专利名称：稳定蛋白质的改进方法
技术领域：
本发明涉及冷冻或冻干过程或低温保存过程中稳定蛋白质的改进方法。
蛋白质诸如酶或抗体及其片段等是不稳定的，易于失活，和/或当储存于低温(低于0℃)，特别是在反复冻融过程中易于形成可溶或不可溶的聚集物。由于形成颗粒，这些聚集物发生明显变化，形成浑浊物。但这种聚集物和/或颗粒形式在药用组合物中是不允许的，或者至少应当含量甚微。药用组合物制剂应是澄清溶液，若是冻干制剂，当重组(加水溶解)时应形成无颗粒的澄清溶液，不含可溶性蛋白聚集物。
已知有许多方法和添加剂可用于溶液中蛋白的稳定。例如，EP-A0599344中描述了加入诸如HSP25的热激蛋白来提高蛋白稳定性。EP-A0318081报道了添加由聚环氧丙烷和聚环氧乙烷组成的嵌段共聚物和磷脂以提高抗体稳定性。含氮基质的盐如含精氨酸、胍或咪唑在EP-A0025275中用于稳定免疫球蛋白。其他适于用作稳定化添加剂的有聚醚(EP-A0018609)、甘氨酸、白蛋白和硫酸葡聚糖(美国专利4808705)、去污剂如Tween20(DE2652636,GB8514349)、伴侣蛋白如Gro EL(Mendoza,J.A.Biotechnol.Tech.10(1991)535-540)、柠檬酸缓冲液(WO9322335)或螯合剂(WO9115509)。虽然这些添加剂可使蛋白质在水溶液中达到一定稳定度，但以前的方法中没有一种方法可适用于反复冻融时稳定蛋白质，以达到适用于临床目的的在再冻融、0℃以下低温保存或冻干后再加水溶解时不形成可溶性或不溶性聚集物，或仅有可忽略的痕量聚集物。
在EP-A0314095中报道了一种诸如因子Ⅷ的血浆蛋白冻干剂，它含组氨酸缓冲液作为缓冲物质，氯化钙作为添加剂，并处于高离子强度下(0.35-1.2mmol/l)。
EP-A0315968中报道了在含有0.15-15mmol/l氯化钠或氯化钾，0.1-10mmol/l盐酸赖氨酸和0.2-5mmol/l组氨酸作缓冲离子的血浆蛋白如因子Ⅷ的冻干制剂。不过，当冻干蛋白制剂加水溶解时组氨酸缓冲液并不适用于稳定蛋白和防止聚集物和颗粒的形成。
因而，本发明的目的便是要提供一种可显著抑制药用蛋白冻干制剂加水溶解时产生聚集物或形成颗粒的方法。
由此，本发明涉及一种防止药用蛋白组合物(优选抗体)自冻干制剂溶解时形成蛋白聚集物的改进方法，其中将这种蛋白冻干制剂的缓冲蛋白水溶液冷冻，解冻，分装成注射剂量的小份，这些小份分装在含有磷酸钾缓冲液作为缓冲物质，钾离子与钠离子比例为10∶1或更高的水溶液中冻干。因此水性缓冲液优选必须不含钠离子的。
本发明可使药用蛋白组合物，尤其是趋于形成二聚体或多聚体的蛋白如抗体，在中性pH范围(pH6-8，优选pH6.5-7.5)内形成稳定的药用组合物。诸如抗体的蛋白在中性pH范围内趋于形成聚集物，尤其是当溶液冷冻(也可以冻干)一次或几次，然后解冻时更是如此。
药用组合物在pH6-8范围内、浓度10-300mmol/l(优选50-250mmol/l)、其中有最可能低量的钠离子存在的磷酸钾缓冲液中是特别有效的。溶液中合适的钾∶钠比例为10∶1或更大。最为理想的是在该药物组合物中仅以磷酸钾缓冲液作缓冲物质，不加钠盐(如NaCl)。在这种情况下，该药用组合物几乎不含钠离子或仅含不会在反复冻融过程中形成蛋白的聚集物的极少量钠离子。
