从转基因非人动物中纯化高级转录复合物的制作方法

专利名称：从转基因非人动物中纯化高级转录复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有编码已附加表位的TATA框结合蛋白(TBP)的DNA的转基因、产生表达已附加表位的TBP的转基因动物和使用它们从各种类型的真核组织和细胞亲和纯化(新的)转录因子和转录复合物。
对真核转录过程的调节重要的是前起始复合物的逐步形成和活性。此复合物是一种大的多亚基复合物，对于RNA聚合酶II酶在转录起始点的正确定位和起始是必需的。在最近几年，从真核生物的核中鉴定了这种复合物的许多一般转录因子(GTFs)，包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH(Zawel和Reinberg(1995)生物化学年度综述64，533-561；Serizawa等(1994)，“转录机制和调节”，45-66，Raven出版社)。在含有TATA的启动子中，TFIID和TATA框序列具有特异性的亲和性。正是通过这种序列识别出TFIID是在基础RNA聚合酶II转录中结合启动子的首要因素，因此是形成复合物的核心(Lewin，B.(1990)细胞.611161-1164)。其它的GTFs以确定的逐步的方式结合，产生了整个前起始复合物。其后，这种大的复合物在转录起始点征集并且使RNA聚合酶II(Pol II)正确定位以开始基础转录。因此，可以看出本身为多亚基复合物的TFIID在调节″活化的转录″中起关键作用，也可以说成在转录激活物的存在下mRNA的产生水平提高了。这样的激活物可以是天然存在的结合增强子的决定簇(如结合E框的USF(Sawadogo和Roeder(1985)细胞43165-175；Kirschbaum等(1992)分子细胞生物学125094-5100))或病毒因子(例如VP16(Stringer等(1990)自然345783-786))。
TFIID是由结合TATA的蛋白质(TBP)和一些TBP相关性因子(TAF11s)(在本申请中″TAF11s”包括任何种类的转录因子、转录激活物、转录抑制剂)组成的。到目前为止已经鉴定了多达20种不同的TAF11s，同时观察到了含有TAF11s不同组合的TFIID复合物(Zawel和Reinberg(1995)生物化学年度综述64533-561；Hori，R.和Carey，M.(1994)当代遗传学的最新发展4236-244)。此外，TAF11s的不同组合导致了TFIID复合物不同的性质。例如，在果蝇属中，模式形成蛋白质Hunchback(HB)和Bicoid(BCD)完全依靠TFIID复合物中的TAF1160、TAF11110和TAF11250的存在(Sauer，F.等(1995)科学270，1783-1788)。这些TFIID组分作为上游结合增强子的HB和BCD蛋白质的共激活物。已经表明神经原因子NTF-1需要TBP、TAF11150(NTF-1与之结合)和TAF11250的最小复合物来激活转录，而SP1需要附加的因子TAF11110来激活(Chen，J.-L.等(1994)细胞7993-105)。另一个研究确定了TAF1128，它的存在对于转录激活(通过雌激素与维生素D3核受体)是必需的(May，M.等(1996)EMBO 15.3093-3104)。很可能TAF11s作为转录衔接子通过蛋白质-蛋白质相互作用从活化剂/阻遏物因子向核心起始复合物传递调节信息。
从目前转录的调节来看，单个基因和/或密切相关基因座小组的表达是由一定数目的转录复合物的亚基控制的。尽管一些因子在大多数转录过程中是普遍存在的(例如GTFs)，但是人们描述了数量不断增加的调节转录的基因和细胞特异性因子。已经存在一些被证明的用于鉴定转录因子的方法。揭示RNA Pol II和七个GTFs(TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、和TFIIJ)的先前的方法主要包括细胞系中的核制剂的柱分级分离(Zawel和Reinberg(1995)；Serizawa等(1994)；Roeder，R.G.(1996)TIBS 21327-335)。这些组分产生能够转录的各种半纯化的蛋白质。这些组分的大多数看来似乎对基础转录来说是完全必要的。在这一点上，已知TFIID组分负责识别TATA框。然而，没能成功地分离出能够结合TATA的单一蛋白质。当发现单一组分的酵母显示出在重建基础转录分析中能够代替TFIID，其能进行27kD的结合TATA的蛋白质(TBP)的分离与克隆，那么就会发生突破(Buratowski，S.等(1988)自然33437-42；Cavallini，B.等(1988)国家科学院学报869803-9809)。使用简并的引物对人TBP亚单位和小鼠TFIID的基因进行进一步鉴定((Kao，C.C.等(1990)科学2481646-1649；Hoffmann，A.等(1990)自然346387-390；Peterson，M.G.等(1990)科学2481625-1630)，Drosophila(Hoey，T.等(1990)细胞611179-1186；Muhich，M.L.等(1990)国家科学院学报87，9148-9152)；(Tamura，T.等(1991)核酸研究193861-3865))。
从不同物种能够得到TBP的cDNA使得各种各样的研究(包括在细胞培养物中过量表达这些蛋白质)成为可能。产生的HeLa细胞系在组成上表达了TBP蛋白质，该蛋白质具有FLAG-尾或者流感病毒血凝素(HA)附加表位加入到它的氨基末端(Zhou，Q.等(1993)基因和发展7，180-187，Chiang等(1993)EMBO 12，2749-2762)。FLAG-尾是由八个氨基酸的合成序列组成的表位。HA-尾是具有SEQ ID NO.1“MGYPYDVPDYAV”(单字母代码)的氨基酸序列的天然表位。
也将来源于天然的HA尾(来源于流感病毒血凝素的10个氨基酸)的较短的肽用于在果蝇属细胞系中表达含有TBP的融合蛋白上(Colgan和Manley(1992)，基因发展.6，304-331；Trivrdi等，(1996)分子细胞生物学16，6909-6916)。
在细菌中已经表达了氨基末端具有两个附加表位(FLAG-和HA-表位)的TBP蛋白质(Chiang等(1993)EMBO 122749-2762)。在诱导型启动子的控制下也表达了已附加FLAG的TBP蛋白质(Wu等，(1996)生物技术21718-725)。然而，将抗表位/表位的单克隆抗体用于从核提取物中纯化TBP相关性复合物，这样共纯化TFIID复合物的TBP相关性因子(TAF11s)(Zhou等，(1993)遗传学发展。7180-187)。
随着最近从HeLa核提取物和酵母中鉴定新的TAFs和TAF-相互作用因子，许多实验室按照这些方法继续研究(Hori和Carey(1994)遗传学的最新发展.4236-244；Zawel和Reinberg(1995)生物化学年度综述64533-561；Roeder，R.G.(1996)生物化学科学发展趋势21，327-335)。
在人体中鉴定了TAFs TAF1168、TAF1155、TAF1130、TAF1128、TAF1220和TAF1118(Mengus等(1995)EMBO 141520-1531；Bertolotti等(1996)EMBO 155022-5031；Wu和Chiang(1996)生物技术21718-725)不能过分强调的是尽管按照这些方法发现了大量的因子，但是也不能把研究只局限于对细胞系类型或者目前正在使用的酵母菌株具有特异性的转录复合物、TAFs、和TAF-相互作用因子上。
本发明涉及一种更″通用的系统″，其中使用已附加表位的TBP来从各种不同类型的真核组织和细胞中亲和纯化新型转录复合物和转录因子(本文中所有动物的TAFs、TAF-相互作用因子)。
本发明涉及能够表达已附加表位的TATA框结合蛋白(TBP)的转基因非人动物。另一方面，本发明涉及到转基因非人动物的用途，特别是用于鉴定与分离高级转录复合物和用于鉴定与分离在高级转录复合物中相关的蛋白质(TAFs和TAF-相互作用因子，如转录因子)中的蛋白质。另一方面本发明涉及优选地在动物的特殊发育阶段，通过将转基因引入到非人转基因动物的种系和/或体细胞中，从而制备非人转基因动物。本发明还涉及可以用于产生转基因非人动物的转基因。
这样，本发明的实施方案提供了编码已附加表位的TBP的转基因。转基因优选地含有编码一个或多个附加表位的第一种DNA序列和含有编码TBP的第二种DNA序列。所说的转基因还可以含有编码附加表位的DNA-序列。编码TBP的DNA优选的是cDNA。编码TBP的DNA可以是任何天然产生的DNA、其衍生物或者它的一部分。DNA(优选的是cDNA)可以来源于真核生物例如包括鸟、两栖类、爬行类、酵母、C.elegans、哺乳动物等等。例如可以使用来源于啮齿动物、绵羊、狗、母牛、猪、灵长类和人的编码TBP的DNA或者它的一部分。优选的是使用人TBP(hTBP)-cDNA。本发明也包含任何非天然存在的DNA(例如TBP-cDNA衍生物)的用途。DNA的衍生物例如可以具有改变的序列，例如突变的或者修饰的序列和/或包含修饰的核苷酸。此DNA的衍生物也可以是盐，优选的是生理上可耐受的盐。
转基因包含一种或多种DNA序列，所说的DNA序列编码一个、两个、三个、四个、五个或者更多的附加表位。优选地，所说的转基因含有编码两个附加表位的DNA。编码个体附加表位的DNA可以位于编码TBP的DNA的5’-和/或3’末端，和/或位于编码TBP的DNA序列中间合适的位置上。编码个体附加表位的DNA可以是分开的，和/或以串联的方式排列，或者彼此直接邻近。
可以使用任何天然或者合成的肽作为附加表位。每一附加表位都以带有TBP的融合蛋白形式表达，所说的附加表位例如可以与TBP直接连接或者通过间隔肽连接。优选地，附加表位应该可以使TBP或者融合蛋白进行亲和纯化，也可以使与TBP或者所说的融合蛋白结合的蛋白质(如TAFs和TAF-相互作用因子)进行亲和纯化。此外，当附加表位表达成带有TBP的融合蛋白时，其不应该破坏TBP的功能活性。为此，优选使用较短的肽作为附加表位。它们可以包含大约1-50或更多的氨基酸，特别是使用包含5-15个氨基酸的肽。可用作附加表位的肽的非限制性例子是FLAG-表位、HA-表位、多个组氨酸残基(6-10个组氨酸残基或者更多，优选的是6个组氨酸残基)(His尾)、Myc尾(Stone等，(1996)自然384129-134)、抗生蛋白链菌素尾和其它。例如HA-表位的用途包括表位“MGYPYDVPDYA“(SEQ ID NO.2)、”GYPYDVPDYA”(SEQ ID NO.3)、″YPYDVPDYA″(SEQ ID NO.4)或者其它来源于HA-表位的肽的用途。
在本发明的一个实施方案中所说的转基因包含人TBP的cDNA和两个编码附加表位的DNA序列。优选的是第一个DNA序列编码HA表位，这种表位可以用作免疫反应(例如与市售的单克隆抗体)的表位(Kolodziej和Young(1991)酶学方法194508-519)。编码6个组氨酸残基(His尾)的一段DNA序列恰好位于编码HA尾之序列的3’端。此His尾可以与Ni2+离子形成非共价的可逆的复合物。例如，通常使用市售的Ni2+的琼脂糖亲和柱物质来纯化已附加His的蛋白质(Hochuli，E.等(1987)层析杂志411177-184；Janknecht，R.等(1991)国家科学院学报744835)。在本发明的一个特定的实施方案中转基因包含SEQ ID NO.13的DNA序列。所说的SEQ ID NO.13提供了编码由双加尾的hTBP组成的融合蛋白的转基因。
在优选的实施方案中，本发明提供了编码已附加表位的TBP以及含有用于表达所说的融合蛋白的启动子的转基因。除了编码TBP的DNA(如TBP的cDNA或者其衍生物)和编码附加表位的DNA序列外，所说的转基因可以包含一个或多个基因调节序列。这样的基因调节序列，例如是天然的或者合成的启动子或者它的一部分、和/或顺式作用元件(例如增强子、沉默子)。为此，可以使用哺乳动物启动子，例如小鼠运铁蛋白基因的启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因的启动子(Forss-Petter，S.等(1990)神经元5187-197)、或者胸苷激酶基因的启动子。也可以使用病毒启动子(如巨细胞病毒基因或者SV 40早期基因的启动子)。优选使用可诱导的或者组成型启动子或者它们的衍生物。可以使用，例如人延伸因子-1α基因(EF)(Uetsuki，T.等(1989)生物化学杂志2645791-5798)的启动子作为组成型启动子。可以使用，例如具有几个顺式元件的金属硫蛋白启动子(MT)作为诱导型启动子，这些顺式元件对重金属能够作出响应(Palmiter，R.D.(1987)Experimentia Supplementum 5263-80，BirkhuserVerlag)。另外，为此，可以使用例如具有细胞周期特异性、细胞类型特异性或者发育特异性的基因启动子。
