合物。通过进行平行ELISA检测进行该特异性检测，其中在独立的检测室中，就结合天然配体的相对能力和候选化合物抑制所述整联蛋白与预选择的配体结合的相对能力同时筛选αvβ3和其它整联蛋白。在实施例中描述了优选的筛选检测方式。
第二种检测测定鸡尿囊绒膜(CAM)中的血管发生，并被称为CAM检测。CAM检测已由其它作者详细描述，并被进一步用于测定肿瘤组织的血管发生和新血管形成。参见Ausprunk等，Am.J.Pathol.,79:597-618(1975)和Ossonski等，Cancer Res.,40:2300-2309(1980)。
CAM检测是广泛认可的体内血管发生的检测模型，因为发生了整个组织的新血管形成，并且实际的鸡胚血管生长进入CAM或生长进入在CAM上生长的组织。
如本文所证实的，CAM检测基于新血管生长的量和程度描绘了新血管形成的抑制。另外，容易地监视移植到CAM上的任何组织的生长，例如肿瘤组织。最后，因为在该检测系统中有内部毒性对照，该检测特别有用。将鸡胚暴露给任何检测试剂，如此，该胚胎的健康是毒性的指示。
测定血管发生的第三个检测是体内兔眼模型并称为兔眼检测。兔眼检测已由其它作者详细描述，并被进一步用于在存在诸如沙利度胺的生血管抑制剂时检测血管发生和新血管形成。参见D’Amato等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:4082-4085(1994)。
兔眼检测是广泛认可的体内血管发生的检测模型，因为以兔血管从角膜边缘向角膜内生长例证的新血管形成过程，可以容易地通过所述眼睛的天然透明角膜观察。另外，可以容易地随时间监视新血管形成的刺激或抑制或新血管形成的退化的程度和量。
最后，将兔暴露给任何检测试剂，因此兔子的健康是该检测试剂的毒性指示。
第四种检测在嵌合小鼠人模型中测定血管发生并被称为嵌合小鼠检测。该检测已由其它作者详细描述，并被本文描述进一步用于测定血管发生、新血管形成和肿瘤组织退化。参见Yan，等，J.Clin.Invest.,91:986-996(1993)。该嵌合小鼠检测是体内血管发生的有用的检测模型，因为移植的皮肤移植物在组织学方面很类似正常人皮肤，并且发生了整个组织的血管发生，其中实际的人血管从该移植的人皮肤向移植的人皮肤表面上的人肿瘤组织内生长。可以通过用人特异性内皮细胞标记物将所述新血管系统进行免疫组织化学染色，证实进入该人移植物的新血管形成的起源。
如本文所证实的，该嵌合小鼠检测基于新血管生长退化的量和程度证实了新血管形成的退化。另外，可以容易地监视对在该移植的皮肤上移植的任何组织例如肿瘤组织的生长的影响。最后，该检测因为在所述检测系统中有内部毒性对照而有用。将该嵌合小鼠暴露给任何检测试剂，因此该小鼠的健康是毒性的指示。
G．生产制品本发明亦考虑了生产制品，该制品是提供本发明的αvβ3拮抗剂的贴有标签的容器。生产制品包含包装材料和包含于该包装材料内的药物。
在生产制品中的药物是本发明的任一αvβ3拮抗剂，其按照本公开的说明如本文所述配制成药学上可接受的形式。该生产制品含有足以用于治疗本文指明的病症的或者单剂量或者多剂量的药物量。
该包装材料包含表明其中含有的药物用途的标签，例如，用于由抑制血管发生协助治疗病症或本文公开的其它病症。该标签可以再包括用法和市场销售必需的相关信息。该包装材料可以包括储存该药物的容器。
本文使用的术语包装材料指诸如玻璃、塑料、纸、铝箔等等可以在固定工具内保持药物的材料。因此，例如，该包装材料可以是塑料或玻璃西林瓶、层压封袋等等用于包含包括该药物的药用组合物的容器。
在推荐实施方案中，该包装材料包括是明确表达的标签，其描述了该生产制品的内容和其包含的药物的用途。
实施例与本发明相关的以下实施例是描述性的，不应视为具体限制本发明。另外，认为在本领域技术人员技术范围内的现在已知的或后来开发的本发明的这类变化属于本发明权利要求书的范围。1．制备合成肽a．合成程序使用例如Merrifield,Adv.Enzymol.,32:221-96(1969)和Fields,G.B.和Noble,R.L.,Int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214(1990)描述的标准固相合成技术合成列于表1的线性和环状多肽。
将2克(g)BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe(SEQ ID NO 1)首先溶解于60毫升(ml)的甲醇中，向其中加入1.5ml 2N氢氧化钠溶液以形成混合物。然后将该混合物于20℃(20C)搅拌3小时。蒸发后，将残留物于水中吸收并用稀盐酸酸化至pH3，用乙酸乙酯抽提。将抽提物在Na2SO4上干燥，再蒸发并将产生的BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(SEQ ID NO 2)与20ml二-氧杂环己烷中的2 N HCl于20C搅拌2小时。将产生的混合物蒸发以得到H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(SEQ ID NO 3)，后者接着被溶解于1800ml二氯甲烷和200ml二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中，并接着被冷却至0C。其后，边搅拌边顺序加入0.5g二环己基碳二亚胺(DCCI)、0.3g1-羟基苯并三唑(HOBt)和0.23ml N-甲基吗啉。
将产生的混合物于0C再搅拌24小时，然后于20C再搅拌48小时。浓缩该溶液并用混合床离子交换器处理以除去盐。将产生的树脂通过过滤除去后，蒸发澄清的溶液，通过层析纯化残留物，导致回收环(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO 4)。类似地得到用单字母代码的氨基酸残基缩写列于表1中并用肽编号命名鉴别的下列肽环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(SEQ ID NO 5)；环(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(SEQID NO 6)；环(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO 9)；环(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(SEQ ID NO 7)；和环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal)(在该缬氨酸残基的酰胺键的α氨基氮被甲基化)(SEQ ID NO 15)。
其序列与肽62184序列相同的命名为66023的肽与肽62184的不同之处，仅在于含有盐酸盐，而不是62184中存在的TFA盐。对于肽6960l和62185以及对于85189和121974同样如此。
b．替代合成程序ⅰ．合成环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal),TFA盐使用固相Merrifield型程序，通过以分步方式顺序将NMeVal、DPhe、Asp(OBut)、Gly和Fmoc-Arg(Mtr)加入4-羟甲基-苯氧基甲基-聚苯乙烯树脂(Wang型树脂)(应用了在Houben-Weyl,1,c.，第15/Ⅱ卷，第1-806页(1974)中描述的惯常的Merrifield型肽合成方法。该聚苯乙烯树脂和氨基酸残基前体可从Aldich、Sigma或Fluka化学公司购得)，合成Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa。完成顺序加入所述氨基酸残基后，使用TFA/二氯甲烷的1∶1混合物从肽链除去该树脂，提供Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH产物。然后用哌啶/DMF的1∶1混合物除去Fmoc基团，提供粗Arg(Mtr)-G1y-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH前体，然后用HPLC以惯常方式纯化该前体。
为了环化，用85ml的二氯甲烷(Aldrich)稀释在15ml DMF(二甲基甲酰胺；Aldrich)中的0.6g Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH(上述合成的)溶液，并加入50mg NaHCO3。在干冰/丙酮混合物中冷却后，加入40μl的叠氮化二苯基磷酰基(Aldrich)。于室温静置16小时后，浓缩该溶液。将浓缩物进行凝胶过滤(Sephadex G10柱，在异丙醇/水8∶2中)，然后以惯常方式通过HPLC纯化。用TFA(三氟乙酸)/H2O(98∶2)处理，产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal)xTFA，然后以惯常方式通过HPLC纯化它；RT=19.5；FAB-MS(M+H):589。
ⅱ．合成“内盐”通过将环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal)xTFA悬浮于水中，接着在真空中蒸发以除去TFA，从上述产生的环状肽除去TFA盐。将形成的环状肽称为“内盐”并命名为环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)。使用术语“内盐”，是因为该环状肽含有两个带相反电荷的残基，它们互相之间内电平衡，形成总的不带电的分子。其中一个带电残基含有酸部分，而另一带电残基含有氨基部分。当该酸部分和该氨基部分互相之间非常接近时，该酸部分可以被该氨基等分脱质子，形成总的带电中性的羧酸盐/铵盐种类。
ⅲ．HCl处理产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xHCl将80mg的环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)溶解于0.01M HCl中5至6次，并在每次溶解操作后冷冻干燥。后续的通过HPLC纯化产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xHCl；FAB-MS(M+H):589。
ⅳ．甲磺酸处理产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xMeSO3H将80mg的环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)溶解于0.01M MeSO3H(甲磺酸)中5至6次，并在每次溶解操作后冷冻干燥。后续的通过HPLC纯化产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xMeSO3H；RT=17.8；FAB-MS(M+H):589。
替代的环化方法包括衍生具有巯基部分的无环肽前体的侧链基团，并当暴露于略高于正常生理pH的条件(pH7.5)时，与该分子内存在的其它巯基在分子内形成二硫键以形成环状肽。另外，无环肽前体的C末端羧酸盐部分可以与该分子内存在的游离巯基部分反应，产生硫酯环化肽。
在使用了所述合成肽的如实施例7中所述的血管发生抑制检测中，HCl中的66203肽在抑制血管发生方面的效力略比TFA中的相同的肽高。
表1肽命名 氨基酸序列 SEQ ID NO62181 环(GrGDFV) 462184(66203*) 环(RGDfV) 562185(69601*) 环(RADfV) 662187 环(RGDFv) 762880 YTAECKPQVTRGDVF862186 环(RaDFV) 962175 环(ARGDfL) 1062179 环(GRGDfL) 1162411 TRQVVCDLGNPM 1262503 GVVRNNEALARLS 1362502 TDVNGDGRHDL141212974(85189*)环(RDGf-NH2Me-V) 15112784 环(RGEf-NH2Me-V) 16huMMP-2(410-631)**17huMMP-2(439-631)**18huMMP-2(439-512)**19huMMP-2(439-546)**20huMMP-2(510-631)**21huMMP-2(543-631)**22chMMP-2(410-637)***23chMMP-2(445-637)***24chMMP-2(445-518)***25chMMP-2(445-552)***26chMMP-2(516-637)***27chMMP-2(549-637)***28*以星号命名的肽是在HCl中制备的，并与同一行命名的肽在序列上相同；没有星号的肽是在TFA中制备的。小写字母表明D-氨基酸；大写字母表明L-氨基酸。**用于合成肽的人MMP-2氨基酸残基序列由示于图22A和22B的对应残基位置标明。(MMP-2指基质金属硫蛋白酶家族的一个成员)。该人MMP-2序列以天然半胱氨酸残基列出，但不以如融合多肽所述的工程化的半胱氨酸残基列出。用非天然半胱氨酸残基于指明残基位置置换该天然氨基酸残基，以增强该合成物以及表达的融合蛋白的溶解性，以确保正确折叠以呈现该结合位点。***用于合成肽的鸡MMP-2氨基酸残基序列由示于图22A和22B的对应残基位置标明。该鸡MMP-2序列以天然半胱氨酸残基列出，而不以如上述融合多肽的工程化的半胱氨酸残基列出。2．单克隆抗体通过用吸附至Sepharose-lentil外源凝集素珠上的分离αvβ3免疫，使用标准杂交瘤方法制备由杂交瘤ATCC HB 9537分泌的单克隆抗体LM609。该αvβ3已从命名为M21的人黑素瘤细胞分离，并如Cheresh等，J.Biol.Chem.,262:17703-17711(1987)所述制备抗体。M21细胞由D.L.Morton博士(加州大学洛杉叽分校，CA)提供，并生长于含有2mM L-谷氨酰胺、50mg/ml硫酸庆大霉素和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中的悬浮培养物中。
已显示单克隆抗体LM609与αvβ3复合物特异性免疫反应，而不与αv亚基、β3亚基或其它整联蛋白免疫反应。3．表征αvβ3表达的组织分布A．与抗整联蛋白受体抗体的免疫荧光在伤口愈合期间，血管的基膜表达几种粘连蛋白，包括威勒布兰特因子、纤连蛋白、血纤蛋白。另外，在培养的平滑肌和内皮细胞表面表达粘连受体的整联蛋白家族的几个成员。参见，Cheresh,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:6471(1987)；Janat等，J.Cell Physiol.,151:588(1992)；和Cheng等，J.Cell Physiol.,139:275(1989)。在这些整联蛋白中有αvβ3、威勒布兰特因子的内皮细胞受体、血纤蛋白原(血纤蛋白)和纤连蛋白，如Cheresh,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:6471(1987)所述。所述整联蛋白起始了导致内皮细胞迁移的钙依赖性信号途径，并因此表现出在血管细胞生物学中起基础作用，如Leavelsey等，J.Cell Biol.,121:163(1993)所述。
为研究血管发生期间αvβ3的表达，从同意的患者得到人伤口肉芽发生组织或邻近的正常皮肤，用1ml磷酸缓冲盐水清洗并包埋于O.T.C.介质(Tissue Tek)中。将包埋的组织在液氮中快速冷冻约30-45秒。在恒冷箱切片机上从所述冷冻组织块上切下6微米厚切片，以进行后续的使用对或者整联蛋白的β3整联蛋白(αvβ3或αⅡbβ3)或者β1亚家族特异性的抗体的免疫过氧化物酶染色。
正常人皮肤和伤口肉芽发生组织的染色结果示于图1A-1D。将分别针对β3和β1整联蛋白的单克隆抗体AP3和LM534用于冷冻切片的免疫组织化学分析。使用四个不同人供体的组织的实验产生相同的结果。以300X的放大倍数显示该显微照片。
αvβ3整联蛋白在肉芽发生组织的血管中大量地表达(图1B)，但在同一供体的正常皮肤的真皮和表皮中检测不到(图1A)。与之相反，β1整联蛋白在正常皮肤(图1C)和肉芽发生组织(图1D)的血管和基质细胞中均大量表达，并且如Adams等，Cell,63:425(1991)所述先前显示的，在表皮内的基底细胞中大量表达。
B．与抗配体抗体的免疫荧光亦分别检测了如上述制备的人正常皮肤和肉芽发生组织的其它切片中β3和β1整联蛋白、威勒布兰特因子和层粘连蛋白的配体的存在。威勒布兰特因子定位于正常皮肤(图2A)和肉芽发生组织(图2B)的血管，而层粘连蛋白定位于所有的血管以及这两种组织制备物中的表皮基底膜(图2C和2D)。
C．抗αvβ3抗体在癌症组织上的分布除上述分析之外，亦检查了人类患者癌症组织活检的αvβ3的存在和分布。如实施例1A中所述制备组织，只是用在实施例2中制备的对整联蛋白受体复合物αvβ3特异性的单克隆抗体LM609染色组织。另外，也通过在Bulins固定液中固定肿瘤的代表性样本8小时，并连续切片和H&E染色，制备用于显微组织分析的肿瘤。
膀胱、结肠、乳腺和肺癌组织的免疫过氧化物酶染色的结果分别示于图3A-3D。αvβ3仅在分析的这四种癌症活检中存在的血管上大量表达，而不在所述组织中存在的任何其它细胞中大量表达。
本文描述的结果因此显示αvβ3整联蛋白受体在特定组织类型中选择性地表达，所述特定组织类型为肉芽发生组织、转移瘤组织和其它发生血管发生的组织，而不是新血管形成已经停止的正常组织。这些组织因此提供了本发明的治疗方面的理想的靶。4．鉴别通过抑制细胞附着和通过配体-受体结合检测检测到的αvβ3特异性合成肽A．抑制细胞附着做为确定本发明拮抗剂的整联蛋白受体特异性的一种方法，如下述进行细胞附着抑制检测。
简言之，如先前Filardo等，J.Cell Biol.,130:441-450(1995)所述，首先用表达β3亚基的质粒转染缺乏αvβ3和αvβ5表达的CS-1仓鼠黑素瘤细胞。通过阻断表达αvβ3的CS-1细胞与VN或层粘连蛋白包被的平板结合的能力，确定潜在的αvβ3拮抗剂的特异性。做为典型检测的实例，将孔首先用10ug/ml底物包被过夜。在用PBS中的1％热变性BSA于室温清洗和封闭30分钟后，将浓度范围为0.0001uM至100uM的肽85189(SEQ ID NO 15)独立地与CS-1细胞混合，以50,000细胞/孔的细胞数量加入孔中。于37C温育10-15分钟后，将含有细胞和肽的溶液废弃。在用1％结晶紫染色后，测定附着细胞的数量。通过加入100微升(μl)10％乙酸，洗脱与细胞结合的结晶紫。通过于600nm波长测定洗脱的结晶紫的光密度，对细胞附着定量。
图21显示用αvβ3拮抗剂(此处为肽85189)的典型检测的结果。使用该肽在层粘连蛋白包被的表面上未检测到抑制。与之相反，用肽浓度为10uM或更高时，在VN包被的表面上得到完全的结合抑制，如剂量-反应曲线所示。
用含有MMP-2蛋白的各种区的融合蛋白进行类似的检测。该MMP-2源多肽包括MMP-2C末端区，该区在与αvβ3结合相互作用中活跃并由此可以抑制MMP-2激活和相关活性。这些多肽或者做为其序列源自如实施例1中所述的MMP-2C末端域的合成多肽、或者做为包括如下述制备的所有或部分MMP-2C末端域的融合蛋白制备。提出了用于鸡和人类特定序列的MMP-2C末端分子。
鸡源MMP-2C末端域亦称为与铰链区紧密邻近的血红素结合蛋白域，包含MMP-2的氨基酸残基445-637。以下描述了鸡MMP-2的完整核苷酸序列和编码的氨基酸序列。以下亦描述了人MMP-2核苷酸序列和编码的氨基酸序列。人MMP-2中对应于鸡的445-637区的C末端域开始于氨基酸残基439、并结束于631，因为如图22A和22B中所示该人类序列中缺失6个残基。用于实践本发明方法的人源和鸡源的C末端MMP-2合成肽均列于表1。所述合成肽的氨基酸残基序列与通过重组融合蛋白对应物产生的那些氨基酸残基序列相同，但没有该GST融合组分。如下述制备源自鸡和人类的C末端MMP-2融合蛋白。
MMP-2融合蛋白是一种嵌合多肽，它具有与诸如谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的载体(融合)蛋白融合(通过共价肽键可操作地连接)的MMP-2C末端域序列或其部分。
为扩增鸡和人MMP-2的各种区，根据已知的鸡和人MMP-2分别的cDNA序列设计引物序列。将亦称为明胶酶原的未加工鸡MMP-2的cDNA核苷酸序列的完整的上链与示于第二行的推测氨基酸序列(Aimes等，Biochem.J.,300:729-736,1994)一起示于图22A和22B。该图的第三和第四行分别显示人类(Collier等，J.Biol.Chem.,263:6579-6587(1988))和小鼠MMP-2(Reponen等，J.Biol.Chem.,267:7856-7862(1992))的推测氨基酸序列。相同的残基用点标明，而不同的残基则以其单字母IUPAC字给出。缺失的残基用短横线标明。所述氨基酸残基的编号从该酶原的第一个残基开始，信号肽的残基则以负数给出。如此将核苷酸序列编号。用三个向前的箭头标记推定的翻译起点(ATG)，而用星号标明翻译终止信号(TGA)。鸡酶原和活性酶的氨基末端序列用菱形和单箭头包括。将鸡明胶酶原的核苷酸序列和氨基酸残基序列一起做为SEQ ID NO 29列出，而将编码的氨基酸残基序列独立地做为SEQID NO 30列出。
产生鸡MMP-2扩增区的模板或者是编码全长成熟鸡MMP-2多肽的cDNA(由纽约州立大学Stoney Brook分校的J.P.Quigley博士提供)，或者是通过标准技术从鸡尿囊绒膜组织切除的样本得到的总细胞RNA模板制备的cDNA。对于后者，用MuLV逆转录酶和对3’末端核苷酸特异性的下游引物5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3’(SEQ ID NO 31)得到该cDNA，所述下游引物的5’和3’末端分别互补于发表的鸡MMP-2序列的核苷酸1932-1912。按照GeneAmp RNA PCR试剂盒(PerkinElmer)制造商的说明书进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。亦将该引物工程化改造以含有一个内部EcoRⅠ限制位点。
从上述cDNA模板的二者之一，通过用上述列出的3’引物(SEQ IDNO 31)与以下列出的多种5’引物中的一种配对进行PCR，得到一些鸡MMP-2的C末端区，它们均在羧基末端的位置637具有天然半胱氨酸残基。所述扩增区编码以下MMP-2融合蛋白，其序列对应于如图22A和22B中所示的并亦列于SEQ ID NO 30中的1)203-637；2)274-637；3)292-637；4)410-637；5)445-637的氨基酸残基位置。设计用于扩增编码以上列出的MMP-2融合蛋白的每个核苷酸区的上游或5’引物，以编码在工程化改造的(即PCR导入的)内部BamHⅠ限制位点3’端的多肽起始位点，所述BamHⅠ限制位点允许直接连接入或者pGEX-1λT或者pGEX-3X的表达载体。所述5’引物包括以下序列，其5’和3’末端对应于图22A和22B中所示的鸡MMP-2序列标明的5’和3’核苷酸位置(亦对每个引物标明了氨基酸残基位置的起始位点)1)核苷酸599-619，编码203起始位点，5’ATGGGATCCACTGCAAATTTC3’(SEQ ID NO 32)；2)核苷酸809-830，编码274起始位点，5’GCCGGATCCATGACCAGTGTA3’(SEQ ID NO 33)；3)核苷酸863-883，编码292起始位点，5’GTGGGATCCCTGAAGACTATG3’(SEQ ID NO 34)；4)核苷酸1217-1237，编码410起始，5’AGGGGATCCTTAAGGGGATTC3’(SEQID NO 35)；和5)核苷酸1325-1345，编码445起始位点，5’CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3’(SEQ ID NO 36)。
