专利名称：人短链醇脱氢酶编码序列、其编码的多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人短链醇脱氢酶的cDNA序列。本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和所述多肽的生产方法。
短链醇脱氢酶家族(SCAD)，是一个广泛存在于原核生物和真核生物中的一大类醇脱氢酶，其功能涉及生物固氮，糖代谢，甾类、芳香烃和前列腺素的代谢，以及抗生素的合成等，是一个成员众多，功能又十分重要的大家族(J SteroidBiochem Mol Biol 1994 Nov；51(3-4)125-130.)。通常短链醇脱氢酶的大小在300个氨基酸左右，需要NAD或NADP为辅基，并且不依赖于任何金属离子作用，而经典的长链醇脱氢酶则约为700个氨基酸，在起作用时高度依赖锌离子(Mol CellEndocrinol 1992 Mar；84(1-2)C25-C31.)。通常认为，SCAD在胞间信息传递中起作用，体现为催化信号分子的活性形式间的相互转化。一些重要的信号分子如类固醇、糖类、前列腺素等，都带有数量不等的羟基，而SCAD通过催化将这些羟基氧化为羰基的反应(及其逆反应)，来调节这些信号分子的活性，改变它与受体结合的能力。在哺乳动物中，SCAD主要表现为甾类失活酶，可以控制靶细胞对糖皮质激素、盐皮质激素或性激素等甾类激素的敏感程度，以不同的激素应答反应来抑制或促进细胞生长。临床研究表明，高血压、唐氏综合症、以及老年性痴呆，都与SCAD的异常有关(J Steroid Biochem Mol Biol 1994 Nov；51(3-4)125-130.)。
第一个发现的短链醇脱氢酶是果蝇的乙醇脱氢酶，到1991年时SCAD家族的成员个数仅为20多个(Eur-J-Biochem.1991 Sep l；200(2)537-43.)。近年来，在植物、真菌、昆虫、哺乳动物中都发现了不少短链醇脱氢酶。Donadel.G和Gabrielli.F等人在1991年在人肝脏胚胎瘤细胞中发现了一种核蛋白(Eur-J-Biochem.1991 Feb14；195(3)723-9.)，在1995年鉴定其为SCAD家族之一，并命名为“HEP27”(Eur-J-Biochem.1995 Sep 1；232(2)473-7.)。迄今，总计发现的短链醇脱氢酶已有三百多个。研究表明，它们在系统发育上都有一定的相关性。尽管如此，在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的人类SCAD家族的新成员。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码短链醇脱氢酶家族的一个新成员，本发明的短链醇脱氢酶被命名为HSHEP27L(GenBankAccession No.AF064256)。
本发明的另一个目的是提供一种新的人短链醇脱氢酶家族成员，该酶被命名为HSHEP27L。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人短链醇脱氢酶的方法。
本发明还提供了这种人短链醇脱氢酶基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人HSHEP27L蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列是SEQ ID NO.3。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的HSHEP27L蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有HSHEP27L蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有HSHEP27L蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HSHEP27L蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HSHEP27L蛋白的重组细胞；(c)在适合表达HSHEP27L蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有HSHEP27L蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1196个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于28-864位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“HSHEP27L蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有HSHEP27L蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中28-864位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框28-864位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中28-864位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位的核苷酸序列的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人HSHEP27L相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“HSHEP27L蛋白多肽”指具有HSHEP27L蛋白活性的SEQID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人短链醇脱氢酶相同功能的、SEQ IDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括HSHEP27L蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与HSHEP27L DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗HSHEP27L多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含HSHEP27L多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了HSHEP27L多肽的可溶性片段。通常，该片段具有HSHEP27L多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供HSHEP27L蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然HSHEP27L多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括HSHEP27L多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内HSHEP27L的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有HSHEP27L多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码HSHEP27L的核酸分子。