已经证明，若仅用磷酸钾缓冲液作缓冲物质，在生产过程中至少冷冻一次的蛋白溶液制成的冻干制剂可加水溶解而不产生浑浊。通常的缓冲液如磷酸钠缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸缓冲液会在这一过程中形成主要含蛋白的聚集物，从而导致一定程度的浑浊。冻干蛋白溶液在大约-15℃以下已完全冰冻，其低共熔点高于大约-15℃，因此可在这一温度下(或更低温度，优选-20℃)保存。由于溶液仅在温度低于其低共熔点以下温度下才会完全冰冻，这意味着在含有钠离子的磷酸钾缓冲液中的蛋白在冷冻保存过程中以及在冻/融过程中会比在不含钠离子或钠离子浓度较低的缓冲液中经受更大应激。对于本发明而言，这种应激在上述制剂中可避免，从而抑制了聚集物或颗粒形成。这种方法可使蛋白溶液在-20℃下稳定保存，从而节约成本。在冷冻过程中，与磷酸钠缓冲液不同，磷酸钾缓冲液仅有很少的pH值变化(优选最多±1pH单位，更优选最多±0.5pH单位)。
已经证明，为有效防止颗粒形成，磷酸钾缓冲液浓度至少应在10mmol/l，优选50mmol/l或更高。由于该渗摩尔浓度在药用组合物(优选加水溶解的溶液)中不能太高(最好在生理范围内，优选加水溶解后大约300mOsm(±20mOsm)，100-500mOsm范围内也是合适的)，缓冲物质浓度或缓冲物质和盐的总浓度不应高于250-300mmol/l。在分装制剂中缓冲液浓度优选50-250mmol/l。但在生产分装试剂的溶液(大批量)中较高浓度缓冲液和/或盐类是容许的。
对于本发明，若在药用组合物中需要加入盐类添加剂以调节离子强度，较为有利的也是不使用钠盐或使用显著低于钾盐浓度的钠盐浓度。这样，合适的做法是加入钾盐如氯化钾以取代通常的氯化钠。不过，已经证明，低浓度钠盐(大约10mmol/l或更低)并不改变规定的钾离子与钠离子比例为10∶1或更高的比值。加入钙盐如氯化钙是不可行的，因为磷酸钙会因此而发生沉淀。这样，除了形成浑浊，本发明中磷酸钾的缓冲效果也消失了。
本发明方法应予以防止形成的不溶性聚集物应理解为大小至少为1um但可达10um的蛋白聚集物。其颗粒可用颗粒计数的适当方法如PSS(Particlesizing Systerm USA)计数器Accusizer700测定。用本发明的一种改进方法得到的结果是浓度在2-400um/ml的颗粒数＜3000或10-400um/ml的为2000或更少。美国药典(US-Pharmacopieia)规定每个注射剂量药用组合物中大于10um的颗粒最多可容许6000个，而大于25um的颗粒可容许600个。这种结果在本发明中可用简单方法达到。
蛋白(多肽)在本发明中可理解为蛋白质或蛋白质片段或化学修饰的蛋白质。适用于稳定蛋白的药用组合物优选的是抗体、抗体融合蛋白(如免疫毒素)、酶和蛋白激素(如促红细胞生成素)、促生长抑制素、胰岛素、细胞分裂素、干扰素、或纤溶酶原激活物。
本发明分装制剂的含义就是等分的蛋白溶液，适于作药用组合物，可先作进一步处理(添加容许的药用物质)。这种制剂主要是病人注射用。可被磷酸钾缓冲液稳定的药用组合物pH范围优选微酸性、中性、微碱性(大约pH6-8，优选pH7)。
本发明优选的是加非离子去污剂(如Tween80)，优选重量百分浓度至多0.1％，至少0.01％。
另外，最好加冷冻保护剂或玻璃形成剂如非还原剂性糖(优选蔗糖或海藻糖)，浓度以至少10mg/ml较为有利，优选大约30-100mg/ml。
由此，本发明的主题是要得到低聚集物的可熔固体储存形式的蛋白，这种蛋白基本上是无定型的，由该蛋白的冻溶液制成，磷酸钾缓冲液作为主要的缓冲物质，该溶液中钾离子∶钠离子比例至少10∶1。
除了钾离子与残留量钠离子的浓度以外，钾离子与钠离子的比应当至少在10∶1，优选至少50∶1。最好使用不含钠离子的磷酸钾缓冲液。
在本发明另一优选的实施方案中，药用组合物含有的蛋白已由体外培养产生(如重组产物或杂交瘤细胞株培养产生单克隆抗体)。这种情况下较为合适的是在第一次加入盐和/或缓冲液时加入磷酸钾缓冲液，或在后来分离纯化过程中再用缓冲液处理。这样可使蛋白提取物在0℃以下稳定保存。再用缓冲液处理是指通过透析进行离子交换。由于这些组分并不用于临床，在分装前的蛋白提纯和分离过程中，缓冲液或盐浓度事实上可达50-100mmol/l。但是，注射用制剂合适的渗摩尔浓度需要在分装前调整好。
