经修饰的TNFα分子和编码该TNFα分子的DNA以及含有该TNFα分子和该DNA的疫苗的制作方法

专利名称：经修饰的TNFα分子和编码该TNFα分子的DNA以及含有该TNFα分子和该DNA的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及经过修饰的人细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)分子，所以将此经修饰TNFα分子施加至人类宿主能够诱发对抗野生型人TNFα的中和抗体。本发明也涉及根据该经修饰TNFα分子的人TNFα疫苗。本发明其它方面将揭示于下文讨论中。发明背景生理学上而言，脊椎动物的免疫系统是作为防止感染物如微生物，侵害身体的防御机制。外来蛋白借助于高特异性的循环抗体通过网状内皮系统予以有效清除，病毒与细菌则由细胞性与体液性机制组成的复合式屏障予以攻击，该机制包括抗体、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、天然杀伤细胞(NK)、补体等等。领导此种抗战的是T辅助(TH)淋巴细胞，它与抗原呈递细胞(APC)共同通过细胞因子的复合网络调节免疫对抗作用。
TH淋巴细胞可识别呈现在APC表面的蛋白抗原。但不识别天然抗原本身。相反，它显然可识别由两种成分组成的复合配体，该成分是“经处理”(片段化)的蛋白抗原(所谓的T细胞抗原决定部位)与主要组织相容性复合体II类分子(O.Werdelin等，Imm，Rev.106，181(1988))。此识别作用最后造成TH淋巴细胞专一地辅助B淋巴细胞产生对抗完整蛋白抗原的特异抗体(Werdelin等，如上)。某特定T细胞仅识别一些抗原-MHC组合，但不识别由另一个MHC等位基因的基因产物所呈递的上述相同抗原或另一抗原。此现象为MHC限制性。
自体蛋白的片段也会由APC呈递，但这些片段一般被T辅助淋巴细胞忽略或不被识别。这是个体为何通常不会有自身抗体存在其血清中，最后致使攻击该个体的自身蛋白(所谓自体蛋白或自身蛋白)的主要理由。但有极少数例子，此过程失误，免疫系统变成对抗个体的自身组份，如此导致自身免疫疾病。
某些自体蛋白在其量升高会导致病症的情况下，此自体蛋白的出现是不当的。已知肿瘤坏死因子α(TNFα)能够引起癌症病人及患有其它慢性疾病的病人中的恶病质(H.N.Langstein等，癌症研究51.2302-2306，1991)。TNFα也在炎症过程中起重要作用(W.P.Arend等，Arthritis Rhem.33，305-315，1990)，且利用单克隆抗体中和TNFα已证实对患慢性炎症疾病例如类风湿性关节炎有效(Elliott等，Lancet 1994，3441105-10)及空氏症(Crohn’s)的病人有效(VanDullemen等，肠胃病学109(1)129-135(1995))。因此需要一种用于诱发对抗这种TNFα蛋白的中和抗体的方法，而本发明包括提供此特性的对抗TNFα的疫苗。肿瘤坏死因子1.总论肿瘤坏死因子(TNF)是调节蛋白细胞因子家族的一员(参见Walsh，G和Headon，D.E.，蛋白生物技术，1994，John Wiley & Sons Ltd.，England，第257-267页)，该家族也包括干扰素与白细胞介素。目前已知TNF有两型，分别为TNFα与TNFβ。虽然这两种蛋白皆与相同受体结合并诱发广效的相似生物学反应，但它们是不同分子且同源性不到30％。命名为肿瘤坏死因子的原始蛋白是以TNF表示，命名为TNFα更恰当，它也以恶病质素(cachectin)而为人所知。TNFβ也可表示淋巴毒素(lymphotoxin)。
TNFα是由多种细胞制造，最著名的是经活化的巨噬细胞、单核细胞、某些T淋巴细胞与NK细胞，以及脑细胞和肝细胞。诱发TNFα合成的最强诱导物是一种，称为脂多糖的复合生物分子(LPS)。它含有脂质与多糖两种组份，也可称为内毒素。脂多糖本身不具有任何抗肿瘤活性。注射脂多糖的动物血清中发现含有对癌细胞有毒性的因子，此因子由对脂多糖产生反应的特定细胞产生，命名为肿瘤坏死因子。诸如某些病毒、真菌及寄生虫等多种其它因素也可刺激此细胞因子的合成与释放。此外，TNFα分子也可以自分泌方式，刺激其本身的产生。
天然人类TNFα是同三聚体，由绕着左右对称的三重轴而紧密结合的三个相同的多肽亚单位组成，下文将进一步说明。这种排列方式类似许多病毒衣壳蛋白亚单位的组装。人TNFα的个体多肽亚单位是非糖基化的，由157个氨基酸组成。此分子的分子量为17300Da，仅含一个链内二硫键。人TNFα最初是合成233个氨基酸前体分子。包括信号序列-76至-1前序列的蛋白酶剪切，释放出了天然TNFα。TNFα也可以26000Da的膜结合型式存在。三个TNFα单体亚单位非共价结合而形成三聚体，下文进一步说明。