本发明还包括检测HSHEP27L核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于HSHEP27L多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对HSHEP27L DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于HSHEP27L基因产物或片段。较佳地，指那些能与HSHEP27L基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制HSHEP27L蛋白的分子，也包括那些并不影响HSHEP27L蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的HSHEP27L基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的HSHEP27L基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达HSHEP27L或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断HSHEP27L功能的抗体以及不影响HSDHML功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用HSHEP27L基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与HSHEP27L基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在本发明中，HSHEP27L的cDNA核苷酸序列是如此获得的以人肝脏λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物5′-GGAACCCATCACTTGCTGGTCGT-3′和反向引物5′-TTCCACTCCAGGTTCCTTCTCTC-3’，进行PCR，获得1196bp的目的片段。经鉴定测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
通过同源检索发现本发明(HSHEP27L的cDNA序列)具有与已被发表并确认为短链醇脱氢酶(SCAD)的基因高度同源的序列，并且本发明涉及的蛋白具有短链醇脱氢酶家族高度保守的氨基酸序列。进一步的检索表明，本发明与已被发表并确认为人类HEP27基因具有高度同源性，而已知HEP27也属于短链醇脱氢酶家族。所以，我们认为HSHEP27L基因也属于SCAD家族，并且是人HEP27基因的一个同源基因而具有相似的功能。
人体细胞组织的生长在很大程度上受到激素的调节，比如常见的糖皮质激素和盐皮质激素，促进生长的雄性激素、雌性激素，和抑制生长的皮质醇等。这些激素通常是先到达靶细胞的胞质中，然后再进入核中，与特定的核内受体结合，并进而发挥调控作用的。如果上述推断正确的话，就有理由相信，本发明涉及的蛋白参与了在细胞中发生的激素代谢过程，通过催化各种激素和激素受体的活性结构的改变，使得细胞受到相应的调控，而发生相应的改变。一般情况下，其功能是使促进生长的因子失活，或是催化生长抑制因子的产生，抑制DNA的复制，同时也抑制了细胞进入分裂期。
就最近发现的短链醇脱氢酶来看，不论是动物还是植物，不论是在哪个部位表达，SCAD总是与生物个体或胚胎的生长发育有关，因此，许多睿智的学者们现已将短链醇脱氢酶SCAD视为研究生物发育机制的前沿与热点。
另外，与本发明同源的SCAD家族的蛋白的种种作用很容易使人想到，它可能可以抑制肿瘤细胞的生长，通过DNA复制阻遏而抑制肿瘤细胞的进一步分裂。事实上，与本发明有密切联系的HEP27蛋白，确实与某种肝脏肿瘤细胞系的体外分化有关，也就是与肿瘤抑制有关。这一可贵的性质给我们带来了对抗癌症和肿瘤的新武器，也使本发明极有可能成为数量不多的抑癌基因家族成员之一。我们认为，本发明的酶活性可受到多种因素的调节，而且很可能存在转录后水平上的调控，这更为进一步研究癌症治疗带来了可喜的希望。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1HSHEP27L的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人肝脏λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15′-GGAACCCATCACTTGCTGGTCGT-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸A25′-TTCCACTCCAGGTTCCTTCTCTC-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。A1/A2的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、62℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测用A1、A2进行PCR扩增得到的产物，目的片断长度为1196bp。
2.PCR产物的测序将用A1、A2扩增得到的产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(pHarmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1196bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于28---864位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出HSHEP27L的氨基酸序列，共278个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用HSHEP27L的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它与已被发表并确认为短链醇脱氢酶(SCAD)的基因间存在高度同源的序列，并且本发明涉及的蛋白具有短链醇脱氢酶家族高度保守的氨基酸序列。进一步的检索表明，其在核酸和蛋白水平上与已被公布的人类HEP27基因(核酸和蛋白检索号分别为gb|U31875和sp|Q13268)存在同源性，其中它们的蛋白序列间有65％Identities，89％Positives，而其核酸序列间虽然只有约30％Identities，但是在它们被推测为酶活性决定区域的序列则很相似(HSHEP27L的155-332位碱基，80％identity)，因此该基因被确认为人HEP27基因的同源基因。又由于HEP27已被鉴定为人类短链醇脱氢酶家族成员，且HSHEP27L的蛋白质序列中具有SCAD家族的严格保守的赖氨酸与酪氨酸，和一些标志性的保守序列(J Steroid BiochemMol Biol 1993 Apr；45(1-3)161-165)，特别是在HSHEP27L的氨基酸序列中存在由26个氨基酸组成的被认为是短链醇脱氢酶家族(SCAD)共有的特征性序列——(L/I/V/S/P/A/D/K)X12Y(P/S/T/A/G/N/C/V)(S/T/A/G/N/Q/C/I/V/M)(S/T/A/G/C)K{P/C}(S/A/G/F/R)(L/I/V/M/T/A/G/D)X2(L/Y/V/M/F/Y/W)(L/I/V/M/F/W/G/A/P/T/H)(G/S/A/C/Q/K/H/M)[注该序列中X为任意氨基酸，“2”等数字为氨基酸数目，“(S/T/A/G/C)”表示从这5个氨基酸中任选一个氨基酸，{P/C}表示这两个氨基酸在这个位置上不可能出现]。在本发明的蛋白中符合上述模式的序列片段是SIAAFSPSPGFSPYNVSKTALLGLTK(SEQ ID NO.4中169-194位)。这进一步确定了本发明的HSHEP27L也属于短链醇脱氢酶家族，并且具有短链醇脱氢酶家族的相关功能。