在本发明的一个特定的实施方案中转基因包含hTBP的cDNA和编码HA表位(例如天然的HA表位的9个氨基酸)、His表位(例如6×his尾)的DNA序列以及组成型启动子。例如，人延伸因子-1α(EF)的启动子控制TBP的表达(Uetsuki等(1989)生物化学杂志2645791-5798)。EF启动子是没有TATA的启动子，使用此启动子已经在小鼠中以中等但恒定的水平表达转基因(Hanaoka，K.等(1991)分化，183-189)。在本发明的一个特定的实施方案中，所说的转基因包含编码双加尾(HA和His表位)的hTBP的DNA序列和EF启动子的序列，具体地说，所说的转基因具有SEQ ID NO.14的DNA序列。
在本发明另一个特定的实施方案中转基因包含编码TBP的DNA(优选的是hTBP的cDNA)、编码HA(例如天然HA表位的9个氨基酸)和His表位(例如6×his)的DNA序列、诱导型启动子。优选地，诱导型启动子是金属硫蛋白启动子(MT)。例如，如果向动物的基因组导入额外的TBP编码序列和随后TBP或者TBP融合蛋白的表达对动物有毒，本发明的这一实施方案将使所说的动物，在导入所说的启动子之前能够忍受编码TBP融合蛋白的转基因(此基因保持沉默)。例如可以在所说的动物完全发育成熟时或在任何感兴趣的发育阶段诱导所说的启动子，例如可以通过腹膜间注射含有二价阳离子(如Zn2+、Mg2+、Mn2+或者Cd2+)的溶液来诱导MT启动子。用其它的模型已经证明在MT指导下，基因的表达水平有所提高(Palmiter，R.D.等(1982)细胞29701-710)。在本发明的一个特定的实施方案中，所说的转基因包含编码双加尾的hTBP(HA和His表位)的DNA序列和MT-启动子，具体地说，此转基因具有SEQ ID NO.15的DNA序列。
本发明还涉及通过将编码一个或多个附加表位的DNA序列与编码TBP蛋白质的DNA序列连接以产生转基因的方法。
本发明还涉及所说的转基因的用途。例如所说的转基因可以用于制备重组载体。
本发明也涉及制备重组载体的方法。此方法包括将所说的转基因整合到合适的载体(例如含有调节序列的载体)中。载体的例子是表达载体、反转录病毒或者它的衍生物。
本发明还涉及含有所说的转基因的重组载体的用途。尤其是本发明涉及包含转基因的重组载体的用途(如包含TBP(尤其是hTBP)的cDNA或者它的衍生物、编码附加表位的DNA序列(例如HA和His表位的编码DNA序列)的重组载体)。本发明涉及此载体用于将所说的转基因引入到真核细胞(特别是引入到哺乳动物细胞)的用途。本发明还涉及含有这种转基因的载体用于在细菌或真核细胞中扩增所说的转基因的用途。已经导入了含有所说的转基因的载体的真核细胞也可以用于转基因的异源/转基因表达。所说的真核细胞(宿主细胞)可以是转基因动物的一部分。
在本发明的一个主要的实施方案中转基因用于制备转基因非人动物。因此，可以将转基因或者含有转基因的重组载体引入到宿主细胞和/或动物中。另一方面本发明涉及通过将所说的转基因引入到动物或者它的细胞中而产生的转基因非人动物。按照本发明的转基因动物能够表达或者过量表达TPB或者含有或者由已附加表位的TBP组成的融合蛋白。
为了制备转基因动物，使用非人动物作为宿主动物。这种非人动物包括脊椎动物(如啮齿动物)、非人灵长目、绵羊、山羊、狗、母牛、猪、鸟、两栖类、爬虫等等。优选的动物选自动物的非人哺乳动物种类，优选地，所说的动物选自啮齿动物科(包括大鼠和小鼠)，最优选的是小鼠。
按照本发明的转基因非人动物包括任何其基因组上已经导入了一个或多个拷贝的转基因的动物，所说的转基因指导基因的表达、或者编码TBP或它的衍生物(如包含TBP和附加表位的融合蛋白)。所说的转基因动物应该能够表达已附加表位的TBP蛋白质。在本发明的一个特定的实施方案中，转基因动物可以具有内源TBP基因的转基因的间断或者改变(剔除动物)。
按照本发明的转基因动物是通过非天然的手段(即通过人的操作)已经将一个或多个TBP基因(按照本发明的转基因)导入到其中的动物，所说的TBP基因不是所说的动物天然存在的基因，如外源TBP基因或者它的衍生物(象通过基因工程方法产生的内源或外源TBP基因)。非天然存在的TBP基因称为转基因。转基因可以来自与所说的动物相同或者不同的物种，但是在任何情况下，所说的转基因绝不以所说的构象天然存在于所说的动物和/或此转基因的染色体位点上。
所说的转基因(转基因DNA)可以包含编码TBP的外源基因，即通常在宿主动物的基因组中不存在的序列，如从不同的动物种类中获得的TBP基因或者cDNA。另外，转基因可以包含编码TBP的内源基因，如不正常的DNA序列，这是因为体外已经将这些序列进行了重排或突变以便改变TBP基因体内正常的表达模式，或者改变或消除内源TBP的生物活性。本发明也涉及表达载体，这些表达载体含有所说的转基因并可以用于制备所说的转基因动物。
本发明还涉及制备本发明的转基因动物的方法。可以通过将转基因和/或载体(如含有转基因的表达载体)分别引入到种系或者种系细胞和/或非人动物的体细胞中来产生按照本发明的转基因动物。例如各种发育阶段的胚靶细胞都可以用来导入本发明的转基因。根据胚靶细胞的发育阶段可以使用不同的方法。列举如下1.在实施本发明的过程中，合子胚的微注射是将转基因导入到动物基因组中的理想方法。微注射包括在单细胞阶段分离胚。因此，还没有经过生殖核融合或接下来的细胞分裂的合子胚(受精卵)对于转基因DNA(转基因的DNA)的微注射是理想的靶细胞。当鼠的雄性生殖核直径达到大约20微米时，它的特性是经过1-2微微升的含有转基因DNA的溶液注射后，具有再生性。合子胚用于导入转基因的好处是，在大多数情况下所注射的转基因DNA在第一次细胞分裂之前将掺入宿主动物的基因组中(Brinster，等(1985)国家科学院学报824438-4442)。结果，所得的转基因动物(新出生的动物)的所有细胞都在特定的基因座位上稳定地携带有掺入的转基因(称作转基因的等位基因)。这些转基因的等位基因表现出孟德尔遗传规律转基因动物和非转基因动物杂交所得的子代有半数将遗传转基因的等位基因，符合孟德尔的随机分配规律。
“转基因动物技术-实验手册”(Carl A.Pinkert编辑，学院出版社公司(1994))中详细描述了通常使用的胚操作和转基因DNA微注射的方法。
2.病毒整合也可以用于将按照本发明的转基因引入到动物中。将正在发育的胚体外培养使之发育到称作卵裂球的发育阶段。此时，用含有转基因的载体(转基因DNA/DNA构建体)感染卵裂球，例如可以使用合适的病毒或者逆转录病毒载体达到此目的(Jaenich，R.(1976)美国科学院学报731260-1264)。可以通过酶促除去透明带来增强卵裂球的转化或者感染(Hogan，等(1986)小鼠胚的操作，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)。如果通过病毒载体将所说的转基因引入到卵裂球中，一般这种载体是复制缺陷型的，但是它们保留了将与载体序列连接的转基因DNA序列整合到宿主动物的基因组上的能力(Jahner等(1985)美国科学院学报826927-6931；Van der Putten等(1985)美国科学院学报826148-6152)。通过在能够产生含有转基因之载体的单层细胞上培养卵裂球可以很容易且有效地完成转染(Van der Putten等(1985)美国科学院学报826148-6152；Stewart等(1987)EMBO 6383-388)。
此外，可以在更晚的阶段(如囊胚腔)时进行感染(Jahner，D.等(1982)自然298623-628)。在任何情况下，大多数新出生的转基因动物是经逆转录病毒或病毒整合到所有细胞中的仅一个上而产生的。此外，多个(逆转录)病毒的整合可以发生在单个新出生的动物上，产生多个转基因的等位基因，这些等位基因在将来产生子代的过程中将分离。通过这种方法将转基因导入到种系细胞是可能的，但是可能导入的频率很低(Jahner，D.等(1982)自然298623-628)。然而，一旦用这种方法将转基因导入到种系细胞中，就可以产生所有的动物细胞(即体细胞和种系细胞)中都存在转基因的等位基因的子代。
3.胚干(ES)细胞也可以用作将按照本发明的转基因导入到动物中的靶细胞。可以从植入前胚获得ES细胞，这种胚可以进行体外培养(Evens，M.J.等(1981)自然292154-156；Bradley，M.O.等(1984)自然309255-258；Gossler，等(1986)美国科学院学报839065-9069；Robertson等(1986)自然322455-448；Robertson，E.J.，畸形癌和胚干细胞实用方法，Robertson，E.J编辑，IRL出版社，牛津(1987)，71-112页)。可以使用一个或多个转基因通过已经建立的方法转化市售(例如从基因组系统公司，St.Louis，MO)的ES细胞(Lovell-Badge，R.H.，畸形癌和胚干细胞实用方法，Robertson，E.J编辑，IRL出版社，牛津(1987)，153-182页)。转化的ES细胞可以与动物卵裂球结合在一起，这样ES细胞定居在胚上并有助于产生的嵌合体(由来源于两个或更多的动物的细胞组成的)动物的种系(Jaenisch，R.(1988)科学2401468-1474；Bradley，A.，畸形癌和胚干细胞实用方法，Robertson，E.J编辑，IRL出版社，牛津(1987)，113-151页)。一旦用这种方法将转基因导入到种系细胞中，就可以产生所有的动物细胞(即体细胞和种系细胞)中都存在转基因的等位基因的子代。
然而，转基因的最初引入不符合孟德尔规律。但是，本发明的转基因可以稳定地整合到种系细胞中，并以孟德尔基因座传递给转基因动物的子代。种系的整合对产生能够将遗传信息以孟德尔方式传递给其子代的转基因动物，并能够以永久的动物模型使用这些转基因动物是至关重要的。
其它的转基因技术导致嵌合体转基因动物的产生，这些动物中一些细胞携带转基因，而其它细胞不携带转基因。在种系细胞不携带转基因的嵌合体转基因动物中，转基因不能传递给子代。然而，嵌合体转基因动物能够表现出与转基因有关的表型，并且可以用于特定转录复合物(TAFs和TAF相互作用的因子)的亲和纯化。本发明涉及含有本发明所描述的转基因的嵌合体转基因动物。
本发明还涉及转基因引入的突变，所说的突变包括无效(“剔除”)等位基因，在这些等位基因中，编码物种特异性TBP的DNA序列发生缺失和/或在选择的启动子/增强子控制之下由遗传上发生改变的同一或不同物种的TBP序列代替。
本发明涉及已经导入了转基因的转基因动物，所说的转基因包含编码已附加表位的TBP的DNA，如果需要还包含本文提到的组成型或者诱导型启动子。具体地说，本发明涉及已经导入了转基因的转基因动物，所说的转基因包含编码已附加HA和His表位的hTBP的DNA序列和EF启动子的DNA序列。在另一个特定的实施方案中，本发明涉及已经导入了转基因的转基因动物，所说的转基因包含编码已附加HA和His表位的hTBP的DNA序列和MT启动子的DNA序列。在本发明一个特定的实施方案中，转基因动物的转基因具有SEQ ID NO.13的序列。本发明的另一个转基因动物的转基因具有SEQ ID NO.14的序列。本发明的另一个转基因动物的转基因具有SEQ ID NO.15的序列。具体地说，本发明涉及转基因动物，这种转基因动物具有已稳定整合到其基因组上的转基因(例如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和/或SEQ IDNO.15的DNA序列)。
