细菌表达系统中甲酰－甲硫氨酸肽的去甲酰化的制作方法

专利名称：细菌表达系统中甲酰－甲硫氨酸肽的去甲酰化的制作方法
技术领域：
本发明涉及在转化细菌中生产重组蛋白所用的材料和方法。在一个重要的实施方案中，本发明涉及用于减少在转化的细菌宿主细胞中生产的高水平重组蛋白的N-末端上甲硫氨酸残基N-甲酰基团的残留(retention)的材料和方法。在另一个实施方案中，公开了用于提高转化细菌宿主细胞中肽脱甲酰基酶水平的新方法。
背景技术：
甲硫氨酸在大多数生物系统中是通用的肽链生长(例如蛋白质合成)起始氨基酸残基。甲硫氨酸为了在细菌中行使起始甲硫氨酸合成新生肽的功能，在蛋白合成起始前和蛋白质已经合成之后，它要经历一系列的转化过程(见Meinnel,T.,Mechulam,Y.,和Blanquet,S.,1993的评论文章)。在大肠杆菌中，所有参与到这一转化过程的酶和它们各自的基因都已经被分离和/或被测序(Meinnel,T.,Mechulam,Y.,和Blanquet,S.,1994)。
涉及到起始氨基酸甲硫氨酸的两个最显著的转化作用涉及在信使RNA(m-RNA)翻译起始前将一个N-甲酰基团加到甲硫氨酸分子上以及后来从新生肽氨基(N-)末端的甲硫氨酸去除N-甲酰基团。N-甲酰基团的去除是通过酶肽脱甲酰基酶(根据IUB在出版的“酶命名建议”中命名为EC3.5.1.27(1992)科学院出版社，San Diego)实现的。在一个底物特异性反应中，肽脱甲酰基酶(PDF)裂解大多数新生甲酰-甲硫氨酸-肽上的甲酰基团。但是，PDF的常规作用也有些例外。例如，有些大肠杆菌蛋白仍然或者全部被甲酰化或者部分被甲酰化。(Hauschild-Rogat,P.,1968；Marasco,W.A.,等，1984；和Milligan,D.L.和Koshland,Jr.,D.E.,1990)。已经观察到，当许多通常不带有N-甲酰-甲硫氨酸(f-Met)的重组蛋白在重组大肠杆菌菌株中过量产生时，明显地显示出了有f-Met残留。这一现象的例子包括大肠杆菌色氨酸合成酶α和β亚单位(Sugino,Y.,等，1980；Tsunasawa,S.,等，1983)；牛生长激素(BST)(Bogosian,G.,等，1989)；鳗生长激素(Sugimoto,Y.,等，1990)；大肠杆菌1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(Coleman,J.,1992)；人粒细胞集落刺激因子(Clogston,C.L.等，1992)；牛脂肪酸结合蛋白(Specht,B.,等，1994)；牛细胞色素P450(Dong,M.S.,等，1995)；炽热甲烷嗜热菌组蛋白A(methanothermus fervidus histonea)(Sandman,K.,等，1995)；人白细胞介素-5(Rose,K.,等，1992)；人甲状旁腺激素(Rabbni.S.,等，1988；Hogset,A.,等，1990)；人γ-干扰素(Honda,S.,等，1989)；大肠杆菌苏氨酸脱氢酶(Eisenstein,1991)；和大肠杆菌TolQ膜蛋白(Vianney,A.,等，1994)。
在制备重组体药物时，并不希望细菌表达系统所表达的蛋白残留有甲酰基团或从细菌表达系统中纯化的蛋白上残留有甲酰基团。因此，需要通过复杂且昂贵的纯化方法将去甲酰化的目的蛋白纯化到一定程度足以使其满足制药要求。另外，经常需要设计出一些昂贵的分析方法来测定甲酰化异构体的数量以确保在最终产物中这样的异构体低于所要求的数量。因此，现在需要一种能够有效去除重组蛋白上残留的不需要的N-甲酰基团并且不影响细菌表达系统中重组蛋白产量的方法。
发明概述本发明涉及用于从转化的细菌宿主(例如大肠杆菌)生产的新生重组N-甲酰甲硫氨酸肽上除去残留的N-甲酰基团的方法和材料的发现。从总的意义上说，本发明通过例如遗传或外遗传操作以使细菌宿主细胞提高表达和/或提高PDF的活性，从而提供了能够减少重组细菌表达的重组肽或蛋白(统称为重组蛋白)上残留有N-甲酰基团的发生率而基本上不降低重组蛋白产量的方法。优选地，这种效果是通过将一种可表达的PDF基因转化到合适的细菌宿主细胞中以使PDF在该细菌宿主细胞中的表达水平提高来实现的。本发明还涉及这样转化的宿主细胞和这样生产的基本上去甲酰化的重组蛋白。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种在转化的细菌宿主细胞中生产残留的N-甲酰甲硫氨酸减少的重组蛋白的方法。这种方法包括用DNA转化的细菌宿主细胞的步骤，该DNA含有编码肽脱甲酰基酶并且能够可操作地连接到宿主细胞中有效的启动子上的第一可表达DNA序列和编码一重组蛋白并且能够可操作地连接到细菌宿主细胞中有效的启动子上的第二可表达序列的DNA序列。可表达DNA序列可位于单一的DNA片段上或者也可能位于可被共转化到细菌宿主细胞中的不同片段上。然后就可以鉴定出既带有第一也带有第二表达序列的转化的细菌宿主细胞并在能够使重组蛋白和PDF酶表达的条件下培养转化的细菌宿主细胞，从而使共表达的重组蛋白基本上去甲酰化。
