专利名称：人p47编码序列、其编码的多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人P47的cDNA序列，该蛋白是P47的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
P47蛋白是近年新发现的和P97蛋白介导的膜融合作用紧密相关的第一个辅因子。P47蛋白以三聚体的形式和P97六聚体结合成稳定、紧密的复合物，共同参与动物细胞胞质分裂后高尔基体分裂小球融合形成高尔基体池的过程，因而对高尔基体重建具有重要作用(Nature 38875-78，1997)。
1997年Kondo等人在大鼠肝细胞的胞液中分离得到了P47蛋白和其cDNA序列。P47在酿酒酵母中的同源物SHP1基因于1995年由Zhang等人克隆得到，经研究证明该基因具有调节磷酸蛋白磷酸酶I活性的功能，广泛参与糖蛋白代谢，减数分裂分化和有丝分裂细胞周期生长等过程(Mol.Cell.Biol.152037-2050，1995)。在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的人类的P47基因和蛋白序列。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码P47的人同源蛋白，本发明的基因被命名为人P47。
本发明的另一个目的是提供一种新的蛋白，该蛋白被命名为人P47蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人P47蛋白的方法。
本发明还提供了这种人P47基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人P47蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人P47蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人P47蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人P47蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人P47蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人P47蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人P47蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人P47蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1412个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于14-1132位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人P47蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人P47蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中14-1132位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框14-1132位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中14-1132位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地，在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人P47相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人P47蛋白多肽”指具有人P47蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人P47相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人P47蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与人P47 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人P47多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人P47多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人P47多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人P47多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人P47蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人P47多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括人P47多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人P47的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有人P47核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人P47的核酸分子。
本发明还包括检测人P47核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人P47多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人P47 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人P47基因产物或片段。较佳地，指那些能与人P47基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人P47蛋白的分子，也包括那些并不影响人P47蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人P47基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人P47基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人P47或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人P47功能的抗体以及不影响人P47功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人P47基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人P47基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人P47核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。
在本发明中，人P47的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用合成的正向引物A15′-GCACGGGGCGAGAATGGCGGC-3′(SEQ ID NO.1)和反向引物A25′-AGGAGGGAGGCCAGGCAGCTG-3′(SEQ ID NO.2)进行PCR，获得1162bp的目的片段。测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
动物细胞分裂时，高尔基体等膜结构细胞器都会分裂成大量的小泡、短管，并在细胞分裂末期，这些小泡、短管会通过两种膜融合方式重组形成高尔基体。这两种方式分别由两个相类似的ATP酶介导。一种方式是由P97蛋白介导随后的同型囊泡的融合(Cell 82869-872，905-914，1995；Nature 38820-21，1997)。该途径的细节仍在研究之中。从大鼠肝细胞中分离得到的P47蛋白是第一个被证实和P97途径直接相关的蛋白因子。本发明的人P47蛋白是与大鼠P47蛋白高度同源的，因此是大鼠P47蛋白的同源蛋白，并具有相似的功能。P97蛋白是P47蛋白在胞液中的唯一结合物，而P47蛋白也是P97蛋白复合物的主要结合蛋白，因此P47蛋白对于P97蛋白介导的高尔基体池重建过程是必需的，而且外源P47可以替代内源P47。大鼠的P47蛋白在大鼠各组织中均有表达，由此可推断它参与了基础的细胞功能(Nature 38875-78，1997)。P47可能通过介导P97蛋白和syntaxin5蛋白的结合(Cell 92603-610，1998)，从而实现对融合途径的调节，这提示人们在肿瘤发生过程中，快速生长而无分泌的肿瘤细胞可能以同型融合为主，从而快速生成细胞器(Cell 92603-610，1998)。另外，P47、P97蛋白在酵母中同源物被证实参与了内质网膜融合和重建以及核膜融合，因而可能和胞质分裂紧密相关(J，Cell.Bio.114(3)443-453，1991；Cell 82885-893，1995)。
在附图中，
