专利名称：人肌动蛋白相关蛋白基因、其编码的多肽及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产。更具体地说，本发明的蛋白多肽被推断鉴定为肌动蛋白相关蛋白家族的一个新成员。
肌动蛋白相关蛋白(actin-related protein，简称为″ARP″)是一类和肌动蛋白有着共同的起源，经历了不同进化历程的蛋白分子。它是肌动蛋白超家族的一员，普遍存在于各种真核生物细胞中，并且是细胞骨架的重要组成部分之一，广泛参与细胞形状的维持、细胞运动、胞质分裂和细胞器移动等功能(Trends Cell Biol.6208-212，1996；Curr.Opin.Cell Biol.830-37，1996)。
1992年Schroer等人最早在酵母中用随机测序法发现了Arp基因(J.Cell.Biol.1271777-1778，1994)，以后人们在各种生物中都发现了Arp基因家族的成员。已知的Arp家族成员可分成三个家族Arp1、Arp2和Arp3，它们分别有着各自独特的序列和功能。1992年Lees-Miller等人从裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中发现了第一个Arp3家族成员act2(Proc.Natl.Acad.Sci.8980-83，1992)；1995年Kelleher等人在阿米巴虫(Acanthamoeba castellanii)中克隆了Arp3的同源物(J.Cell.Biol.131(2)385-397，1995)；同年Murgia等人在粘菌(Dictyostelium discoideum)中找到了Apr3家族成员(FEBS Letters 360235-241，1995).1997年Welch等人在人的血小板细胞中找到了Arp3家族的同源物(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。但在本申请之前，没有公开或发表过其它的人的Arp3蛋白同源物。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码肌动蛋白相关蛋白基因家族的一个新成员，本发明新的人肌动蛋白相关蛋白基因被命名为人Arp3H。
本发明的另一个目的是提供一种新的肌动蛋白相关蛋白蛋白家族成员，该蛋白被命名为人Arp3H蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人肌动蛋白相关蛋白的方法。
本发明还涉及这种人肌动蛋白相关蛋白基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人Arp3H蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人Arp3H蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人Arp3H蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人Arp3H蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人Arp3H蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人Arp3H蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为583个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于29-1237位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人Arp3H蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中29-1237位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框29-1237位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中29-1237位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人Arp3H相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人Arp3H蛋白多肽”指具有人Arp3H蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人肌动蛋白相关蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人Arp3H蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人Arp3H DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人Arp3H多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人Arp3H多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了人Arp3H多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人Arp3H多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人Arp3H蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人Arp3H多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人Arp3H保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。较佳地，这些保守性变异多肽是根据表1进行氨基酸替换而产生的。
表1
本发明还包括人Arp3H多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人Arp3H的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有人Arp3H核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人Arp3H的核酸分子。
本发明还包括检测人Arp3H核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人Arp3H多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人Arp3H DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人Arp3H基因产物或片段。较佳地，指那些能与人Arp3H基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人Arp3H蛋白的分子，也包括那些并不影响人Arp3H蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人Arp3H基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人Arp3H基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人Arp3H或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人Arp3H功能的抗体以及不影响人Arp3H功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人Arp3H基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人Arp3H基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人Arp3H核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的SEQ ID NO.3序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明获得的Arp3H的多核苷酸全长为1269个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于29-1237位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A15′-CGGGGCCGAGCGCCGCGCG-3′和反向引物B15′-TGACACCATCGAACGAC GCGTTC-3′进行PCR，获得1269bp的目的片段。测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