随后按照制造商关于扩增高保真性PCR系统(BoehringerMannheim)的说明书，对该模板cDNA的标明的区扩增35个循环(退火温度55C)。将产生的PCR产物凝胶纯化，用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性酶消化，并在连接入或者pGEX-1λT或者pGEX-3X载体(Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)之前再次纯化，所述载体在连接反应之前已类似地消化以及脱磷酸。质粒的选择基于扩增产物所需的阅读框架。通过热休克用单独的构建物转化感受态的大肠杆菌菌株BSJ72或者BL21细胞。在对阳性克隆双脱氧测序以确认导入的编码序列的完整性之前，就相应MMP-2融合蛋白编码质粒的加入通过PCR筛选产生的菌落。另外，通过表达适当大小的GST-MMP-2融合蛋白证实质粒加入的确认。
基本上如GST基因融合系统(Pharmacia Biotech)的制造商所述，使用IPTG诱导的对数期培养物进行每种重组GST-MMP-2融合蛋白的纯化。简言之，通过超声处理裂解回收的细菌，并在澄清和在sepharose 4B偶联的谷胱甘肽(Pharmacia Biotech)上固定化该重组蛋白之前用去污剂温育。在充分清洗后，用50mM Tris-HCl,pH8.0中的10mM还原的谷胱甘肽，从该亲和基质独立地洗脱固定化的融合蛋白，并对PBS充分地透析，以在使用之前除去残留的谷胱甘肽。
先前产生鸡MMP-2残基445和637之间的只有一个编码半胱氨酸残基的融合蛋白的尝试，产生不溶性产物。因此，为制备源自该C末端区、不包括存在于先前描述的融合蛋白中的内源末端半胱氨酸残基的其它可溶性MMP-2融合蛋白，将核苷酸序列导入扩增的MMP-2区，以在需要时根据特定融合蛋白编码一个半胱氨酸残基。半胱氨酸残基天然地存在于鸡MMP-2序列的位置446和位置637。在人类序列中，这些位置分别对应于440和631。因此，设计融合蛋白，以在目的鸡MMP-2序列的氨基或羧基末端含有工程化改造的末端半胱氨酸残基，以便按该构建物的需要与另一末端的天然存在的半胱氨酸残基一起提供二硫键。
如此设计寡聚核苷酸引物，以扩增用于表达可溶性MMP-2/GST融合蛋白的鸡MMP-2C末端区。扩增的鸡MMP-2C末端区包括编码氨基酸残基位置445-518、445-552、516-637和549-637的那些区。对于含有残基517的融合蛋白，用半胱氨酸残基置换天然编码的酪氨酸残基，以与位于残基位置446或者637的半胱氨酸之一一起提供二硫键。对于含有残基551的融合蛋白，用半胱氨酸置换天然编码的色氨酸残基，以与位于残基位置446或者637的天然编码的半胱氨酸之一一起提供二硫键。
简言之，使用如上述制备的编码重组GST/MMP-2(410-637)融合蛋白的pGEX-3X质粒构建物，做为按照扩增高保真性PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)的制造商方案的扩增模板，该扩增使用了一组寡聚核苷酸引物，其设计是基于发表的鸡MMP-2序列(亦示于图22A和图22B)。一个上游引物具有核苷酸序列(5’CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3’(SEQ ID NO 37))，该引物被设计于用于插入pGEX-3X GST载体的工程化内部BamHⅠ核酸内切酶限制位点之后的位置445编码鸡MMP-2蛋白起始位点。该引物的5’和3’端分别对应于所述图中的鸡MMP-2序列的位置1325-1345。另一上游引物具有核苷酸序列(5’GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC3’(SEQ ID NO 38))，它设计以于用于插入pGEX-1λT GST载体的工程化内部BamHⅠ限制位点之后的位置516编码鸡MMP-2蛋白起始位点、并于位置517编码半胱氨酸残基。该引物的5’和3’末端分别对应于所述鸡MMP-2序列的位置1537-1562。第三个上游引物具有该核苷酸序列(5’GCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG3’(SEQ ID NO 39))，设计以于用于插入pGEX-1λT GST载体的工程化内部EcoRⅠ核酸内切酶限制位点之后的位置549编码鸡MMP-2蛋白起始位点、并于位置551编码半胱氨酸残基。该引物的5’和3’末端分别对应于所述鸡MMP-2序列的位置1639-1665。
将这些上游引物单独地与下列下游引物之一一起使用，以产生源自鸡MMP-2C末端域的上述区。第一个下游引物(反义)具有核苷酸序列(5’GTAGAATTCCAGCACTCATTTCCTGC3’(SEQ ID NO 40))，设计以在位置518编码鸡MMP-2蛋白终止位点、在位置517编码半胱氨酸残基、并含有用于插入GST载体的一个内部EcoRⅠ核酸内切酶限制位点。以5’-3’方向书写的该引物的5’和3’末端分别与所述鸡MMP-2序列的位置1562-1537部分互补。第二个下游引物具有核苷酸序列(5’TCTGAATTCTGCCACAGTTGAAGG3’(SEQ ID NO 41))，设计以在位置552编码鸡MMP-2蛋白终止位点、在位置551编码半胱氨酸残基、并含有用于插入GST载体的一个内部EcoRⅠ核酸内切酶限制位点。以5’-3’方向书写的该引物的5’和3’末端分别与所述鸡MMP-2序列的位置1666-1643部分互补。第三个下游引物具有核苷酸序列(5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3’(SEQ ID NO 42))，设计以在位置637编码鸡MMP-2蛋白终止位点并含有用于插入GST载体的一个内部EcoRⅠ核酸内切酶限制位点。以5’-3’方向书写的该引物的5’和3’末端分别与所述鸡MMP-2序列的位置1932-1912部分互补。
以特定组合使用以产生含有至少一个上述工程化半胱氨酸残基的上述上游和下游引物定界的鸡MMP-2羧基末端区，按照扩增高保真性PCR系统(Boehringer Mannheim)的制造商说明书，独立地用55C的退火温度扩增30个循环。将产生的扩增产物独立地纯化，根据需要用BamHⅠ和或用EcoRⅠ限制性酶消化，并在连接入适当的GST融合蛋白载体(或者pGEX-3X或者pGEX-1λT，如由所述上游寡聚核苷酸引物的阅读框架所表明)之前再次纯化。为连接所述扩增的MMP-2产物，在连接反应之前将所述载体类似地消化和脱磷酸。然后用产生的含有MMP-2的载体构建物通过热休克独立地转化感受态大肠杆菌菌株BL21细胞。在对阳性克隆双脱氧测序以确认导入的编码序列的完整性之前，通过PCR和适当大小的GST-融合蛋白的产生，就适当大小的融合蛋白编码质粒的加入筛选产生的菌落。基本上如上述产生其它GST-MMP-2融合蛋白那样，使用IPTG诱导的对数期培养物进行重组GST融合蛋白的纯化。
使用各种鸡MMP-2蛋白以及其它肽的细胞粘连抑制检测的结果表明，完整的MMP-2、源自残基445-637的融合蛋白CTMMP-2(2-4)和肽66203(SEQ ID NO 5)而不是MMP-2(1-445)以及对照肽69601，抑制表达β3的CS-1细胞粘连至玻连蛋白，而不是层粘连蛋白，并由此通过干扰正常αvβ3结合活性而抑制玻连蛋白受体(αvβ3)结合至玻连蛋白。与2-4相比，其它测试的源自残基274-637的CTMMP-2融合蛋白7-1、源自残基292-637的10-1和源自残基274-400的4-3对细胞粘连的影响较小。
除上述鸡MMP-2 GST融合蛋白之外，制备两个人MMP-2 GST融合蛋白，以表达成熟人MMP-2酶原多肽的氨基酸区203-631和439-631。所述标明的区分别对应于鸡MMP-2区203-637和445-637。如上述对鸡MMP-2-GST融合蛋白那样，使用由国立癌症研究院，Bethesda,MD的W.G.Stetler-Stevenson博士提供的编码完整人MMP-2开放读框的cDNA模板，通过PCR产生人MMP-2-GST融合蛋白。基于先前发表的人MMP-2序列(Collier等，J.Biol.Chem.,263:6579-6587(1988))设计上游5’引物序列，以编码导入的一个内部EcoRⅠ限制位点，以将所述扩增的产物插入适当的表达载体。
一个上游引物具有核苷酸序列(5’GATGAATTCTACTGCAAGTT3’(SEQ ID NO 43))，设计以于用于插入pGEX-1λT GST载体的工程化内部EcoRⅠ内切酶限制位点之后的位置203编码人MMP-2蛋白起始位点。该引物的5’和3’末端分别对应于所述人MMP-2开放阅读框架序列的位置685-704。另一个上游引物具有核苷酸序列(5’CACTGAATTCATCTGCAAACA3’(SEQ ID NO 44))，设计以于用于插入pGEX-1λT GST载体的工程化内部EcoRⅠ限制位点之后的位置439编码人MMP-2蛋白起始位点。该引物的5’和3’末端分别对应于所述人MMP-2开放阅读框架序列的位置1392和1412。
将上述引物的每种独立地与下游引物一起使用，所述下游引物具有与结尾远离MMP-2开放阅读框架，并指导氨基酸残基631后的蛋白终止，并且5’和3’末端与其人MMP-2序列的碱基1998和1978分别互补。产生的扩增产物表达含有人MMP-2氨基酸残基203-631(SEQ IDNO 45)和439-631(SEQ ID NO 18)的融合蛋白。
将产生的PCR产物纯化、用EcoRⅠ消化，并在连接反应之前为连接进入类似地消化和脱磷酸的pGEX-1λT质粒再纯化。如上述转化细胞。
如上述制备含有氨基酸残基410-631(SEQ ID NO 17)、439-512(SEQ ID NO 19)、439-546(SEQ ID NO 20)、510-631(SEQ ID NO 21)和543-631(SEQ ID NO 22)的其它人MMP-2融合蛋白以用于本发明的方法。
B．配体-受体结合检测在纯化的配体-受体结合检测中，将实施例1中制备的合成肽与上述MMP-2融合蛋白一起，通过测定其拮抗αvβ3和αⅡbβ3受体结合活性的能力进一步进行筛选。这些结合研究的方法已由Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:10003-10007(1993)、Smith等，J.Biol.Chem.,265:11008-11013(1990)和Pfaff等，J.Biol.Chem.,269:20233-20238(1994)描述，其说明书通过引用结合到本文中。
本文描述了在配体-受体结合检测中鉴别拮抗剂的方法，其中该受体被固定到固相支持体上，并且所述配体和拮抗剂是可溶性的。亦描述了一个配体-受体结合检测，其中该配体被固定到固相支持体上，并且所述受体和拮抗剂是可溶性的。
简言之，以50纳克(ng)/孔的包被浓度将选择的纯化整联蛋白独立地固定于Titertek微量滴定孔中。用于该配体-受体结合检测的受体的纯化是本领域众所周知的，并可以用本领域一般技术人员熟悉的方法容易地得到。于4C温育18小时后，用Tris缓冲盐水中的10毫克/毫升(mg/ml)牛血清白蛋白(BSA)封闭平板上的非特异性结合位点。对于抑制研究，测试各种浓度的从表1选择的肽阻断125Ⅰ-玻连蛋白或125Ⅰ-血纤蛋白原与整联蛋白受体αvβ3和αⅡbβ3结合的能力。尽管这些配体表现出对特定整联蛋白的理想结合，例如玻连蛋白对αvβ3以及血纤蛋白原对αⅡbβ3，但使用肽阻断血纤蛋白原与受体之一结合的结合抑制研究使得可以精确地测定半最大抑制受体与配体结合必需的以微摩尔浓度(μM)计的肽量。使用浓度为1nM的放射性标记的配体，并独立地用未标记合成肽竞争结合。
3小时温育后清洗除去游离的配体，并通过γ计数检测结合的配体。检测使用列于表1的选择的环状肽抑制受体以及放射标记血纤蛋白原与独立地固定化的αvβ3和αⅡbβ3受体结合，所述检测的数据具有高度重复性，数据点之间的误差通常低于11％。以双份数据点的平均+标准差表达以微摩尔计的IC50数据(IC50uM)，如表2中所示。
表2肽编号αvβ3(IC50uM) αⅡbβ3(IC50uM)62181 1.96±0.6214.95±7.8462184 0.05±0.001 0.525±0.1062185 0.885+0.16100+0.00162187 0.05±0.001 0.26+0.05662186 57.45+7.84100+0.00162175 1.05+0.07 0.63+0.1862179 0.395±21 0.055+0.007通过与对αⅡbβ3受体相比需要较低浓度的肽达到半最大抑制所测定，各具有一个D-氨基酸残基的含RGD或RGD衍生环状肽62181、62184、62185和62187表现出优先抑制血纤蛋白原与αvβ3受体的结合。与之相反，其它含RGD或RGD衍生环状肽62186、62175和62179或者在阻断血纤蛋白原与αvβ3结合方面低效，或者与和αvβ3的结合相比，表现出优先抑制血纤蛋白原与αⅡbβ3结合。这些结果与最近Pfaff等，J.Biol.Chem.,269:20233-20238(1994)发表的那些一致，在该文献中所述环状肽RGDFV(其中F表明D-氨基酸残基)特异性地抑制血纤蛋白原与αvβ3整联蛋白结合，而不特异性地抑制其与αⅡbβ3和α5β1结合。使用具有或缺乏RGD基序的线性化肽进行类似的结合抑制检测，所述肽的序列源自αv受体亚基、αⅡb受体亚基或玻连蛋白配体的氨基酸残基序列。在表1中列出了线性肽62880(VN源氨基酸残基35-49)、62411(αv源氨基酸残基676-687)；62503(αv源氨基酸残基655-667)和62502(αⅡb源氨基酸残基296-306)的序列。将这些肽的每一种均用于独立的检测，以抑制或者玻连蛋白(VN)或者血纤蛋白原(FG)与或者αⅡbβ3或者αvβ3的结合。每个实验的单个检测的数据IC50以微摩计(IC50uM)，示于表3中。
表3肽编号 αⅡbβ3IC50(uM) αvβ3IC50(uM)FG VN FG VN628804.2 0.98 ＜0.1 0.562411＞100＞100 ＞100 ＞10062503＞100＞100 ＞100 ＞1006250290 5 ＞100 ＞100通过与αⅡbβ3受体相比，半最大抑制所需的肽浓度较低所测定，使用线性化肽抑制配体结合选定整联蛋白受体的检测结果显示，仅肽62880对抑制或者FG或者VN与αvβ3的半最大结合有效。其它的线性化肽均对阻断配体与αvβ3结合无效，尽管肽62502对阻断VN与αⅡbβ3结合有效。
在如上述进行(除了用ELISA和过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG检测结合或抑制)的其它配体受体结合检测中，范围为5-50ng/孔并以效力顺序列出的配体VN、MMP-2和纤连蛋白显示与固定化αvβ3受体结合，而胶原蛋白不结合。另外，用肽69601(SEQ ID NO 6)和肽66203(SEQ ID NO 5)评价肽抑制或者MMP-2或者VN与固定化αvβ3结合的能力。仅肽66203有效地抑制这两种底物与所述αvβ3受体结合，而对照肽69601对这两种配体未产生影响。
用固相受体结合检测证实了MMP-2与整联蛋白受体结合的特异性，其中显示碘化的MMP-2与固定化于固相上的αvβ3结合，而不与αⅡbβ3结合(结合的300cpm对比结合的约10cpm)。MMP-2源肽或融合蛋白抑制MMP-2与αvβ3特异性结合的能力在一个可比较的检测中得到证实，其结果示于图23。标记为GST-MAID的如上述制备的GST-CTMMP-2(445-637)(亦称为CTMMP-2(2-4))融合蛋白抑制碘化MMP-2与αvβ3结合，而仅GST自身无任何效应，其结合CPM的水平可以与根本未接受任何抑制剂的孔(标记为NT)相比拟。称为CTMMP-2(274-637)、亦称为CTMMP-2(10-1)的MMP-2融合蛋白不能抑制标记的MMP-2与αvβ3结合。
用结合固相检测的结合和抑制证实了受体与MMP-2源拮抗剂相互作用的特异性。在图24中标记为[125I]GST2-4的CTMMP-2(2-4)与αvβ3结合，而不与αⅡbβ3结合；而在图24中标记为[125I]GST10-1的CTMMP-2(10-1)在所述体外固相检测中不与这两种受体结合。另外，未标记GST2-4竞争标记GST2-4的结合。
因此，可以将本文描述的配体-受体检测用于筛选表现出对特定整联蛋白受体(具体地说即αvβ3)具选择性特异性的环状或线性合成肽，做为实践本发明中的玻连蛋白受体(αvβ3)拮抗剂使用。
5．表征未处理的鸡尿囊绒膜(CAM)A．制备CAM在正常胚胎血管发生已导致形成成熟血管之后，可以在鸡尿囊绒膜(CAM)上诱导血管发生。如Leibovich等，Nature,329:630(1987)和Ausprunk等，Am.J.Pathol.,79:597(1975)所述，已显示血管发生对特定细胞因子或肿瘤片段应答而被诱导。从鸡胚制备CAM，以进行后续的如实施例6和7中分别所述的血管发生的诱导和抑制。从McIntyrePoultry(Lakeside,CA)得到10日龄的鸡胚，并于37C以60％湿度温育。使用小手工钻(crafts drill)(Dremel,Division of Emerson Electric Co.,Racine,WI)在蛋的末端直接在气囊上经过壳穿一小孔。在蛋的宽边的预先通过对光检查该蛋确定无胚胎血管的区中钻第二个孔。在第一个孔施以负压，导致CAM(尿囊绒膜)从壳膜扯离，并在CAM上形成一个伪气囊。使用小型砂轮(Dremel)在掉落的CAM上方的蛋壳切出一个1.0厘米(cm)x1.0cm的正方形窗口。该小窗口使得可以直接利用下面的CAM。
然后或者将产生的CAM制备物于胚胎发生6天时使用，此阶段以活跃的新血管形成为标记，不对所述CAM做另外的处理，反映出用于评价对胚胎新血管形成的影响的模型，或将产生的CAM制备物于胚胎发生10天时使用，此时血管发生已消退。因此将后一制备物用于本发明，以诱导对细胞因子处理或肿瘤接触应答的重新开始的血管发生，如实施例6中所述。
B．CAM的组织学为分析鸡胚CAM和/或如实施例8中所述从该鸡胚切除的人类肿瘤的显微结构，如实施例3A中所述准备所述CAM和肿瘤以做冷冻切片。在恒冷箱切片机上从冷冻块上切下6微米(μm)厚的切片做免疫荧光分析。
图4显示未处理的10日龄CAM中无血管区的典型显微照片。由于到胚胎发生的此阶段CAM系统中的血管发生正在减退，因此该系统可以用于本发明刺激从已存在的脉管从邻近区域向此时缺乏任何脉管的CAM区中产生新血管系统。
C．通过免疫荧光检测的CAM中整联蛋白的分布型为观察CAM组织中存在的整联蛋白受体的组织分布，将肿瘤组织和鸡胚CAM组织的6μm冷冻切片在丙酮中固定10秒钟，并用10微克/毫升(μg/ml)的由此做为对照的mAb CSAT或如实施例2中制备的LM609免疫荧光染色，mAb CSAT是如Buck等，J.Cell Biol.,107:2351(1988)所述的对β1整联蛋白亚基特异性的单克隆抗体。初次染色后接着用1∶250稀释的山羊抗小鼠若丹明标记的二级抗体(Tago)染色，以检测初级免疫反应产物。然后用Zeiss免疫荧光化合物显微镜分析所述切片。
所述免疫荧光分析的结果显示，未处理的10日龄鸡胚中存在的成熟血管表达整联蛋白β1亚基(图5A)。与之相反，在示于图5A的一系列组织切片中未揭示与LM609抗体的免疫反应性(图5B)。因此，10日龄未处理鸡胚中的成熟血管没有活跃地表达由所述LM609抗体检测到的整联蛋白αvβ3。如在CAM模型和以下实施例中所示，当血管正在进行正常胚胎发生中的新生长时或由或者细胞因子或者肿瘤诱导时，所述血管表达αvβ3。但是，在活跃的新血管形成之后，一旦所述脉管停止发育，αvβ3的表达即减少至免疫荧光分析不能检测的水平。这种与成熟脉管中缺乏表达相比的、进行血管发生的血管中αvβ3表达的调节，提供了本发明控制和抑制血管发生的独特能力，如以下使用CAM血管发生检测系统的实施例中所示。
在其它分布型中，10日龄CAM模型中金属蛋白酶MMP-2和αvβ3共定位于bFGF诱导后3天进行血管发生的内皮细胞上。MMP-2在缺乏αvβ3受体的血管上仅最低水平表达。另外，MMP-2与αvβ3共定位于体内生血管性M21-L肿瘤相关血管(肿瘤由将M21-L人黑素瘤细胞注射入在SCID小鼠上生长的人皮肤移植物的真皮而产生，如实施例11中所述)，而不共定位于预先存在的非肿瘤相关血管上。在CAM模型中用含有αvβ3的CS-1黑素瘤肿瘤得到了MMP-2与αvβ3选择性相关的类似结果，但用缺乏αvβ3的CS-1细胞未得到类似结果。
6．CAM血管发生检测A．由生长因子诱导的血管发生如实施例5A中所述，已显示血管发生由细胞因子或生长因子诱导。在本文描述的实验中，在实施例5中描述的CAM中的血管发生由如本文所述局部用于CAM血管上的生长因子诱导。
通过将用Hanks平衡盐溶液(HBSS,GIBCO,Grand Island,NY)或含有150纳克/毫升(ng/ml)重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Genzyme,Cambridge,MA)的HBSS饱和的5毫米(mm)X5mm Whatman滤片(Whatman 1号滤纸)置于10日龄鸡胚的CAM无血管的区上，然后将窗口用胶带封闭而诱导血管发生。在其它检测中，125ng/ml bFGF亦有效抑制血管生长。对于使用静脉内注射拮抗剂评价血管发生抑制的检测，首先用成纤维细胞生长培养基中的1-2ug/ml bFGF诱导血管发生。于72小时后通过显微照相监视血管发生。将CAM快速冷冻，然后用丙酮将6μm恒冷切片固定，并如实施例5C中所述用10μg/ml的或者抗β1单克隆抗体CSAT或LM609通过免疫荧光染色。
图5C中的免疫荧光显微照相显示，在鸡CAM上在bFGF诱导的血管发生期间αvβ3表达增强，与图5B中所示的未处理的鸡CAM中缺乏αvβ3表达形成对比。在bFGF处理的CAM上的许多(75％-80％)血管上容易地检测到αvβ3。另外，整联蛋白β1的表达与在未处理CAM中观察到的没有变化，因为在受刺激的血管上也容易地检测到β1。
然后通过所述CAM恒冷切片的激光聚焦影像，定量bFGF诱导的血管发生期间αvβ3和β1整联蛋白的相对表达。然后用Zeiss激光聚焦显微镜分析染色的切片。从随机视野中选择25个用LM609染色和15个用CSAT染色的血管(平均大小为～1200平方毫米，范围为350-3,500mm2)，然后通过激光聚焦影像分析以任意单位测定每单位面积的每个脉管的平均若丹明荧光。将数据表达为任意单位的脉管的平均荧光强度±标准差(SE)。
绘制于图6中的结果显示，通过威尔科克森秩和检验(p＜0.0001)测定，αvβ3染色在用bFGF处理的CAM上显著增强(高四倍)，而β1染色与用bFGF处理没有显著不同。
进一步使用CAM检测以测定另一有效的血管发生诱导物肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对β1和β3整联蛋白表达的影响。发现用或者bFGF或者TNFα浸渍并置于10天胚胎上的CAM上的滤片，促进72小时后的局部血管发生。
结果示于或者未处理(图7A)、用bFGF处理(图7B)或者用TNFα处理(图7C)的CAM的显微照相中。血管在bFGF和TNF-α处理的制备物中是极其明显的，但不存在于未处理的CAM中。因此，局部使用生长因子/细胞因子，导致诱导从邻近区域的成熟脉管血管发生进入原先缺乏血管的区域。鉴于bFGF诱导的血管和αvβ3的同时表达(示于图5C)，TNFα处理导致可比较的活性。
这些发现表明，在人类和鸡中，参与血管发生的血管显示αvβ3的增强表达。与此一致的是，αvβ3在培养内皮细胞上的表达由各种细胞因子体外诱导，如Janat等，J.Cell Physiol,151:588(1992)；Enenstein等，Exp.Cell Res.,203:499(1992)和Swerlick等，J.Invest.Derm.,99:715(1993)所述。
抗体和肽抑制剂对生长因子诱导的血管发生的影响在实施例7A和7B中展示。