HEP27已被证实能够抑制人类肝脏胚胎瘤细胞系的DNA复制作用(Eur-J-Biochem.1991 Feb 14；195(3)723-9.& Eur-J-Biochem.1995 Sep 1；232(2)473-7.)，本发明所涉及的蛋白由于在结构上与HEP27十分相似，从蛋白质结构决定着功能特异性的生物化学原理，我们认为本发明的HSHEP27L也有此功能。除此之外，由于HSHEP27L已被证实属于人类短链醇脱氢酶家族，所以推测其还同样具有该家族所具有的一些功能是合理的。如该家族能够在一定条件下抑制表观型盐皮质激素过量(A.M.E.)(apparent mineralocorticoid excess)(J Steroid Biochem MolBiol 1993 Apr；45(1-3)161-165)，这一特性能被用来调节激素水平，并保护细胞免受过量激素的刺激而停止或过度生长。最近，一些报道显示SCAD家族的成员还参与胚胎组织中的某些重要信号途径(Proc Natl Acad Sci U.S.A.1998 Apr.14；95(8)4404-4409.)。
实施例3HSHEP27L在大肠杆菌中的表达在该实施例中，编码HSHEP27L的cDNA序列(GenBank Accession No.AF064256)是用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，并用人肝脏λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，获得HSHEP27L插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGGGGATCCATGCACAAGGCGGGGCTGC-3′(SEQ ID NO.5)该引物含有BamH1限制性限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的HSHEP27L编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-CGTCGGATCCTCAGAGGCGGGACGGGGTT-3’(SEQ ID NO.6)该引物含有BamH1限制性限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和HSHEP27L的编码序列的19个核苷酸。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，用Hind III酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证HSHEP27L的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)达0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的HSHEP27L。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱HSHEP27L。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质以PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小，测得HSHEP27L的分子量大小约为30 kDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4HSHEP27L在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码HSHEP27L的cDNA序列(GenBank Accession No.AF064256)是用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人肝脏λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，获得HSHEP27L插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5′-TTGGGGATCCATGCACAAGGCGGGGCTGC-3′(SEQ ID NO.5)该引物含有BamHI限制性限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的HSHEP27L编码序列的19个核苷酸；3’端引物序列为5’-CGTCGGATCCTCAGAGGCGGGACGGGGTT-3’(SEQ ID NO.6)该引物含有BamHI限制性限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和HSHEP27L的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用BamHI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用ApaI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证HSHEP27L的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小，测得HSHEP27L的分子量大小约为30 kDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将如上获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀HSHEP27L基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GGAACCCATC ACTTGCTGGT CGT 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TTCCACTCCA GGTTCCTTCT CTC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度1196bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 GGAACCCATCACTTGCTGGTCTGATCCATGCACAAGGCGGGGCTGCTAGGCCTCTGTGCC61 CGGGCTTGGAATTCGGTGCGGATGGCCAGCTCCGGGATGACCCGCCGGGACCCGCTCGCA121 AATAAGGTGGCCCTGGTAACGGCCTCCACCGACGGGATCGGCTTCGCCATCGCCCGGCGT181 TTGGCCCAGGACGGGGCCCATGTGGTCGTCAGCAGCCGGAAGCAGCAGAATGTGGACCAG241 GCGGTGGCCACGCTGCAGGGGGAGGGGCTGAGCGTGACGGGCACCGTGTGCATGGTGGGG301 AAGGCGGAGGACCGGGAGCGGCTGGTGGCCACGGCTGTGAAGCTTCATGGAGGTATCGAT361 ATCCTAGTCTCCAATGCTGCTGTCAACCCTTTCTTTGGAAGCATAATGGATGTCACTGAG421 