TNFα通过结合易感细胞表面的特异受体而诱发其生物作用。已鉴定出两种不同的TNFα受体。其中一个受体(TNF-R55)的分子量为55000Da，而第二受体(TNF-R75)的分子量约为75000Da。此两种不同受体类型的序列同源性不超过25％。TNF-R55出现在多种细胞上，但TNF-R75的分布较局限。两者都是穿膜糖蛋白，具细胞外结合结构域，疏水性跨膜结构域及细胞内效应结构域。
TNFα诱发生物作用的确实分子机制仍有待确定。TNFα结合至其受体似乎起动了多种G-蛋白调节的反应，并活化了腺苷酸环化酶、磷脂酶A2及蛋白激酶。由TNFα诱生的确实生物作用随细胞种类改变。诸如额外细胞因子等其它因子的存在，进一步调节TNFα作用在敏感细胞所造成的观察到的分子效应。
已克隆出TNFα基因且插入多种，细菌及真核细胞重组表达系统。所生成的经纯化且具生物活性的大量TNFα可利用性有助于临床评估多种疾病，尤其是癌症。已完成单独使用TNFα或与干扰素合并使用的多种试验，但结果令人十分失望。大量的TNFα不能施加至病人，因为其有毒性，即使不致死，也有副作用。
如上所述，持续产生不当升高量的TNFα也会发展恶病质，耗废综合征通常与慢性寄生虫或其它感染症及癌症有关。TNFα也涉及某些癌症的转移与生长，以及诱发贫血。再者，TNFα也直接涉及某些人类慢性炎症失调症的发展，包括类风湿性关节炎及空氏症，这些病症已知施加抗-TNFα单克隆抗体是有效的。TNFα也涉及骨质疏松症与牛皮癣。此外，动物模型已显示，施加抗-TNFα抗体可减轻或预防移植或转植组织的排斥。2.TNFα的结构I.简介人肿瘤坏死因子(TNFα)的三维结构早已解决(参见“肿瘤坏死因子、结构、功能和作用机制”，Bharat B.Aggarwal和Jan Vilcek编辑，1992 Marcel Dekker公司，New York，第五章“TNFα的晶体结构”，Jones，E.Y.、Stuant，D.I.和Walker N.P.C合著)。TNFα的生物活性由其与其受体间的相互作用决定。此种相互作用由正确折叠的三级结构的精确组合所控制。所以如果想了解TNFα分子如何在氨基酸相互作用的层次上行使其生物学功能，不仅必须知道其氨基酸序列，也要知道其三维结构。II.三维结构借助于分析超离心、小角度x-射线离散法和凝胶电泳，得知具生物活性的TNFα在水溶液中是三聚体构象，交联研究显示此构象是该蛋白的活性形式(Smith和Baglioni，1987，生物化学杂志252，6951-6954)。结合分析法显示，此三聚体比单体的活性至少高出8倍。实验证据显示天然与重组TNFα在生理条件下都以三聚体为主要存在形式。圆二色谱的分析将TNFα归类为全部是折叠等级的蛋白(Davis等，生物化学1987，26，1322-1326，此文献报导借助于硫氢基滴定法、凝胶过滤法与圆二色法分析纯化的重组TNFα结构的结果)。人重组TNFα的数种不同晶体型已有记载。所有记载的晶体型呈现晶体图及/或非晶体图上的三级对称性，显示TNFα在晶体中是以三聚体形式存在。此TNFα三聚体呈疏松的填充排列，由直径100A的溶剂通道贯穿成多孔。此分子表面只有一小部分涉及晶体的填充接触。这类接触仅轻微扰乱其优选的溶液构象上的小部分侧链，甚至可能是固有可变主链上的短短一区。A.TNFα单体的主链折叠TNFα三聚体中157氨基酸的单个亚单位的整体形状是约55高且距底部最宽35的楔形。主链的拓扑学说明于

图1a-c；基本上由2个反平行的β折叠形成β-三明治式结构。主链折叠是遵照传统肉冻图式(图1c)(病毒衣壳蛋白常见此图式)。图1中用于标记二级结构单位的名称是遵照针对病毒结构所建立的习惯。标准的8个β-股(B至I)皆呈现出来，但在B与C间有一段插入，其在两个β-折叠的边界增加了一个短股并将C的N一终端半段截断，如此每一个β-折叠含有5个反平行的β-股，向后β-折叠含有β-股B’、B、I、D及G，而向前折叠含有β-股C’、C、H、E及F。