在一个更优选的实施方案中，每个可表达DNA序列是带有一个标记基因的DNA分子，从而可以通过筛选由标记基因所赋予的标记特征而鉴定出转化的细菌宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中，由转化的宿主细胞的生产的重组蛋白具有减少的残留N-甲酰甲硫氨酸残基，同时表达量也基本上等同于(例如至少约为80％)只用含有编码该重组蛋白的基因的DNA分子来转化同样的宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种提高转化的细菌宿主细胞中PDF水平的新方法，该方法涉及用编码肽脱甲酰基酶并能够有效地连接到宿主细胞中有效启动子上的可表达DNA序列转化宿主细胞。在一个优选的实施方案中，用于转化的DNA分子也要含有一个标记基因。然后，可凭借标记基因所赋予的标记特征而鉴定出被转化的宿主细胞。在需要减少表达蛋白中N-甲酰甲硫氨酸残留时，可将这一转化的宿主细胞用作通用的表达系统。
其它的实施方案涉及共表达编码PDF和重组目的蛋白基因的细胞以及编码PDF和重组目的蛋白的载体。


图1质粒pBGH1和pXT179。
图2对从W3110G[pBGH1](A)和W3110G[pXT179](B)的诱导培养物中分离的BST进行反相高效液相层析分析。为确定吸收峰下的面积已经把吸光度的单位转换为毫伏。两种可观测到的组份为1．正常的BST；和2．在N-端甲硫氨酸上含有甲酰基团的BST。用质谱仪又通过水解从蛋白上去除了甲酰基团，接着用反相高效液相层析鉴定了后一种物质。菌株W3110G[pBGH1]和W3110G[pXT179]生长在10升的发酵容器中并用吲哚丙烯酸诱导(Bogosian,G.,等，1989)。通过均化作用和离心作用从培养物中分离出含有BST的内含体，将BTS溶解并重新折叠(Bogosian,G.,等，1989)。用DEAE-纤维素离子交换层析进一步纯化BST(Wood,D.C.,等，1989)。用Vydac C-18层析柱通过Perkin-Elmer Series4反相高效液相层析系统从这总BST中分离出甲酰化的BST。层析条件是以1.5ml/min的流速，用恒定的40mM的三氟乙酸和54-60％的乙腈洗脱超过24分钟，接着用60-75％的乙腈洗脱6分钟。鉴定甲酰化BST的低限约为总BST的0.5％。
对作为例证的实施方案的说明在原核表达系统中表达药用重组蛋白的主要弊端之一是残留有不需要的甲酰化异构体，从而导致大规模生产系统更加昂贵并且效率比应有的效率低。因此，本发明的目的之一是要达到能够有效去除重组蛋白上残留的N-甲酰基团而不显著影响这样的蛋白在原核表达系统中的产量。
在一个实施例中，用编码PDF酶的基因转化要表达重组目的蛋白的细菌宿主细胞，从而使细胞中PDF的表达量相对于其原来的表达量有所提高。本发明的意义在于，当其它条件都相同时，如果重组目的蛋白产物被甲酰化的量低于未用编码PDF酶的基因转化的同一细菌宿主细胞所应当生产的甲酰化蛋白的量，说明残留的N-甲酰甲硫氨酸减少了。
可通过本领域技术人员公知的一些技术来制备编码PDF酶的遗传物质，这些技术包括，但不限于PCR技术，从DNA基因组文库中克隆，或由信使RNA的cDNA克隆，用任何本领域技术人员所公知的可实施的筛选方法鉴定带有PDF基因的克隆。PCR技术由Ronald M.Atlas和S.AsimkBej，在聚合酶链式反应，第418-435页的普通和分子生物学方法中作了描述，Philipp Gerhardt美国微生物学会，华盛顿D.C.1994，其它克隆技术在Sambrook，等的分子克隆手册，第二版，1989中作了描述，各种方法都在本文的参考文献中给出。
本发明的一个实施方案是提高被转化的细菌宿主细胞生产PDF的数量的方法，包括(ⅰ)用含有标记基因和编码PDF酶并可操作地连接到在宿主细胞中有效的启动子上的DNA序列的DNA载体，(ⅱ)鉴定出具有标记基因赋予标记特征的被转化宿主细胞，和(ⅲ)在能够使它们比未转化的细菌生产更多的PDF的条件下培养这些被转化的宿主细胞。用这种方法生产的是一种通用宿主，为了人们希望减少N-甲酰甲硫氨酸残留的目的，该宿主可被编码重组目的蛋白的基因进一步转化。有许多可诱导控制系统可用来改变PDF的量并且其中的任一方法都适用于本发明。在一个优选的实施方案中，连接到PDF上的启动子是可化学诱导的并且转化的大肠杆菌在足以使PDF产物增加到所需水平的诱导化合物存在时培养。在最优选的实施方案中，启动子为吲哚丙烯酸可诱导色氨酸启动子而诱导化合物是吲哚丙烯酸。其改变取决于所用控制系统希望的PDF水平的，在未转化的大肠杆菌的产量和转化的大肠杆菌的最大产量之间。本领域技术人员可以确定所希望PDF的水平以及选用哪种控制系统可以满足技术人员的特殊需要。本发明中选用的本领域技术人员所公知的一些启动子包括lac,tac,recA,ara，和λpl。