通过分析子代的遗传物质，检测包含相当于转基因序列的唯一序列的生物分子或由转基因编码的生物分子是否存在，可以将已遗传了转基因的子代与没有遗传转基因的子代区别开。例如，可以对含有只由按照本发明的转基因编码的多肽(例如已附加表位的TBP)的生物液体进行免疫测定，以检验由转基因编码的多肽(如已附加表位的TBP)是否存在。鉴定转基因子代的更简单和更有效的方法包括从动物的远端(如尾巴)获得组织样品，并分析样品中是否存在对应于本发明转基因特有的一部分或几部分之DNA序列的核酸序列。例如可以通过使用对应于所说的转基因特有的部分的DNA序列的杂交(“Southern”、“Northern”)分析、以样品中的DNA序列作为底物和使用来源于转基因的DNA序列的寡核苷酸的PCR反应产物的分析等等来确定所说的核酸序列是否存在。
因此，本发明也涉及检验方法，在这种检验方法中可以检验可能的第一代转基因动物(Go)以及所有的后代转基因动物(G1、G2、G3、G4...)或转基因动物品系的动物是否存在所说的转基因(例如通过标准的PCR反应)。为此，可以在蛋白酶K和RNAse处理后，从动物组织(如尾组织)中提取基因组DNA。对于这种PCR反应，引物序列应该相当于部分转基因的序列，例如在启动子区内，编码附加表位的DNA区和/或特定TBP构建体独有的DNA区。在小鼠的这种PCR反应中，例如可以在大约25％注射的卵中检测到相应的PCR产物，即大约25％的小鼠产生阳性子代。
另一种检验动物是否携带转基因的方法涉及到检验可能的转基因动物/转基因动物品系中是否存在转基因mRNA。例如最初的实验可以通过S1分析进行，这种分析对少量的mRNA是十分敏感的(Berk，A.J.和Sharp，P.A.(1977)细胞12，721)。为此，使用从动物组织中分离的总RNA杂交标记的反义寡核苷酸。然后，通过S1核酸酶消化所有的单链核酸、DNA和RNA。双链DNA或者DNA-RNA杂交体保持完整。如果存在任何的转基因mRNA，其将与反义寡核苷酸杂交，因此“保护”其免受S1核酸酶的消化。
本发明包括通过S1保护测定检测组织制剂(如总肝mRNA的制剂)中是否存在转基因mRNA。可以合成与部分转基因mRNA(如对应于已附加表位之TBP的DNA序列的mRNA)互补的反义寡核苷酸。例如可以经5’-末端标记寡核苷酸，例如使用32S、33P、35P、3H或14C进行放射性标记、或者使用荧光标记物或其它类型的标记物(如生物素或者地高辛配基)进行标记。按照标准方案(Sambrook等，1989)在选择性杂交条件下将标记的寡核苷酸与转基因小鼠的mRNA混合。然后将所得的混合物用S1核酸酶处理。没有配对序列的短区(如寡核苷酸的3’-末端)应该一定被消化掉，这些短区提供了内部对照以表明所说的S1核酸酶确实消化了所有可能的单链的核酸。在转基因mRNA存在时，标记的寡核苷酸应该免受消化，并且例如通过测序型变性凝胶(如8M脲PAGE)电泳可以很容易地检测它的存在和大小。例如可以通过将凝胶曝光在胶片上来检测没有消化的标记寡核苷酸的存在。如果没有转基因mRNA，曝光后不会显示出任何带，这是因为没有保护的寡核苷酸将由S1核酸酶消化。本发明包括从所说的动物中制备与不同细胞类型有关的不同组织和细胞，并检测转基因mRNA的存在。
本发明的另一个实施方案涉及通过Northern分析检验转基因动物。最优选的是通过Northern分析进一步检验经PCR或者S1核酸酶图谱已经证明为转基因mRNA阳性的转基因动物(McMaster，G.K.和Carmichael(1977)国家科学院学报744835)。为此，可以从不同的组织和/或细胞类型中分离总RNA，并且在琼脂糖凝胶上(例如在变性条件下)将大小不同的片段分开。然后例如使用毛细管转移和UV交联将所得的RNA结合到膜或滤膜上。在常规的Northern印迹条件下使用相当于转基因编码区或其部分的标记探针(例如使用相当于SEQ ID NO.13的转基因5’端的DNA探针)检测结合的RNA。这种DNA探针优选的长度为大约20-1000碱基对(bp)。它们最优选的长度为大约100、200、300、400和500bp。如果需要将过量的标记探针冲洗掉，并将此膜在胶片上曝光。按照如上所述标记寡核苷酸的方法来标记这些探针。有时寡核苷酸也可以用于这些Northern印迹实验中。
使用特异性免疫反应(例如使用Western印迹分析或者ELISA)检测转基因动物(优选的是在任何其它的分子生物学检验中已经证明为阳性的转基因动物)中是否存在转基因TBP蛋白质。因此从所说的动物的组织或特定的细胞(优选的是从肝脏组织或任何其它的软组织)中通过标准方法(如在超离心的蔗糖梯度上)分离核。例如可以通过高盐溶液(如400mM KCl)和非离子表面活性剂(例如NP-40)处理所说的核来从这些核中收集总核蛋白。之后，例如使用合适的变性凝胶电泳(优选的是SDS-PAGE)将核蛋白按照大小不同分开。例如可以通过电转移法将这种凝胶转移到固体表面(如膜或者滤膜，优选的是硝化纤维素膜)上。然后，按照标准方案(Sambrook等″分子克隆″再版(1989)，冷泉港实验室出版社)将膜或滤膜进行预封阻并使用合适的抗体进行检测。
为此，可以使用例如在小鼠、兔、大鼠、绵羊、山羊、马、鸟等等中产生的多克隆和/或单克隆抗体。可以使用能够识别TBP融合蛋白并能够与酶或标记物(如碱性磷酸酶或者荧光标记物或者生物素或者地高辛配基或者放射标记物)结合的抗体直接进行检测。也可以通过使用能够识别一级抗体保守区的二级抗体(例如当在小鼠中产生第一种抗体时，二级抗体必需是在例如绵羊中产生的抗小鼠的抗体)间接进行检测。这种二级抗体也可以与用于检测的酶或者其它标记物结合。
本发明还涉及转基因或其部分、或者所编码的融合蛋白或者其部分在产生抗体中的用途，所说的抗体能够与所说的转基因编码的已附加表位的TBP结合，例如本发明涉及单克隆或者多克隆抗体的制备。
与本发明有关的抗体是能够识别一个或多个TBP融合蛋白表位的抗体。这些抗体可以直接抗属于TBP的各个表位，和/或可以直接抗附加表位。本发明的一个实施方案涉及能够识别TBP融合蛋白的氨基末端区的抗体。本发明的另一个实施方案涉及能够识别TBP融合蛋白的羧基末端区的抗体。本发明的另一个实施方案涉及能够识别氨基酸序列部分附近的表位的抗体，在这段氨基酸序列中TBP和附加表位和/或两个附加表位连接在一起。
本发明的一个实施方案涉及能够识别融合蛋白表位的抗体，所说的融合蛋白由hTBP和两个附加表位组成。具体地说，所说的抗体能够识别由His-和HA-尾及hTBP组成的融合蛋白的表位。最优选的是抗体能够HA-和His加尾的TBP氨基末端的表位。本发明特定的实施方案涉及能够识别SEQ ID NO.16氨基酸序列的抗体或者能够识别具有SEQ IDNO.16氨基酸序列或其部分且正确折叠的融合蛋白表位的抗体。本发明涉及能够识别SEQ ID NO.17氨基酸序列或其正确折叠的表位(优选的是本文的TBP融合蛋白)的抗体(抗TBP抗体)。
本发明的抗体可以是多克隆或者单克隆抗体。可以在非人动物的所有物种中产生抗体，优选地从小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、马、鸟(例如从鸟蛋中)产生。可以按照标准方案产生这种抗体(Hurlow和lane，“抗体”“实验室手册”(1988))冷泉港出版社)。如果需要可以使用原来的免疫肽(表位)亲和纯化抗体。本发明的一个特定的实施方案涉及一种在兔中产生的多克隆抗体，这种多克隆抗体是用具有SEQ IDNO.17序列的肽通过兔免疫产生的(例如连接到合适的载体蛋白质上)。多克隆抗体(抗TBP抗体)识别hTBP融合蛋白(HA和His尾)。
与本发明有关的抗体可以用于Western印迹分析、TPB融合蛋白的亲和纯化、与TBP融合蛋白相关的高级转录复合物的亲和纯化。高级复合物包含与TBP融合蛋白相关的TAFs和TAF-相互作用因子。
本发明涉及转基因动物的用途。按照本发明的转基因动物可以用于从转基因动物组织和/或培养的转基因动物细胞中亲和共纯化高级转录复合物、TAFs和TAF-相互作用因子。可以从各种不同的组织和/或细胞类型中分离并纯化这种高级转录复合物。优选地，从这种组织/细胞类型中制备核制剂，最优选的是从均质化的细胞中按照标准方案制备核制剂(Dignam等(1983)核酸研究111575；Lichtenstein等(1987)细胞51963-973；Gorsky等(1986)细胞47767-776)。如果需要，然后可以通过标准方法收集核蛋白。因此，本发明也涉及从转基因动物中亲和共纯化高级或转录复合物、TAFs和TAF-相互作用因子的方法。
例如，本发明涉及通过使用表位-特异性抗体或带电荷(正电荷或负电荷)的物质对高级转录复合物TAFs和TAF-相互作用因子进行亲和纯化。例如，可以将已详细描述的抗体用于所说的亲和纯化。包含已附加HA和His表位的TBPs(优选的是hTBPs)的最优选的共纯化方法之一包括使用Ni2+和/或抗HA抗体(例如市售的抗体)和/或识别SEQ ID NO.17序列之表位的抗体进行亲和纯化。可以将这种抗体或者Ni2+连接到合适的柱物质上，以便能够通过使用例如Ni2+柱或带有特异性抗体的柱(例如具有抗HA抗体或者抗TBP抗体的柱)进行亲和纯化。
在本发明的另一个实施方案中涉及TBP融合蛋白、已附加表位的TBP。优选的TBP融合蛋白是在转基因动物中表达的。特别是本发明涉及一种hTBP融合蛋白。可以从转基因动物中分离和纯化TBP融合蛋白。本发明的一个实施方案是已附加HA和His的TBP蛋白质，特别是已附加HA和His的hTBP蛋白质。本发明的另一个实施方案是具有SEQID NO.16氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个实施方案中TBP融合蛋白含有一个或多个蛋白酶或肽酶的切割位点，例如凝血酶切割位点。在融合蛋白的氨基酸序列内优选的切割位点是在附加表位和TBP-蛋白质之间。
本发明涉及到制备TBP融合蛋白的方法，其中在合适的宿主细胞中表达按照本发明的转基因，所说的宿主细胞优选的是在转基因动物中的。
可以在转基因动物中发现的不同类型的组织和/或细胞(例如大脑、心脏、肾、肝、肺脏、神经系统、肌肉、腺、骨髓、属于免疫系统的细胞、皮肤等)中分离转基因mRNA和/或由转基因编码的TBP融合蛋白和/或与TBP融合蛋白相关的高级转录复合物。
本发明涉及到TBP融合蛋白的用途，特别是用于从转基因动物中分离高级转录复合物以及鉴定从不同的物种、不同的组织和/或不同的细胞类型中得到的分离的高级转录复合物。因此，按照本发明的转基因动物和TBP融合蛋白可以用于分离和鉴定单个的蛋白质，例如在不同的高级复合物中相关的TAFs和TAF相互作用因子。例如，可以分开和分离在特殊的高级转录复合物中相关的蛋白质，因此可以鉴定单个的TAFs和TAF相关性因子。至少在一定程度上在不同的高级复合物(组织和/或细胞类型和/或发育阶段和/或表达的转基因不同)中的TAFs和TAF-相互作用因子的组成是不同的。
可以快速鉴定TAFs和TAF-相互作用因子，特别是已经鉴定的组织特异性因子和已经存在抗体的因子，并且评价它们和转录复合物相关的程度。Bob-I/OCA-B因子就是一个例子，此因子是负责B-细胞被限激活的组织特异性共激活剂(Gstaiger，M.等(1996)EMBO 15，2781-2790)。虽然没有内在的结合DNA的能力并需要几乎广泛存在的Oct因子，但是这种因子的组织被限表观通过蛋白质-蛋白质机制给予B-细胞特异性的转录激活。
此外，可以在高级转录复合物中鉴定新型的TAFs和TAF-相互作用因子，特别是组织和/或细胞类型特异性和/或发育阶段特异性和/或细胞周期特异性的TAFs和TAF-相互作用因子。如上所述，有大量数据明显表明许多结合增强子的组织特异性因子能够对基因的转录活性发挥组织特异性的作用。因此，可以鉴定调节基因特异性表达的“独特的”、组织特异性、细胞类型特异性、细胞周期特异性、发育阶段特异性因子。
“通用”转基因系统还提供了研究在组织和细胞类型中的所说的TAFs和TAF-相互作用因子(例如助激活剂)与TBP和/或TAFs以及转录复合物相关程度的强有力工具。
本发明也涉及用于确定和鉴定不同的高级转录复合物的方法，其中从转基因动物中分离所说的与高级转录复合物相关的已附加表位的TBP。鉴定不同的高级转录复合物的组成的方法包括a)将本发明的转基因引入到非人动物中，b)在不同的动物组织和/或不同的细胞类型(任选的是在动物的不同发育阶段)中分离已附加表位的TBP，和c)鉴定高级转录复合物的组成。