以下的实施例、文献和图表用于进一步阐明了本发明，而发明的保护范围由专利权利要求确定。上述方法的实施例即使修改后仍被认为是本发明的范围以内。
图1显示不同缓冲液和盐溶液的低共熔点。
图2显示冰冻过程中磷酸盐缓冲液的pH值变化。
图3显示经剪切或冻/融应激后一种抗体(抗L-选择素)溶液在不同缓冲液(A、B、C)中颗粒形成情况。
A:AB在10mmol/l磷酸钾缓冲液中，150mmol/lNaCl,pH7；B:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，pH7.2；C:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，0.01％重量百分比Tween80,pH7.2；a离心(起始物质)；b剪切应激后(30秒搅拌)；c六次冻/融循环后(-20℃)；图4显示经剪切或冻/融应激后一种抗HBV抗体溶液在不同缓冲液(A、B、C)中颗粒形成情况。
A:AB在10mmol/l磷酸钾缓冲液中，150mmol/lNaCl,pH6.5；B:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，pH7.2；C:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，0.01％重量百分比Tween80,pH7.2；
a离心(起始物质)；b剪切后(30秒搅拌)；c六次冻/融循环后(-20℃)；图5显示在0℃下经冷冻保存后蛋白溶液(实施例3中人源抗体IgG)的可溶性聚集物的颗粒大小排阻的HPLC分析结果。
A:AB在10mmol/l磷酸钾缓冲液中，150mmol/lNaCl,pH7.0；B:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，pH7.2；实施例1不同缓冲液和盐溶液中低共熔温度从图1可清楚看出氯化钠缓冲液的低共熔温度大约10℃，要比不含氯化钠而含氯化钾的缓冲液的低。由于溶液在低于低共熔温度下才能完全冰冲东，这意味着在冰冻保存(通常为-20℃)和冻/融过程中蛋白在含有氯化钠的磷酸缓冲液中要比在不含氯化钠的缓冲液中经受更大应激。在本发明以上所述的制剂由于抑制聚集物和颗粒形成而避免了这种应激。这种制剂使得在-20下蛋白溶液得以稳定保存，从而节约成本。实施例2磷酸盐缓冲液冷冻过程中缓冲液pH值的变化从图2可清楚看到在冰冻过程中由于磷酸氢二钠沉淀，含氯化钠的磷酸缓冲液的pH值大大降低。不含氯化钠的磷酸钾缓冲液的pH值保持稳定。实施例3经剪切或冻/融应激后蛋白溶液中颗粒的形成对一种人源IgG(抗L-选择素抗体)溶液在不同缓冲液(A,B,C)中进行了颗粒含量分析(Accu sizer，颗粒分析系统，USA)。
A:AB在10mmol/l磷酸钾缓冲液中，150mmol/lNaCl,pH7；B:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，pH7.2；C:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，0.01％重量百分比Tween80,pH7.2；a离心(起始物质)；b剪切应激后(30秒搅拌)；c六次冻/融循环后(-20℃)；图3中数据每个样品为0.7ml。