N-末端是可高度弯曲的。此区域，远至第10个残基(参见图1b)，与分子的其余部分通常无关，其前几个残基在溶剂中无法取得多样的构象。相反地，C末端埋在向后β-折叠的底部，形成此相当扁平的二级结构单位的组成部分。β-股的逐渐加长现象与β股B与C间的插入作用，协同产生了几乎全部由环所形成的正面，此为β-三明治“被隐藏”的一侧，但在三聚体中面向溶剂。晶体学数据测得此结构多个部分具相当可屈折性。β-股形成相当不能屈折的支架；具体地，向后β-折叠位于三聚体核心，所以特别稳固。可预期的是，装饰该分子接触溶剂的表面的环会呈现高度的可屈折性/流动性。整体而言，核心在分子上半部折叠愈松散，稳固性通常会降低。B.TNFα三聚体的基本拓扑学三个TNFα单体亚单位共价连结而形成长约55A，最大宽度为50A紧密的圆锥形三聚体。此三个个体β-三明治的β-股对此三聚体的三向轴的排列接近平行(倾度约为30°)。亚单位借三向轴连接的相互作用是经由β-三明治的简单由旁至面的折叠方式；β-三明治的边是由一个亚单位的F股与G股组成，此边通过三向关连的亚单位的向后β-折叠[GDIBB’](参见图2)。羧基末端位于接近三向轴处。此种由边至面的包装模式在亚单位间产生极紧密的关连。因此三聚体的核心完全接触不到溶剂。C.氨基酸类型的分布TNFα三级结构中氨基酸残基种类的整体分布反映蛋白的一般原则即疏水性残基集聚在分子核心中，而带电荷的残基分布在表面。所以TNFα三明治的核心预期会充满紧密交联的大而无极性残基。
此系统能量学上不利于TNFα以单体状态存在。对于互补残基(例如极性残基与极性残基互补吻合)所组成的大界面区域而言，丧失可接触溶剂的表面积表示有相当能量利于形成寡聚物(即三聚体)。由通常埋在三聚体界面中较低部分中的强疏水性残基组成的大片块接触溶剂通常会使TNFα单体不稳定。3.结构-功能的探针A.TNFα/抗体相互作用现今已发现由一种物种(例如人)对抗TNFα所产生的抗体不会与另一种物种(例如鼠)的TNFα交叉反应，尽管其序列相同性超过80％且TNFα具有结合至另一物种的TNFα受体的能力。若将序列差异的程度在三级结构上作图，立刻显示分子序列上最可变化的区域对应了可接触抗体的表面环。在三明治中或三聚体交接面上，由高度保守残基构成的区域，对抗体而言，是十分不易被发现的。因此针对抗-TNFα抗体的抗原决定部位通常会含有一些可在物种间变化的残基，因此阻止了抗体与其结合。此现象表示TNFα与其受体间的相交作用一定有些特性与抗体结合至TNFα所需的特性不同。B.定点诱变利用定点诱变(Jones等，上述引证，第113-119页)，用不同的氨基酸置换或删除那些氨基酸部分序列，探测出与TNFα分子生物(细胞毒性)活性及受体结合情形有关的多种特异残基与区域的作用。
自N-末端删除高达8个残基却对生物活性无任何不利影响，强调这些区域对整个分子的稳定性是非必要的。N-末端残基对TNFα三聚体的生物效能显然有非直接的次级作用。
对形成β-三明治的紧密折叠核心的正常高度保守残基进行非保守性取代作用，会破坏TNFα的结构，由此使其无生物活性(Yamagishi等，蛋白工程，第3卷，第8期，第713-719页(1989))。许多这类突变型蛋白(又称muteins)不能形成稳定且正确折叠的分子。有些保守性取代作用是允许发生在具三度折叠轴的底部的疏水小区内；但靠近三聚体顶端的排列较疏松区域中似乎有更多的变化余地。尤其是在分子的排列疏松的顶端，形成两个连接环的间二硫键的Cys69及Cys101，对变化相当不敏感(参见图1a)。一般而论，为了保留TNFα的某些生物活性，靠近TNFα中轴的突变作用一定要具有高度保守性，以保持TNFα的完整构象。
分子表面的残基具有相当大的自由度，可进行突变而不发生灾难般的结构性报应，这可由不同动物品种间这类残基变化的再现而得到证明。因此，由于此区域取代作用而导致TNFα生物活性显著地减少，指出这类残基直接参与TNFα三聚体与其受体间的相互作用。下列残基包括位于后β折叠的B与B’股间的连接环内的Arg31、Arg32及Ala33；位于前β折叠的E及F股间的连接环内的Ser86及Tyr87；以及位于前β折叠的H股与后β折叠的I股间的连接环内的Glu146，看来是这类残基(参见图3)。这些残基似乎归属于TNFα单体前侧与后侧的两个不同的“热门点”区域。不管结构性分类，所有不利突变作用的分布情形更进一步地加强此种构图。这种“热门点”的存在提供生物功能对突变作用的敏感性，有关评论可参见Yamagishi等，上述引证；及Goh等，蛋白工程，第4卷，第4期，第385-389页(1991)。
人类TNFα多肽的突变研究早已记载于多件专利申请案。
Yamagishi等，(EP251037)揭示多种位置特异的突变TNFα分子，其为可溶的且具有人类TNFα特征的体外及/或体内细胞毒性活性及抗肿瘤活性。
其它具有TNFα活性的突变型蛋白揭示于WO90/07579。对人类p75-TNF受体的结合亲和力比对人类p55-TNF受体的结合亲合力更高的突变型蛋白揭示于EP-A-619372。
在此引用作为参考的这些引证没有一个揭示TNFα分子的修饰作用是为了去除TNFα的生物活性以提供诱发对抗野生型人TNFα的抗体的能力。