本发明也涉及所生产PDF水平增加了的转化的细菌宿主细胞。所用的菌株可以是可以被转化的任何菌种。优选的是肠杆菌家族中的一些成员。在一个优选的实施方案中，所用细菌是大肠杆菌，最优选的是大肠杆菌K12株。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种使细菌生产的重组蛋白去甲酰化的方法，包括在也生产重组蛋白的细菌中增加PDF酶的产量。用这种方法，可以在重组蛋白和PDF酶能够共表达的条件下培养转化的细菌。PDF基因和编码重组目的蛋白的基因经过构型排列，从而使它们能够有效地连接到合适的目的启动子上，该启动子具有指导表达PDF和重组目的蛋白的能力。在一个优选的实施方案中，编码重组蛋白和PDF酶的DNA序列位于同一的DNA分子并且有效地连接到同一的启动子上。虽然本领域技术人员可以确定和适用其它启动子和构型排列，但是优选地，这两个序列是位于吲哚丙烯酸可诱导色氨酸启动子下并且在两个基因之间没有转录终止子。在另一个实施方案中，这两个序列在同一的分子上但有效地连接到不同的启动子上，该启动子可以是相同或不同的类型。
在另一个实施方案中，这两个序列位于两个不同的DNA分子上并且在不同的启动子控制之下，启动子可以是相同或不同的类型。因此，虽然在优选的实施方案中用色氨酸启动子来启动PDF基因和编码所需目的多肽的基因的表达，但是用色氨酸启动子或甚至是同一的启动子来启动两个基因却不是必须的。另外的实施方案允许选择在给定的细胞类型中达到所需表达水平的启动子。
重要的是选择一个与细菌宿主相容的PDF基因以使该基因的功能能够在细菌宿主中表达。因此优选地，编码PDF的DNA序列同与所用细菌菌株内源的编码PDF酶的DNA序列基本相同。在一个优选的实施方案中，菌株和PDF酶来自大肠杆菌，在一个更优选的实施方案中，基因来自大肠杆菌K12菌株并且被引入到相同基因型的菌株中。为了本发明的目的，大肠杆菌PDF基因是一个编码PDF酶的基因，该酶的氨基酸序列同大肠杆菌PDF酶的氨基酸序列基本相似并且在大肠杆菌宿主中是可表达的和有效的。
编码目的蛋白的“基因”可选自许多异源基因或为在原核宿主中生产蛋白而设计的cDNA。由于原核转录/翻译机制不能识别并去除经常出现在未处理的真核细胞RNA中的内含子，如果本发明中的目的基因是含有内含子的真核基因，就要用相应的cDNA而不是该基因自身作为引入用于生产重组蛋白的细菌菌株的DNA来源。在最优选的实施方案中，目的基因编码生长激素。在另一个优选的实施方案中，目的基因编码人粒细胞集落刺激因子。然而，编码其它重组蛋白的基因也是合适的，这些重组蛋白上残留有不希望有的甲酰化了的N-端甲硫氨酸部分，包括人白细胞介素-5(IL-5)，人甲状旁腺激素，鳗生长激素，1-酰基-sn-甘油-3-酰基转移酶，牛脂肪酸结合蛋白，牛细胞色素P450和人γ-干扰素。
最好能够建立一种系统，从而使其能够增加PDF的表达量而不影响目的蛋白的表达水平。在一个最优选的实施方案中，本发明提供了一种能够显著减少N-甲酰甲硫氨酸残留而基本不降低重组蛋白产量的方法。因此，最优选的转化细菌生产的重组蛋白的产量比不含编码PDF酶的DNA序列的细菌在相同条件下的产量多80％。
在转化细菌宿主前，将编码PDF的DNA片段和编码目的基因的片段插入到任何适宜的载体中以转化细菌宿主。适宜的载体包括本领域技术人员所公知的各种质粒载体，粘粒质粒载体，和噬菌体载体，例如，如在Sambrook等所描述的。PDF基因和编码目的蛋白的基因可位于同一或不同的分子上，优选地，每个DNA分子带有一个标记基因从而能够鉴定出已转化了的细菌宿主细胞。当基因位于不同的分子上时，可用两种DNA分子同时转化细菌宿主或在不同的时间分别转化宿主。例如，在一个实施方案中，用带有编码PDF基因的载体转化细菌，然后该基因会稳定地整合到染色体中。所得到的转化细菌可被保留下来并用编码目的蛋白的第二个载体转化。虽然优选的是用能够稳定地整合到染色体中的载体来转化细胞，但是转化的方法并不是关键的。这种类型的载体之一是噬菌体λ。另一个实施例是在美国专利U.S.5,395,763中公开的噬菌体Mu载体。由于相对于质粒载体而言，Mu载体要稳定得多，而相对于噬菌体λMu载体更小，并且能够严格调节重组蛋白基因的表达，所以本发明中使用Mu载体是特别有益的。另一个已经描述过的方法是以Tn1545和噬菌体λ位点特异重组的调节因子为基础，用多次、稳定的染色体插入来构建大肠杆菌菌株(Peredelchuk,M.和Bennet,G.,1997)。