图1为本发明的人P47与大鼠P47的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人P47蛋白与大鼠P47蛋白的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人P47的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用寡核苷酸A15′-GCACGGGGCGAGAATGGCGGC-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸A25′-AGGAGGGAGGCCAGGCAGCTG-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段，为1162bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将PCR扩增产物A1/A2与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1162bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于14-1132位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人P47的氨基酸序列，共372个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用人P47的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它们与大鼠P47基因及其编码蛋白具有极高同源性，用PCGENE软件比较发现，在核酸和蛋白水平上的同一性分别达到了90％和95％，因此，本发明的人P47基因和蛋白是大鼠P47在人中的同系物，并且具有与大鼠P47基因或蛋白相同或相似功能。
研究表明，动物细胞分裂时，高尔基体等膜结构细胞器都会分裂成大量的小泡、短管，并在细胞分裂末期，当母细胞被分成两个子细胞时，这些小泡、短管会通过两种膜融合方式重组形成高尔基体。这两种方式分别由两个相类似的ATP酶介导一是N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子(NSF)介导的早期异型囊泡的融合，产生有膜孔的池，并有附着的小泡和膨胀的池缘；另一种方式是由P97蛋白介导随后的同型囊泡的融合，产生无膜孔的池和钝端的池缘(Cell 82869-872，905-914，1995；Nature 38820-21，1997)。这两种方式相辅相成，共同完成细胞分裂后高尔基体的重建。NSF途径的分子作用方式已研究得较为清楚，其中涉及可溶性的NSF附着蛋白(SNAP)、可溶性的NSF附着蛋白(SNARE)等辅助因子(Nature 362318-324，1993)。但P97途径的细节仍在研究之中。从大鼠肝细胞中分离得到的人P47蛋白是第一个被证实和P97途径直接相关的蛋白因子。本发明涉及的人P47蛋白和大鼠P47蛋白高度同源，因而具有相似的功能。而在人体内存在类似于P97的途径，人P47蛋白与该途径直接相关。P97蛋白是P47蛋白在胞液中的唯一结合物，而P47蛋白也是P97蛋白复合物的主要结合蛋白，因此P47蛋白对于P97蛋白介导的高尔基体池重建是必需的，而且外源P47可以替代内源P47。大鼠的P47蛋白通过Northen印迹分析表明，它在大鼠各组织中均有表达，由此可推断它参与了基础的细胞功能(Nature 38875-78，1997)。最新研究表明，P47可能通过介导P97蛋白和syntaxin5蛋白的结合而实现P97蛋白的膜功能(Cell 92603-610，1998)。P47可以和NSF途径中的SNAP分子竞争两种途径的共同作用因子syntaxin5蛋白，从而实现对两种融合途径的调节。这提示人们在肿瘤发生过程中，快速生长而无分泌的肿瘤细胞可能以同型融合为主，从而以达到快速地生成细胞器(Cell92603-610，1998)。对本发明人P47蛋白研究可以为肿瘤研究和治疗提供一条新途径。另外，P47、P97蛋白在酵母中同源物被证实参与了内质网膜融合和重建以及核膜融合，因而可能和胞质分裂紧密相关(J.Cell.Bio.114(3)443-453，1991；Cell 82885-893，1995)，随着研究的深入，P47、P97在其它动物细胞中的相似功能也会不断被发现和证实。
本发明的人P47除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人P47还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人P47的N端与鼠的P47的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人P47的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
实施例3人P47在大肠杆菌中的表达在该实施例中，将编码人P47的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人P47 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-GTAAGGATCCATGGCGGCGGAGCGACAGG-3′(SEQ ID NO.5)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人P47编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-GAACGTCGACTTATGTTAACCGCTGCACG-3’(SEQ ID NO.6)该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人P47的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和SalI消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人P47的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人P47。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人P47。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白，纯化后的蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将获得的蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约41KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4人P47在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码人P47的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人P47 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-GTGTGGATCCATGGCGGCGGAGCGACAGG-3′(SEQ ID NO.7)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人P47编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-AAATCTGCAGTTATGTTAACCGCTGCACG-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有PstI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人P47的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用BamHI和PstI分别消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用ApaI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证人P47的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是用脂转染法，用Lipofection试剂盒(GiBco Life)进行。