一种从转基因非人动物中分离高级转录复合物的方法包括通过使用至少一种已附加表位的TBP进行亲和纯化。当分离已附加表位的TBP时，优选的是对高级转录复合物和在这种复合物中相关的TAFs和TAF-相互作用因子进行共纯化。例如，当通过结合一种ist表位(优选的是表位和此表位能特异性结合的物质连接)来纯化已附加表位的TBP时，可以分离得到高级转录复合物。所说的物质可以是，例如Ni2+柱(结合His-表位)或抗体(例如抗HA抗体(和HA表位结合)或与具有SEQ ID NO.17序列或其一部分序列的已附加表位的TBP的表位(例如SEQ ID NO.17序列的表位)结合的抗体)。
本发明也涉及鉴定新的和/或特异性的TAF和/或TAF-相互作用因子的方法。优选的高级转录复合物是从按照本发明的转基因动物中分离的。这样一种方法可以包括，例如a)将本发明的转基因引入到非人动物中，b)从不同的动物组织和/或不同的细胞类型(任选的是在动物的不同发育阶段)中分离已附加表位的TBP，c)分开和分离与高级转录复合物中的已附加表位的TBP相关的TAF和/或TAF-相互作用因子，和d)如果需要，确定TAF和/或TAF-相互作用因子的氨基酸序列。
此外，为了进一步证实已知的机制，在发现和鉴定新的TAFs或者TAF相关的因子方面转基因模型优于目前的细胞培养系统。如上所述，到目前为止通过亲和共纯化得到的TAF蛋白质来源于HeLa和酵母的研究。使用时间消耗相互作用文库筛选方法也发现了其它有机体的TAF-cDNAs。所说的转基因模型的“整个有机体”方面使得这个通用的转基因系统通过和体内的实际转录过程保持非常“相近”从而对新型组织特异性活化因子的识别作出响应。
很明显，这样一种表达附加的TBP转基因动物(例如小鼠)将会对药物开发领域起推动作用。大量的药物学兴趣可以归因于给定的基因(特别是与疾病有关的基因)的转录复合物的任何“独特的”、组织特异性、细胞类型特异性、细胞周期特异性、发育阶段特异性因子(TAFs和TAF-相互作用因子)。参与一个或者几个与疾病相关的基因转录控制的“关键”TAFs和TAF-相互作用因子的确定和鉴定是开发减轻这种遗传疾病的治疗组合物的合理方案。一旦鉴定和克隆出这类TAFs和TAF-相互作用因子，可以采取任何一种筛选方法来鉴定能特异性地和TAFs或TAF相关性因子的分子种类/物质。在药学上有用的种类/物质可以是一种能在体内或者体外增强或者减弱TAF或者TAF-相互作用因子天然活性，从而能治疗性地操纵有关的基因的物质。
然而，也可以将鉴定的TAFs和TAF-相互作用因子作为生物化学和分子生物学中使用的工具，例如，可以将来源于转基因非人动物的蛋白质作为探针来分离相应的人类TAFs和TAF-相互作用因子或它们的cDNA。然后可以将人TAFs和TAF-相互作用因子用于筛选具有高度特异性的新药物。
在下列非限制性实施例中进一步详细描述了本发明。
实施例1.转基因动物的构建潜在的动物来源从一般的商业途径、Charles River(Wilmington，MA)、Taconic(Germantown，NY)、和Jackson实验室(Bar Harbor，Maine)得到了适合用于转基因实验的动物。将B6SJL/F1小鼠用于得到胚和转移。可以把B6SJL/F1雄性小鼠用于交配，并将切除输精管的SwissWebster studs用于刺激假孕。转基因小鼠通过(0.1cc，腹膜内)的怀孕母马血清促性腺素(PMSG；例如Sigma，Saint Louis，Missouri，美国)，48小时后再注射5IU(0.1cc，腹膜内)的人绒毛膜促性腺素(hCG；例如Sigma)来诱导六周龄的雌性小鼠超数排卵。在hCG注射后立即将雌鼠和雄鼠放在一起。hCG注射后21小时，通过CO2窒息或者颈部脱臼杀死已经交配的雌鼠，并从切开的输卵管取出胚，放置在M2培养基(例如Sigma)中。在丘周围使用透明质酸酶(1mg/ml)除去细胞。然后洗涤原核胚并且放置在M16培养基(例如Sigma)中，然后在注射前一直放置在37℃的培养箱(其中含有湿润的空气、CO2和O2的浓度为5％、N2的浓度为90％)中。
实施例2用于转染和微注射的构建体的制备用合适的酶切割用于微注射的DNA克隆，用Cla I和BamHI切割含有MT-hTBP转基因(双加尾的，按照表3的序列)的DNA克隆，或者用Eco RI/Eco RI切割EF-hTBP转基因(双加尾的，按照表2的序列)，使用TBE缓冲液在1％琼脂糖凝胶上进行电泳获得大小合适的DNA片段(Sambrook等，1989)。通过溴化乙锭染色显示DNA带，切下DNA带并将其放置在含有0.3M乙酸钠(pH7.0)的透析袋中。将DNA电洗脱到透析袋中，用酚-氯仿(1∶1)提取，通过两倍体积的乙醇沉淀。将所得的DNA重新溶解在TE缓冲液(10mM Tris，pH7.4和1mM EDTA)并在DEAE葡聚糖纤维素(例如Pharmacia，Uppsala，Schweden)柱上纯化。首先用0.5ml高盐缓冲液(1.5M NaCl、10mM Tris(pH7.4)和1mM EDTA)引发此柱，然后用3ml的低盐缓冲液(0.15M NaCl、10mM Tris(pH8.0)和1mM EDTA)洗涤此柱。将DNA溶液的盐调整到0.15M NaCl，然后使DNA通过此柱以便DNA与柱基质结合。用3ml的低盐缓冲液洗涤三次后，用每份0.3ml的高盐缓冲液将DNA洗脱4次，用2倍体积的乙醇沉淀。将DNA溶解在200μl的TE中并合并各组分，酚∶氯仿提取一次，氯仿提取两次，然后用乙醇过夜沉淀所说的DNA。将DNA重新悬浮在微注射缓冲液TE(10mM Tris pH7.4和0.1mM EDTA)中，并将DNA浓度调到2ng/μl，通过琼脂糖凝胶电泳与已知DNA标准物比较来显示所说的DNA。微注射将DEAE纯化的转基因DNA(MT-hTBP或者EF-hTBP)以2ng/μl的浓度溶解在微注射缓冲液中。将显微操作针和手握移液管装入到FlamingBrown微量移液管的拉出器(如P87型，Sutter研究所公司)中。然后打碎手握移液管，然后把它放在deFonbrune型微型熔炉(例如技术产品研究所公司)中抛光(fire poished)。将移液管安装在与ZeissAxiovert135显微镜连接的显微操作器(例如on Leitz)上。通过吸头将DNA溶液加入到充满空气的注射移液管(例如医疗系统公司)中。将胚(每组40-50个)在用于微注射的聚硅氧烷油存在下放置在200μl的M2培养基中。通过手握移液管将胚按方向排好并固定，然后将注射移液管插入到与之最近的生殖核中。通过生殖核的膨胀来监测注射。注射后，在转移到受体雌鼠前，将每组胚放置在M16培养基中。
实施例3通过微注射转移胚胎将成年雌性小鼠与切除输精管的雄性小鼠进行随机循环配对。Swiss Webster或者其它类似的品系可以用于此目的。同时将受体雌鼠作为供体雌鼠进行交配。在胚转移时，通过每克体重腹膜内注射0.015ml的2.5％三溴乙醇来麻醉受体雌性。通过单一背中线切开暴露出输卵管，然后直接切开位于输卵管上面的体壁。然后用watchmakers钳撕裂卵巢囊。将待转移的胚放置在M16中，然后放在转移移液管的吸头中(大约10-12个胚)。将此移液管吸头插入到漏斗中并转移这些胚。转移后，用两个缝线来缝合切口，同时缝合皮肤。受体在暖托盘上恢复三小时，然后放置在用于传递的集群中。
用MT-hTBP总共微注射了469个原核胚，产生了170个幼鼠，对于EF-hTBP总共微注射了407个原核胚，产生了76个幼鼠。
实施例4在新出生的小鼠中检测转基因DNA4a)DNA提取从一块2-4周龄的子代的尾组织(大约1cm)提取可能的新出生的小鼠基因组的DNA。54℃下将尾切片在含有500-750μl尾缓冲液(尾缓冲液10mM Tris pH7.5，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5％SDS，30μg/ml蛋白酶K)的振荡器中过夜温育。然后向每份尾样品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)。将样品在低速旋涡仪上通过手动或自动温和振荡。将样品在台式离心机上离心10分钟。将水相转移到5ml聚丙烯管(例如falcon管)中。向此管中慢慢加入等体积的乙醇(逐滴加入)以便使DNA缓慢沉淀。再加入一倍体积的乙醇以便混合管中的组分。然后将此管上下颠倒几次混合均一。然后将基因组DNA缠绕在平移液管吸头(测序凝胶吸头)上，并转移到微量滴定板的每一个孔中。将DNA在平皿中吹干4小时。然后向每个孔中加入200μl的1X TE(1X TE10mMTris pH7.4，1mM EDTA)。然后在室温下溶解基因组DNA 15-30分钟，小心地上下颠倒移液管温和混合DNA。通常在PCR检验前将微量滴定板保存在-20℃。测试前取出10μl并用EcoRI消化(例如10μl基因组DNA，2μl 10 x EcoRI缓冲液，7μl H2O，1μl EcoRI；酶和缓冲液来自Boehringer-Mannheim，Mannheim，德国)。4b)PCR反应将消化的基因组DNA用水以1∶3稀释。然后在加热块上将样品加热到100℃，10分钟。取出2μl进行PCR反应。反应以50μl的体积进行，其中包含2μl的基因组DNA、1x反应缓冲液、1.5mM MgCl2、0.8μM正向寡核苷酸引物、0.8μM反相寡核苷酸引物、8μl的核苷酸混合物(每种核苷酸(dATP、dCTP、dTTP和dGTP)的浓度都为0.2mM)、2.5单位的Taq聚合酶。例如使用Perkin Elmer(Perkin Elmer Norwalk，Conneticut，美国)的AmpliTaq酶和缓冲液进行PCR反应。
使用正向引物寡核苷酸(有意义引物)5′GGAGCA ACC GCC TGC TGGGTG C 3′(SEQ ID NO.5)和反向引物寡核苷酸(反义引物)5′CCT GTG TTGCCT GCT GGG ACG 3′(SEQ ID NO.6)进行MT-hTBP转基因的检测。
使用正向引物寡核苷酸(有意义引物)5′GGA GAC TGA AGT TAG GCCAGC 3′(SEQ ID NO.7)进行EF-hTBP转基因的检测。同时使用了在MT-hTBP检测中使用的相同反向引物(5′CCT GTG TTG CCT GCT GGG ACG3′)。
使用自动循环变温仪(例如来自Stratagene，La Jolla，CA，美国)进行循环变温。循环温度是循环1 94℃ 5分钟60℃ 3分钟 72℃ 2分钟；循环2-25 94℃ 1分钟60℃ 2分钟 72℃ 3分钟；循环2694℃分钟 60℃ 2分钟 72℃ 5分钟；或者循环1-4095℃ 2分钟 55℃ 1分钟 72℃ 1分钟；通过连续的标准琼脂糖凝胶电泳(例如1.2-1，5％琼脂糖)检测扩增产物的存在，并用溴化乙锭染色凝胶，用UV灯观察DNA。
通过大约580bp扩增的DNA产物的存在来区分阳性的MT-hTBP样品。阳性的EF-hTBP样品产生了大约500bp的扩增的DNA片段。
通过PCR反应对170个幼鼠的MT-hTBP的DNA分析表明35个基因组DNA的样品呈转基因阳性。通过PCR分析对76个EF-hTBP幼鼠的基因组DNA的分析表明EF-hTBP转基因包含在9只小鼠中。4d)转基因模型扩展将DNA阳性的G0小鼠和非转基因B6SJL小鼠杂交，并将产生的幼仔进行PCR遗传型分析。将G1子代用于连续繁育，并保持单个系以用于进一步的mRNA和蛋白质表达分析。实施例5通过S1核酸酶保护测定检测转基因mRNA5a)特异性产生了和转基因转录物的5’末端和3’末端互补的寡核苷酸5′寡核苷酸序列(有意义引物)(SEQ ID NO.8)5′GCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGACTGCGTAATGCGGTCATGACGCTTT 3′。5′寡核苷酸序列(反义引物)(SEQ ID NO.9)5′GAAGGGGGTGGGGGAGGCAAGGGTACATGAGAGCCATTACGTCGTCTTCCTGAATCCCTTTAGCCGCTTTGCTCG 3’。