本领域技术人员应当清楚，本发明的大量其它可能的实施方案会涉及到利用内源PDF的表达和/或活性的方法。例如，已经描述了大量用于靶向内源性细菌染色体区的替代或修饰的方案(例如参见，Gutterson,N.I.和Koshland,D.,1983:Hamilton,C.，等，1989；Moskovitz,J.,等，1995)。可以用这样的方法在大肠杆菌中引入可提高PDF的表达/活性的遗传修饰。例如，可用象色氨酸启动子一样的强启动子来替代内源PDF的启动子，该启动子能够启动较高水平的PDF表达。另外，对内源PDF启动子修饰的方法或者是去除负转录调节因子或者是引入能够促进转录的调节因子。另外一种提高PDF表达的方法是向细菌细胞中引入可导致产生一种蛋白的重组DNA分子，该蛋白能够促进内源PDF的活性，例如一种转录因子，它或者是在结构上同PDF相互作用并作为阳性调节因子的一种蛋白，或者是起PDF上游正调节因子作用的一种蛋白。另外，可以移去或去除通常在某些方式中对PDF的表达和/或活性作为负调节因子的蛋白。这可以通过，例如，用如上所述的遗传修饰方案来消除或削弱编码负调节因子的基因，或通过用对基因表达的反义抑制来抑制生产负调节因子而达到。
根据本发明，可以生产一种含有由细菌生产的重组蛋白，该蛋白的96-100％已经去甲酰化。更优选地，98-100％的该组合物已经去甲酰化。最优选的组合物包括牛促生长素。另一个优选的组合物包括人粒细胞集落刺激因子。
下面的实施例将对本发明的一个优选的实施方案进行说明而不是对本发明进行限制。
提供了通过用编码肽甲酰化酶的DNA载体来转化细菌宿主已经减少各种N-甲酰化蛋白的残留的制备表达系统并且产生了重组目的蛋白。
实施例1大肠杆菌PDF基因的克隆在本实施例中，引入处于一个色氨酸启动子控制之下的PDF和牛促生长素基因致使N-甲酰化的BST的水平降低，即由所带的质粒含有BST基因而不含PDF基因的对照菌株中总BST的5％的水平降低到含有两种基因的菌株中无法测出的水平。
大肠杆菌PDF基因的两个末端的侧翼的引物是以出版公开的这一区域中核酸(nt)序列为基础的(Guillon,J.M.,等，1992)。正向(该基因的起始端)引物具有序列5’-GCATGAGTCGCATGCATTAAGTCTGGAGATTTATGTCAGTT-3’(SEQ ID NO:1)，它包括一个限制性核酸内切酶SphⅠ(GCATGC)的识别位点。反向(该基因的终止端)引物含有序列5’-GCAGAGTATGCGTCGACTTAAGCCCGGGCTTTCAGACG-3’(SEQ ID NO:2)，它包括一个限制性核酸内切酶SalⅠ(GTCGAC)的识别位点。在PCR反应中，这些引物限定扩增产物，所述产物含有整个PDF结构基因，它包括天然核糖体结合位点，而不含有任何相关的启动子或其它调节序列(Guillon,J.M.,等，1992)。以来自大肠杆菌K-12株W3110G的染色体DNA作模板实施PCR反应(Bogosian,G.,等，1989)，结果产生了预期的500碱基对的产物，然后克隆并测定核酸序列。所得到的PDF核苷酸序列同以前出版过的完全相同(Guillon,J.M.,等，1992；Mazel,D.,等，1994)。
实施例2:pXT179的性质和构建用SphⅠ和SalⅠ消化含有PDF基因的500bp的PCR产物并亚克隆到可用于生产过量的牛促生长素(BST)的质粒载体pBGH1的SphⅠ和SalⅠ位点中，该载体已经在以前有过描述(Seeburg,P.H.,等，1983；Calcott,P.H.,等，1988；Bogosian,G.,等，1989,1990；Kane,J.F.,等人，1990)。所得到的构建体被称作pXT179，该质粒中的BST和PDF基因处于色氨酸启动子的调控之下。载体中的BST和PDF基因之间没有转录终止子。由位于这样的质粒上的，在色氨酸启动子控制下的基因所编码的蛋白质的大量合成是通过在不含色氨酸而存在诱导物吲哚丙烯酸(IAA)的培养条件下培养用pXT179转化的菌株获得的(Calcott,P.H,等，1988；Bogosian,G.,等，1989；Kane,J.F.,等，1990)。为了测定PDF基因对残留的甲酰化的BST的水平的影响，用pBGH1和pXT179转化大肠杆菌K-12菌株W3100G，所得到的菌株被分别称作W3110G[pBGH1]和W3110[pXT179]。两菌株生产的BST占总细胞蛋白的30％。