B．胚胎血管发生用于评价血管发生抑制剂对胚胎新血管系统自然形成的影响的CAM制备物是先前所述的6天胚胎鸡胚。在发育的此阶段，血管正进行从头生长，并因此为确定αvβ3是否参与胚胎血管发生提供了有用的系统。如上述制备所述CAM系统，除了在胚胎第六天而不是第十天进行该检测。在实施例7C中展示了用本发明的抗体和肽处理对胚胎血管发生的影响。
C．由肿瘤诱导的血管发生为研究αvβ3在肿瘤诱导的血管发生中的作用，将各种αvβ3阴性人类黑素瘤和癌片段用于CAM检测中，如Brooks等，J.Cell Biol.,122:1351(1993)和如本文所述，所述黑素瘤和癌片段从17天鸡胚的CAM预先生长和分离。所述片段在仅存在缓冲液时诱导了广泛的新血管形成。
通过直接将肿瘤片段添附在CAM上，在所述CAM检测系统中诱导血管发生。该鸡胚CAM的制备与上述程序相同。未使用滤纸片，而将50毫克(mg)至55mg重量的αvβ5阴性肿瘤的片段置于CAM上原先没有血管的区中，所述肿瘤是人黑素瘤肿瘤M21-L、人肺癌肿瘤UCLAP-3、人胰腺癌细胞系FG(Cheresh等，Cell 58:945-953,1989)或人喉癌细胞系HEp3的一种。
将M21-L人黑素瘤细胞系、UCLAP-3人肺癌细胞系、FG胰腺癌细胞系或HEp3人喉癌细胞系(均为αvβ3阴性)用于在鸡胚CAM上生长人类实体瘤。首先在总体积为30μl的无菌HBSS中，将8×106M21-L、UCLAP-3和FB或5×105HEp3细胞的单细胞悬浮液加在CAM上。用胶带封闭窗口，并将胚胎温育7天使人类肿瘤损害生长。在7天结束时(此时胚胎为17天)，从所述CAM切除肿瘤，并将周围的CAM组织去除干净。将肿瘤切成50mg至55mg的肿瘤片段，以用于或者血管发生或者肿瘤生长检测。将所述肿瘤片段置于如实施例6A中描述的新的一组10天鸡胚CAM的无血管区中。
然后用实施例3A中描述的mAb LM609对在鸡胚CAM上体内生长的肿瘤进行αvβ3表达染色。未观察到肿瘤细胞的特异性染色，表明缺乏αvβ3表达。
然后如实施例7D和7E中所述，对这些CAM肿瘤制备物进行后续处理，以测定抗体和肽对肿瘤诱导的血管发生的影响。亦如实施例8、9和12中所述处理所述CAM肿瘤制备物，测定抗体和肽对肿瘤退化和生血管性血管和血管细胞凋亡的影响。7．抑制在CAM检测中测定的血管发生A．通过局部应用抑制剂抑制生长因子诱导的血管发生1)用单克隆抗体处理为确定αvβ3是否在血管发生中起活跃的作用，将用bFGF或TNFα饱和的滤片置于CAM上，并接着将单克隆抗体(亦称为mAb)LM609(对αvβ3特异性)、CSAT(对β1特异性)或P3G2或P1F6(均对αvβ5特异性)加入该制备物。
通过用bFGF饱和的滤片在10天鸡胚的CAM上诱导血管发生。然后用含有25mg mAb的50ml HBSS以总体积25μl的无菌HBSS，于0、24和48小时处理滤片。72小时后，收获CAM并将其置于35mm陪替氏培养皿中，并用lml磷酸缓冲盐水清洗一次。然后在Olympus立体显微镜下，以双盲方式由两个观察者分析滤纸的底面和CAM组织。当CAM表现出在直接位于滤片下CAM的血管浸润的减少＞50％时，就认为血管发生抑制是显著的。每种抗体重复实验4次，每种条件有6-7个胚胎。
mAb处理对bFGF诱导的血管发生的影响的结果示于图8A-8B。将缺乏血管的未处理CAM制备物示于图8A，以提供与示于图8B的bFGF血管诱导和示于图8C-8E的mAb对其影响的比较。如图8E中所示，约75％的用mAb LM609处理的这些CAM表现出＞50％的血管发生抑制，并且它们之中的许多看起来缺乏脉管浸润。与之相反，缓冲液对照(图8A)和用mAb CSAT(图8C)和P3G2(图8D)处理的滤片一致地显示广泛的血管生成。
当用TNFα诱导血管发生时，得到相同的结果。为检测这些同样的抗体对预先存在的邻近无脉管区的正常脉管发育的成熟血管的影响，将用mAb饱和的滤片置于未接受局部应用细胞因子的10天胚胎的CAM血管生成的区域。这三种mAb均不影响预先存在的脉管，正如通过在立体显微镜下目视评价的。因此，mAb LM609选择性地仅抑制新血管生长，而不影响邻近区域存在的成熟血管。在如实施例7A2)和7E2)中分别描述的或者局部或者静脉内使用合成肽时，观察到同样的效应。
2)用合成肽处理亦用本发明的合成肽进行CAM检测，以确定环状和线性肽对生长因子诱导的血管发生的影响。如实施例1中所述制备所述肽，并将80ug的肽置于总体积为25ul的无菌HBSS中。立即将该肽溶液用于所述CAM制备物上，然后于24和48小时再次使用。在72小时时解剖出该滤纸和周围的CAM组织并如上述观察。
该检测的结果揭示的与实施例7E2)中所述的示于图9A-9C中的那些结果类似，其中将合成肽静脉内注射入肿瘤诱导的血管。如图9A中所示，使用对照肽62186时，bFGF诱导的血管保持未受干扰。与之相反，当将环状RGD肽62814用于所述滤片时，血管形成被抑制，使得该区域缺乏新血管系统。这种效应看起来与以下实施例7E2)中所述的图9B中所示的类似。另外，亦如示于图9C关于静脉内注射的肽，在其中存在成熟血管且远离所述生长因子饱和的滤纸的区域中，未观察到合成肽局部处理对这些较远的脉管的任何影响。因此所述肽对血管发生的抑制活性限于由生长因子诱导的血管发生的区域，并且不影响邻近的预先存在的成熟脉管，或不会导致对周围组织的任何有害的细胞毒性。
用在实施例1制备的和列于表1的其它合成肽进行了类似的检测。
3)用MMP-2肽片段处理为证实MMP-2肽片段对血管发生的生物学效应，如上述进行CAM检测，除了用HBS中浓度为1.0ug/ml的bFGF饱和10分钟的滤片诱导血管发生。然后将所述滤片置于CAM预先存在的脉管数量减少的区上。然后每天一次总共3天，将如上述制备的C末端CTMMP-2(410-637)融合蛋白或对照GST受体相关融合蛋白(RAP)(30ul HBSS中1.5ug)局部加到该滤片上。在温育期结束时，牺牲胚胎并将所述滤片和下面的CAM组织解剖出，并用立体显微镜分析血管发生。通过计数在该滤片范围内发生的血管分枝点的数量定量血管发生。认为分枝的血管主要对应于新的生血管性出芽血管。
以双盲方式由至少两名独立观察者进行定量。将所述结果表达为生血管指数，其中生血管指数是每个滤片的分枝点(bFGF刺激的)的数量减去分枝点(对照未刺激的)的数量。实验常规是每种条件有6-10个胚胎。
该CAM血管发生检测的结果示于图25A-D、26和27。在图25中，分成四个图的一系列照片图25A-D描绘了存在CTMMP-2融合蛋白(CTMMP-2(410-637))(图25C-D)时抑制和存在对照GST融合蛋白(图25A-B)时不抑制血管发生的比较。图26和27是矩形图，描绘用CTMMP-2即如上述的同一融合蛋白与对照(仅bFGF或GST-RAP融合蛋白)相比较的CAM血管发生检测的血管发生指数。在图27中，显示了使用CTMMP-2(410-637)融合蛋白的两个独立实验(#1和#2)的结果。
这些结果证实，在三个图中表明CTMMP-2融合蛋白或含有MMP-2C末端域的多肽是用于通过抑制αvβ3来抑制bFGF介导的血管发生的有用的组合物。
B．通过静脉内应用抑制剂来抑制生长因子诱导的血管发生1)用单克隆抗体处理亦评价了用静脉内注射入CAM制备物的单克隆抗体对生长因子诱导的血管发生的影响用于本发明。
基本上如实施例7A中所述制备用于静脉内注射的鸡胚CAM，但有一些修改。在对光检查程序中选择显著的血管并在蛋壳上做标记以标明其位置。在蛋壳上钻孔，使CAM掉落，然后将bFGF饱和的滤纸如上述放置于CAM上。用无菌胶带封闭窗口并将胚胎置于培养箱中。24小时后，在蛋壳的侧边直接在先前选择的显著血管之上小心地切出第二个小窗口。小心地除去外部蛋壳使胚胎膜完整。用一小滴使血管容易看见的矿物油(Perkin-Elmer Corp.Norwalk,CT)使壳膜透明。然后，在总体积100ul的无菌PBS中，将纯化无菌mAb或合成肽(后者在以下描述)直接用30号针以200ug IgG/胚胎一次接种入所述血管里。用胶带封闭窗口并使胚胎温育直至72小时。如前述分析所述滤片和周围的CAM组织。
为确定LM609 mAb在如本文和在以下实施例中所示的预先用LM609静脉内接种的CAM组织中或在肿瘤组织中的定位，用HBSS中的2.5％BSA于室温封闭固定的切片1小时，接着用1∶250稀释度的山羊抗小鼠若丹明标记的二级抗体(Tago)染色。然后用Zeiss免疫荧光化合物显微镜分析所述切片。
静脉内抗体处理时bFGF诱导的血管CAM制备物的结果示于图10A-10C。在图10A中，显示了作为bFGF处理的结果的诱导的血管发生。如图10B中所示，当用静脉内暴露给抗αvβ5抗体mAb P3G2未观察到bFGF诱导的血管系统存在的变化。与之相反，用抗αvβ3抗体LM609处理所述bFGF诱导的血管发生CAM制备物，导致完全抑制新脉管生长进入所述滤片区域，如图10C所示。因此，对血管发生的抑制效果产生于通过LM609抗αvβ3特异性抗体抑制αvβ3受体活性。由于阻断αvβ5不抑制新血管系统形成进入所述CAM滤片位点，因此与αvβ3相比，αvβ5对于新脉管的生长不是必需的。
2)用合成肽处理对于其中如先前所述用1-2ug/ml bFGF诱导血管发生的CAM制备物，在bFGF诱导血管发生后18小时将合成肽69601(对照)和66203(SEQID NO 5)独立地静脉内注射入CAM制备物。将所述制备物再保持36-40小时，其后如先前所述测定分枝点的数量。
结果示于图28中，其中肽66203完全抑制bFGF诱导的血管发生，与用对照肽的缺乏抑制形成对比。
在其它检测中，在10ug/胚胎至300ug/胚胎的剂量范围内，评价肽85189(SEQ ID NO 15)在CAM检测中抑制bFGF诱导的血管发生。如前述进行该检测。结果示于图29中，其中最低有效剂量是30ug，而100和300ug几乎完全抑制血管发生。
在进一步的检测中，比较肽85189与肽69601和66203的抗血管发生活性。如上述进行该检测，除了使用50ug的肽。绘制于图30中的结果显示，与bFGF处理(标记为bFGF)和69601处理(标记为601)对照相比，肽66203(标记为203)和85189(标记为189)是bFGF介导的血管发生的有效抑制剂。
在类似的bFGF诱导的CAM检测中，亦评价了肽85189的不同盐制剂的效力。以100ug/胚胎使用所述肽。HCl中(肽85189)和TFA中(肽121974)的同样的肽序列均抑制bFGF诱导的血管发生，用HCl配制的肽的效力略高于在TFA中配制的肽(肽85189对肽121974的分枝点数量是30对60)。标记为“无细胞因子”的未处理CAM的分枝点数约是用bFGF处理所观察到的一半，它们分别为70对190。用对照肽69601处理对抑制血管发生无效(230分枝点)。
将实施例1中制备的其它合成肽独立地静脉内注射入上述CAM制备物中生长因子诱导的血管中。类似地评价所述肽对所述脉管存活的影响。
3)用MMP-2片段处理使用上述程序，亦评价了MMP-2融合蛋白CTMMP-2(2-4)(亦称为CTMMP-2(445-467))和CTMMP-2(10-1)(亦称为CTMMP-2(274-637))的影响。如上述进行该检测，除了将50ug融合蛋白给予bFGF处理的胚胎。于24小时、48小时和72小时评价融合蛋白处理的效果。
在图31A-L中显示了这些选择时间段的结果，其中在无处理、bFGF处理、标记为bFGF+MAID(MAID=MMP-2血管发生抑制域)的bFGF处理后接CTMMP-2(2-4)和标记为bFGF+对照的bFGF处理后接CTMMP-2(10-1)的检测条件下照相评价血管发生。bFGF处理后48和72小时血管发生的显著诱导由仅暴露给CTMMP-2(2-4)几乎完全抑制。使用CTMMP-2(2-4)的抑制程度比使用CTMMP-2(10-1)所观察到的大，后者表现出一些体内抗血管发生活性。
将前述制备的其它MMP-2组合物、完整MMP-2、片段和融合蛋白亦独立地静脉内注射入上述CAM制备物中生长因子诱导的血管中。类似地评价所述肽对所述脉管存活的影响。
C．通过局部使用抑制胚胎血管发生1)用单克隆抗体处理为确定αvβ3是否参与胚胎血管发生，在6天胚胎中检测LM609对CAM上血管的从头生长的影响，此阶段以实施例5A中所述的活跃的新血管形成为标记。如实施例6C中所述准备所述CAM检测，接着将用mAB饱和的滤片在没有细胞因子的情况下置于6日龄胚胎的CAM之上进行局部使用。3天后，解剖CAM并拍照。每个实验包括6个胚胎/组并重复2次。
抗体LM609(图11C)而不是CSAT(图11A)或P3G2(图11B)在这些条件下防止血管生长；这表明αvβ3与用于诱导血管发生的添加的生长因子无关的胚胎新血管形成中起基本作用。
2)用合成肽处理通过或者局部用于所述CAM或者静脉内用于血管，将实施例1中制备的合成肽独立地加入上述制备和如实施例5A2)中所述的胚胎CAM制备物。类似地评价所述肽对所述脉管存活的影响。
D．通过局部使用抑制肿瘤诱导的血管发生1)用单克隆抗体处理除了上述评价抗αvβ3拮抗剂、LM609和各种肽对胚胎血管发生影响的血管发生检测外，亦研究了αvβ3在肿瘤诱导的血管发生中的作用。做为诱导物，使用了预先生长和分离自17天鸡胚CAM的αvβ3阴性人M21-L黑素瘤片段。如在实施例6C中所述制备所述片段。
如实施例7A1中所述，以在25μl HBSS中25μg的浓度将mAb独立地局部应用于所述肿瘤片段，并用胶带封闭窗口。以同样方式于24小时和48小时再次加入mAb。于72小时如实施例7Al)中所述分析所述肿瘤和周围的CAM组织。
如实施例6C中所述，通过将如Felding-Habermann等，J.Clin.Invest.,89:2018(1992)所述的不表达整联蛋白αvβ3的培养M21-L细胞系移植到10日龄鸡胚CAM上初始产生肿瘤。这些αvβ3阴性片段在存在仅缓冲液、或mAb CSAT(抗β1)或P3G2(抗αvβ5)时诱导了广泛的新血管形成。与之相反，mAb LM609(抗αvβ3)取消了大多数脉管浸润进入所述肿瘤块和周围CAM。
为定量所述mAb对肿瘤诱导的血管发生的影响，以双盲方式由两个观察者在立体显微镜下计数进入该CAM病灶平面内的肿瘤的血管。图12中的每个数据条块代表每组中12个CAM的平均脉管数量±SE，所述组代表双份实验。
该定量分析揭示，通过威尔科克森秩和检验测定，与用缓冲液或其它mAb P3G2或CSAT处理的肿瘤相比，用mAb LM609处理的进入肿瘤的脉管数量减少了三倍(p＜0.0001)。M21-L肿瘤不表达αvβ3的事实表明mAb LM609通过直接影响血管而不是所述肿瘤细胞来抑制血管发生。这些结果对应于示于图3A-3D中的癌症组织活检中αvβ3的组织学分布，其中αvβ3的分布局限于肿瘤中的血管而不是肿瘤细胞自身。
2)用合成肽处理将在实施例1中制备的合成肽(包括MMP-2源肽和融合蛋白)局部应用于如上述肿瘤诱导的生血管CAM检测系统。类似地评价所述肽对脉管存活的影响。
E．通过静脉内应用抑制肿瘤诱导的血管发生1)用单克隆抗体处理亦用通过静脉内注射应用的mAb处理实施例7E1)中制备的肿瘤诱导的血管。如实施例7D1)中所述将肿瘤置于CAM上并用胶带封闭窗口，24小时后如前述将200μg纯化的mAb一次静脉内注射入鸡胚血管。然后使该鸡胚温育7天。然后如上述观察血管发生的程度。如实施例8中下述，在此时期后切除肿瘤，并通过其重量分析以确定抗体暴露对肿瘤生长或抑制的影响。
2)用合成肽处理在CAM检测系统中亦评价了肽暴露对肿瘤诱导的血管系统的影响。如上述使用该肿瘤-CAM制备物，除了不静脉内注射mAb，而如将实施例1中所述和实施例7A2)中制备的合成肽独立地静脉内注射入可见的血管。
使用含有HCl盐的环状肽66203和对照肽62186的CAM检测结果示于图9A-9C。在图9A中，用对照肽处理不影响由肿瘤处理诱导的丰富的大血管生长进入CAM起初缺乏血管的区域。与之相反，当将αvβ3拮抗剂环状RGD肽66203用于所述滤片时，血管形成被抑制，使得该区缺乏新血管系统，如图9B中所示。该含RGD肽的抑制效应是特异性并局部化的，正如对位于邻近肿瘤放置位置的血管没有任何有害影响所证实的。因此，在图9C中，当将抑制性肽静脉内注射入所述CAM检测系统时，在CAM邻近但是远离肿瘤位置的区的中的预先存在的成熟脉管中未观察到影响。在此位置预先存在的脉管不受在所述脉管内流动的抑制性肽的影响，尽管从这些预先存在的脉管产生新脉管进入肿瘤实体受到抑制。因此，包括先前在实施例4中的配体-受体检测中显示为αvβ3拮抗剂的66203和62184的合成肽，现已被证实抑制限于进行发育的脉管的血管生成，而不是成熟的预先存在的脉管的血管发生。另外，肽的静脉内输注不会导致对周围区域的任何有害的细胞毒性，正如图9C中的完整血管系统所证实的。
使用在实施例1中制备的和列于表1的其它合成肽与本发明的MMP-2组合物进行类似的检测。
3)用MMP-2片段处理如上述在CAM中制备CS-1肿瘤(β3阴性)。肿瘤生长24小时后，将命名为CTMMP-2(2-4)的如实施例4A中所述制备的MMP-2片段组合物以在100ul PBS中50ug片段静脉内给予。6天后，评价所述肿瘤的质量。与用CTMMP-2(10-1)或用PBS对照处理的对照肿瘤的生长速率相比，用CTMMP-2(2-4)处理的肿瘤的生长速率被降低了约50％。因此，该αvβ3拮抗剂抑制肿瘤生长。8．用αvβ3拮抗剂抑制由CAM检测中测定的肿瘤组织生长如实施例7E1)中所述，除了目测评价抗αvβ3拮抗剂对生长因子或肿瘤诱导的血管发生的影响，亦通过测定暴露后肿瘤质量的任何变化来评价所述拮抗剂的影响。对于该分析，如实施例6C和7D中所述制备肿瘤诱导的血管发生CAM检测系统。在7天温育期结束时，从所述CAM切出产生的肿瘤并去除任何残留的CAM组织，用1ml磷酸缓冲盐水清洗并测定每个肿瘤的湿重。
另外，用于显微组织学分析的肿瘤制备包括在Bulins固定液中固定代表性肿瘤样本8小时，并在石蜡中包埋。进行连续切片并用苏木精和曙红(H&E)染色以做显微分析。Gladson，等，J.Clin.Invest.,88:1924(1991)。于250x用Olympus复式显微镜将切片照相。
A．局部使用得自局部使用对照缓冲液(HBSS)、P3G2(抗αvβ5)或LM609(抗αvβ3)的典型的人黑素瘤肿瘤(M21L)重量的结果列于表4中。评价每种处理的一定数量的胚胎，将计算的每种处理的以毫克(mg)计的平均肿瘤重量与平均值的SE一起示于该表的底部。
表4胚胎编号mAb处理肿瘤重量(mg)1 HBSS 1082 1523 2164 2705 1096 1741 P3G2 1342 1443 4084 1575 1986 1027 1248991LM609 242135317427535668748859mAb处理 平均肿瘤重量(mg)HBSS对照 172±26P3G2 171±36LM609 52±13αvβ3阴性人黑素瘤肿瘤块在CAM检测系统中暴露给LM609引起未处理平均肿瘤重量从172mg+26降低至52mg+13。P3G3抗体对肿瘤质量没有影响。因此通过局部使用αvβ3特异性LM609抗体阻断αvβ3受体，导致肿瘤块退化以及示于先前实施例中的血管发生抑制。得自暴露给P3G2的肿瘤块的测定直径为平均约8毫米至1厘米。与之相反，LM609处理的肿瘤的直径平均为2-3毫米。
这些肿瘤的冷冻切片揭示了暴露给P3G2的肿瘤的完整肿瘤细胞结构，与之相反的是暴露给LM609的肿瘤中缺乏或有组织的细胞结构。因此αvβ3受体活性对于αvβ3阴性肿瘤通过发育表达αvβ3新血管系统维持其实体营养是必需的。用本发明的αvβ3拮抗剂阻断αvβ3，导致抑制血管发生进入肿瘤，最终导致肿瘤质量减小。
B．静脉内使用得自静脉内使用对照缓冲液(PBS，磷酸缓冲盐水)、CSAT(抗β1)或LM609(抗αvβ3)的典型癌瘤(UCLAP-3)的重量结果列于表5中。评价每种处理的一定数量的胚胎，将计算的每种处理的平均肿瘤重量与平均值的SE一起示于该表的底部。
表5胚胎编号 mAb处理 肿瘤重量(mg)1 PBS 1012 803 674 901 CSAT 1512 923 1684 615 701 LM609 162 543 304 205 376 397 12mAb处理 平均肿瘤重量(mg)PBS对照 85±7CSAT108±22LM609 30±6
αvβ3阴性人癌瘤块在CAM检测系统中暴露给LM609，引起未处理的平均肿瘤重量从85mg±7降低至30mg±6。CSAT抗体对肿瘤块的肿量没有显著影响。因此通过静脉内使用αvβ3特异性LM609抗体阻断αvβ3受体，如其对黑素瘤肿瘤块一样导致癌退化以及示于先前实施例中的血管发生抑制。另外，人黑素瘤肿瘤生长被静脉内注射LM609类似地抑制。9．用αvβ3拮抗剂的由CAM检测中测定的肿瘤组织生长退化为进一步评价αvβ3拮抗剂对肿瘤生长和存活的影响，如实施例5A中所述将人黑素瘤和肺癌、胰腺癌和喉癌的片段置于10日龄胚胎的CAM上。
A．静脉内使用1)用单克隆抗体处理a．用LM609(抗αvβ3)和CSAT(抗β1)处理用αvβ3阴性人黑素瘤M21-L、胰腺癌FG、人肺癌UCLAP-3或人喉癌HEp3的癌片段植入CAM24小时后，仅用PBS或单剂量(300ug/100ul)或者mAb LM609(抗αvβ3)或者CSAT(抗β1)静脉内注射入胚胎。使肿瘤再繁殖6天。在该温育期结束时，小心地切出肿瘤并除去周围的CAM组织。由两位独立的研究者进行肿瘤切除，仅移出可以容易地界定的实体瘤块。所述肿瘤界限明确，因此将可以容易地与实体瘤区分的薄半透明膜(CAM)去除而不影响肿瘤块自身。将切出的肿瘤称重并进行形态学和组织学检查。
如图13中所示，确定了7天结束时的肿瘤湿重并与处理前起始肿瘤重量比较。每个条块代表每组5-10个肿瘤的平均值±S.E.。与所有检测的肿瘤中的对照相比，mAb LM609显著地抑制肿瘤生长(p＜0.001)。在所有的情况下，用PBS或CSAT处理的肿瘤的增殖。与之相反，mAb LM609不仅防止这些肿瘤生长，而且在大多数情况下诱导广泛的退化。重要的是，这些肿瘤细胞不表达整联蛋白αvβ3，表明生长的抑制是因为该抗体对新血管系统而不是直接对肿瘤细胞的抗生血管性效力。
b．用LM609(抗αvβ3)和P3G2(抗αvβ5)处理如实施例5A中所述，将人M21-L黑素瘤片段(50mg)植于10日龄胚胎的CAM之上。24小时后，仅用PBS或单剂量(300ug/100ul)或者mAbLM609(抗αvβ3)或者P3G2(抗αvβ5)静脉内注射胚胎。如实施例9A1)中所述使肿瘤繁殖，如本文所述进行形态学和组织学检查。
形态学检查用mAb P3G2(抗αvβ5)或者LM609(抗αvβ3)处理的M21-L肿瘤的代表性样本。P3G2处理的肿瘤大(直径8mm)且很好地形成血管，而那些用mAb LM609处理的肿瘤相当小(直径3mm)且缺乏可检测的血管。
如实施例9A1)a中所述，通过制备组织学切片并用苏木精和曙红染色进一步检测所述肿瘤。如图14(上图板)中所示，用mAb P3G2(抗αvβ5)处理的肿瘤显示许多存活的和活跃分裂的肿瘤细胞，由有丝分裂图象(箭头)以及由肿瘤基质中的多个血管(箭号)所表明。与之相反，在用mAb LM609(抗αvβ3)处理的肿瘤(图14，下图版)中进行检测，存活的肿瘤细胞或血管即使有也很少。这些结果证实整联蛋白αvβ3的拮抗剂抑制肿瘤诱导的血管发生导致各种人类肿瘤体内生长停止和退化。重要的是肿瘤生长7天后检查的胚胎(胚胎17天)在粗略检查时看起来正常，无论它们是否已用αvβ3拮抗剂处理。这些发现表明该整联蛋白的拮抗剂对发育中的胚胎表现出无毒性。
2)用合成肽处理如实施例5A中所述将人M21-L黑素瘤片段(50mg)植于10日龄胚胎的CAM之上。24小时后，胚胎接受单次静脉内注射300ug/100ul或者环状-RADfV(69601)和或者环状RGDfV(66203)。总共72小时后，如实施例9A1)中所述切除肿瘤，进行形态学检查，并用立体显微镜照相。
示于图15-15E中的图版如下图15A，用环-RADfV肽(69601)处理的双份样本；图15B，用环-RGDfV肽(66203)处理的双份样本；图15C，从用环-RGDfV肽(66203)处理的同一胚胎取出的邻近CAM组织，图15D和15E，肽处理的肿瘤的高倍放大(13x)。图15D描绘对照肽(69601)处理的肿瘤的正常血管。图15E描绘环-RGDfV肽(66203)处理的肿瘤的破坏的血管实例(箭号)。