下划线区是非杂交序列。用(32Pγ)ATP(5000cpm/mM)通过T4多核苷酸激酶和缓冲液(例如Boehringer-Mannheim(Mannheim))对40ng的寡核苷酸进行5’标记。在30℃ 50μl的反应体积中反应1小时。通过使用大小排阻层析(例如Push-Columns，Stratagene，La Jolla，CA，美国)从未加入(32Pγ)ATP的反应物中分离出标记的寡核苷酸。5b)启动子诱导在RNA分析前需要诱导MT-hTBP小鼠，因为在Zn2+存在时启动子是活化的。在取出肝脏前18小时和4小时对每一个MT-hTBP小鼠腹膜内两次注射ZnSO4(溶于水)，剂量为0.1mg ZnSO4/10g鼠体重。5c)RNA提取使用市售的Trizol试剂(例如Gibco-BRL，Paisly，UK)从1-5g的组织中提取总RNA。在12ml聚丙烯管(例如falcon管)中将组织在5ml的Trizol溶液中用Ultra-Turrax匀化。加入1ml的氯仿，将试管塞上并用手剧烈振荡15秒种。在室温下将溶液温育3分钟，然后4℃下在12,000xg离心15分钟(Sorvall SS-34转子)。将上清液转移到另一个试管中，加入2.5ml异丙醇并混合。然后在室温下温育10分钟。在4℃下在12,000xg离心样品10分钟。除去上清液，用5ml的75％乙醇洗涤RNA沉淀。将样品混合并在7,500xg离心10分钟。将RNA沉淀重新悬浮在不含有RNAse的水中，然后通过测量在260nm吸收率确定RNA的量。5d)S1核酸酶保护相同量的RNA(10-20μg)加入到不含RNAse的100μl水中。并加入50,000-150,000dpm标记的寡核苷酸(0.1-1ng，取决于标记效率)。用0.3M乙酸钠和乙醇沉淀RNA/寡核苷酸混合物。洗涤RNA/寡核苷酸沉淀并在空气中干燥。加入23μl杂交溶液(80％甲酰胺，10mMPIPES(pH6.4)(Sambrook等1989)，1mM EDTA，0.05％SDS)。将反应物混合，并在65℃下变性20分钟。然后在65℃下向每一种样品中加入2μl的5M NaCl。65℃下在水浴中将样品温育1小时，然后将水浴的温度调整为37℃。将温度逐渐从65℃降低至37℃(过夜)以有利于特异性的寡核苷酸-mRNA杂交。第二天，将300μl的S1缓冲液(S1缓冲液167U/ml S1核酸酶(例如Gibco BRL，Paisly，UK)，0.3M NaCl，30mM NaOAc(pH4.5)，3mM ZnSO4)加入到每一种样品中。在室温下将样品温育1小时，然后加入1ml乙醇(冷)以沉淀出所有的核酸。将沉淀离心、洗涤并在Speed-Vac中简单地干燥。然后将沉淀悬浮在12μl的S1加样缓冲液(85％甲酰胺，0.01％溴酚蓝，0.01％二甲苯苯胺，1xTBE)。在加样前，将样品加热至70℃(保持5分钟)并使用变性(6M脲)薄聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。干燥凝胶的放射自显影有利于检测带保护基的未消化的带。
当通过S1保护测定分析时，在35只MT-hTBP幼鼠中有7只幼鼠显示出可检测的mRNA水平。而在EF-hTBP幼鼠中有3只幼鼠显示出可检测的mRNA水平。
实施例6转基因mRNA的Northern印迹检测6a)通过TBP的PCR扩增合成杂交探针和TBP探针的标记设计和合成了包括双加尾hTBP构建体498bp片段的寡核苷酸/引物。
正向寡核苷酸开始于″AUG”起始位点的10个碱基下游(表1中的ATG位点)。有意义引物的序列为SEQ ID NO.105’CCCTATGACGTCCCGGATTACG 3’。
反向引物结束于″AUG″起始位点的507bp下游(表1中的ATG位点)。反义引物的序列是SEQ ID NO.115’GTGGAGTGGTGCCCGGCAAGGG 3’。
使用0.2μg pAG-17，0.5mM MgCl2，0.8μM各引物，1x PCR缓冲液(Perkin-Elmer)，0.2mM dATP、dTTP、dCTP、dGTP和2.5U的AmpliTaq酶(Perkin Elmer Norwalk，Conneticut，美国)进行PCR反应。热循环仪程序循环1-3594℃1分钟 55℃1分钟 72℃1分钟；然后，72℃10分钟，并在4℃下保存。由0.7％琼脂糖凝胶纯化扩增的带。
用随机引物和Megaprime标记试剂盒(Amersham，英国)的克列诺片段酶标记TBP-DNA探针。将25-50ng探针DNA与5μl的随机六聚体引物(例如Amersham)和20μl的水结合。在100℃下将DNA变性5分钟。将标记混合物与1x的反应缓冲液、1xdATP、1xdTTP、1xdGTP、4μl 3000Ci/mmol α-32P dCTP(例如Amersham)和2U克列诺酶混合至最终体积为50μl。在室温下进行反应1小时。使用大小排阻层析(例如Push Columns)从未加入的核苷酸中分离标记的DNA。6b)凝胶电泳和转移用乙醇沉淀出10-20μg的总RNA。在65℃下在RNA加样缓冲液(65％甲酰胺，20％甲醛(37％溶液)，1x MOPS缓冲液(Sambrook等(1989))，5％甘油，0.01％溴酚蓝，0.01％二甲苯苯胺，0.1mg/ml溴化乙锭)中将所说的沉淀变性10分钟。在含有18％甲醛(37％溶液)的1％琼脂糖凝胶和1x MOPS运行缓冲液(40mM MOPS(pH7.0)，10mM乙酸钠，1mM EDTA)上按大小分级分离RNA。在含有18％甲醛(37％溶液)的1x MOPS运行缓冲液中以1V/cm将凝胶缓慢地电泳过夜。然后在0.05M NaOH/1.5MNaCl中将凝胶处理30分钟，然后在0.5M Tris(pH7.4)/1.5M NaCl中处理20分钟。使用毛细管技术将RNA转移到尼龙膜(例如Hybond-N+，Amersham，UK)上，将结合膜的RNA交联，例如使用Stratalinke(Stratagene，La Jolla，CA，美国)进行UV-交联。6c)杂交和洗涤例如65℃下在″Rapid-Hyb″缓冲液(Amersham，英国)中在旋转杂交烘箱(例如Hybaid)中进行1-2小时预杂交。例如65℃下在含有106-10×106cpm的变性探针的6-10ml″Rapid-Hyb″缓冲液中进行2-3小时杂交。在室温下用2x SSC/0.1％SDS(1xSSC150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)将膜洗涤两次(10分钟/洗涤)。在65℃下用1x SSC/0.1％SDS将膜进一步洗涤两次(15分钟/洗涤)。在65℃下用0.5x SSC/0.1％SDS进行洗涤两次，每次15分钟，此后，如果需要，在65℃下用0.2x SSC/0.1％SDS最后洗涤1或2次，每次15分钟。将洗涤的膜进行放射自显影。
实施例7加尾hTBP特异性多克隆抗体的产生一般的方案在小鼠和人TBP之间存在着足够量的序列同源性。因此，大多数市售的抗体会发生交叉反应，检测内源性和转基因的TBP。为了区别二者，产生了抗转基因TBP的加尾区(相对应于凝血酶切割位点和加尾的hTBP的His尾)的多克隆抗体SEQ ID NO.12H2N--MGSSHHHHHHSSGLVPRGC--COOH。
将这种肽连接到载体蛋白上，并使用标准的方案注射到兔中。在一定的时间间隔内收集血清并使用ELISA测定检验抗hTBP滴度。
实施例8转基因蛋白质的Western-印迹检测8a)肝脏核提取物的制备将MT-hTBP小鼠进行2次腹膜内注射ZnSO4(参见5b)。通过颈部脱臼杀死小鼠并取出肝脏。立即在10ml的匀浆缓冲液(1.8M蔗糖，10mMHEPES(pH7.4)(Sambrook等(1989)，25mM KCl，1mM EDTA，5％甘油，0.15mM精胺，0.5mM亚精胺，0.4mM PMSF)将肝脏匀化。匀化后，加入同种缓冲液使体积增加到25ml。将匀浆小心地分装(layer)在含有7ml匀浆缓冲液的离心管中，所用的离心管如Ultra-Clear SW-28管(Beckman，Palo Alto，CA，美国)。将样品在SW-28转头上以25,000rpm(4℃)离心1小时。小心地除去上清液，将沉淀的核悬浮在200μlNEXB缓冲液(20mM HEPES pH7.9，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM PMSF，10％甘油，2μg/ml抑肽酶，2μg/ml亮抑蛋白酶肽，2μg/ml胃蛋白酶抑制剂-A)中。将悬浮的核在冰上温育15-30分钟，同时经常混合并上下吸打。通过干冰/乙醇浴及37℃的水浴将样品进行5次冻融循环。将样品高速离心30秒，然后，例如通过使用蛋白质测定试剂(例如Bio-Rad，Hercules，CA，美国)测定上清液中的蛋白质含量。8b)电泳和转移将20-75μg的提取物通过变性凝胶电泳按大小分开。分离胶10％丙烯酰胺(丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝1∶37)、0.1％SDS、375mM TrispH8.8。浓缩胶5％丙烯酰胺、0.1％SDS、125mM Tris pH8.3。运行缓冲液25mM Tris pH8.3、192mM甘氨酸、0.1％SDS。使用改良的Bjerrum转移缓冲液(48mM Tris，39mM甘氨酸，10％甲醇，0.0375％SDS，pH9.2)通过半干吸墨纸(例如Hoefer，San Francisco，CA，美国)将蛋白质转移到纯品硝化纤维素膜(如Bio-Rad)上。使转移物在0.8mA/cm下电泳2-4小时。8c)免疫检测室温下将膜在含有3％明胶(例如Bio-Rad)的1×TBS(20mM TrispH7.5，500mM NaCl)的振荡表面封阻1-2小时。室温下将此膜在1×TTBS(含有0.05％Tween-20的1×TBS)中洗涤10分钟。将膜与一级抗体在1％明胶/1×TTBS中杂交4小时，室温下在振荡的表面上过夜。用1×TTBS洗涤膜2-3次(5分钟/洗涤)。将其和与碱性磷酸酶(AP)偶联的二级抗体在1％明胶/1×TTBS中杂交2-3小时。室温下将此膜用1×TTBS再洗涤2-3次(5分钟/次)，之后在1×TBS缓冲液中洗涤5分钟。然后室温下将膜在含有NBT/BCIP试剂的1倍展开缓冲液(例如BioRad)中温育，直到其上的带完全显示出。通过水洗涤终止AP反应。
序 列 表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Hoechst Aktiengesellschaft(B)街道-(C)城市Frankfurt(E)国家德国(F)邮编代码(ZIP)65926(G)电话069-305-7072(H)传真069-35-7175(I)电传-(ii)发明名称从转基因非人动物中纯化高级转录复合物(iii)序列数17(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release #1.0，Version #1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..12(xi)序列描述SEQ ID No1
Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val1 5 10(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..11(xi)序列描述SEQ ID No2Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5 10(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..10(xi)序列描述SEQ ID No3Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5 10(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征
(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..9(xi)序列描述SEQ ID No4Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..22(xi)序列描述SEQ ID No5GGAGCAACCG CCTGCTGGGT GC 22(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA
(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQ ID No6CCTGTGTTGC CTGCTGGGAC G 21(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQ ID No7GGAGACTGAA GTTAGGCCAG C21(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)长度76个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..76(xi)序列描述SEQ ID No8GCGGCACCAG GCCGCTGCTG TGATGATGAT GATGATGGCT GCTGCCCATGACTGCGTAAT GCGGTCATGA CGCTTT 76(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)长度75个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..75(xi)序列描述SEQ ID No9GAAGGGGGTG GGGGAGGCAA GGGTACATGA GAGCCATTAC GTCGTCTTCCTGAATCCCTT TAGCCGCTTT GCTCG 75(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..22(xi)序列描述SEQ ID No10CCCTATGACG TCCCGGATTA CG 22(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..22(xi)序列描述SEQ ID No11GTGGAGTGGT GCCCGGCAAG GG22(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..19(xi)序列描述SEQ ID No12Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val1 5 10 15Pro Arg Gly Cys(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)长度1310个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子
(B)位置1..1310(xi)序列描述SEQ ID No13CCATGGGCTA TCCCTATGAC GTCCCGGATT ACGCAGTCAT GGGCAGCAGC CATCATCATC 60ATCATCACAG CAGCGGCCTG GTGCCGCGCG GCAGCCATAT GGATCAGAAC AACAGCCTGC120CACCTTACGC TCAGGGCTTG GCCTCCCCTC AGGGTGCCAT GACTCCCGGA ATCCCTATCT180TTAGTCCAAT GATGCCTTAT GGCACTGGAC TGACCCCACA GCCTATTCAG AACACCAATA240GTCTGTCTAT TTTGGAAGAG CAACAAAGGC AGCAGCAGCA ACAACAACAG CAGCAGCAGC300AGCAGCAGCA GCAGCAACAG CAACAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC360AGCAGCAGCA GCAGCAGCAA CAGGCAGTGG CAGCTGCAGC CGTTCAGCAG TCAACGTCCC420AGCAGGCAAC ACAGGGAACC TCAGGCCAGG CACCACAGCT CTTCCACTCA CAGACTCTCA480CAACTGCACC CTTGCCGGGC ACCACTCCAC TGTATCCCTC CCCCATGACT CCCATGACCC540CCATCACTCC TGCCACGCCA GCTTCGGAGA GTTCTGGGAT TGTACCGCAG CTGCAAAATA600TTGTATCCAC AGTGAATCTT GGTTGTAAAC TTGACCTAAA GACCATTGCA CTTCGTGCCC660GAAACGCCGA ATATAATCCC AAGCGGTTTG CTGCGGTAAT CATGAGGATA AGAGAGCCAC720GAACCACGGC ACTGATTTTC AGTTCTGGGA AAATGGTGTG CACAGGAGCC AAGAGTGAAG780AACAGTCCAG ACTGGCAGCA AGAAAATATG CTAGAGTTGT ACAGAAGTTG GGTTTTCCAG840CTAAGTTCTT GGACTTCAAG ATTCAGAACA TGGTGGGGAG CTGTGATGTG AAGTTTCCTA900TAAGGTTAGA AGGCCTTGTG CTCACCCACC AACAATTTAG TAGTTATGAG CCAGAGTTAT960TTCCTGGTTT AATCTACAGA ATGATCAAAC CCAGAATTGT TCTCCTTATT TTTGTTTCTG 1020GAAAAGTTGT ATTAACAGGT GCTAAAGTCA GAGCAGAAAT TTATGAAGCA TTTGAAAACA 1080TCTACCCTAT TCTAAAGGGA TTCAGGAAGA CGACGTAATG GCTCTCATGT ACCCTTGCCT 1140CCCCCACCCC CTTCTTTTTT TTTTTTTAAA CAAATCAGTT TGTTTTGGTA CCTTTAAATG 1200GTGGTGTTGT GAGAAGATGG ATGTTGAGTT GCAGGGTGTG GCACCAGGTG ATGCCCTTCT 1260GTAAGTGCCC CTTCCGGCAT CCCGGAATTC CTGCAGCCCA ACGCGGCCGC 1310(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)长度4286个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..4286(xi)序列描述SEQ ID No14GAATTCCCCT GCAGGTCACT TAGCGTTGGC CACATAGTAG GTTCTCAAAT ACTTGTTAAT 60AAATAAGTTT GTTCGAGAAG CTGGGCAATG ATATTCTACA GCTGGAAGAA GAAACATAAT120GATCTAGTAA TTAGCTCAAT TAAAAATAAA CGTTCTTCTT TCCTCAGAGG AGCATTTCCC180AAGGCCTGCC TTGATAGCCA TCCAAAAAGG CCAAGCTCAT CCAATCTTGC CCTAGATTTA240TGCTAAAATG CAGTTACAAT CGATAGGATG ACAGAAAACG ACAGCACTTA TTTAAATATA300ATAGGCACTT ATTTAAATAG GAGAAGCTGT GACTTCATAG CAAGTGTTGG GGTTAGGAAA360CTGGGTGGAT AAACTTGCTG ATGCTGTAGA TCTTAGCCTC TACATGAGAT CATGTGGAAA420ATCTGAAAGC ATTTTAGGTT CCTTATGTTT GCAATCAAAT AACTGTACAC CTTTTAATTT480AAAAAGTACC ATGAGGCACA CACACACACT CGCAGGAACT TTTTGGCGTA ACAAAACTAG540AATTAGATCT AAAAGCTAAC TGTAGGACTG AGTCTATTCT AAACTGAAAG CCTGGACATC600TGGAGTACCA GGGGGAGATG ACGTGTTACG GGCTTCCATA AAAGCAGCTG GCTTTGAATG660GAAGGAGCCA AGAGGCCAGC ACAGGAGCGG ATTCGTCGCT TTCACGGCCA TCGAGCCGAA720CCTCTCGCAA GTCCGTGAGC CGTTAAGGAG GCCCCCAGTC CCGACCCTTC GCCCCAAGCC780CCTCGGGGTC CCCGGGCCTG GTACTCCTTG CCACACGGGA GGGGCGCGGA AGCCGGGGCG840GAGGAGGAGC CAACCCCGGG CTGGGCTGAG ACCCGCAGAG GAAGACGCTC TAGGGATTTG900TCCCGGACTA GCGAGATGGC AAGGCTGAGG ACGGGAGGCT GATTGAGAGG CGAAGGTACA960CCCTAATCTC AATACAACCT TTGGAGCTAA GCCAGCAATG GTAGAGGGAA GATTCTGCAC 1020GTCCCTTCCA GGCGGCCTCC CCGTCACCAC CCCCCCCAAC CCGCCCCGAC CGGAGCTGAG 1080AGTAATTCAT ACAAAAGGAC TCGCCCCTGC CTTGGGGAAT CCCAGGGACC GTCGTTAAAC 1140TCCCACTAAC GTAGAACCCA GAGATCGCTG CGTTCCCGCC CCCTCACCCG CCCGCTCTCG 1200TCATCACTGA GGTGGAGAAG AGCATGCGTG AGGCTCCGGT GCCCGTCAGT GGGCAGAGCG 1260CACATCGCCC ACAGTCCCCG AGAAGTTGGG GGGAGGGGTC GGCAATTGAA CCGGTGCCTA 1320GAGAAGGTGG CGCGGGGTAA ACTGGGAAAG TGATGTCGTG TACTGGCTCC GCCTTTTTCC 1380CGAGGGTGGG GGAGAACCGT ATATAAGTGC AGTAGTCGCC GTGAACGTTC TTTTTCGCAA 1440CGGGTTTGCC GCCAGAACAC AGGTAAGTGC CGTGTGTGGT TCCCGCGGGC CTGGCCTCTT 1500TACGGGTTAT GGCCCTTGCG TGCCTTGAAT TACTTCCACG CCCCTGGCTG CAGTACGTGA 1560TTCTTGATCC CGAGCTTCGG GTTGGAAGTG GGTGGGAGAG TTCGAGGCCT TGCGCTTAAG 1620GAGCCCCTTC GCCTCGTGCT TGAGTTGAGG CCTGGCCTGG GCGCTGGGGC CGCCGCGTGC 1680GAATCTGGTG GCACCTTCGC GCCTGTCTCG CTGCTTTCGA TAAGTCTCTA GCCATTTAAA 1740ATTTTTGATG ACCTGCTGCG ACGCTTTTTT TCTGGCAAGA TAGTCTTGTA AATGCGGGCC 1800AAGATCTGCA CACTGGTATT TCGGTTTTTG GGGCCGCGGG CGGCGACGGG GCCCGTGCGT 1860CCCAGCGCAC ATGTTCGGCG AGGCGGGGCC TGCGAGCGCG GCCACCGAGA ATCGGACGGG 1920GGTAGTCTCA AGCTGGCCGG CCTGCTCTGG TGCCTGGCCT CGCGCCGCCG TGTATCGCCC 1980CGCCCTGGGC GGCAAGGCTG GCCCGGTCGG CACCAGTTGC GTGAGCGGAA AGATGGCCGC 2040TTCCCGGCCC TGCTGCAGGG AGCTCAAAAT GGAGGACGCG GCGCTCGGGA GAGCGGGCGG 2100GTGAGTCACC CACACAAAGG AAAAGGGCCT TTCCGTCCTC AGCCGTCGCT TCATGTGACT 2160CCACGGAGTA CCGGGCGCCG TCCAGGCACC TCGATTAGTT CTCGAGCTTT TGGAGTACGT 2220CGTCTTTAGG TTGGGGGGAG GGGTTTTATG CGATGGAGTT TCCCCACACT GAGTGGGTGG 2280AGACTGAAGT TAGGCCAGCT TGGCACTTGA TGTAATTCTC CTTGGAATTT GCCCTTTTTG 2340AGTTTGGATC