实施例3:PDF产物和BST的去甲酰化用Adams法分析由两个转化菌株的IAA诱导培养物所制备的粗提取物中PDF的活性(1968)。每次分析是对每个菌株各自不同的三份培养物实施的。菌株W3110G[pXT179]的粗细胞提取物的PDF的活性比菌株W3110G[pBGH1]菌株提取物高40倍(分别是110±10对2.6±0.8单位)。从两种菌株中分离BST并通过反向高效液相层析分析以测定f-Met的残留。每次分析都对每种样品实施两次。在这样的条件下，从W3110G[pBGH1]中纯化的BST显示出两个峰值。一个具有代表性的反向高效液相层析图谱如图2所示。较大的峰是Met-BST，而较小的峰是f-Met-BST(Bogosian,G.,等，1989)，代表总共生产的BST的5％。由于f-Met-BST峰的存留时间约为18.4分钟而较小的第二个峰的存留时间为18.8分钟，所以看起来代表菌株W3110G[pXT179]所纯化的BST的RP-HPLC模式的第二个较小的峰不含f-Met-BST。然而，为了排除这种可能性，将含有较小峰的物质分离出来并进行电喷射质谱分析以确定不含f-Met-BST。来自较小峰的BST的分子量比Met-BST高42-46道尔顿，但是向Met-BST上加上甲酰基团只会使分子量增加28道尔顿。较小峰所代表的物质非常可能是BST上的一个赖氨酸残基发生了氨甲酰化，这会使其分子量提高43道尔顿。已知这里所用的用脲水解BST内含体的纯化方法(Bogosian,G.,等，1989)会导致很小一部分的BST被氨甲酰化(观测结果未出版)。因此，当W3110G[pBGH1]菌株生产的BST的总量中异构体的量约占到5％时，f-Met-BST异构体的量在生产高水平PDF的菌株(即，W3110G[pXT179])中就降低到无法测出了。
由上面的数据得到了三个有意义的观测结果。第一，在上述实施例中使用的从大肠杆菌K-12株W3110G中得到的PDF基因与从其它大肠杆菌菌株中所得到的PDF基因相同。第二，相对于只具有PDF基因单染色体拷贝的菌株而言，表达多拷贝质粒上由色氨酸启动子所控制的PDF基因的大肠杆菌的PDF表达量高40倍。第三，高水平的BST和PDF基因共表达致使可检测到的f-Met-BST被消除。通常这一方法可用于防止大肠杆菌或其它生物所表达蛋白中f-Met的残留。这些数据表明，可利用PDF的过量表达作为从细菌表达的重组蛋白中去除残留的甲酰基团的方法。
实施例4去甲酰化人粒细胞集落刺激因子(GCSF)的生产。
根据出版的GCSF的cDNA序列(该序列确定了包括含有天然核糖体结合位点的全部GCSF结构编码区的扩增产物)(Tsuchiya,N.,等)设计了PCR引物。用含有GCSF的cDNA质粒作为模板实施PCR，并且对所得的产物进行测序以确保它同对应的出版的序列相同。
运用标准的分子生物学技术(例如在Sambrook,1989中所描述的)，用合适的限制性酶消化该PCR产物并将其亚克隆到pBGHI中以代替编码BST的序列。这样，所得到的质粒就带有在色氨酸启动子控制下的GCSF基因。对含有PDF的500bp的PCR产物(如实施例中所描述的)进行限制性酶切并亚克隆到trp-GCSF质粒中，从而生产出了一个PDF和GCSF基因都处于色氨酸启动子控制之下的质粒。
为了确定PDF基因对残留的甲酰化GCSF的影响，将大肠杆菌K-12株W3110G转化以生产两个转化子菌株，一个带有含PDF和GCSF的基因的质粒而另一个仅带有含GCSF基因的质粒。如上述，高水平蛋白质的合成是通过在有IAA存在下培养W3110G而达到。通过Admas法(1968)将两个转化菌株的IAA-诱导的培养物所制备的粗提取物用作鉴定PDF的活性，并且用反向高效液相层析法来分析从两个菌株中分离出的重组GCSF以测定残留的f-Met。用这种方法，所得到的结果应当同在实施例3中对BST所描述的相似。这样，消除可检测水平的f-Met-GCSF是有利的。
实施例5生产去甲酰化的人白细胞介素-5(IL-5)根据出版的IL-5的cDNA序列(该序列确定了包括含有天然核糖体结合位点的整个IL-5结构编码区的扩增产物)(Azuma,C.,等，1986)设计了PCR引物。用含有IL-5的cDNA质粒作为模板实施PCR反应，并且对所得的产物进行测序以确保它同相应的出版的序列相同。
运用标准的分子生物学技术(例如在Sambrook,1989中所描述的)，用合适的限制性酶消化该PCR产物并将其亚克隆到pBGHI中以代替编码BST的序列。这样，所得到的质粒就带有在色氨酸启动子控制下的IL-5基因。对含有PDF的500bp的PCR产物(如实施例中所描述的)进行限制性酶切并亚克隆到trp-IL-5质粒中，从而生产出了一个PDF和IL-5基因都处于色氨酸启动子控制之下的质粒。
为了确定PDF基因对残留的甲酰化IL-5的影响，将大肠杆菌K-12株W3110G转化以生产两个转化子菌株，一个带有含PDF和IL-5的基因的质粒而另一个仅带有含IL-5基因的质粒。如上述，高水平蛋白质的合成是通过在有IAA存在下培养W3110G而达到。通过Admas法(1968)将两个转化菌株的IAA-诱导的培养物所制备的粗提取物用作鉴定PDF的活性，并且用反向高效液相层析法来分析从两个菌株中分离出的重组IL-5以测定残留的f-Met。用这种方法，所得到的结果应当同在实施例3中对BST所描述的相似。这样，有利于消除可检测水平的f-Met-IL-5。