尽管如此，这些引证提供了有关TNFα及其生物学作用的有用背景资料。制造及表达TNFα类似物与其配方，以及受体结合分析法也有揭示。4.简述许多各式各样的数据现已导引出TNFα结构对功能的特异关系。所有适用的证据指出三聚体为稳定的天然单位的重要性。位于TNFα单体不同侧上的两个热门点区域，以三聚体中相邻亚单位的角度来看，显然彼此十分接近。所以由残基31至35，84至87，及143至148组成的具有功能上重要性的区域，似乎位于三聚体下半部分上的两个亚单位间的界面上。上述Yamagishi等报告Asp143突变为Tyr时，会失去受体结合能力及细胞毒性；Tsujimoto等，生物化学杂志101，第919-925页(1987)报告Ary31及Arg32突变为Asn及Thr时有类似效果。因此该位置可能与受体结合力及细胞毒性直接相关。有趣的是，TNFα的受体结合区域显然位于两个亚单位间的界面上。
简言之，TNFα的详细三级结构是用于解释抗体结合、寡聚化和定点诱变的各式各样观察。当结构与最近大量由定点诱变体一起考虑时，具有与受体结合有关的生物学重要性的区域似乎位于三聚体下半部的亚单位上。现有技术描述WO95/05849中，本案的部分发明人揭示修饰自体蛋白以诱发对抗未修饰自体蛋白的抗体反应的方法，其中自体蛋白类似物以分子生物学方法提供。更具体地，自体蛋白的一个或多个肽片段由含有免疫显性的外源T细胞抗原决定部位的一个或多个肽片段取代。
在本发明申请前，导引出WO95/05849的技艺早已知道将肽类或蛋白，其包括自身蛋白，与含有T细胞抗原决定部位的载体蛋白共轭。WO92/19746揭示了含有LHRH序列、一个或多个T细胞抗原决定部位及纯化位点的用于动物免疫去势疫苗的重组多肽。
WO95/058 49优选地说明了嵌入免疫显性的T细胞抗原决定部位以使包括至少4个氨基酸的来自原先的蛋白外侧区域保留在嵌入的抗原决定部位两侧任一侧。换句话说，抗原决定部位不应该与自身蛋白共轭而成融合蛋白。优选地，取代应该基本保留原先蛋白的三级结构。除此之外，没有关于产生对抗未经修饰自身蛋白最强抗体反应的嵌入抗原决定部位的分子内最佳位置明确指导方针。可预期地，自身蛋白间互有差异，但根据本发明说明书的一般指导方针即可决定最适合的位置而不需繁重的实验，它借助筛选含有适当免疫显性的抗原决定部位的肽类、以自身蛋白分子内的基本上具有相同长度的多种蛋白部分来替换该肽序列，并利用适合的分析技术决定所产生的抗体反应。
利用现今的模型工具，预测蛋白中一个或多个肽片段的取代作用是否导致原先蛋白的三级结构的改变可能十分困难。所以在寻找前导性化合物的药物发展计划中，一定要在发展前期考虑一种标准筛选流程以评估那一个经修饰的自身蛋白保留了原先蛋白的三级结构。可使用数种实验技术完成评估，这些技术早已在蛋白鉴定法有关的许多教科书中描述，例如萤光分光法，近UV圆二色性分析法，傅立叶(Fourier)转形红外线分光法及多向NMR技术(“鉴定药物蛋白的物理方法”，药物生物技术，第7册，J.N.Herro、W.Jiskoot & D.J.A.Crommelin编辑，Plenum Press，New York(1995))。在前导性化合物的筛选方法中，为了评估三级结构是否发生变化，应该联合两种或多种上述实验技术。附图简述图1(a)说明天然TNFα单体的晶体结构。此图是由亚单位折叠组成的图解式骨架，β股是以氨基至羧基方向呈粗箭头表示，连接环是以细线表示，二硫键以闪电标志表示，高度曲折区以交叉斜线表示。三聚体的三维轴将与此图定位垂直。
图1(b)是TNFα单体晶体结构的Cα链全貌。它详细表示法应与图1(a)共同使用，借以提供氨基酸序列对应于亚单位折叠的较清楚且特殊造型表现格式的精确关连。
图1(c)表示以果冻卷为基序的TNFα结构。β股B与C间的嵌入作用以虚线表示。
图2表示TNF三聚体中β三明治的边对面式折叠方式。沿三级轴向下看，显示具有由穿进穿出平板的丝带方式表示的β股的三聚体的窄平板。
图3(a)说明编码肿瘤坏死因子的DNA序列，该因子具有的氨基酸序列示于图3(b)。
DNA序列可来自Gen Bank，编号M10988，SEQ ID NO339737。
此DNA序列已被Wang等揭示于科学228，149-154(1985)。此序列包括编码人类TNFα前序列-76至-1的密码子。
包括内含子的完整基因序列是由Nedwin等揭示于核酸研究13(17)6361-6373(1985)；Shirai等揭示于自然313(6005)，803-806(1985)；及Dennica等揭示于自然312(5996)，724-729(1984)。
图3(b)表示包括-76至-1前序列的人TNFα的氨基酸序列，。