根据同源比较的结果，本发明的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列与不同来源的肌动蛋白相关蛋白显示了显著的同源性，因此，这表明它是肌动蛋白相关蛋白家族的一个新成员，并且具有肌动蛋白相关蛋白家族蛋白的一些重要功能。
和Arp2相类似，Arp3也是和肌动蛋白同源程度较低、相关性较远的Arp蛋白(Proc.Natl.Acad.Sci.8980-83，1992)。它们广泛存在于真核生物中(Curr.Opin.Cell Biol.830-37，1996)。Arp3蛋白和肌动蛋白有着相似的三维核心结构，并且有结合ATP所需的全部氨基酸残基，但是和蛋白间相互作用相关的蛋白表面的氨基酸残基是各异的(Trends Cell Biol.6208-212，1996)。
在在阿米巴虫中Arp3蛋白集中分布于富含肌动蛋白的皮质区(J.Cell.Biol.131(2)385-397，1995)。对鼠Swiss 3T3成纤维细胞的研究发现，Arp3蛋白和Arp2蛋白组成的复合体经荧光免疫显示定位于片状足(lamellipodia)结构中(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。Welch等人在一种能在宿主细胞质内直接移动的致病细菌(Listeria monocytogenes)中的研究表明，有活性的Arp2/3复合体可能作为肌动蛋白组装时聚核作用的模板，促进肌动蛋白聚集(Nature 385265-269，1997).Arp3蛋白和肌动蛋白有着交联作用，使得片状足结构中的纤维有序地排列成网状结构(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。
此外，片状足伸出与神经细胞发育、生长锥形成和神经突触的定向等过程均有紧密关联(Cell Motil Cytoskeleton 37(1)54-71 1997；Perspect.Dev.Neurobiol.4(2-3)111-123，1996)，因此Arp3对神经系统的发育可能是必需的。另外，粘菌中的Arp3同源蛋白参与了线粒体在细胞内的运动和定位(FEBS Letters 360235-241，1995)，Arp3是否在哺乳动物细胞中也参与细胞内能量的分配过程还有待进一步的研究。
在附图中，
图1为本发明的人Arp3H与人Arp3(h-Arp3)的核酸序列同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人Arp3H与人Arp3(h-Arp3)的氨基酸序列同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，比如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人Arp3H的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λgtl lcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物-A15′-CGGGGCCGAGCGCCGCGCG-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B15′-TGACACCATCGAACGACGCGTTC-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、70℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段为1269bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将如上获得的PCR扩增产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1269bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于29-1237位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人Arp3H的氨基酸序列，共402个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用本发明的人Arp3H的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+Swiss Prot+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，本发明的人Arp3H与肌动蛋白相关蛋白家族成员显示了较高的同源性，如用PCGENE软件分析，它与人Arp3(gb|AF006083)在核酸水平上的同一性达到了75.7％(图1)，在蛋白水平上的同一性达到了82.6％，并有5％的氨基酸相似(图2)，因此z这表明本发明的人Arp3H是人Arp3的同源基因，并且属于同一个Arp基因家族，并具有相同或相似类似的功能。
和Arp2相类似，Arp3也是和肌动蛋白同源程度较低、相关性较远的Arp蛋白，它们并不组成肌动蛋白丝那样的纤维结构(Proc.Natl.Acad.Sci.8980-83，1992).Arp3基因广泛存在于真核生物中，在酵母中该基因的缺失是致死的(Curr.Opin.Cell Biol.830-37，1996)。
研究表明，Arp3蛋白和肌动蛋白有着相似的三维核心结构(L/M)(L/I/V/M)TE(G/A/P/Q)X(L/I/V/M/F/Y/W/H/Q)N(P/S/T/A/Q)X2N(K/R)[注该序列中X为任意氨基酸，“2”等数字为氨基酸数目，“(L/M)”表示从这2个氨基酸中任选一个氨基酸]。
在本发明的Arp3H蛋白中，相对应序列为SEQ ID NO.4中第92位至第104位氨基酸，即92M-T-E-P-P-L-N-T-P-E-N-R104。并且，本发明的Arp3H中存在结合ATP所需的全部氨基酸残基，但是和蛋白间相互作用相关的蛋白表面的氨基酸残基是各异的(Trends Cell Biol.6208-212，1996)。
研究已表明，Arp3在阿米巴虫中是主要的细胞内蛋白，集中分布于富含肌动蛋白的皮质区(J.Cell.Biol.131(2)385-397，1995)。研究静止或移动的鼠Swiss 3T3成纤维细胞发现，Arp3蛋白和Arp2蛋白组成的复合体经荧光免疫显示定位于片状足(lamellipodia)结构中，这与肌动蛋白丝不同(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。片状足是真核细胞内由一层细胞质组成的非肌肉的基本运动细胞器，具有伸出活力(Symp.Soc.Exp.Biol.4757-71，1993)。Welch等人在一种能在宿主细胞质内直接移动的致病细菌(Listeria monocytogenes)中的研究表明，有活性的Arp2/3复合体可能作为肌动蛋白组装时聚核作用的模板，促进肌动蛋白聚集。它们位于肌动蛋白丝静止的一端，启动肌动蛋白有方向的聚合(Nature 385265-269，1997)。Arp3蛋白和肌动蛋白有着交联作用，很可能起到肌动蛋白丝端和复合体的连结作用并具有帮助肌动蛋白丝平行排列的功能，使得片状足结构中的纤维有序地排列成网状结构(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。有关实验表明，片状足伸出与神经细胞发育、生长锥形成和神经突触的定向等过程均有紧密关联(Cell MotilCytoskeleton 37(1)54-71，1997；Perspect.Dev.Neurobiol.4(2-3)111-123，1996)，因此Arp3对神经系统的发育可能是必需的。根据目前研究推测，本发明的Arp3H可能与神经系统的发育存在一定相关性。