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为41KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人P47基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人上海新黄浦复旦基因工程有限公司(ii)发明名称人P47编码序列、其编码的多肽及制备方法(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度21碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GCACGGGGCG AGAATGGCGG C 21(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度21碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.2AGGAGGGAGG CCAGGCAGCT G 21(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度1162bp(B)类型核酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 GCACGGGGCG AGAATGGCGG CGGAGCGACA GGAGGCGCTG AGGGAGTTCG TGGCGGTGAC61 GGGCGCCGAG GAGGACCGGG CCCGCTTCTT TCTCGAGTCG GCCGGCTGGG ACTTGCAGAT121 CGCGCTAGAG CTCTTTTATG AGGACGGAGG GGATGAAGAC ATTGTGACCA TTTCGCAGGC181 AACCCCCAGT TCAGTGTCCA GAGGCACAGC CCCCAGTGAT AATAGAGTGA CATCCTTCAG241 AGACCTCATT CATGACCAAG ATGAAGATGA GGAGGAAGAG GAAGGCCAGA GGAGCAGGTT301 TTATGCTGGG GGCTCAGAGA GAAGTGGACA GCAGATTGTT GGCCCTCCCA GGAAGAAAAG361 TCCCAACGAG CTGGTGGATG ATCTCTTTAA AGGTGCCAAA GAGCATGGAG CTGTAGCTGT421 GGAGCGAGTG ACCAAGAGCC CTGGAGAGAC CAGTAAACCG AGACCATTTG CAGGAGGTGG481 CTACCGCCTT GGGGCAGCAC CAGAGGAAGA GTCTGCCTAT GTGGCAGGAG AAAAGAGGCA541 GCATTCCAGC CAAGATGTTC ATGTAGTATT GAAACTCTGG AAGAGTGGAT TCAGCCTGGA601 TAATGGAGAA CTCAGAAGCT ACCAAGACCC ATCCAATGCC CAGTTTCTGG AGTCTATCCG661 CAGAGGGGAG GTGCCAGCAG AGCTTCGGAG GCTAGCTCAC GGTGGACAGG TGAACTTGGA721 TATGGAGGAC CATCGGGACG AGGACTTTGT GAAGCCCAAA GGAGCCTTCA AAGCCTTCAC781 TGGCGAGGGT CAGAAACTGG GCAGCACTGC CCCCCAGGTG TTGAGTACCA GCTCTCCAGC841 CCAACAGGCA GAAAATGAAG CCAAAGCCAG CTCTTCCATC TTAATCGACG AATCAGAGCC901 TACCACAAAC ATCCAAATTC GGCTTGCAGA CGGCGGGAGG CTGGTGCAGA AATTTAACCA961 CAGCCACAGG ATCAGCGACA TCCGACTCTT CATCGTGGAT GCCCGGCCAG CCATGGCTGC1021 CACCAGCTTT ATCCTCATGA CTACTTTCCC GAACAAAGAG CTGGCTGATG AGAGCCAGAC1081 CCTGAAGGAA GCCAACCTGC TCAATGCTGT CATCGTGCAG CGGTTAACAT AACCGCCCAG1141 CCAGCTGCCT GGCCTCCCTC CT(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度372个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Ala Ala Glu Arg Gln Glu Ala Leu Arg Glu Phe Val Ala Val16 Thr Gly Ala Glu Glu Asp Arg Ala Arg Phe Phe Leu Glu Ser Ala31 Gly Trp Asp Leu Gln Ile Ala Leu Glu Leu Phe Tyr Glu Asp Gly46 Gly Asp Glu Asp Ile Val Thr Ile Ser Gln Ala Thr Pro Ser Ser61 Val Ser Arg Gly Thr Ala Pro Ser Asp Asn Arg Val Thr Ser Phe76 Arg Asp Leu Ile His Asp Gln Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu91 Gly Gln Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Gly Gly Ser Glu Arg Ser Gly106 Gln Gln Ile Val Gly Pro Pro Arg Lys Lys Ser Pro Asn Glu Leu121 Val Asp Asp Leu Phe Lys Gly Ala Lys Glu His Gly Ala Val Ala136 Val Glu Arg Val Thr Lys Ser Pro Gly Glu Thr Ser Lys Pro Arg151 Pro Phe Ala Gly Gly Gly Tyr Arg Leu Gly Ala Ala Pro Glu Glu166 Glu Ser Ala Tyr Val Ala Gly Glu Lys Arg Gln His Ser Ser Gln181 Asp Val His Val Val Leu Lys Leu Trp Lys Ser Gly Phe Ser Leu196 Asp Asn Gly Glu Leu Arg Ser Tyr Gln Asp Pro Ser Asn Ala Gln211 Phe Leu Glu Ser Ile Arg Arg Gly Glu Val Pro Ala Glu Leu Arg226 Arg Leu Ala His Gly Gly Gln Val Asn Leu Asp Met Glu Asp His241 Arg Asp Glu Asp Phe Val Lys Pro Lys Gly Ala Phe Lys Ala Phe256 Thr Gly Glu Gly Gln Lys Leu Gly Ser Thr Ala Pro Gln Val Leu271 Ser Thr Ser Ser Pro Ala Gln Gln Ala Glu Asn Glu Ala Lys Ala286 Ser Ser Ser Ile Leu Ile Asp Glu Ser Glu Pro Thr Thr Asn Ile301 Gln Ile Arg Leu Ala Asp Gly Gly Arg Leu Val Gln Lys Phe Asn316 His Ser His Arg Ile Ser Asp Ile Arg Leu Phe Ile Val Asp Ala331 Arg Pro Ala Met Ala Ala Thr Ser Phe Ile Leu Met Thr Thr Phe346 Pro Asn Lys Glu Leu Ala Asp Glu Ser Gln Thr Leu Lys Glu Ala361 Asn Leu Leu Asn Ala Val Ile Val Gln Arg Leu Thr(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5GTAAGGATCC ATGGCGGCGG AGCGACAGG 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GAACGTCGAC TTATGTTAAC CGCTGCACG 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7GTGTGGATCC ATGGCGGCGG AGCGACAGG 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8AAATCTGCAG TTATGTTAAC CGCTGCACG 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人P47蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列包含SEQ ID NO.3中核苷酸14-1132位的序列。
4.一种分离的人P47蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有人P47蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人P47蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人P47蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人P47蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人P47蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人P47蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸14-1132位。
12.一种能与权利要求4所述的人P47蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了人P47的cDNA序列,该序列编码的蛋白是P47的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C07K14/435GK1250098SQ9812092
公开日2000年4月12日 申请日期1998年10月5日 优先权日1998年10月5日
发明者余龙, 张宏来, 傅强, 屠强, 赵寿元 申请人:上海新黄浦复旦基因工程有限公司