图4(a)绘图说明野生型TNFα(WT)中免疫显性抗原决定部位P2与P30的取代作用形成的TNFα同系物TNF2-1至2-7，以及TNF30-1至30-5。
图4(b)表示个别TNFα同系物在WT序列上取代的精确定位。
图5(a)及5(b)表示根据图1(a)的同系物结构，其中P2与P30分别在β折叠的各股间及连接环上造成的不同取代作用以黑色表示。
图6表示L929分析法中，TNFα同系物与重组TNFα比较的生物活性(Meager，A.、Leung，H.& Woolley，肿瘤坏死因子和相关细胞因子测定杂志，免疫学方法，116，1-17(1989))。
图7表示免疫接种经修饰TNFα分子的兔子体内的抗-人TNFα抗体反应。
图8表示由L929细胞分析法测定的P2/P30经修饰人TNFα分子诱发中和抗体的能力。
图9表示由受体分析法测定的对兔子施用P2/P30经修饰人TNFα分子所诱发中和抗体的能力。
图10表示三位献血者对TT，以及P2与P30肽的外周血单核细胞(PBMC)反应。
图11表示两位献血者对不同的P2与P30经修饰TNFα分子的多克隆增殖反应。
图12表示从34个试验所计算出的对于P2及P30经修饰TNFα分子的增殖指数(PIs)。
图13表示P2及P30特异反应者，分别对P2及P30经修饰TNFα蛋白所产生的PBMC反应。
图14表示另两位献血者的类似PBMC反应。
图15表示外侧氨基酸对T细胞识别P2及P30的影响。
图16表示用于制备经修饰TNFα分子的突变策略。发明简述本发明的目的在于提供上述WO95/05849一般范围内的某一特定自身蛋白，即人类TNFα，应如何修饰的指导方针，此修饰是为了不具有生物活性，但能够诱发对野生型，具生物活性的TNFα的强中和抗体反应。本说明书中，“不具生物活性”一词表示不具野生型TNFα的活性，主要是其细胞毒性活性。
由上述TNFα三级结构的讨论可知，具生物活性的TNFα是三个亚单位组成的三聚体。由于“边对面”的折叠方式，“后β-折叠”呈现亚单位间的完全不能接触溶剂的接触“隐藏”区域。此区域的明显取代作用会几乎无法避免地失去TNFα分子的全部生物活性。相反，“前β-折叠”与连接区域提供包括与TNFα受体相互作用的区域可接触的表面区域。所以对抗此区域的抗体似乎可干扰受体的结合，因此具有TNFα中和特性。
根据WO95/05849构建去毒性但具免疫原性的TNFα分子，本领域技术人员的首要选择将是把免疫显性的T细胞抗原决定部位嵌入TNFα单体的后β-折叠。此区域的修饰作用最可能阻断TNFα的生物活性，但保留可接触受体的前β-折叠而自由地与抗体相互作用。此选择是与上述在β-三明治所构成的紧密折叠核心进行的定点诱变是一致的。
然而，令人无法预期地，事实并非如此。下列实验结果相当不同，因为涉及后β-折叠的B股与G股的取代作用竟然令人惊奇地提供了不能诱发对抗TNFα的中和抗体的TNFα同系物。
因此，本发明寻求提供一种经修饰的人TNFα分子，将所述经修饰的TNFα分子接种人类宿主后，能诱发针对野生型人TNFα的中和抗体，此分子中人TNFα分子的至少一个肽片段被至少一个已知含有免疫显性T细胞抗原决定部位的肽取代；或者提供含有免疫显性抗原决定部位及包含至少一个TNFαB细胞抗原决定部位的人TNFα分子的一侧或两侧外侧区域的所述分子的截断形式，其中取代作用造成前β-折叠、任一连接环和/或后β-折叠的B’，I或D股的任一股氨基酸序列的实质改变。根据推测，应避免后β-折叠的B股与G股的取代作用。
本说明书中，“实质改变”一词表示超过个别氨基酸的保守式取代所造成的改变，且超过不改变野生型TNFα二级及/或三级结构的点突变作用所造成的改变。换句话说，TNFα序列中导入的T细胞抗原决定部位，优选地导入与野生型TNFα序列的相同性极低的序列。
本发明也提供经修饰的人TNFα分子，将所述经修饰的TNFα分子接种人类宿主后，能诱发针对野生型人TNFα的中和抗体，此分子中人TNFα分子的至少一个肽片段被至少一个已知含有免疫显性T细胞抗原决定部位的肽取代；或者提供含有免疫显性抗原决定部位及包含至少一个TNFαB细胞抗原决定部位的人TNFα分子的一侧或两侧外侧区域的该分子的截断形式，其中该经修饰TNFα分子基本上无TNFα活性。
本说明书中，“基本上无TNFα活性”一词表示将这类经修饰TNFα分子接种至人类，不会产生明显的由天然TNFα诱导的已知细胞因子作用所致的副作用。换句话说，本发明的经修饰TNFα分子是药学上可接受的物质。
为了测试本发明的经修饰人TNFα分子是否基本上无TNFα活性，可使用本发明书所记载的L929生物分析法。此外，为了确认此经修饰TNFα分子的免疫原特性，适当宿主体内诱发的抗经修饰TNFα分子的抗体将明显抑制L929生物测定中所示的野生型TNFα的活性和/或该抗体会明显抑制野生型TNFα结合至55kD TNFα受体1(TNFα-R55)或结合至75kD TNFα受体(TNFα-R75)。