所述结果描述与对照肽69601相比，仅肽66203抑制脉管形成，而且邻近肿瘤的CAM组织中的脉管未受影响。
用做为对照的抗69601的αvβ3反应性肽85189(SEQ ID NO 15)进行其它的肿瘤退化实验。如上述进行所述实验，除了将100ug肽于移植后第18小时静脉内注射入CAM。再48小时后，切除肿瘤并得到湿重。
图32、33和34分别显示静脉内暴露给肽85189后UCLAP-3、M21-L和FgM肿瘤的肿瘤重量的减少，与使用或者PBS或者肽69601缺乏影响形成对比。10．如通过体内兔眼模型检测测定的用αvβ3拮抗剂的肿瘤组织生长退化可以在以眼睛角膜为典型的天然透明结构中观察抗αvβ3拮抗剂对生长因子诱导的血管发生的影响。新血管从具有丰富血液供应的角膜边缘向通常不具有血液供应的角膜中央生长。当将诸如bFGF的血管发生刺激剂用于角膜时即诱导新血管从角膜边缘生长。当将血管发生的拮抗剂用于角膜时，即抑制新血管从角膜边缘生长。因此，通过内皮细胞从角膜边缘向坚韧的堆积胶原蛋白的角膜组织侵入进行血管发生的角膜是容易观察的。因此该兔眼模型检测提供一个体内模型，以在将化合物直接植入眼睛角膜后直接观察血管发生的刺激和抑制。
A．体内兔眼模型检测1)由生长因子诱导的血管发生用生长因子bFGF在该体内兔眼模型检测中诱导血管发生并在以下进行描述。
a．制备含有生长因子和单克隆抗体的海昌(Hydron)丸如D'Amato，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4082-4085(1994)所述，制备含有生长因子和mAb的海昌聚合物九。单个的丸含有650ng生长因子bFGF，后者结合至硫糖铝(Marion Merrel Dow Corporation)以稳定bFGF并确保它缓慢释放入周围组织。另外，制备含有在PBS中的40μg或者mAb LM609(抗αvβ3)或者mAb P1F6(抗αvβ5)的海昌丸。在特殊制造的表面有2.5mm钻孔核心的特氟隆栓内浇铸所述丸。将约12μl的浇铸材料置于每个栓中，并在无菌通风橱中聚合过夜。然后通过紫外辐射将丸灭菌。
b．用单克隆抗体处理每个实验由3只动物组成，其中一只眼睛接受含有bFGF和LM600的丸，另一只眼睛接受包含bFGF和小鼠mAb P1F6(抗αvβ5)的丸。使用成对眼检测以比较LM609(抗αvβ3)与其它mAb和PBS，对照为证实测试的mAb之间的显著性差异提供了严密的测试手段。
所述P1F6 mAb与整联蛋白αvβ5起免疫反应，整联蛋白αvβ5发现于血管内皮细胞表面，但假定不参与血管发生。为确定mAb P1F6是否参与血管发生，制备仅含有该mAb的丸并如下检测以确认该mAb不诱导血管发生。
按照众所周知的方法，使用A蛋白Sepharose CL-4B亲和柱层析从腹水纯化所有测试的mAb。然后将洗脱的免疫球蛋白对PBS透析，并用Detoxi-gel(Pierce Chemicals)处理以去除内毒素。已显示内毒素是有效的生血管的和炎症刺激剂。因此用产色素鲎变形细胞溶解物检测(BioWhittaker)检测单克隆抗体中内毒素的存在，只有那些没有可检测的内毒素的mAb用于兔眼模型检测。
将包含bFGF和LM609(抗αvβ3)或P1F6(抗αvβ5)的海昌丸植入在兔子眼睛中形成的角膜口袋。所述海昌丸亦含有用于在检测期间稳定bFGF的硫糖铝。将单个的海昌丸植入在兔子角膜中基质(mid-stroma)中手术形成的“口袋”中。使用装备有其上装有用于摄影记录单个角膜的照相机的分束器的Wild M691型手术显微镜，在无菌条件下进行外科手术程序。通过用69 Beaver刀片做一个3mm的至一半角膜厚度的切口，在角膜基质中制作一个3mmx5mm的“口袋”。使用虹膜复位器沿周边解剖基质并将该丸植入，使其周边距边缘2mm。
在以后的14天中，bFGF和mAb从该植入丸渗出进入周围组织，由此影响从角膜边缘的血管发生。
每种处理的代表性结果示于图16A-16E。以如下定义的时钟小时术语定量和描述存在的脉管数量。如同时钟被划分成小时一样的方式，将眼睛划分为12个相等的区。“1时钟小时的脉管”指充满了与时钟的1小时相当的眼睛区的血管量。仅接受bFGF的5只兔子表现出鲜红的血管发生，其中新血管从角膜边缘向正常情况下没有血管的角膜中心生长。这些兔子中的1只对所述丸仅有1时钟小时的脉管。同时接受bFGF和mAb LM609的兔子中的2只，直到手术后14天都绝对没有可检测的血管发生。14天时，这些兔子中的1只有3个出血病灶和出芽脉管。接受bFGF和mAb P3G2(抗αvβ5)的兔子中的2只显示广泛的血管形成，其中新血管已从角膜边缘生长进入角膜。这些兔子中的1只对所述丸仅有1-2小时的脉管。
在兔眼模型检测中证实，在接受mAb LM609(抗αvβ3)的兔子中存在生长因子bFGF时，在正常paralimbal脉管上未观察到生血管效应。与之相反，在接受mAb P3G2(抗αvβ5)的兔子中存在生长因子bFGF时，在paralimbal脉管上观察到生血管效应。mAb LM609对角膜血管发生的完全抑制实质上比任何先前报道的抗生血管试剂大。
c．用多肽处理每个实验由8只兔子组成，其中兔子的一只眼睛接受包含100纳克(ng)bFGF的丸，而另一只眼睛接受包含1微克(ug)VEGF的丸。如上述将所述丸插入角膜口袋，所述细胞因子接着就刺激新血管生长进入角膜。肽在1ml PBS中皮下(s.q.)给予，在插入丸的当天的起始剂量为50ug/kg兔，其后每天皮下剂量以20ug/kg给予。7天后，如上述评价角膜。
在vFGF和VEGF刺激的眼睛中，接受对照肽69601的兔子在7天时显示大量角膜血管生长。接受肽85189的兔子显示与对照相比在vFGF刺激的眼睛中角膜血管生长的量小于50％，在VEGF刺激的眼睛中几乎100％抑制。11．通过嵌合小鼠人检测测定的用αvβ3拮抗剂的肿瘤组织生长的体内退化通过用人新生儿包皮替换SCID小鼠皮肤的一部分，制备体内嵌合小鼠人模型(图17)。建立该皮肤移植物后，用癌细胞接种该人类包皮。在可测定的肿瘤建立后，将或者mAb LM609(抗αvβ3)或者PBS注射入小鼠尾静脉。2-3周后，摘除该肿瘤并进行重量和组织学分析。
A．体内嵌合小鼠人检测基本上如Yan等，J.Clin.Invest.,91:986-996(1993)所述，制备该体内嵌合小鼠人模型。简言之，从SCID小鼠(6-8周龄)手术切除2cm2正方面积并用人包皮替换。将该小鼠麻醉，并通过剃须从侧腹区的每边5cm2区除去毛发。通过除去皮肤全厚度直至筋膜，制备两个圆形的2cm2移植床。将源自人新生儿包皮的同样尺寸的全厚度人皮肤移植物置于该创口床并缝合到位。使用缝合至皮肤的急救绷带覆盖该移植物。使用微孔纱布(micropore cloth tape)覆盖该伤口。
使用M21-L人黑素瘤细胞系或MDA 23.1乳腺癌细胞系(ATCCHTB 26；通过组织切片与mAb LM609的免疫反应性鉴定为αvβ3阴性)，以在该SCID小鼠上的人皮肤移植物上形成人类实体瘤。将5×106M21-L或MDA 23.1细胞的单细胞悬浮液皮内注射入该人类皮肤移植物。然后观察该小鼠2-4周，以使可测定的人类肿瘤生长。
B．静脉内使用1)用单克隆抗体处理在可测定的肿瘤生长后，将250μg的或者mAb LM609(抗αvβ3)或者PBS注射入已用M21L肿瘤细胞注射的SCID小鼠的尾静脉，每周2次，注射2-3周。此时期之后，从皮肤切除肿瘤并去除周围组织。评价每种处理的数只小鼠，将计算每种处理的平均肿瘤重量并示于该表的底部。
表6M21肿瘤编号mAb处理肿瘤重量(mg)1 PBS1582 1923 2164 2275 LM609 1956 427 828 489 10011172处理 平均肿瘤重量(mg)PBS 198LM609 113
M21L αvβ3阴性人癌瘤块在小鼠人嵌合检测系统中暴露给LM609(抗αvβ3)，引起由PBS处理的平均肿瘤重量的198mg降低至113mg。
形态学检查用mAb LM609(抗αvβ3)和PBS处理的M21L肿瘤的代表性样本。PBS处理的肿瘤大(直径8-10mm)且很好地血管化，而用mAbLM609(抗αvβ3)处理的那些肿瘤则很小(直径3-4mm)，并缺乏可检测的血管。
在小鼠人嵌合检测系统中使用M21-L黑素瘤肿瘤细胞的其它实验中，与对照合成肽69601(SEQ ID NO 6)对比，将用mAB LM609的应答与用合成肽85189(SEQ ID NO 15)得到的应答相比较。如上述进行检测。示于图35的结果证实，与对照肽的肿瘤体积约360mm3相比，合成肽85189将肿瘤体积降低至小于25mm3。mAb LM609亦显著地将肿瘤体积降低至约60mm3。
在已注射MDA 23.1细胞的皮肤移植物形成的肿瘤是可检测和可测量的。建立的肿瘤的形态学检查揭示，已经发生了从移植的人组织新血管生成到MDA23.1肿瘤细胞中。
因此，通过静脉内使用αvβ3特异性LM609抗体和肽阻断αvβ3受体，以与实施例9和10中分别描述的CAM和兔眼模型系统相同的方式，导致该模型系统中癌的退化。
2)用合成肽处理使用与用于上述单克隆抗体类似的程序，将αvβ3肽拮抗剂静脉内注射入具有可测定M21-L肿瘤的SCID小鼠的尾静脉。在一初步分析中，在10-250μg/ml的浓度范围内，制作注射的肽69601(对照)和85189(测试)的剂量反应曲线。确定处理后切除的肿瘤的平均体积和重量，结果分别示于图36A和36B。与用对照肽处理相比，肽85189在测试浓度范围内有效地抑制M21-L肿瘤生长，最有效剂量为250μg/ml。
为分析肽85189随时间进程的处理效力，在同一SCID肿瘤模型中评价两种处理制度。在一个检测中，在第6天时起始用或者肽85189或者69601处理，第0天时则是将3X106细胞的M21-L肿瘤皮下注射入小鼠皮肤，每隔一天用250μg/ml的肽85189或对照69601腹膜内注射直至29天。同样地进行另一检测，除了在第20天时起始处理。在检测结束时，切除肿瘤并测定以mm3计的平均肿瘤体积。以此值±平均标准差将该数据作图。
分别示于图37A和37B中的这些检测的结果表明，根据特定的处理制度，肽85189而不是69601在抑制起始处理后各天的肿瘤生长。因此，肽85189是血管发生和由此的肿瘤生长的有αvβ3拮抗剂。12．如在CAM检测中测定的在存在整联蛋白αvβ3拮抗剂时，刺激血管细胞进入细胞周期并进行凋亡生血管过程清楚地依赖于诸如bFGF和VEGF的细胞因子刺激血管细胞增殖的能力。Mignatti等，J.Cell.Biochem.,471:201(1991)；Takeshita等，J.Clin.Invest.,93:662(1994)；和Koyama等，J.Cell.Physiol.,158:1(1994)。然而，亦很明显的是，信号事件可以调节这些血管细胞分化为成熟血管。因此，可以想象，正在进行新生长或血管发生的血管细胞的或者生长或者分化相关的信号的干扰，可以导致干扰血管发生。
已显示整联蛋白连接事件参与体外细胞增殖以及凋亡或程序性细胞死亡。Schwatz,Cancer Res.,51:1503(1993)；Meredith等，Mol.Biol.Cell.,4:953(1993)；Frisch等，J.Cell Biol.,124:619(1994)；和Ruoslahti等，Cell,77:477(1994)。仔细地检查αvβ3拮抗剂对血管发生的影响，揭示存在不连续和破坏的肿瘤相关血管。因此，可能血管连续性的丧失可能是因为血管细胞的选择性坏死或凋亡引起的。
为探索这种可能性，在用生长因子bFGF诱导血管发生和用本发明的mAb和环状肽处理后检查CAM。
A．用单克隆抗体处理可以通过各种方法检测凋亡，所述方法包括直接检测从组织分离的DNA，以检测所述DNA的片段、用特异性检测片段化DNA的游离3’OH基的抗体检测完整组织中的3’OH。
1)分析DNA片段如实施例6A中所述，通过将用bFGF饱和的滤片放置于10日龄胚胎CAM上诱导血管发生。用LM609(抗αvβ3)的CAM免疫组织学分析揭示用bFGF起始血管发生后12-24小时在血管上的αvβ3峰值表达。因此，用bFGF刺激24小时后，用100μl PBS或含有300μg或者mAb CSAT(抗β1)或者LM609(抗αvβ3)的PBS静脉内接种胚胎。
用mAb LM609(抗αvβ3)、CSAT(抗β1)或PBS静脉内接种24或48小时后，通过切除直接位于bFGF饱和的滤片下的CAM组织检测DNA片段。用无菌PBS清洗切出的CAM组织三次并仔细地绞碎，再悬浮于0.25％细菌胶原蛋白酶(Worthington Biochemical；Freehold,NJ)，于37C温育90分钟并偶然涡旋搅拌。从如前述的单细胞悬浮液的相同数量的CAM细胞抽提DNA。Bissonette等，Nature,359:552(1992)。简言之，将相等数量的CAM细胞在0.5％(v/v)Triton X-100(Sigma,St.Louis,MO)中的10mM Tris-HCl,pH8.0、10mM EDTA中裂解。将细胞裂解液于16,000xg在4C离心15分钟，以从完整的染色质沉淀中分离可溶性片段化DNA。将片段化DNA清洗、沉淀并在1.2％(wv)琼脂糖凝胶上分析。
从每种处理的相同数量的CAM细胞分离可溶性片段化DNA，在琼脂糖凝胶上电泳分离，并通过用溴化乙锭染色显现。未检测到处理后24小时三个不同处理产生的DNA片段的相对数量的任何差异。但是，用mAb LM609(抗αvβ3)处理后48小时，与用或者mAb CSAT(抗β1)或者仅PBS处理的胚胎相比，观察到DNA片段的显著增加。
2)刺激血管细胞进入细胞周期为实验性检测αvβ3在这些过程中的作用，用碘化丙锭染色用或不用bFGF处理的CAM的细胞，并与mAb LM609(抗αvβ3)免疫反应。
将分离自mAb LM609(抗αvβ3)、CSAT(抗β1)或者PBS处理后24和48小时胚胎的CAM，通过如上述与细菌胶原蛋白酶温育，解离成单细胞悬浮液。然后将单细胞可透过化，并使用Apop Tag原位检测试剂盒按照制造商说明书(Oncor,Gaithersburg,MD)染色。Apop Tag是特异性检测片段化DNA游离3’OH基团的抗体。检测这种游离3’OH基团是检测凋亡细胞的已建立的方法。Gavrieli等，J.Cell Biol.,119:493(1992)。
然后将Apop Tag染色的细胞在PBS中的0.1％(v/v) Triton X-100中清洗，再悬浮于含有PBS中的0.5％(w/v)BSA、0.02％(w/v)叠氮化钠和200ug/ml RNA酶A的FACS缓冲液中。将细胞温育1.5小时，清洗并通过荧光激活细胞分选分析。使用FACScan流式细胞仪测定细胞荧光，并如下述分析数据。
使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson,Mountain View,CA)测定血管荧光。同时测定侧向散射(SSC)和正向前散射(FSC)，用配备FACScan研究软件(Becton Dickinson,Mountain View,CA)的HewletPackard(HP9000)计算机收集所有的数据。用P.C Lysis Ⅰ版软件(BectonDickinson,Mountain View,CA)分析数据。通过使用未加入Apop Tag试剂盒的初级抗体的细胞悬浮液设定阴性对照门控。将相同的门控设置用于所有的细胞群体，导致每个不同的细胞处理分析约8,000个细胞。
将通过FACS分析确定的mAb处理的CAM并用Apop Tag染色的单细胞的百分比示于图18。黑条块代表分析前24小时处理的胚胎细胞。打点的条块代表分析前48小时处理的胚胎细胞。每个条块代表三个重复的平均值±S.E。
如图18所示，与用或者单独的PBS或者CSAT(抗β1)处理的CAM相比，2天前用mAb LM609(抗αvβ3)处理的CAM表现出Apop Tag染色增强3-4倍。
B．用合成肽处理亦用本发明的合成肽进行如实施例6A中所述的用生长因子诱导的血管发生的CAM检测，以确定环状肽对凋亡的影响。如实施例1中所述，制备肽环-RGDfV(66203)和环-RADfV(69601)。以300ug/ml的浓度将肽溶液或PBS注射入CAM制备物。于24和48小时解剖出滤片和周围的CAM组织，并如实施例12A2)中所述用Apop Tag染色，以检测凋亡。
如图18中所示，与用或者单独的PBS或者对照环状肽69601(环-RADfV)处理的CAM相比，2天前用肽69203(环-RGDfV)处理的CAM显示Apop Tag染色增加3-4倍。
C．用单克隆抗体处理对凋亡和细胞周期的影响通过用碘化丙锭染色检测单细胞悬浮液染色体DNA的拷贝数，以确定用单克隆抗体处理对细胞周期的影响，以及通过用Apop Tag染色确定对凋亡的影响。
如实施例12A1)中所述，制备24或48小时前用mAbLM609(抗αvβ3)或CSAT(抗β1)或PBS处理的CAM单细胞悬浮液。
为用Apop Tag染色细胞，用含有PBS中的2.5％(w/v)BSA和0.25％(w/v)叠氮钠的缓冲液清洗细胞悬浮液三次。然后将细胞在PBS中的1％(w/v)多聚甲醛中固定15分钟，接着如上述清洗三次。为防止非特异性结合，将单细胞悬浮液用PBS中的5％(w/v)BSA于4C封闭过夜。然后如前述清洗细胞，用Apop Tag染色，并如实施例12A中所述使用FACScan测定细胞荧光。
将每个实验条件的细胞用PBS中的10ug/ml碘化丙锭(Sigma,St.Louis,MO)染色1小时，用PBS清洗两次，并分析凋亡典型的核特征，包括染色质凝集和断裂。通过形态学分析至少10-15个随机选择的显微镜视野的细胞，估计凋亡细胞的百分比。
在图19中给出了用或者CSAT(抗β1)或者LM609(抗αvβ3)处理的、用Apop Tag和碘化丙锭染色、并通过FACS分析的胚胎CAM单细胞悬浮液的组合结果。Y轴代表Apop Tag染色(凋亡)，X轴代表碘化丙锭染色(DNA含量)。水平线代表Apop Tag染色阴性门控。左和右图版分别表明CSAT和LM609处理的胚胎的CAM细胞。通过分析每种条件约8,000事件进行细胞周期分析，数据示于等高图(contour plot)中。
用DNA染料碘化丙锭染色的单细胞样品揭示，25-30％的LM609(抗αvβ3)处理的CAM细胞在处理后48小时显示核凝集和/或断裂的证据。这些过程是进行凋亡的细胞的特征。这与用CSAT(抗β1)处理的CAM形成对比，其中90-95％的细胞显示正常核染色。
如图19中所示，与用LM609诱导凋亡一致，观察到一个峰中的相当多的细胞含有的DNA拷贝小于1(AO)。先前已表明该峰代表晚期凋亡细胞中的片段化DNA。Telford等，Cytometry,13:137(1992)。另外，这些AO细胞容易用Apop Tag染色，确认了该试剂检测凋亡细胞的能力。然而，除了AO中的细胞染色之外，显著数量的含有多于一个DNA拷贝的细胞亦被Apop Tag染色(图19)。这些结果证实，LM609具有在已经进入细胞周期的血管细胞中促进凋亡的能力。与之相反，源自已进入细胞周期的对照CAM的细胞显示最低的Apop Tag染色，与对照处理的CAM中很少检测到凋亡细胞一致。
在bFGF刺激的CAM中已进入细胞周期(S和G2/M期)的那些细胞中，70％显示LM609(抗αvβ3)阳性染色。将此结果与在非bFGF处理的CAM的循环细胞中观察到的10％LM609染色相比较。这些发现表明bFGF刺激后，大多数携带αvβ3的细胞显示活跃增殖。
综合这些发现，表明静脉内注射mAb LM609或αvβ3拮抗剂促进诱导血管发生后鸡CAM内的凋亡。
亦通过与LM609的免疫反应性组织学检查CAM的αvβ3表达，通过与Apop Tag的免疫反应性检测进行凋亡的细胞。将48小时前用实施例5A中制备的LM609(抗αvβ3)、CSAT(抗β1)或PBS处理的胚胎上切出的CAM切片清洗，包埋于OTC(Baxter)并在液氮中快速冷冻。切6微米CAM组织切片，在丙酮中固定30秒钟并储存于-70C直至使用。制备染色用组织切片，即在70％(v/v)乙醇(ETOH)中快速清洗，接着在PBS中清洗三次。接着，用PBS中的5％(w/v)BSA封闭切片2小时，接着与10ug/ml mAb LM609温育2小时。然后清洗切片并用1∶50稀释度的若丹明缀合山羊抗小鼠IgG(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)温育2小时。最后，清洗所述切片并用Apop Tag如实施例12A2)中所述染色。封固并通过聚焦免疫荧光显微镜分析染色的组织切片。
在图20中，图版A至C代表CSAT(抗β1)处理的胚胎CAM组织，图版D至E代表LM609(抗αvβ3)处理的胚胎CAM组织。图版A和D描绘用Apop Tag染色并通过于D.I.C.影像上重叠的荧光(FITC)显现的组织。图版B和E描绘用LM609(抗αvβ3)染色并通过荧光(若丹明)显现的相同组织。图版C和F代表用Apop Tag和LM609染色的相同组织的重合图象，其中黄色代表共定位。该条带在左和右图版中分别代表15μm和50μm。
如图20(A-C)中所示，静脉内注射CSAT或PBS对照后，用Apop Tag的染色显得最少并随机，表明组织内凋亡水平最低。与之相反，先前用LM609或环状肽203处理的胚胎CAM显示，大多数血管被Apop Tag深度染色，而在周围非血管细胞中则观察到极低的反应性(图20D-F)。另外，当将Apop Tag和LM609均用于染色这些组织时(19C和19F)，仅在用αvβ3拮抗剂处理的胚胎的CAM中观察到这些标记物之间的显著的共定位(图20F)。这些发现证实，体内诱导血管发生之后，整联蛋白αvβ3的抑制剂选择性地促进携带αvβ3血管的凋亡。
虽然血管发生是涉及许多分子和细胞生物学事件的复杂过程，但几个证据提示，血管细胞整联蛋白αvβ3在该过程中起相对晚的作用。首先，免疫组织学分析揭示，血管细胞上αvβ3的表达在用bFGF诱导血管发生后12-24小时达到最大。第二，αvβ3拮抗剂干扰多个激活剂诱导的血管发生，提示该受体参与可能所有的导致血管发生的初级信号事件下游的共同途径。第三，mAbLM609和环状肽处理的CAM在用这些拮抗剂处理后48小时之前，未显示凋亡(由DNA laddering测定)的显著增加。最后，αvβ3拮抗剂促进已被诱导进入细胞周期的血管细胞的凋亡。
本文提供的结果提供了整联蛋白连接事件可以体内调节细胞存活的第一个直接证据。因此假设一旦血管发生开始，单个血管细胞分裂并开始向生血管源移动，其后，αvβ3连接提供一个允许继续细胞存活的信号，其导致分化和成熟血管的形成。然而，如果αvβ3连接被制止，细胞未接受该分子的指令，则细胞自动进入凋亡。该假说亦预测在发生了分化之后，成熟血管不再需要αvβ3信号以存活，并因此抗拒该整联蛋白的拮抗剂。
最后，本文提交的结果提供整联蛋白αvβ3拮抗剂可以提供治疗瘤形成和其它由特征为血管发生的疾病的强大的治疗手段的的证据。首先，αvβ3拮抗剂破坏新形成的血管，而对预先存在的血管系统无影响。第二，这些拮抗剂对鸡胚存活无显著影响，提示它们无毒性。第三，无论生血管刺激物怎样，血管发生都被显著地阻断。最后，系统给予αvβ3拮抗剂引起各种组织学明显的人类肿瘤的显著退化。13．制备有机分子αvβ3拮抗剂有机αvβ3拮抗剂化合物7(96112)、9(99799)、10(96229)、12(112854)、14(96113)、15(79959)、16(81218)、17(87292)和18(87293)的合成在以下描述并亦示于注释的图中。有机拮抗剂亦由括号内的数字代表。然后将先前定义的称为本发明的有机模拟物的产生的有机分子用于实施例11中描述的抑制αvβ3介导的血管发生的方法中。
对于下述的每个合成物，在Perkin-Elmer 241分光光度计UV上测定旋光，并将可见光谱记录在Beckman DU-70光度计上。将1H和13C NMR谱于400和500MHz记录在Bruker AMX-400和AMX-500光度计上。在快速原子轰击(FAB)条件下将高分辨率质谱(HRMS)记录在VG ZAB-ZSE质谱仪上。用70-230目硅胶进行柱层析。在Merck Art.5744(0.5mm)上进行制备性TLC。在Thomas Hoover装置上测定熔点。
A．化合物1如图38中描绘的t-Boc-L-酪氨酸苄酯