此外，对粘菌中Arp3同源基因进行的荧光免疫实验证明，该蛋白参与了线粒体在细胞内的运动和定位(FEBS Letter 360235-241，1995)。虽然，Arp3和Arp3H是否在哺乳动物细胞中也参与细胞内能量的分配过程还有待进一步的研究。但是，这些研究都暗示，Arp3和Arp3H的缺失或表达异常会导致疾患，甚至死亡。
本发明的人Arp3H除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人Arp3H还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人Arp3H蛋白的N端与人Arp3蛋白或粘菌的Arp3蛋白的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人Arp3H的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员，如人Arp3蛋白)。
例如，本发明人Arp3H核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人Arp3H的表达水平或者抑制人Arp3H的过度表达。本发明的人Arp3H蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人Arp3H缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人Arp3H在大肠杆菌中的表达编码人Arp3H的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中得到的片段为模板进行扩增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGCGTCGACATGGCAGGCTCCCTGCTCC-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人Arp3H编码序列的19个核苷酸；3’寡核苷酸引物序列为5’-GTTCAAGCTTCTAGGACATGACTCCAAAG-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和人Arp3H的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用BamHI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明人Arp3H的cDNA插入片段已正确装入载体。
过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人Arp3H。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人Arp3H。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为45KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4人Arp3H在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码人Arp3H的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中得到的片段为模板进行扩增，以合成插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGCAAGCTTATGGCAGGCTCCCTGCTCC-3′(SEQ ID NO.7)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人Arp3H编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-GTTCGAATTCCTAGGACATGACTCCAAAG-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人Arp3H的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII、EcoRI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明人Arp3H的cDNA插入片段已正确装入载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为45KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人Arp3H基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人上海新黄浦复旦基因工程有限公司(ii)发明名称人肌动蛋白相关蛋白基因、其编码的多肽及制法和用途(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CGGGGCCGAG CGCCGCGCG 19(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TGACACCATC GAACGACGCG TTC23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度1269bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3CGGGGCCGAG CGCCGCGCGT TCCCGAGCAT GGCAGGCTCC CTGCTCCCTG CGTGGTGGAC 60TGTGGCACCG GCTATTGCCA TCAAAGAGTC AGCAAAGATA GTTGACCAAG CTCAAAGGAG 120AGTGTTGAGG GGAGTTGATG ACCTTAACTT TTTCATAGGA GATGAAGCCA TCGATAAACC 180TACATATGCT ACAAAGTGGC CGATACGACA TGGAATCATT GAAGACTGGG ATCTTATGGA 240AAGGTTCATG GAGCAAGTGG TTTTTAAATA TCTTCGAGCT GAACCTGAGG ACCATTATTT 300TTTAATGACA GAACCTCCAC TCAATACACC AGAAAACAGA GAGTATCTTG CAGAAATTAT 360GTTTGAATCA TTTAACGTAC CAGGACTCTA CATTGCAGTT CAGGCAGTGC TGGCCTTGGC 420CGCATCTTGG ACATCTCGAC AAGTGGGTGA ACGTACGTTA ACGGGGATAG TCATTGACAG 480CGGAGATGGA GTCACCCATG TTATCCCAGT TGGCCAAGAA GGTTATGTAA TTGGAAGCTG 540CATCAAACAC ATCCCGATTG CAGGTAGAGA TATTACGTAT TTCATTCAAC AGCTGCTAAG 600GGAGAGGGAG GTGGGAATCC CTCCTGAGCA GTCACTGGAG ACCGCAAAAG CCATTAAGGA 660GAAATACTGT TACATTTGCC CCGATATAGT CAAGGAATTT GCCAAGTATG