这些适当的宿主例如有灵长类，例如恒河猴或Cynomuleus猴，啮齿类，例如大鼠，小白鼠或天竺鼠，或兔类，例如兔子。
适用于评估本发明经修饰例子特性的分析法是使用抗体或抗血清完成，其浓度视分析法而定，且此分析法应该反映出所涉及的反应物的生理状况，或应能由分析法所得结果而外推其生理状况。换句话说，分析法的结果一定要显示体内对抗TNFα的抗体生理浓度能够降低TNFα活性，至少达10％、15％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。本领域技术人员可轻易知悉如何测知这些状况。
应当理解，“明显抑制野生型TNFα”优选地是造成减轻或去除野生型TNFα的副作用。这类抑制作用优选地至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至100％。
据此技术背景，本发明的经修饰人TNFα分子的特征在于，此TNFα分子中发生取代的区域涉及前β-折叠及/或连接环，基本上保留了后β-折叠任一股的β-折叠结构。
虽然尚未经实验充分确认，其必然可假设形成后β-折叠的任一股皆具有此分子特征，所以优选地在TNFα分子内的取代作用是发生在不包括后β-折叠任一完整股的区域内。由上述残基31-35的功能重要性可假设，后β-折叠的各股间的连接环优选地也避免取代。
然而，取代可以发生在TNFα分子中只涉及后β-折叠D股片段的区域。
根据本发明的优选的实施方案，取代作用包括前β-折叠的H股的至少一片段，及连接至后β-折叠I股的连接环的至少一片段，优选地是氨基酸132至146。根据本发明另一实施方案，取代作用包括H股与I股的片段及整个连接环，优选地是氨基酸132至152。根据本发明另一优选的实施方案，取代作用包括后β-折叠D股的片段，前β-折叠E股的至少一个片段，以及整个连接环，优选地是氨基酸65至79或64至84。
根据本发明的另一实施方案，取代作用包括前β-折叠的完整C’股与C股，及后β-折叠D股的一片段，优选地是氨基酸40至60。
根据本发明的另一实施方案，取代作用包括前β-折叠股的至少一片段及连接环的一或两者至少一片段，优选地是氨基酸76至90。
嵌入的T细胞抗原决定部位优选地应为任何已知在绝大多数人HLAII类分子中具免疫原性的。适合的抗原决定部位可来自破伤风毒素，优选地是抗原决定部位P2和/或P30，请参见Panina-Bordignon等，欧洲免疫学杂志192237-42，1989。也可使用来自白喉毒素的抗原决定部位。
参照上述取代位置，优选的经修饰人TNFα分子(TNFα同系物)示于本文附录序列表中的SEQ ID NO8及SEQ ID NO16。
其它可用的TNFα同系物示于SEQ ID NO4、10、14及16。
本发明也涉及上述本发明经修饰TNFα同系物的截断型同系物。因此含有任一免疫显性T细胞抗原决定部位及包括至少一个TNFαB细胞抗原决定部位的，优选地含有至少5个氨基酸一侧或两侧外侧区域TNFα分子的截断型同系物也可构成本发明TNFα疫苗中的活性组份。T细胞抗原决定部位借助APC呈现至MHC II类分子时，会诱使T细胞增生，同时B细胞抗原决定部位将被B细胞上的免疫球蛋白受体识别，随后由MHC I类分子呈现在这些细胞上。根据WO95/05849与本发明，构建了诱发对抗携带B细胞抗原决定部位的野生型TNFα的免疫反应的基础。
理论上及实验上的可鉴定出TNFα中的B细胞抗原决定部位。鉴定可能是直线型B细胞抗原决定部位的十进位方法早已发现，这些方法形成调查这些潜在抗原决定部位的实验基础。注射含有T细胞抗原决定部位的截断型TNFα分子至异源系统(例如兔子)所诱发的抗体，优选地以中和方法分析其体外结合天然人TNFα的能力。可体外筛选多组已知的中和单克隆抗体以分析其结合TNFα的潜在B细胞抗原决定部位的能力。上述两种方法都是鉴定可能最佳的B细胞抗原决定部位的策略。
据认为上述TNFα同系物维持单体形式，因为修饰作用会破坏野生型TNFα原有的三聚体倾向。
本发明另外涉及申请专利的经修饰TNFα分子的二聚体、寡聚体、特别是三聚体或多聚体，其前提为不具有TNFα活性，也涉及编码申请专利的经修饰TNFα分子的分离的DNA分子。
编码优选的TNFα同系物的分离DNA分子具有SEQ ID NO7及15所示序列，编码其它适用同系物的DNA分子示于SEQ ID NO3、9、13和15。
本发明另外包括含有编码该同系物的经分离DNA分子的载体和包括可操作性连接至适合表达控制序列的该DNA分子的表达载体。