实施例6生产去甲酰化的人γ-干扰素(IFN-γ)根据出版的IFN-γ的cDNA序列(该序列确定了包括含有天然核糖体结合位点的整个IFN-γ结构基因的扩增产物)(Leung,D.,等，1982)设计了PCR引物。用含有IFN-γ的cDNA质粒作为模板实施PCR反应，并且对所得的产物进行测序以确保它同相应的公开的序列相同。
运用标准的分子生物学技术(例如在Sambrook,1989中所描述的)，用合适的限制性酶消化该PCR产物并将其亚克隆到pBGHI中以代替编码BST的序列。这样，所得到的质粒就带有在色氨酸启动子控制下的IFN-γ基因。对含有PDF的500bp的PCR产物(如实施例中所描述的)进行限制性酶切并亚克隆到trp-IL-5质粒中，从而生产出了一个PDF和IFN-γ基因都处于色氨酸启动子控制之下的质粒。
为了确定PDF基因对残留的甲酰化IFN-γ的影响，将大肠杆菌K-12株W3110G转化以生产两个转化子菌株，一个带有含PDF和IFN-γ的基因的质粒而另一个仅带有含IFN-γ基因的质粒。如上所述，高水平蛋白质的合成是通过在有IAA存在下培养W3110G而达到。通过Admas法(1968)将两个转化菌株的IAA-诱导的培养物所制备的粗提取物用作鉴定PDF的活性，从两个菌株中分离出重组IFN-γ并且用反向高效液相层析法来分析以测定残留的f-Met。用这种方法，所得到的结果应当同在实施例3中对BST所描述的相似。这样，有利于消除可检测水平的f-Met-IFN-γ。
几乎在所有微生物生产的重组目的蛋白中通常都显示出有一定程度的f-Met残留，本领域技术人员应当清楚，利用这种方法，可以消除残留的f-Met或使其降低到最低限度。
下面的参考文献可以帮助理解或实施本发明。然而下表中所包括的参考文献，并不是要承认任何这样的参考文献都构成本发明的现有技术。
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1．一种使细菌宿主细胞生产的重组蛋白去甲酰化的方法，所述方法包括培养细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞表达a．编码肽脱甲酰基酶的第一个可表达DNA序列，该序列有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上；和b．编码一种重组蛋白的第二个可表达DNA序列，该序列有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上；其中所述细菌宿主细胞所生产的肽脱甲酰基酶的数量增加到有效地使所述重组蛋白去甲酰化作用增强。
2．根据权利要求1的方法，其中所述的重组蛋白是大肠杆菌色氨基酸合成酶α，色氨基酸合成酶β，牛促生长素，鳗生长激素，大肠杆菌1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶，人粒细胞集落刺激因子，牛脂肪酸结合蛋白，牛细胞色素P450，炽热甲烷嗜热菌组蛋白，人白细胞介素-5，人甲状旁腺激素，人γ-干扰素，大肠杆菌苏氨酸脱氨酶，或大肠杆菌TolQ膜蛋白。
3．根据权利要求2的方法，其中所述的重组蛋白是人粒细胞集落刺激因子，牛促生长素，人γ干扰素或人白细胞介素-5。
4．使细菌宿主细胞中生产的牛促生长素去甲酰化的方法，该方法包括培养一种细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞表达a．编码肽脱甲酰基酶第一个可表达DNA序列，该序列有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上；和b．编码牛促生长素第二个可表达DNA序列，该序列有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上；其中所述细菌宿主细胞所生产的肽脱甲酰基酶的数量增加到有效地使所述牛促生长素去甲酰化作用增加。
5．一种降低在转化的细菌宿主细胞中生产重组蛋白中的N-甲酰甲硫氨酸残留的方法，该方法包括a．用含有(ⅰ)编码肽脱甲酰基酶的第一个可表达DNA序列，该序列可可操作地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上以及(ⅱ)编码重组蛋白的第二个可表达DNA序列，该序列有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上，的DNA序列转化细菌宿主细胞，b．鉴定既含有所述第一也含有所述第二可表达序列的转化的细菌宿主细胞，和c．在可使所述重组蛋白和所述肽脱甲酰基酶能够共表达的条件下培养步骤b中鉴定出的所述转化的细菌宿主细胞。
