专利名称：肿瘤热休克蛋白－多肽复合物抗原的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物化学的蛋白质分离提纯技术，肿瘤抗原的分离纯化方法。
目前研究表明很多恶性肿瘤细胞有热休克蛋白-多肽复合物(Heat ShockProteins-peptide complexes，HSPs)表达。由于HSPs上结合有肿瘤抗原肽，因此，分离得到肿瘤细胞的HSPs就可得到肿瘤抗原，用于制备抗肿瘤的生物制剂，所以研究HSPs的分离提取方法并不断进行技术改进，探索大批量生产的工艺，对实现提供大量的成品HSPs抗原供临床使用有重大的实用价值。
现在普遍采用的分离HSPs技术一是用ATP-agarose，但分离后HSPs无生物活性(免疫原性)，没有临床使用价值。二是过Con A-sephrose后再过Mono Q柱。这种方法提纯量小，只能用于试验室，并且因柱子价格昂贵、易损，一旦操作不慎造成柱子损坏，浪费很大，又影响进度，柱子是进口的，不能自行组装，所以该方法的最大缺点是成本高。
本发明的目的是提供一种降低成本、适于制备大量样品的肿瘤HSP-多肽复合物抗原的分离纯化方法。
肿瘤热休克蛋白-多肽复合物(HSP)抗原的分离纯化方法，包括取瘤组织破碎，使细胞核与膜分离，然后离心、第一次层析、透析、浓缩、第二次层析、定性定量、纯度测定，其特征是破碎时将低渗裂解液与超声粉碎机并用；在层析时用DEAE-52行第二次分离。
本发明分离纯化方法的优点是1、在裂解步骤中低渗裂解液及超声粉碎机并用，这样既减少了裂解液的用量，是原有用量的1/18，又能使细胞在行超声粉碎前膨胀或部分破裂，易于粉碎。因此该法操作简便、适于处理量大的样品，使规模化生产成为可能。单纯使用低渗裂解液，在处理大量组织细胞时裂解液量大，离心及过柱费时，效率低，且不必要，但单纯应用超声粉碎机恐难将细胞器彻底粉碎，而影响HSPs的产率。
2、在第二次层析中改用DEAE-52有如下优点(1)传统的ATP-agarose方法分离得到的HSPs无抗原性，因HSPs具有ATP酶的活性，HSPs与ATP接触后HSP与多肽分离，丧失抗原性，使得HSPs无临床使用
(2)目前国外用的Mono Q柱分离方法，纯度高，分离效果好。但Mono Q柱容积小(10×0.5cm)，价格昂贵，8900元/支。该柱对样品要求高，且易损坏。一旦损坏使提纯成本倍增。而且Mono Q柱主要用于处理少量的实验用品，不适于大批量生产成品。而本发明改用DEAE-52层析柱进行第二次分离，效果与用Mono Q相同。DEAE-52价格低廉，且可自行装柱，多次使用。其成本较MonoQ柱层析显著下降，比用现有技术下降2/3-3/4，适合于大批量生产用。
(3)本发明中层析时还可省去ConA-Sepharose层析步骤，而只用DEAE-52进行两次层析，此法比方案1更进一步地降低成本。
实施例1肿瘤HSP-多肽复合物抗原的分离纯化方法，包括取瘤组织或培养的瘤细胞株(若取组织则需将组织研碎后，过200目网)，细胞清洗干净、离心后，破碎，其特征是破碎时用低渗裂解液与超声粉碎机并用；按固体物体积比1/10加入低渗裂解液，10分钟(4℃)后再用超声粉碎机破碎，实验室用的超声粉碎机，在10ml试管内加入样品5-8ml，反复三次，每次3秒，于冰水中进行。使细胞核与膜分离，然后用超高速离心机离心，105g/分钟，离心1小时，取上清液，层析先过ConA-Sepharose层析柱行第一次层析，收集洗脱液，透析、浓缩后再用快速液相蛋白系统(FPLC)，过DEAE-52层析柱行第二次层析，用20-500mmol/L NaCl洗脱，收集250-350mmol/L浓度的洗脱液透析、浓缩后可得HSPs。分离得到的HSPs经定性(聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE、免疫印迹杂交Western-Blot法)、定量后，纯度达到电脉纯，(电脉后为一条带)。每次上样品量与所用的DEAE-52要相匹配，将前步骤的浓缩样品按1∶5比例配DEAE-52。纯度测定后，可作为抗原使用。主要用于恶性肿瘤及传染病的免疫治疗。
实施例2本方法还可在此基础上试行改进层析时省去Con A-Sepharose层析柱，而只用DEAE-52层析柱行两次分离。这样可使成本比方案1进一步大幅度下降。细胞破碎后，直接于FPLC系统上过DEAE-52柱，用20-500mmol/L NaCl洗脱，收集各峰蛋白，行SDS-PAGE，再行Western-Blot，然后寻找HSPs的蛋白峰纯化，再测纯度及产率，直至HSPs达到电脉纯。