本发明另一方面涉及转化了表达该同系物的表达载体的宿主。
该宿主可以是表达常用的任一宿主，例如细菌、酵母菌或真菌或昆虫、哺乳动物或禽类细胞系。
本发明另外涉及制造申请专利的TNFα同系物的方法，即在允许同系物产生的合适条件下培养转化了表达同系物的表达载体的宿主细胞并回收产生的同系物。
若有需要，本发明的经修饰TNFα分子可与适当佐剂分子一起表达而形成一融合蛋白或其一部分，优选地，该佐剂分子是免疫活性佐剂，例如GM-CSF，HSP70或白细胞介素(例如白细胞介素2)。
更具体地，生产经修饰TNFα分子是用适合的编码含有或构成免疫显性T细胞抗原定位的肽的基因片段取代至编码天然人TNFα分子的基因中。然后使此经修饰TNFα基因在适合的真核或原核表达载体中表达。如下所述纯化和再折叠表达后的经修饰TNFα分子。
虽然嵌入整个T细胞抗原决定部位是优选的，有些情况嵌入含有抗原决定部位与该抗原决定部位起源的蛋白的外侧区域的肽序列是有利的。
根据本发明，经修饰人TNFα分子可用于疫苗以对抗TNFα。疫苗配方发展的策略是基于纯化的蛋白，例如经调和的自身蛋白，它通常相当于任何其它以蛋白为主的药品的配方策略。潜在问题与克服这些问题的指导方针--例如保留三级结构--在下列数种教科书中探讨，例如“治疗性肽和蛋白制剂，加工和运送体系”，A.K.Banga编辑，Technomic Publishing AG，Basel 1955。佐剂的使用，例如氢氧化铝、磷酸铝(Adju-Phos)、磷酸钙、胞壁酰二肽同系物或一些最近疫苗佐剂的发展，例如生物可分解的微粒及Iscom’s，是该技术领域的制药科学家熟知的配方加强作用。
含有作为活性组份的肽序列本发明疫苗的制备是该技术领域普遍熟知的，例如美国专利4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792、4,578,770，所有的在此引用作为参考。传统上，这类疫苗是制成可注射的液体溶液或悬浮液；也可制成适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体型式。也可乳化此制剂。活性免疫原性组份通常与药学上可接受的且与活性组份相容的赋形剂混合。适合的赋形剂包括水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。若有需要，疫苗可含有少量辅助性物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或加强疫苗效力的佐剂。
已知疫苗接种是采用非经肠方式，借皮下或肌肉内等方式注射。适合其它用药途径的其它配方包括栓剂，有些情况可用口服配方。使用栓剂时，传统结合剂及载体包括聚烷烯二醇或甘油三酯等；这类栓剂可由含有0.5％至10％，优选地1-2％的活性组份的混合物制成。口服配方包括一般使用的赋形剂，例如药用甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素及碳酸镁等。这些组合物的型式有溶液、悬浮液、片剂，药丸，胶囊，缓释配方或散剂，其中含有10-95％活性组份，优选地25-70％。
多肽可调配成中性或盐形式的疫苗。药学上可接受的盐类包括酸加成盐(与肽的自由胺基反应形成)和诸如氢氯酸或磷酸的无机酸反应而形成的，或与诸如乙酸、草酸、酒石酸、金钢酸等有机酸反应而形成。与自由羧基形成的盐类也可来自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物；及有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙基胺基乙醇、组织胺、普鲁卡因(procaine)等。
疫苗是以剂量配方可相容的方式且用治疗有效和有免疫原性的量施用。施用量是由接受治疗的对象决定，包括个体产生免疫反应的免疫系统效能和由病人体内TNFα量决定的所欲保护的程度。适合的剂量范围为每次接种约有数百微克的活性组份，优选地约0.1μg至1000μg，例如1μg至300μg，尤其是约1μg至50μg。首次接种与加强注射的合适疗程也是可改变的，但通常在第一次接种，接着下一次注射或另外的免疫接种。
施用疫苗的方式可有多种变化。可采用任何一种接种疫苗的常规方法。据认为这些方法包括在固体的生理上可接受基质上或于生理上可接受的悬浮液中经口服用，或以注射等方式非经肠施用。疫苗剂量视用药途径而定，且随接受免疫者的年龄及次要的，接受接种者的体重而变化。
有些本发明的经修饰TNFα分子在疫苗中具充分免疫原性，但有些在疫苗中另外含有佐剂物质时，会加强免疫反应。