6．根据权利要求5中的方法生产的重组蛋白。
7．根据权利要求5中的方法，其中所述的重组蛋白是大肠杆菌色氨酸合成酶α，色氨酸合成酶β，牛促生长素，鳗生长激素，大肠杆菌1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶，人粒细胞集落刺激因子，牛脂肪酸结合蛋白，牛细胞色素P450，炽热甲烷嗜热菌组蛋白A，人白细胞介素-5，人甲状旁腺激素，人γ干扰素，大肠杆菌苏氨酸脱氨酶或大肠杆菌TolQ膜蛋白。
8．根据权利要求7的方法，其中所述的重组蛋白是人粒细胞集落刺激因子，牛促生长素，人γ干扰素或人白细胞介素-5。
9．一种在转化的细菌宿主生产具有降低的N-甲酰甲硫氨酸残留的牛促生长素的方法，该方法包括a．用含有(ⅰ)第一个可表达DNA序列，该序列编码肽脱甲酰基酶并可可操作地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上以及(ⅱ)第二个可表达DNA序列，该序列编码牛促生长素并有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上的DNA序列转化细菌宿主细胞，b．鉴定既含有所述第一也含有所述第二可表达序列的转化的细菌宿主细胞，和c．在可使所述牛促生长素和所述肽脱甲酰基酶能够共表达的条件下培养步骤b中鉴定出的所述转化的细菌宿主细胞。
10．根据权利要求9的方法生产牛促生长素。
11．根据权利要求5,7,8或9的方法，其中(ⅰ)所述的第一个可表达DNA序列在一个至少含有一个标记基因的DNA分子上，(ⅱ)所述的第二个可表达DNA序列在一个至少含有一个标记基因的DNA分子上以及(ⅲ)所述的转化细菌宿主细胞被鉴定为含有至少一个标记基因所赋予的标记特征。
12．根据权利要求5,7,8或9的方法，其中所述的第一个和第二个可表达DNA序列可被有效地连接到不同的启动子上。
13．根据权利要求12的方法，其中所述的启动子至少有一个是吲哚丙烯酸诱导的色氨酸启动子。
14．根据权利要求12的方法，其中所述的第一个和第二个可表达DNA序列位于含有至少一个标记基因的同一DNA分子上。
15．根据权利要求12的方法，其中所述的第一个和第二个可表达DNA序列位于不同的DNA分子上，每种DNA分子至少含有一个标记基因。
16．根据权利要求5,7,8或9的方法，其中所述的第一个和第二个可表达DNA序列可被有效地连接到同一的启动子上。
17．根据权利要求16的方法，其中所述的启动子是一个吲哚丙烯酸可诱导的色氨酸启动子。
18．根据权利要求5,7,8或9的方法,其中所述转化细菌宿主细胞所生产的由所述第二个可DNA表达序列编码的蛋白的数量大于不含有第一个可表达DNA序列而在其它方面相同的细菌宿主细胞所生产的蛋白的80％。
19．根据权利要求5,7,8或9的方法，其中至少所述的可表达DNA序列之一被稳定地整合到细菌染色体中。
20．根据权利权利要求1,2,3,4,5,7或8的方法，其中所述的肽脱甲酰基酶的氨基酸序列同所述细菌宿主细胞内源性的肽脱甲酰基酶的氨基酸序列基本上相同。
21．根据权利要求1,2,3,4,5,7或8的方法，其中所述的细菌宿主细胞是肠杆菌科家族的成员。
22．根据权利要求1,2,3,4,5,7或8的方法，其中所述的细菌宿主细胞是大肠杆菌。
23．根据权利要求22的方法，其中所述肽脱甲酰基酶的氨基酸序列同大肠杆菌的肽脱甲酰基酶的氨基酸序列基本相同。
24．根据权利要求22的方法，其中所述的细菌宿主细胞是大肠杆菌K12株。
25．一种提高大肠杆菌宿主细胞中肽脱甲酰基酶产量的方法，该方法包括a．用含有(ⅰ)一个标记基因和(ⅱ)一个能够可操作地连接到在大肠杆菌中有效的启动子上的，编码大肠杆菌肽脱甲酰基酶基因的可表达DNA序列的DNA分子转化大肠杆菌宿主细胞，b．鉴定出具有由标记基因赋予的标记特征的转化的大肠杆菌宿主细胞，以及c．在能够导致所述转化大肠杆菌宿主细胞比未转化的大肠杆菌宿主细胞生产出更多的肽脱甲酰基酶的条件下，培养在b步骤中鉴定出的所述转化的大肠杆菌宿主细胞。
26．根据权利要求25的方法，其中所述的启动子是化学可诱导的，并且在存在一定量的诱导化合物的情况下培养所述转化大肠杆菌宿主细胞，该诱导化合物的量足以有效地使肽脱甲酰基酶产量提高到所需的水平，即在未转化的大肠杆菌宿主细胞的生产水平和所述转化的大肠杆菌宿主细胞的最大产量之间的水平。
27．根据权利要求26的方法，其中所述的启动子是吲哚丙烯酸可诱导的色氨酸启动子，而所述诱导化合物是吲哚丙烯酸。