用上述方法提取Hcaf细胞(小鼠的肝癌细胞株)HSP-多肽肿瘤抗原实例1、Hcaf细胞培养、扩增、一共9个克氏瓶(每个容积100ml)盛培养液10ml，内有约107细胞)总计用Hcaf细胞9×107个，量约90-100ml，将上述细胞用PBS洗三次，用低渗裂解液60毫升，作用10分钟后用超声粉碎机破碎三次，每次3秒，于冰水中，用超高速离心机在4℃环境下离心(105g/分)一小时，取上清液。
2、层析将上清液过Con A-Sepharose柱，6ml/分，收集洗脱液透析浓缩至5ml。再将该样品于FPLC系统上用DEAE-52分离剂分离，柱子规格40×1.5，20-500mmol/L NaCl洗脱，收集各洗脱峰蛋白，然后每个峰均行SDS-PAGE，测分子量，在E峰发现-70KD蛋白质，再行电泳；用电转移法将蛋白转移至硝酸素纤维膜上，以抗HSP-70抗体为一抗，碱性磷酸酶标记的抗鼠IgG抗体为二抗，行Western-blot定性，显色后证实该蛋白为HSP70。测定该蛋白纯度为97.3％。
以此蛋白为抗原注射给健康的615系近交系小鼠10μg/次，连续二次，每周一次，最后一次注射一周后，再向实验组小鼠腹腔内注射活的HCaf细胞107个/次/只，则注射HSP70的小鼠长期存活，无一死于肿瘤，而对照组于10日内全部死亡，荷瘤组鼠的生存期比对照组延长了2-3倍。
用HSP70为抗原成功地诱导出了肿瘤特异性的细胞毒T细胞(CTL)，效靶比例为50∶1时，体外杀瘤效应为84.8％，注射给荷瘤鼠后，小鼠肿瘤于注射三次后全部消退，该组小鼠全部存活，无一死于肿瘤。进一步说明该方法提取的肿瘤HSP70具有强大的免疫原性，证明该分离方法实用、有效、纯化效果好。
权利要求
1.一种肿瘤HSP-多肽复合物抗原的分离纯化方法，包括取瘤组织破碎，使细胞核与膜分离，然后离心、第一次层析、透析、浓缩、第二次层析、定性定量、纯度测定，其特征是破碎时用低渗裂解液与超声粉碎机并用；在层析时用DEAE-52行第二次层析分离。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征是破碎步骤a将组织研碎后，过滤一次，用200目网筛；b按固体物体积比1/10，加入低渗裂解液，4℃浸10分钟后再粉碎；c将低渗裂解液浸泡物放入超声粉碎机，破碎三次，每次3秒，于冰水中进行，再离心，105g/分钟，1小时、取上清液。
3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征是层析时提取液经ConA-Sepharose层析柱，透析、浓缩后，再用快速液相蛋白系统(FPLC)、过DEAE-52层析柱行第二次分离，用20-500m mol/L NaCl洗脱液，浓缩样品按1∶5比例配DEAE-52，经上述步骤得到的HSPs可达电脉纯。
4.根据权利要求1和3所述的分离纯化方法，其特征是层析时省去ConA-Sepharose层析柱步骤，而只用DEAE-52进行两次层析分离；细胞破碎后，直接于FPLC系统上过DEAE-52柱，用20-500mmol/L NaCl洗脱，收集各峰蛋白，行SDS-PAGE，再行Western-Blot，然后寻找HSPs的相应蛋白峰，再行一次DEAE-52，以纯化，再测纯度及产率，直到HSPs达到电脉纯。
全文摘要
肿瘤热休克蛋白－多肽复合物抗原的分离纯化方法,包括取瘤组织破碎,使细胞核与膜分离,然后离心、第一次层析、透析、浓缩、第二次层析、定性定量、纯度测定,其特征是破碎时低渗裂解液与超声粉碎机并用;用EDAE－52行第二次层析分离。这种破碎方法既减少了裂解液的用量,是原有用量的1/18,又能使细胞易于粉碎;该分离纯化方法使成本比现有技术下降2/3—3/4,适合于大批量生产,从而使该抗原能够用于临床。本发明中层析时还可省去ConA－Sepharose层析步骤,而只用DEAE－52进行两次层析,此法比方案1更进一步降低成本。
文档编号C07K1/36GK1257870SQ9812109
公开日2000年6月28日 申请日期1998年12月18日 优先权日1998年12月18日
发明者傅庆国, 郭仁宣 申请人:傅庆国, 郭仁宣