GAGGTGTGGGACAAGACTCTGGACATTAATGTGAAGGCCCCAGCCCTGATGACAAAGGCA481 GTGGTGCCAGAAATGGAGAAACGAGGAGGCGGCTCAGTGGTGATCGTGTCTTCCATAGCA541 GCCTTCAGTCCATCTCCTGGCTTCAGTCCTTACAATGTCAGTAAAACAGCCTTGCTGGGC601 CTGACCAAGACCCTGGCCATAGAGCTGGCCCCAAGGAACATTAGGGTGAACTGCCTAGCA661 CCTGGACTTATCAAGACTAGCTTCAGCAGGATGCTCTGGATGGACAAGGAAAAAGAGGAA721 AGCATGAAAGAAACCCTGCGGATAAGAAGGTTAGGCGAGCCAGAGGATTGTGCTGGCATC781 GTGTCTTTCCTGTGCTCTGAAGATGCCAGCTACATCACTGGGGAAACAGTGGTGGTGGGT841 GGAGGAACCCCGTCCCGCCTCTGAGGACCGGGAGACAGCCCACAGGCCAGAGTTGGGCTC901 TAGCTCCTGGTGCTGTTCCTGCATTCACCCACTGGCCTTTCCCACCTCTGCTCACCTTAC961 TGTTCACCTCATCAAATCAGTTCTGCCCTGTGAAAAGATCCAGCCTTCCCTGCCGTCAAG1021 GTGGCGTCTTACTCGGGATTCCTGCTGTTGTTGTGGCCTTGGGTAAAGGCCTCCCCTGAG1081 AACACAGGACAGGCCTGCTGACAAGGCTGAGTCTACCTTGGCAAAGACCAAGATATTTTT1141 TCCTGGGCCACTGGGGAATCTGAGGGGTGATGGGAGAGAAGGAACCTGGAGTGGAA(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度278个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met His Lys Ala Gly Leu Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ala Trp Asn16 Ser Val Arg Met Ala Ser Ser Gly Met Thr Arg Arg Asp Pro Leu31 Ala Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly46 Phe Ala Ile Ala Arg Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val61 Val Ser Ser Arg Lys Gln Gln Asn Val Asp Gln Ala Val Ala Thr76 Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser Val Thr Gly Thr Val Cys Met Val91 Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg Leu Val Ala Thr Ala Val Lys106 Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val Ser Asn Ala Ala Val Asn121 Pro Phe Phe Gly Ser Ile Met Asp Val Thr Glu Glu Val Trp Asp136 Lys Thr Leu Asp Ile Ash Val Lys Ala Pro Ala Leu Met Thr Lys151 Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly Ser Val Val166 Ile Val Ser Ser Ile Ala Ala Phe Ser Pro Ser Pro Gly Phe Ser181 Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys Thr196 Leu Ala Ile Glu Leu Ala Pro Arg Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu211 Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Arg Met Leu Trp Met226 Asp Lys Glu Lys Glu Glu Ser Met Lys Glu Thr Leu Arg Ile Arg241 Arg Leu Gly Glu Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu256 Cys Ser Glu Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val271 Gly Gly Gly Thr Pro Ser Arg Leu(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGGGGATCC ATGCACAAGG CGGGGCTGC 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸
(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6CGTCGGATCC TCAGAGGCGG GACGGGGTT 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人HSHEP27L蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列是SEQ ID NO.3。
4.一种分离的HSHEP27L蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有HSHEP27L蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有HSHEP27L蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HSHEP27L蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HSHEP27L蛋白的重组细胞；(c)在适合表达HSHEP27L蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有HSHEP27L蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸28-864位。
12.一种能与权利要求4所述的HSHEP27L蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明涉及了一种新的人短链醇脱氢酶HSHEP27L。本发明提供了该新的人短链醇脱氢酶的cDNA编码序列、该序列编码的多肽,以及利用重组技术生产所述的新的人短链醇脱氢酶的方法。本发明还提供了这种新的人短链醇脱氢酶的应用。
文档编号C07K16/40GK1246535SQ9811104
公开日2000年3月8日 申请日期1998年8月31日 优先权日1998年8月31日
发明者余龙, 屠强, 张宏来, 赵勇, 傅强 申请人:复旦大学