28．含有能够可操作地连接到在大肠杆菌中有效的启动子上、编码大肠杆菌肽脱甲酰基酶的DNA序列的转化的大肠杆菌宿主细胞，所述转化的大肠杆菌宿主细胞能够比未转化的大肠杆菌宿主细胞生产出更多的肽脱甲酰基酶。
29．根据权利要求28所述转化的大肠杆菌宿主细胞，进一步含有一个编码重组蛋白的DNA序列，该DNA序列可可操作地连接到在大肠杆菌中有效的启动子上，同没有用权利要求24所述的DNA序列转化而在其它方面相同的转化的大肠杆菌宿主细胞所生产的重组蛋白相比较，这一转化的大肠杆菌宿主细胞能够生产更少甲酰化的所述重组蛋白。
30．根据权利要求29所述的转化的大肠杆菌宿主细胞，其中所述的重组蛋白是大肠杆菌色氨酸合成酶α，色氨酸合成酶β，牛促生长素，鳗生长激素，大肠杆菌1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶，人粒细胞集落刺激因子，牛脂肪酸结合蛋白，牛细胞色素P450，炽热甲烷嗜热菌组蛋白A，人白细胞介素-5，人甲状旁腺激素，人γ-干扰素，大肠杆菌苏氨酸脱氨酶，或大肠杆菌TolQ膜蛋白。
31．根据权利要求30的转化的大肠杆菌，其中所述的重组蛋白是人粒细胞集落刺激因子，牛促生长素，人γ-干扰素或人白细胞介素-5。
32．一个转化的大肠杆菌宿主细胞，含有a．第一个可表达的DNA序列，编码大肠杆菌肽脱甲酰基酶并有效地连接到在大肠杆菌中有效的启动子上；以及b．第二个可表达的DNA达序列，编码牛促生长素并有效地连接到在大肠杆菌中有效的启动子上；同没有用第一个DNA序列转化而在其它方面相同的转化的大肠杆菌宿主细胞生产的牛促生长素相比较，其中所述的转化的大肠杆菌宿主细胞能够生产出含有较少甲酰化甲硫氨酸的牛促生长素。
33．根据权利要求32的转化的大肠杆菌宿主细胞，其中(ⅰ)所述的第一个可表达DNA序列在一个至少含有一个标记基因的DNA分子上，(ⅱ)所述的第二个可表达DNA序列在一个至少含有一个标记基因的DNA分子上以及(ⅲ)所述的转化的大肠杆菌宿主细胞具有一个标记特征，该特征是由至少一个标记基因所赋予的。
34．根据权利要求32的转化的大肠杆菌宿主细胞，其中所述的肽脱甲酰基酶和所述的牛促生长素有效地连接到同一启动子上。
35．一种DNA组合物，使用所述DNA组合物转化的细菌宿主细胞能够生产降低了N-甲酰甲硫氨酸残留的重组蛋白，所述DNA组合物含有a．第一个可表达DNA序列，编码肽脱甲酰基酶并能够有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上，以及b．第二个可表达DNA序列，编码重组蛋白并能够有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上。
36．一种DNA组合物，使用所述DNA组合物转化的细菌宿主细胞能够生产具有降低的N-甲酰甲硫氨酸残留的牛促生长素，所述DNA组合物含有a．第一个可表达DNA序列，编码肽脱甲酰基酶并能够有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上，以及b．第二个可表达DNA序列，编码牛促生长素并能够有效地连接到在所述细菌宿主细胞中有效的启动子上。
37．根据权利要求35或36的DNA组合物，包括a．含有第一个标记基因和有效地连接到第一个启动子上的第一可表达DNA序列的第一DNA分子，和b．含有第二个标记基因和有效地连接到第二个启动子上，第二个可表达DNA序列的第二个DNA分子。
38．根据权利要求35或36的DNA组合物，包括含有a．一个标记基因，b．有效地连接到了第一个启动子上的所述第一个可表达DNA序列，以及c．有效地连接到了第二个启动子上的所述第二个可表达DNA序列，的DNA分子。
39．根据权利要求35或36的含有DNA分子的DNA组合物含有a．一个标记基因，以及b．有效地连接到一个单独的启动子上的所述第一个和第二个DNA序列，的DNA分子。
40．一种含有细菌宿主细胞所生产的重组蛋白的组合物，其中96100％的重组蛋白是脱甲酰化的。
41．一种含有细菌宿主细胞所生产的重组蛋白的组合物，其中98％-100％的重组蛋白是脱甲酰化的。
42．一种含有细菌宿主细胞所生产的牛促生长素的组合物，其中96-100％的牛促生长素是脱甲酰化的。
43．一种含有细菌宿主细胞所生产的牛促生长素的组合物，其中98-100％的牛促生长素是脱甲酰化的。
全文摘要
本发明公开了通过共表达一种肽脱甲酰基酶而生产滞留的N－甲酰—甲硫氨酸减少的重组肽和蛋白的方法。也公开了一种基本上去甲酰化的蛋白组合物和用于达到这种去甲酰化目的的转化细菌细胞和DNA载体。
文档编号C07K14/54GK1230994SQ97198027
公开日1999年10月6日 申请日期1997年7月17日 优先权日1996年7月19日
发明者G·波戈思安 申请人:孟山都公司