TTGGTTCATT CTCAAGCCTC AGACAGTGGT TCAAAGTTTT TTTCTTCCAT 2400TTCAGGTGTC GTGAGGAATT GCCCGGGGGA TCCATGGGCT ATCCCTATGA CGTCCCGGAT 2460TACGCAGTCA TGGGCAGCAG CCATCATCAT CATCATCACA GCAGCGGCCT GGTGCCGCGC 2520GGCAGCCATA TGGATCAGAA CAACAGCCTG CCACCTTACG CTCAGGGCTT GGCCTCCCCT 2580CAGGGTGCCA TGACTCCCGG AATCCCTATC TTTAGTCCAA TGATGCCTTA TGGCACTGGA 2640CTGACCCCAC AGCCTATTCA GAACACCAAT AGTCTGTCTA TTTTGGAAGA GCAACAAAGG 2700CAGCAGCAGC AACAACAACA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAACA GCAACAGCAG 2760CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGGCAGTG 2820GCAGCTGCAG CCGTTCAGCA GTCAACGTCC CAGCAGGCAA CACAGGGAAC CTCAGGCCAG 2880GCACCACAGC TCTTCCACTC ACAGACTCTC ACAACTGCAC CCTTGCCGGG CACCACTCCA 2940CTGTATCCCT CCCCCATGAC TCCCATGACC CCCATCACTC CTGCCACGCC AGCTTCGGAG 3000AGTTCTGGGA TTGTACCGCA GCTGCAAAAT ATTGTATCCA CAGTGAATCT TGGTTGTAAA 3060CTTGACCTAA AGACCATTGC ACTTCGTGCC CGAAACGCCG AATATAATCC CAAGCGGTTT 3120GCTGCGGTAA TCATGAGGAT AAGAGAGCCA CGAACCACGG CACTGATTTT CAGTTCTGGG 3180AAAATGGTGT GCACAGGAGC CAAGAGTGAA GAACAGTCCA GACTGGCAGC AAGAAAATAT 3240GCTAGAGTTG TACAGAAGTT GGGTTTTCCA GCTAAGTTCT TGGACTTCAA GATTCAGAAC 3300ATGGTGGGGA GCTGTGATGT GAAGTTTCCT ATAAGGTTAG AAGGCCTTGT GCTCACCCAC 3360CAACAATTTA GTAGTTATGA GCCAGAGTTA 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AATGCCTCCA ACATGTGAGG 4260AAGTAATGAT AGAAATCATA GAATTC 4286(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)长度3263个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..3263(xi)序列描述SEQ ID No15ATCGATAAGC TGAGATCCGG CTAGAAACTG CTGAGGGCTG GACCGCATCT GGGGACCATC60TGTTCTTGGC CCTGAGCGGG GCAGGAACTG CTTACCGCAG ATATCCTGTT TGCCCCAATT 120CAGCTGTTCC ATCTGTTCTT GGCCCTGAGC GGGGCAGGAA CTGCTTACCA CAGATATCCT 180GTTTGGCCCA TATTCAGCTG TCTCTCTGTT CCTGACCTTG ATCTGAACTT CTCTATTCTC 240AGTTATGTAT TTTTCCCATG CCTTGCAAAA TGGCGTTACT TAAGCTAGCT TGCCAAACCT 300ACGGCTGGGG TCTTTCACGT TTATATCTAT GAGGGGAAGG ACCCAGAGTG GGGAAGCTGG 360GATCTTGGGA ACACGCTTCT CTACATGGCA TTGTCTGCAC GGTGGAGTCC GGATCTGAGC 420TTGGCTTGGT TTTTAAAACC AGCCTGGAGT AGAGCAGATG GGTTAAGGTG AGTGACCCCT 480CAGCCCTGGA CATTCTTAGA TGAGCCCCCT CAGGAGTAGA GAATAATGTT GAGATGAGTT 540CTGTTGGCTA AAATAATCAA GGCTAGTCTT TATAAAACTG TCTCCTCTTC TCCTAGCTTC 600GATCCAGAGA GAGACCTGGG CGGAGCTGGT CGCTGCTCAG GAACTCCAGG AAAGGAGAAG 660CTGAGGTTAC CACGCTGCGA ATGGGTTTAC GGAGATAGCT GGCTTTCCGG GGTGAGTTCT 720CGTAAACTCC AGAGCAGCGA TAGGCCGTAA TATCGGGGAA AGCACTATAG GGACATGATG 780TTCCACACGT CACATGGGTC GTCCTATCCG AGCCAGTCGT GCCAAAGGGG CGGTCCCGCT 840GTGCACACTG GCGCTCCAGG GAGCTCTGCA CTCCGCCCGA AAAGTGCGCT CGGCTCTGCC 900AGGACGCGGG GCGCGTGACT ATGCGTGGGC TGGAGCAACC GCCTGCTGGG TGCAAACCCT 960TTGCGCCCGG ACTCGTCCAA CGACTATAAA GAGGGCAGGC TGTCCTCTAA GCGTCACCAC 1020GACTTCAACG TCCTGAGTAC CTTCTCCTCA CTTACTCCGT AGCTCCAGCT TCACCAGATC 1080CTCGAGAACG TCTCCCATGG GCTATCCCTA TGACGTCCCG GATTACGCAG TCATGGGCAG 1140CAGCCATCAT CATCATCATC ACAGCAGCGG CCTGGTGCCG CGCGGCAGCC ATATGGATCA 1200GAACAACAGC CTGCCACCTT ACGCTCAGGG CTTGGCCTCC CCTCAGGGTG CCATGACTCC 1260CGGAATCCCT ATCTTTAGTC CAATGATGCC TTATGGCACT GGACTGACCC CACAGCCTAT 1320TCAGAACACC AATAGTCTGT CTATTTTGGA AGAGCAACAA AGGCAGCAGC AGCAACAACA 1380ACAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGCAACAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA 1440GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGGCA GTGGCAGCTG CAGCCGTTCA 1500GCAGTCAACG TCCCAGCAGG CAACACAGGG AACCTCAGGC CAGGCACCAC AGCTCTTCCA 1560CTCACAGACT CTCACAACTG CACCCTTGCC GGGCACCACT CCACTGTATC CCTCCCCCAT 1620GACTCCCATG ACCCCCATCA CTCCTGCCAC GCCAGCTTCG GAGAGTTCTG GGATTGTACC 1680GCAGCTGCAA AATATTGTAT CCACAGTGAA TCTTGGTTGT AAACTTGACC TAAAGACCAT 1740TGCACTTCGT GCCCGAAACG CCGAATATAA TCCCAAGCGG TTTGCTGCGG TAATCATGAG 1800GATAAGAGAG CCACGAACCA CGGCACTGAT TTTCAGTTCT GGGAAAATGG TGTGCACAGG 1860AGCCAAGAGT GAAGAACAGT CCAGACTGGC AGCAAGAAAA TATGCTAGAG TTGTACAGAA 1920GTTGGGTTTT CCAGCTAAGT TCTTGGACTT CAAGATTCAG AACATGGTGG GGAGCTGTGA 1980TGTGAAGTTT CCTATAAGGT TAGAAGGCCT TGTGCTCACC CACCAACAAT TTAGTAGTTA 2040TGAGCCAGAG TTATTTCCTG GTTTAATCTA CAGAATGATC AAACCCAGAA TTGTTCTCCT 2100TATTTTTGTT TCTGGAAAAG TTGTATTAAC AGGTGCTAAA GTCAGAGCAG AAATTTATGA 2160AGCATTTGAA AACATCTACC CTATTCTAAA GGGATTCAGG AAGACGACGT AATGGCTCTC 2220ATGTACCCTT GCCTCCCCCA CCCCCTTCTT TTTTTTTTTT TAAACAAATC AGTTTGTTTT 2280GGTACCTTTA AATGGTGGTG TTGTGAGAAG ATGGATGTTG AGTTGCAGGG TGTGGCACCA 2340GGTGATGCCC TTCTGTAAGT GCCCCTTCCG GCATCCCGGA ATTCCTGCAG CCCAACGCGG 2400CCGCTTCGAG GGATCTTTGT GAAGGAACCT TACTTCTGTG GTGTGACATA ATTGGACAAA 2460CTACCTACAG AGATTTAAAG CTCTAAGGTA AATATAAAAT TTTTAAGTGT ATAATGTGTT 2520AAACTACTGA TTCTAATTGT TTGTGTATTT TAGATTCCAA CCTATGGAAC TGATGAATGG 2580GAGCAGTGGT GGAATGCCTT TAATGAGGAA AACCTGTTTT GCTCAGAAGA AATGCCATCT 2640AGTGATGATG AGGCTACTGC TGACTCTCAA CATTCTACTC CTCCAAAAAA GAAGAGAAAG 2700GTAGAAGACC CCAAGGACTT TCCTTCAGAA TTGCTAAGTT TTTTGAGTCA TGCTGTGTTT 2760AGTAATAGAA CTCTTGCTTG CTTTGCTATT TACACCACAA AGGAAAAAGC TGCACTGCTA 2820TACAAGAAAA TTATGGAAAA ATATTCTGTA ACCTTTATAA GTAGGCATAA CAGTTATAAT 2880CATAACATAC TGTTTTTTCT TACTCCACAC AGGCATAGAG TGTCTGCTAT TAATAACTAT 2940GCTCAAAAAT TGTGTACCTT TAGCTTTTTA ATTTGTAAAG GGGTTAATAA GGAATATTTG 3000ATGTATAGTG CCTTGACTAG AGATCATAAT CAGCCATACC ACATTTGTAG AGGTTTTACT 3060TGCTTTAAAA AACCTCCCAC ACCTCCCCCT GAACCTGAAA CATAAAATGA ATGCAATTGT 3120TGTTGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA 3180TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA 3240TGTATCTTAT CATGTCTGGA TCC 