于25℃向0.10M(M)二氯甲烷中的N-(叔丁酯基)-L-酪氨酸(t-Boc-L-酪氨酸)溶液(1.0当量；Aldrich)中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.5当量)并搅拌1小时。接着，加入1.5当量苯甲醇，并将该混合物于25℃再搅拌12小时。然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释该反应混合物并用水洗涤二次(2X)、用盐水洗涤一次(1X)并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物。亦可从Sigma购得化合物1,t-Boc-L-酪氨酸苄酯。B．化合物2如图38步骤ⅰ中描绘的(S)-3-(4-(4-溴丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物2将t-Boc-L-酪氨酸苄酯(2克，5.38mmol；如上述合成)、1,4-二溴丁烷(1.9ml,16.2mmol；Aldrich)、碳酸钾(5g)和18-冠醚-6(0.1g；Aldrich)的混合物于80C加热12小时。冷却后，滤掉沉淀并将该反应混合物在真空中蒸发至干燥。然后使用100％己烷通过结晶纯化该粗产物，产生2.5g(92％)的化合物2。
C．化合物3如图38步骤ⅱ中描绘的(S)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物3将化合物2(2.5g,4.9mmol)与叠氮钠(1.6g,25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中于25C搅拌12小时。然后蒸发溶剂并将残留物用水(约10ml)处理，并用乙酸乙酯萃取二次。将有机层合并、借助硫酸镁干燥并蒸发，产生2.0克(90％)无色浆化合物3(FAB-MS:469(M+H+)。D．化合物4如图38步骤ⅲ中描绘的(S)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-氨基-丙酸苄酯