由图3可清楚看出，本发明中由于使用了不含钠盐的磷酸钾缓冲液，颗粒形成得以抑制。这种效果可由加入非离子去污剂而增强(Tween80,0.01％重量比)。实施例4经剪切或冻/融应激后蛋白溶液形成颗粒情况对一种抗HBV抗体溶液在不同缓冲液(A,B,C)中进行了颗粒含量分析(Accu sizer，颗粒分析系统，USA)。
A:AB在10mmol/l磷酸钾缓冲液中，30mmol/lNaCl,pH6.5；B:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，pH7.2；C:AB在100mmol/l磷酸钾缓冲液中，0.01％重量百分比Tween80,pH7.2；a离心(起始物质)；b剪切应激后(30秒搅拌)；c六次冻/融循环后(-20℃)；图3数据每个样品为0.7ml由图4可见，本发明中由于使用了不含钠盐的磷酸钾缓冲液，颗粒形成得以抑制。这种效果可由加入非离子去污剂而增强。实施例5在0℃以下温度保存蛋白溶液(即实施例3中的人源抗体IgG)时防止可溶性聚集物的形成蛋白溶液在-20℃低温保存数周A)10mM磷酸钾，150mM氯化钠，pH7.0；B)100mM磷酸钾，pH7.2。使用HPLC大小排阻法分析可溶性聚集物和原蛋白。本发明中，在不含氯化钠的缓冲液中蛋白聚集物要明显少于含有氯化钠的缓冲液。这一切均是由于不含氯化钠的缓冲液的pH值变化基本上被抑制，保存温度也明显低于低共熔点温度。(参阅实施例1,2)。实施例6冻/融应激后蛋白溶液颗粒的形成对不同缓冲液中的抗体如MABL-选择素、MAB HBV、MABPDGF-R和MAB LNGF-R，在冻/融应激前后的颗粒组成作分析(Accu sizer,颗粒分析系统)(结果见表一，Cprot蛋白浓度)。颗粒大小在2-400/ml。
权利要求
1．用于防止药用蛋白冻干剂加水溶解时形成蛋白聚集物的改进方法，该药用组合物中蛋白含水缓冲溶液经冷冻，融解，分装成注射剂量，并将这些分装制剂冻干，其中蛋白含水缓冲溶液含有磷酸钾缓冲液作缓冲物质，溶液中钾离子∶钠离子比例为10∶1或更高。
2．权利要求1的方法，其中分装制剂的缓冲液浓度为10-300mmol/1。
3．权利要求12的方法，其中分装制剂的重组溶液的渗摩尔浓度为100-500mOsm，优选300±50mOsm。
4．权利要求1-3中的方法，其中含水缓冲溶液pH范围为6-8。
5．权利要求1-4中的方法，其中含水缓冲溶液含有非离子去污剂。
6．权利要求1-5中的方法，其中含水缓冲溶液含有浓度为10-100mg/ml的糖。
7．权利要求1-6中的方法，其中蛋白质为一种抗体。
8．含有低聚集物的可溶性固态保存蛋白，其基本上是无定型的，含有该蛋白的冰冻溶液，用磷酸钾缓冲液作缓冲物质，溶液中钾离子∶钠离子比例至少10∶1。
9．权利要求8的固态保存蛋白，其中保存态是用冻干方法制备的。
10．权利要求8或9中的固态保存蛋白，其中该蛋白是一种抗体。
11．含水缓冲溶液pH值范围为6-8的药用蛋白组合物，其中该溶液含有磷酸钾缓冲液作为缓冲物质，并且a)钾离子∶钠离子比例为10∶1或更高。b)缓冲液浓度为10-300mmol/1。
12．权利要求11的药用组合物，其中该蛋白是一种抗体。
全文摘要
一种可防止药用蛋白冻干剂在重组时形成蛋白聚集物的改进方法,其中含水的蛋白缓冲液经冷冻、融解、分装成注射剂量,并将这些分装制剂冻干,其特征在于,该含水的蛋白缓冲溶液含有磷酸钾缓冲液作缓冲物质,溶液中钾离子∶钠离子比例为至少10∶1,该方法可用于生产稳定的药用组合物冻干剂。
文档编号C07K16/00GK1220270SQ9812253
公开日1999年6月23日 申请日期1998年11月20日 优先权日1997年11月22日
发明者克劳斯·海勒布兰德, 阿波朗·帕帕迪米特里奥, 格哈德·温特 申请人:贝林格尔曼海姆股份有限公司