3263(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)长度371个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..371(xi)序列描述SEQ ID No16Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val Met Gly Ser Ser1 5 10 15His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His20 25 30Met Asp Gln Asn Asn Ser Leu Pro Pro Tyr Ala Gln Gly Leu Ala Ser35 40 45Pro Gln Gly Ala Met Thr Pro Gly Ile Pro Ile Phe Ser Pro Met Met50 55 60Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Thr Pro Gln Pro Ile Gln Asn Thr Asn Ser65 70 75 80Leu Ser Ile Leu Glu Glu Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln85 90 95Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln100 105 110Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala115 120 125Val Ala Ala Ala Ala Val Gln Gln Ser Thr Ser Gln Gln Ala Thr Gln130 135 140Gly Thr Ser Gly Gln Ala Pro Gln Leu Phe His Ser Gln Thr Leu Thr145 150 155 160Thr Ala Pro Leu Pro Gly Thr Thr Pro Leu Tyr Pro Ser Pro Met Thr165 170 175Pro Met Thr Pro Ile Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ser Glu Ser Ser Gly180 185 190Ile Val Pro Gln Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu Gly Cys195 200 205Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala Glu Tyr210 215 220Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro Arg225 230 235 240Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr Gly Ala245 250 255Lys Ser Glu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala Arg Val260 265 270Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Leu Asp Phe Lys Ile Gln275 280 285Asn Met Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly290 295 300Leu Val Leu Thr His Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe305 310 315 320Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Ile Lys Pro Arg Ile Val Leu Leu Ile325 330 335Phe Val Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg Ala Glu340 345 350Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly Phe Arg355 360 365Lys Thr Thr370(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID No17Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu15 10Val Pro Arg Gly1权利要求
1.能够表达已附加表位的TATA框结合蛋白(TBP)的转基因非人动物。
2.按照权利要求1的转基因非人动物，其中所说的TBP是以含有两个附加表位的融合蛋白形式表达的。
3.按照在权利要求1和2中一个或多个的转基因非人动物，其中所说的融合蛋白含有人类TBP(hTBP)。
4.按照权利要求1-3中一个或多个的转基因非人动物，其中所说的融合蛋白含有HA-和His-表位。
5.按照权利要求4的转基因非人动物，其中所说的融合蛋白具有SEQ ID NO.16的序列。
6.按照权利要求1-5中的一个或多个的转基因非人动物，其中所说的转基因动物是小鼠。
7.一种产生如权利要求1-6中一个或多个所要求的转基因非人动物的方法，该方法是通过将转基因引入到非人动物的种系和/或体细胞而完成的。
8.一种通过将转基因DNA微注射到非人动物合子中而产生如权利要求7所要求的非人转基因动物的方法。
9.一种通过使用含有转基因的载体转染卵裂球来产生如权利要求7所要求的非人转基因动物的方法。
10.一种通过将转基因引入到胚胎干细胞来产生如权利要求7所要求的非人转基因动物的方法。
11.一种转基因，这种转基因编码已附加表位的TBP，并且可以用来产生权利要求1-6中的一个或多个所要求的转基因非人动物。
12.如权利要求11所要求的转基因，这种转基因含有第一种编码TBP的DNA序列和第二种编码一个或多个附加表位的DNA序列。
13.如权利要求11和12的一个或多个所要求的转基因，其中所说的编码TBP的DNA序列是cDNA。
14.如权利要求13所要求的转基因，其中所说的DNA序列是人TBP(hTBP)的cDNA。
15.如权利要求11-14的一个或多个所要求的转基因，其中所说的第二种DNA序列编码两个附加表位。
16.如权利要求15所要求的转基因，其中所说的附加表位是HA-表位和His-表位。
17.如权利要求15和16的一个或多个所要求的转基因，其中所说的HA-表位具有下列序列之一SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3或SEQ ID NO.4。
18.如权利要求11-17的一个或多个所要求的转基因，这种转基因含有SEQ ID NO.13的序列。
19.如权利要求11-18的一个或多个所要求的转基因，这种转基因含有可诱导的或者组成型启动子的DNA。
20.如权利要求19所要求的转基因，其中所说的启动子是EF基因的启动子。
21.如权利要求19所要求的转基因，其中所说的启动子是MT基因的启动子。
22.如权利要求11-22的一个或多个所要求的转基因，其中所说的转基因具有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15的序列。
23.如权利要求11-22的一个或多个所要求的转基因在产生非人转基因动物方面的用途。
24.一种通过将编码一个或多个附加表位的DNA序列与编码TBP蛋白质的DNA序列连接来产生如权利要求11-22的一个或多个的转基因的方法。
25.如权利要求11-22的一个或多个所要求的转基因在产生已附加表位的TBP上的用途。
26.如权利要求1-6的一个或多个中所要求的转基因动物在表达已附加表位的TBP上的用途。
27.一种在如权利要求1-6中的一个或多个所要求的转基因动物中表达的已附加表位的TBP。
28.一种含有两个表位的如权利要求27所要求的已附加表位的TBP。
29.一种如权利要求27和28的一个或多个所要求的已附加表位的TBP，其中所说的TBP是hTBP。
30.一种如权利要求27-29的一个或多个所要求的已附加表位的TBP，其中所说的TBP与HA-表位和His-表位连接。
31.如权利要求27-30的一个或多个所要求的已附加表位的TBP，其中所说的HA表位具有下列序列之一SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
32.如权利要求27-31的一个或多个所要求的已附加表位的TBP，其具有SEQ ID NO.16的序列。
33.一种通过将如权利要求11-22的一个或多个所要求的转基因引入到动物的种系和/或体细胞中来产生如权利要求27-32的一个或多个所要求的已附加表位的TBP的方法。
34.一种通过将含有组成型启动子的转基因引入到非人动物中来产生如权利要求33所要求的已附加表位的TBP的方法，其中所说的已附加表位的TBP可以在也可以不在动物发育的特定阶段在动物特定的细胞类型和/或组织中表达。
35.一种通过将含有诱导型启动子的转基因引入到非人动物中并在此启动子的诱导下表达已附加表位的TBP来产生如权利要求33所要求的已附加表位的TBP的方法。
36.已附加表位的TBP在从转基因动物中分离高级转录复合物及鉴定TAFs和TAF-相互作用因子方面的用途。
37.如权利要求1-6的一个或多个所要求的转基因非人动物在表达已附加表位的TBP方面的用途。
38.如权利要求1-6的一个或多个所要求的转基因非人动物在从不同的组织和/或细胞类型中分离高级转录复合物方面的用途，可以任选动物的不同发育阶段。
39.转基因非人动物在鉴定新的和/或特异性TAFs和/或TAF-相互作用因子方面的用途。
40.一种鉴定和定性不同的高级转录复合物的方法，其中所说的与高级转录复合物相关的已附加表位的TBP是从转基因动物中分离出来的。
41.一种确定不同的高级转录复合物的组成的方法，其中a)将如权利要求11-22的一个或多个所要求的转基因引入到非人动物中，b)在任选的动物的不同发育阶段从不同的动物组织和/或不同的细胞类型中分离已附加表位的TBP，c)确定高级转录复合物的组成。
42.一种鉴定新的和/或特异性TAF和/或TAF-相互作用因子的方法，其中a)将如权利要求11-22的一个或多个所要求的转基因引入到非人动物中，b)可以在也可以不在动物的特定发育阶段从动物的特定组织和/或特定的细胞类型中分离已附加表位的TBP，c)将在高级转录复合物中与已附加表位的TBP相关的TAF和/或TAF-相互作用因子分开并分离，d)可以确定也可以不确定TAF和/或TAF-相互作用因子的氨基酸序列。
43.一种从权利要求1-6的一个或多个所要求的转基因非人动物中分离不同的高级转录复合物的方法，其中对与已附加表位的TBP相关的高级转录复合物进行亲和共纯化，而已附加表位的TBP经使用至少一种已附加到TBP上的表位进行亲和纯化。
44.一种分离如权利要求43所要求的高级转录复合物的方法，其中已附加表位的TBP是通过其His表位与Ni2+柱的结合而纯化的。
45.一种分离如权利要求43和44的一个或多个所要求的高级转录复合物的方法，其中已附加表位的TBP是通过其HA表位与抗HA抗体的结合而纯化的。
46.一种分离如权利要求43-45的一个或多个所要求的高级转录复合物的方法，其中所说的高级转录复合物是通过使用含有抗体的亲和柱分离的，所说的抗体能够识别具有SEQ ID NO.17序列的已附加表位的TBP的表位。
47.一种能够识别已附加表位的TBP的表位的抗体，所说的TBP具有SEQ ID NO.17的序列。
全文摘要
本发明涉及含有编码已附加表位的TATA框结合蛋白(TBP)的DNA的转基因、表达已附加表位的TBP的转基因动物的产生和使用它们从各种类型的真核组织和细胞亲和纯化(新型的)转录因子和转录复合物。
文档编号C07K14/47GK1200235SQ9810898
公开日1998年12月2日 申请日期1998年5月25日 优先权日1997年5月26日
发明者B·克什巴姆, E·比格伦德, M·梅斯特雷斯特 申请人:赫彻斯特股份公司