化合物4将化合物3(2.0g(4.4mmol))溶解于三氟乙酸(TFA；2ml)并于室温搅拌3小时。在真空中蒸发产生1.6克(定量的)的无色浆化合物4，它不用进一步纯化即用于下一步。FAB-MS:369(M+M+)。
E．化合物5如图38步骤ⅳ中描绘的(S)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸苄酯

化合物5将化合物4(1.6g；4.3mmol)、丁磺酰氯(0.84ml；6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生1.4克(67％)非晶形固体化合物5。E．化合物6如图38步骤ⅴ中描绘的(S)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物6将化合物5(1.3g(2.6mmol)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)，并在氢气中(1个大气压；Parr Shaker装置)于25C在存在100mg钯(在活性炭上10％)时氢化。3小时后，滤掉该催化剂并将溶剂蒸发，产生油状残留物的化合物6。在从水中冻干后，得到1.0克(定量)的化合物6白色粉末。FAB-MS:373(M+H+)。
G．化合物7如图38步骤ⅵ中描绘的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物7将二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物6(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60C加热12小时。冷却后，在真空中蒸发溶剂，并通过HPLC(Lichrocart RP-18,梯度乙腈/水+0.3％TFA99∶1至1∶99)纯化残留物，冻干后产生50mg(25％)白色非晶形粉末的化合物7。FAB-MS:415(M+H+),m.p.:70C。H．化合物8如图39步骤ⅲ中描绘的(S)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸

化合物8将化合物3(0.5g(1.07mmol)溶解于10ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.1ml三氟乙酸(TFA)，并在氢气中(1个大气压；Parr Shaker装置)于25C在存在30mg钯(在活性炭上10％)时氢化。3小时后，滤掉该催化剂并将溶剂蒸发，产生油状残留物的化合物8。在从水中冻干后，得到370毫克(定量)的白色粉末的化合物8。FAB-MS:353(M+H+)。
I．化合物9如图39步骤ⅳ中描绘的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸

化合物9将二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物8(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60C加热12小时。冷却后，在真空中蒸发溶剂，并通过HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA99∶1至1∶99)纯化残留物，冻干后产生160mg(90％)白色非晶形粉末的化合物9。FAB-MS:395(M+H+)。
J．化合物10如图40步骤ⅰ-ⅵ中描绘的(R)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

使用与合成化合物7相同的反应顺序制备D-酪氨酸类似物10，如下述使用中间体化合物100-600以形成化合物10，得到205mg的白色非晶形物质FAB-MS:415(M+H+)。
1)化合物100如图40中描绘的t-Boc-D-酪氨酸苄酯

化合物100于25C向0.10M(M)二氯甲烷中的N-(叔丁酯基)D-酪氨酸(t-Boc-L-酪氨酸)(1.0当量；Aldrich)溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.5当量)并搅拌1小时。接着，加入1.5当量苯甲醇，并将该混合物于25C再搅拌12小时。然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释该反应混合物，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物。
2)化合物200如图40步骤ⅰ中描绘的(R)-3-(4-(4-溴丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物200将t-Boc-D-酪氨酸苄酯(2克，5.38mmol；如上述合成)、1,4-二溴丁烷(1.9ml,16.2mmol；Aldrich)、碳酸钾(5g)和18-冠醚-6(0.1g；Aldrich)的混合物于80C加热12小时。冷却后，滤掉沉淀并将该反应混合物在真空中蒸发至干燥。然后使用100％己烷通过结晶纯化该粗产物，产生2.5g(92％)的化合物200。
3)化合物300如图40步骤ⅱ中描绘的(R)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物300
将化合物200(2.5g,4.9mmol)与叠氮钠(1.6g,25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中于25C搅拌12小时。然后蒸发溶剂并将残留物用水(约10ml)处理，并用乙酸乙酯萃取二次。将有机层合并、借助硫酸镁干燥并蒸发，产生2.0克(90％)无色浆的化合物300(FAB-MS:469(M+H+)。
4)化合物400如图40步骤ⅲ中描绘的(R)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-氨基-丙酸苄酯

化合物400将化合物300(2.0g(4.4mmol))溶解于三氟乙酸(TFA；2ml)并于室温搅拌3小时。在真空中蒸发产生1.6克(定量的)无色浆的化合物400，它不用进一步纯化即用于下一步。FAB-MS:369(M+H+)。
5)化合物500如图40步骤ⅳ中描绘的(R)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-丁基亚磺酰氨基-丙酸苄酯

化合物500
将化合物400(1.6g；4.3mmol)、丁磺酰氯(0.84ml；6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生1.4克(67％)的非晶形固体的化合物500。
6)化合物600如图40步骤ⅴ中描绘的(R)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物600将化合物500(1.3g(2.6mmol)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)，并在氢气中(1个大气压；Parr Shaker装置)于25℃在存在100mg钯(在活性炭上10％)时氢化。3小时后，滤掉该催化剂并将溶剂蒸发，产生油状残留物的化合物600。在从水中冻干后，得到1.0克(定量)白色粉末的化合物600。FAB-MS:373(M+H+)。
7)化合物10如图40步骤ⅵ中描绘的(R)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸将二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物600(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加热12小时。冷却后，在真空中蒸发溶剂，并通过HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA99∶1至1∶99)纯化残留物，冻干后产生50mg(25％)白色非晶形粉末的化合物10。FAB-MS:415(M+H+),m.p.:70℃。
5)化合物11如图4中描绘的(S)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-(10-樟脑亚磺酰氨基-丙酸苄酯

化合物11将化合物4(1.0g；2.7mmol)、10-樟脑磺酰氯(6.6mmol；AldrichChemical Company)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生1.4克(67％)的非晶形固体的化合物11。
L．化合物12如图41步骤ⅰ-ⅱ中描绘的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-(10-樟脑亚磺酰氨基)-丙酸

化合物12按照以下条件将化合物11氢化和脒基化后得到化合物12
步骤ⅰ将化合物11(1.3g(2.6mmo1)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)，并在氢气中(1个大气压；Parr Shaker装置)于25℃在存在100mg钯(在活性炭上10％)时氢化。3小时后，滤掉该催化剂并将溶剂蒸发，产生油状残留物的中间体胺。从水中冻干后，得到1.0克(定量)的白色粉末的中间体胺，接着如下述处理步骤ⅱ将二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的上述形成的中间体胺化合物(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich Chemical Company)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加热12小时。冷却后，在真空中蒸发溶剂，并通过HPLC(LichrocartRP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA99∶1至1∶99)纯化残留物，冻干后产生50mg(25％)白色非晶形粉末的化合物12。FAB-MS:509.6(M+H+)。
M．化合物13如图41中描绘的(S)-3-(4-(5-溴戊氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物13将t-Boc-L-酪氨酸苄酯(4.5克，12.1mmol；如上述合成的化合物1)、1,5-二溴戊烷(5ml,36.7mmol；Aldrich)、碳酸钾(10g)和18-冠醚-6(0.25g；Aldrich)的混合物于80℃加热12小时。冷却后，滤掉沉淀并将该反应混合物在真空中蒸发至干燥。然后使用100％己烷通过结晶纯化该粗产物，产生5.35g(85％)的化合物13。
N．化合物14如图41步骤ⅰ-ⅴ中描绘的(S)-3-(4-(5-胍基戊氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物14与上述使用中间体化合物1-6形成化合物7的程序或使用化合物100-600形成化合物10的上述程序相同地进行溴-叠氮化物-交换、Boc-切割、用丁磺酰氯磺酰化、氢化和用DPFN脒基化的五步骤反应顺序。得到白色粉末FAB-MS:429(M+H+)的化合物14。
O．化合物15如图42中描绘的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)-2-噁唑烷二盐酸盐1)合成化合物15的原材料2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐

化合物15通过酯化0.10M甲醇和稀1％HCl中的(D或L)N-(叔丁酯基)-L(D)-酪氨酸(t-Boc-L(D)-酪氨酸)(1.0当量；Sigma)，得到原材料2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。将该混合物于25C搅拌12小时。然后通过碳酸钾中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。
2)合成化合物15的原材料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步骤程序如下将二氯甲烷(0.10M)中的对氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)与2,3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)于25C搅拌12小时。接着在真空中除去溶剂并将粗4-(2,3-二羟基丙氨)苄腈进行到如下述的下一步骤将25C的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈(1.0当量；如上述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(potassium tert-butylate)(1.1当量；Aldrich)于110C搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷，并将其进行到如下述的下一步骤将二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述)与1.1当量硫化氢、1.1当量甲基碘和1.1当量乙酸铵于25C搅拌。将该反应混合物搅拌6小时，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到所述脒，并将其进行到如下述的下一步骤将1.0当量的如上述合成的脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25C保护并搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂，并将粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。将该反应混合物在0C搅拌6小时，然后用水(5当量)淬火，接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂，通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中间体2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶联，形成化合物15的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羧基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷将1.9克2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)于室温搅拌30分钟。搅拌后，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入并于室温再搅拌15分钟。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂，通过硅胶柱层析纯化粗产物得到化合物15的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并将其进行到下一步骤。
4)将化合物15的保护形式脱保护形成化合物15:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷二盐酸盐，图42将化合物15的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述合成)用4ml 2NNaOH于室温处理4小时。然后于0C至25C滴加二氧杂环己烷中的40ml2N HCl溶液将混合物处理3小时。然后将该反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到化合物15:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，二盐酸盐；m.p.165℃(d)。
P．化合物16如图X(旧14)中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基
-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物16的原材料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐

化合物16通过酯化0.10M甲醇和稀1％ HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0当量；Sigma)得到原材料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。将该反应混合物于25C搅拌12小时。然后通过碳酸钾中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并对粗产物如下处理将上述化合物(4.3mmol)、丁磺酰氯(6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至于燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物产生该标题化合物。
2)合成化合物16的原材料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步骤程序如下将二氯甲烷(0.10M)中的对氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)与2,3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)于25C搅拌12小时。接着在真空中除去溶剂并将粗4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈进行到如下述的下一步骤将25C的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈(1.0当量；如上述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量；Aldrich)于110C搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷并，将其进行到如下述的下一步骤将二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述)与1.1当量硫化氢、1.1当量甲基碘和1.1当量乙酸铵于25C搅拌。将该反应混合物搅拌6小时，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到所述脒，并将其进行到如下述的下一步骤将1.0当量的如上述合成的脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25C保护并搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并将粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。将该反应混合物在0C搅拌6小时，然后用水(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中间体2-N-BOC-丁磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐与3-时-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶联形成化合物16的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2噁唑烷将1.9克2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)于室温搅拌30分钟。搅拌后，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入并于室温再搅拌15分钟。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物16的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并将其进行到下一步骤。
4)将化合物16的保护形式脱保护形成化合物16:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，图42将化合物16的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室温处理4小时。然后于0C至25C滴加二氧杂环己烷中的40ml 2N HCl溶液将混合物处理3小时。然后将该反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物16:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.236-237℃。
Q．化合物17如图42中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物17的原材料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐

化合物17
通过酯化0.10M甲醇和稀1％ HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0当量；Sigma)，得到原材料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。将该反应混合物于25C搅拌12小时。然后通过碳酸钾中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并对粗产物如下处理将上述化合物(4.3mmol)、丙磺酰氯(6.6mmol；Aldrich)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物产生该标题化合物。
2)合成化合物17的原材料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步骤程序如下将二氯甲烷(0.10M)中的对氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)与2,3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)于25C搅拌12小时。接着在真空中除去溶剂并将粗4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈进行到如下述的下一步骤将25C的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈(1.0当量；如上述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量；Aldrich)于110C搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷，并将其进行到如下述的下一步骤将二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述)与1.1当量硫化氢、1.1当量甲基碘和1.1当量乙酸铵于25C搅拌。将该反应混合物搅拌6小时然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到所述脒，并将其进行到如下述的下一步骤
将1.0当量的如上述合成的脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亚氨基基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25C保护并搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并将粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。将该反应混合物在0C搅拌6小时，然后用水(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中间体2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶联，形成化合物17的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷将1.9克2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)于室温搅拌30分钟。搅拌后，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入并于室温再搅拌15分钟。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物17的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并将其进行到下一步骤。
4)将化合物17的保护形式脱保护形成化合物17:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，图42将化合物17的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室温处理4小时。然后于0C至25C滴加二氧杂环己烷中的40ml 2N HCl溶液将混合物处理3小时。然后将该反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到化合物17:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.200℃(d)。
R．化合物18如图42中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物18的原材料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐

化合物18通过酯化0.10M甲醇和稀1％ HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0当量；Sigma)得到原材料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。将该反应混合物于25C搅拌12小时。然后通过碳酸钾中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并对粗产物如下处理将上述化合物(4.3mmol)、乙磺酰氯(6.6mmol；Aldrich)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生该标题化合物。
2)合成化合物18的原材料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步骤程序如下将二氯甲烷(0.10M)中的对氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)与2,3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)于25C搅拌12小时。接着在真空中除去溶剂，并将粗4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈进行到如下述的下一步骤将25C的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈(1.0当量；如上述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量；Aldrich)于110C搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯)0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷，并将其进行到如下述的下一步骤将二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述)与1.1当量硫化氢、1.1当量甲基碘和1.1当量乙酸铵于25C搅拌。将该反应混合物搅拌6小时然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到所述脒，并将其进行到如下述的下一步骤将1.0当量的如上述合成的脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25C保护并搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂，并将粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。将该反应混合物在0C搅拌6小时，然后用水(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中间体2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶联，形成化合物18的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2噁唑烷将1.9克2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)于室温搅拌30分钟。搅拌后，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入并于室温再搅拌15分钟。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物18的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并将其进行到下一步骤。
4)将化合物18的保护形式脱保护形成化合物18:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，图42将化合物18的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室温处理4小时。然后于0C至25C滴加二氧杂环己烷中的40ml 2N HCl溶液将混合物处理3小时。然后将该反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到化合物18:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.212℃(d)。
14．通过静脉内使用αvβ3配体有机模拟物抑制在CAM检测中测定的生长因子诱导的血管发生亦评价了静脉内注射入CAM制备物中的αvβ3配体有机模拟物对生长因子诱导的血管发生的影响，以在本发明中的应用。
如先前实施例5A中所述使用10日龄CAM制备物。起始bFGF诱导的血管发生24小时后，将称为化合物16(81218)、17(87292)和18(87293)的有机模拟物以100ul的体积、在20％pH 7.0四甘醇-PBS中的浓度1mg/ml(100ug/胚胎)下，独立地静脉内注射入CAM制备物。在平行检测中，类似地评价化合物7(96112)、9(99799)、10(96229)、12(112854)和14(96113)。48小时后分析有机模拟物的影响，以双盲方式通过计数滤片区内血管分枝点的数量进行定量。
结果分别示于图43和44。在图43中，与对照bFGF诱导和与化合物7(96112)相比，以抑制下降顺序排列的化合物14(96113)、10(96229)、9(99799)和12(112854)有效地降低新血管的分枝点数量。在图44中，与未处理bFGF对照和用化合物16(81218)的处理相比，化合物17(87292)和18(87293)表现出抗生血管性质。
在第三个检测中，与肽69601和66203一起评价做为bFGF诱导的血管发生抑制剂的有机化合物7(96112)、10(96229)和14(96113)。对于该检测，如实施例7B中所述，于bFGF处理18小时后给予250ug/ml的有机化合物。所述结果示于图28，其中如上述，化合物14(96113)和10(96229)几乎完全抑制bFGF诱导的新血管形成。
因此，以上实施例证实，整联蛋白αvβ3在由各种刺激物诱导的血管发生中起关键作用，因此αvβ3是本发明的αvβ3拮抗剂用于由特征为新血管形成的疾病的有价值的治疗靶。
认为以上书面说明书已足以使本领域技术人员实践本发明。本发明不限于保藏的细胞系的范围，因为保藏的实施例仅做为本发明一个方面的单一描述，任何功能相当的细胞系都属于本发明的范围。材料的保藏不会构成承认本文的书面描述不足以实践包括本发明的最佳方式的本发明的任何方面，亦不应认为它将权利要求的范围限制于其代表的特定描述。实际上，除这些已显示的和本文描述之外的本发明的各种修饰对本领域技术人员是显而易见的，并属于所附的权利要求书的范围内。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人；(A)姓名THE SCRIPPS RESEARCHINSTITUTE(B)街道10550 North Torrey Pines Road(C)城市La Jolla(D)州加州(E)国家美国(F)邮编92037(G)电话(619)784-2937(H)传真(619)784-9399(ⅱ)发明名称用于抑制血管发生的方法和组合物(ⅲ)序列数45(ⅳ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本1.25(ⅴ)当前申请数据(A)申请号PCT/US97/(B)提交日期1997年5月30日(ⅵ)在先申请数据(A)申请号US08/210,715(B)提交日期1994年5月18日(ⅵ)在先申请数据(A)申请号US08/366,665(B)提交日期1994年12月30日(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..6(D)其它信息/标记=BOC-GRGDFV-OMe/注释=“BOC表示N末端保护基团丁酯基；OMe表示C末端甲酯；精氨酸在第2位置”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..6(D)其它信息/标记=OMe/注释=“OMe表示C末端保护基团甲酯”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..6(D)其它信息/标记=D-Arg/注释=“D-Arg中的前缀“D”表示位置2的精氨酸是D-氨基酸”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:1:
Gly Arg Gly Asp Phe Val15(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部
(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..6(D)其它信息/标记=BOC/注释=“BOC表示N末端保护基团叔丁酯基”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..6(D)其它信息/标记=OH/注释=“OH表示游离C末端羧酸”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1.6(D)其它信息/标记=D-Arg/注释=“D-Arg中的前缀“D”表示位置2的精氨酸是D-氨基酸”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:2:
Gly Arg Gly Asp Phe Val15(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..6(D)其它信息/标记=H/注释=“H表示游离N末端胺”
(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..6(D)其它信息/标记=OH/注释=“OH表示游离C末端羧酸”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..6(D)其它信息/标记=D-Arg/注释=“位置2的D-Arg中的前缀“D”表示该精氨酸是D-氨基酸”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:3:
Gly Arg Gly Asp Phe Val15(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学环状(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置2(D)其它信息/注释=“精氨酸是D-氨基酸”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:4:
Gly Arg Gly Asp Phe Val15(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑学环状(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置4(D)其它信息/注释=“精氨酸是D-氨基酸”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:5:
Arg Gly Asp Phe Val1 5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学环状(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置4(D)其它信息/注释=“Phe是D-氨基酸”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:6:
Arg Ala Asp Phe Val15(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学环状
(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置5(D)其它信息/注释=“Val是D-氨基酸”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:7:
Arg Gly Asp Phe Val15(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:8:Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe1 5 10 15(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学环状(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置2(D)其它信息/注释=“Ala是D-氨基酸”
(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:9:
Arg Ala Asp Phe Val15(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学环状(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置5(D)其它信息/注释=“Phe是D-氨基酸”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:10:
Ala Arg Gly Asp Phe Leu15(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学环状(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置5(D)其它信息/注释=“Phe是D-氨基酸”
(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:11:
Gly Arg Gly Asp Phe Leu15(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:12:
Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met1 5 10(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:13:
Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser15 10(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:14:
Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu15 10(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学环状(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置5(D)其它信息/注释=“甲基化位于缬氨酸残基的氨基(NH2)末端”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:15:
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GCAGGATCCG AGTGCTGGGT TTATAC 26(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假定无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:39:
GCAGAATTCA ACTGTGGCAG AAACAAG 27(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假定无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:40:
GTAGAATTCC AGCACTCATT TCCTGC 26(2)SEQ ID NO:41的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假定无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:41:
TCTGAATTCT GCCACAGTTG AAGG24(2)SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假定无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:42:
ATTGAATTCT TCTACAGTTC A 21(2)SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假定无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:43:
GATGAATTCT ACTGCAAGTT 20(2)SEQ ID NO:44的信息
(ⅰ)顺序特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假定无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:44:CACTGAATTC ATCTGCAAAC A 21(2)SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度429个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅴ)片段类型C末端(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:45:
Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys1 5 10 15Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr20 25 30Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Cys Pro His Glu Ala Leu35 40 45Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe50 55 60Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr65 70 75 80Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys85 90 95Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala Met Ser Thr Val Gly Gly Asn100 105 110Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys115 120 125Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys130 135 140Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro145 150 155 160Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His165 170 175Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gln Asp Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro180 185 190Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys195 200 205Gly Ile Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr210 215 220Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gln225 230 235 240Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe245 250 255Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro260 265 270Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys275 280 285Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu Glu Lys Ala Val Phe290 295 300Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly305 310 315 320Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg325 330 335Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr lle340 345 350Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp355 360 365Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp370 375 380Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe385 390 395 400Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser405 410 415Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys420 42权利要求
1．生产制品，它包含包装材料和包含于所述包装材料之中的药物，其中所述药物有效抑制组织中的血管发生，并且其中所述包装材料包含一标签，该标签表明所述药物可以用于通过抑制血管发生治疗疾病，并且其中所述药物包含血管发生抑制量的αvβ3拮抗剂，该拮抗剂包含其氨基酸残基序列包括基质金属蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以结合整联蛋白αvβ3。
2．权利要求1的生产制品，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸残基序列。
3．权利要求1的生产制品，其中所述组织是炎症组织，而所述疾病是关节炎或类风湿性关节炎。
4．权利要求1的生产制品，其中所述组织是实体瘤或实体肿瘤转移瘤。
5．权利要求1的生产制品，其中所述组织是视网膜组织，而所述疾病是视网膜病、糖尿病性视网膜病或黄斑变性。
6．αvβ3拮抗剂，它包含其氨基酸残基序列包括基质金属蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以结合整联蛋白αvβ3。
7．权利要求6的拮抗剂，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28的氨基酸残基序列。
8．权利要求6的拮抗剂，其中所述多肽是融合蛋白。
9．权利要求6的拮抗剂，其中所述多肽具有示于SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28的氨基酸残基序列。
10．药物，它包含足以在组织中抑制血管发生的量、在药学上可接受载体中的按照权利要求6的αvβ3拮抗剂。
11．在组织中抑制血管发生的方法，它包括给予所述组织包含血管发生抑制量的αvβ3拮抗剂的组合物。
12．权利要求11的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
13．权利要求11的方法，其中与抑制血纤蛋白原与αⅡbβ3的结合相比，所述整联蛋白αvβ3拮抗剂优先抑制血纤蛋白原与αvβ3结合。
14．权利要求11的方法，其中所述αvβ3拮抗剂包含其氨基酸残基序列包括基质金属蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以与整联蛋白αvβ3结合。
15．权利要求11的方法，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28的氨基酸残基序列。
16．权利要求11的方法，其中所述多肽是融合蛋白。
17．权利要求11的方法，其中所述多肽具有示于SEQ ID NO 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28的氨基酸残基序列。
18．权利要求11的方法，其中所述组织是炎症组织，而所述血管发生是炎症组织的血管发生。
19．权利要求18的方法，其中所述组织是关节炎组织。
20．权利要求19的方法，其中所述关节炎组织存在于患有类风湿性关节炎的哺乳动物中。
21．权利要求11的方法，其中所述组织是患有糖尿病性视网膜病的视网膜组织，而所述血管发生是视网膜血管发生。
22．权利要求11的方法，其中所述组织是实体瘤或实体肿瘤转移瘤，而所述血管发生是肿瘤血管发生。
23．权利要求11的方法，其中所述给予包括静脉内、经皮、滑膜内、肌内或口服给予。
24．权利要求22的方法，其中所述给予与化疗联合进行。
25．权利要求11的方法，其中所述给予包括单剂量静脉内给予。
26．在患者中诱导实体瘤组织退化的方法，包括给予所述患者包含足以抑制实体瘤组织新血管形成的治疗有效量的整联蛋白αvβ3拮抗剂的组合物。
27．权利要求26的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
28．权利要求26的方法，其中所述αvβ3拮抗剂是按照权利要求6的αvβ3拮抗剂。
29．抑制患者中进行新血管形成的实体瘤组织生长的方法，包括给予所述患者包含足以抑制实体瘤组织生长的治疗有效量的整联蛋白αvβ3拮抗剂的组合物。
30．权利要求29的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
31．权利要求29的方法，其中所述αvβ3拮抗剂是按照权利要求6的αvβ3拮抗剂。
32．治疗具有其中发生新血管形成的炎症组织的患者的方法，包括给予所述患者包含治疗有效量的整联蛋白αvβ3拮抗剂的组合物。
33．权利要求32的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
34．权利要求32的方法，其中所述αvβ3拮抗剂是按照权利要求6的αvβ3拮抗剂。
35．治疗其中视网膜组织中发生新血管形成的患者的方法，包括给予所述患者包含新血管形成抑制量的整联蛋白αvβ3拮抗剂的组合物。
36．权利要求35的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
37．权利要求35的方法，其中所述αvβ3拮抗剂是按照权利要求6的αvβ3拮抗剂。
38．治疗其中在血管成形术后发生平滑肌细胞迁移的组织中再狭窄的患者的方法，包括给予所述患者包含治疗有效量的整联蛋白αvβ3拮抗剂的组合物。
39．权利要求38的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
40．权利要求38的方法，其中所述αvβ3拮抗剂是按照权利要求6的αvβ3拮抗剂。
41．降低患者中支持所述组织新生长需要的组织血液供应的方法，包括给予所述患者包含足以降低对所述组织的所述血液供应的治疗有效量的整联蛋白αvβ3拮抗剂的组合物。
42．权利要求41的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
43．权利要求41的方法，其中所述αvβ3拮抗剂是按照权利要求6的αvβ3拮抗剂。
全文摘要
本发明描述使用玻连蛋白α
文档编号C07K19/00GK1226172SQ97196822
公开日1999年8月18日 申请日期1997年5月30日 优先权日1996年5月31日
发明者P·布罗克斯, D·A·彻雷斯 申请人:斯克里普斯研究学院