ATGTGGATCC 720CCGGAAGTGG ATCAAACAGT ACACGGGTAT CAATGCGATC AACCAGAAGA AGTTTGTTAT 780AGACGTTGGT TACGAAAGAT TCCTGGGACC TGAAATATTC TTTCACCCGG AGTTTGCCAA 840CCCAGACTTT ATGGAGTCCA TCTCAGATGT TGTTGATGAA GTAATACAGA ACTGCCCCAT 900CGATGTGCGG CGCCCGTCGT ATAAGAATGT CGTACTCTCA GGAGGCTCCA CCATGTTCAG 960GGATTTCGGA CGCCGACTGC AGAGGGATTT GAAGAGAGTG GTGGATGCTA GGCTGAGGCT 1020CAGCGAGGAG CTCAGCGGCG GGAGGATCAA GCCGAAGCCT GTGGAGGTCC AGGGTGGTCA 1080CGCATTCACA TGCAGCGCTA CGCCGTGTGG TTCGGAGGCT CCATGCTTGG CCTCGACTCC 1140CGAGTTCTTT CAGGTCTGCC ACACCAAGAA GGACTATGGA AGGAGTACGG GCCCAGCATC 1200TTGCCGCCAC AACCCCGTCT TTGGAGTCAT GTCCTAGTGT CTGCCTGAAC GCGTCGTTCG 1260ATGGTGTCA 1269(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度402个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ala Gly Ser Leu Leu Pro Ala Trp Trp Thr Val Ala Pro Ala 15Ile Ala Ile Lys Glu Ser Ala Lys Ile Val Asp Gln Ala Gln Arg 30Arg Val Leu Arg Gly Val Asp Asp Leu Asn Phe Phe Ile Gly Asp 45Glu Ala Ile Asp Lys Pro Thr Tyr Ala Thr Lys Trp Pro Ile Arg 60His Gly Ile Ile Glu Asp Trp Asp Leu Met Glu Arg Phe Met Glu 75Gln Val Val Phe Lys Tyr Leu Arg Ala Glu Pro Glu Asp His Tyr 90Phe Leu Met Thr Glu Pro Pro Leu Asn Thr Pro Glu Asn Arg Glu 105Tyr Leu Ala Glu Ile Met Phe Glu Ser Phe Asn Val Pro Gly Leu 120Tyr Ile Ala Val Gln Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Ser Trp Thr 135Ser Arg Gln Val Gly Glu Arg Thr Leu Thr Gly Ile Val Ile Asp 150Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Ile Pro Val Gly Gln Glu Gly 165Tyr Val Ile Gly Ser Cys Ile Lys His Ile Pro Ile Ala Gly Arg 180Asp Ile Thr Tyr Phe Ile Gln Gln Leu Leu Arg Glu Arg Glu Val 195Gly Ile Pro Pro Glu Gln Ser Leu Glu Thr Ala Lys Ala Ile Lys 210Glu Lys Tyr Cys Tyr Ile Cys Pro Asp Ile Val Lys Glu Phe Ala 225Lys Tyr Asp Val Asp Pro Arg Lys Trp Ile Lys Gln Tyr Thr Gly 240Ile Asn Ala Ile Asn Gln Lys Lys Phe Val Ile Asp Val Gly Tyr 255Glu Arg Phe Leu Gly Pro Glu Ile Phe Phe His Pro Glu Phe Ala 270Asn Pro Asp Phe Met Glu Ser Ile Ser Asp Val Val Asp Glu Val 285Ile Gln Asn Cys Pro Ile Asp Val Arg Arg Pro Ser Tyr Lys Asn 300Val Val Leu Ser Gly Gly Ser Thr Met Phe Arg Asp Phe Gly Arg 315Arg Leu Gln Arg Asp Leu Lys Arg Val Val Asp Ala Arg Leu Arg 330Leu Ser Glu Glu Leu Ser Gly Gly Arg Ile Lys Pro Lys Pro Val 345Glu Val Gln Gly Gly His Ala Phe Thr Cys Ser Ala Thr Pro Cys 260Gly Ser Glu Ala Pro Cys Leu Ala Ser Thr Pro Glu Phe Phe Gln 375Val Cys His Thr Lys Lys Asp Tyr Gly Arg Ser Thr Gly Pro Ala 390Ser Cys Arg His Asn Pro Val Phe Gly Val Met Ser 402(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGTCGAC ATGGCAGGCT CCCTGCTCC 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCAAGCTT CTAGGACATG ACTCCAAAG 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCAAGCTT ATGGCAGGCT CCCTGCTCC 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGAATTC CTAGGACATG ACTCCAAAG 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列。
4.一种分离的人Arp3H蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有人Arp3H蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人Arp3H蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人Arp3H蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人Arp3H蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人Arp3H蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸29-1237位。
12.一种能与权利要求4所述的人Arp3H蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明涉及了一种新的肌动蛋白相关蛋白基因家族的成员人Arp3H。本发明提供了该新肌动蛋白相关蛋白的cDNA编码序列、该序列编码的多肽,以及利用重组技术生产所述的新的人肌动蛋白相关蛋白的方法。本发明还提供了这种新人肌动蛋白相关蛋白的应用。
文档编号C07K14/435GK1252448SQ9812348
公开日2000年5月10日 申请日期1998年10月22日 优先权日1998年10月22日
发明者余龙, 傅强, 张宏来, 屠强, 赵勇 申请人:上海新黄浦复旦基因工程有限公司