加强疫苗的佐剂功效的多种方法包括使用诸如氢氧化铝或磷酸铝(alum)等药剂，其一般以0.05至0.1％于磷酸盐缓冲盐水中的溶液使用，混合合成的糖类聚合物(Carbopal)以0.25％溶液形式使用，疫苗中蛋白的聚集现象是以70至101℃的温度分别处理30秒至2分钟。聚集至白蛋白是与经胃蛋白酶处理过的(Fab)抗体反应而完成，也可混合使用细菌细胞，例如小棒杆菌(C.parvum)或内毒素或革兰氏阴性菌的脂多糖组份，乳化于生理上可接受的油类载剂例如二缩甘露醇单油酸(Aracel A)或以作为阻断取代物的20％全氟化碳溶液(fluosol-DA)进行乳化。根据本发明，DDA(溴化二甲基二(十八碳烷基)铵)是佐剂的预期候选物，但Quil A与RIBI也可使用。其它可能的佐剂有单磷酰基脂肪A(MRL)及胞壁酰二肽(MDP)。其它适合的佐剂有氢氧化铝、磷酸铝(Adju-Phos)、磷酸钙、胞壁酰二肽同系物。有些最近发展的疫苗佐剂，例如生物可分解的微粒和Iscom’s也适合使用。
另一种高度注意的(即优选的)达到佐剂作用的可能方法是使用Gosselin等，1992所记载的技术(在此引用作为参考)。简言之，相关抗原，例如本发明的经修饰TNFα分子，可借助于将此抗原与对抗单核细胞/巨噬细胞上的Fcγ受体的抗体(或结合抗原的抗体片段)共轭而促进该抗原表现出来。尤其是抗原与抗-FcrγI所形成的共轭物早已证实可增进免疫接种所需的免疫原性。
也可与上述佐剂联合使用免疫调节物质，例如淋巴因子(如IFN-γ，IL-2及IL-12)或合成的IFN-γ诱导剂，例如聚IC。
许多范例中，必须多次接种疫苗，通常不超过六次接种，更经常不超过四次接种，优选地一次或更多次，通常至少三次接种。免疫接种一般有2至12周间隔，更常是3至5周间隔。1-5年间隔，通常为3年的阶段性加强可维持所需的保护性免疫。
本发明多肽与佐剂混和的理由之一，是为了活化细胞性免疫反应。但此效果也可由其它方法达到，例如以非病原性微生物表达疫苗中的有效抗原。这类微生物的熟知范例是牛结核杆菌BCG。
优选的非病原性微生物是，例如选自分枝杆菌菌属，沙门氏杆菌属，假单胞菌属及大肠杆菌属的细菌。特别优选的非病原性微生物是牛结核杆菌。
将编码本发明分子的一套或多套核苷酸序列掺入牛结核杆菌BCG菌株衍生的分枝杆菌，会增强BCG菌株的免疫原作用。考虑掺入多套本发明核苷酸序列以增进免疫反应，因此本发明某一方面是关于一疫苗，其中在微生物基因组中掺入至少2套，例如至少5套编码该分子的DNA序列。成套的DNA序列可与编码相同分子的相同，或是编码相同多肽或多肽同系物的相同DNA序列的变种，另一实施方案中，成套的DNA序列可以是编码不同多肽的不同DNA序列，其中至少有一个多肽是本发明的多肽。
可通过培养本发明的转化了的非病原性细胞，将这些细胞转移至疫苗基质，随机添加载剂，赋形剂及/或佐剂制备本发明的活疫苗。
本发明的核酸片段除了可用来作为合成本发明分子的起始物及作为杂交探针(其适用于直接杂交分析法或作为PCR或其它分子扩增法中的引物)，也可用于体内有效表达抗原，即该核酸片段可用作所谓的DNA疫苗。近期研究显示，克隆在真核细胞非复制载体中的DNA片段，可采用肌内注射或皮下接种(所谓的“基因枪”方法)导入动物(包括人类)。此DNA是由诸如肌肉细胞摄入目的基因，由在真核细胞内有功能的启动子，例如病毒启动子予以表达，然后基因产物刺激免疫系统。这些近期发展的方法描述于Ulmer等，1993，在此引用作为参考。
这类“DNA疫苗”的效力可借助于施用编码表达产物的基因与编码能调节免疫反应的多肽的DNA片段而增强。例如，编码淋巴因子前体或淋巴因子(如INF-γ，IL-2，或IL-12)的基因与编码免疫原性蛋白的基因一起施用，施用两种独立不同的DNA片段或施用包含在相同载体内的两种DNA片段。
此疫苗可用于预防/治疗上述任一疾病，这些疾病在病理生理学上的特征是TNFα释放，尤其是慢性炎症疾病。这类疾病的例子有类风湿性关节炎及发炎性肠病(IBD)。后者包括溃疡性大肠炎及空氏(Crohn’s)症，尤其是空氏大肠炎。其它例子有癌症、通常与癌症有关的恶病质、多发性硬化症、糖尿病、牛皮癣、骨质疏松症及哮喘。本发明优选地治疗或预防的癌症在组织遗传学上可分类为恶性上皮性肿瘤，包括癌症与腺癌；以及恶性非上皮性肿瘤，包括脂肪肉瘤、纤维肉瘤、软骨癌、骨癌、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、神经胶质瘤、神经纤维母细胞瘤、骨髓母细胞瘤、恶性黑色素瘤、恶性脑膜瘤、多种白血病、多种骨髓增生性失调症、多种淋巴瘤(Hodgkin淋巴瘤或非Hodgkin淋巴瘤)、血管肉瘤、卡波西氏(kaposi’s)肉瘤、淋巴管肉瘤、恶性畸胎瘤、生殖不全瘤、精细胞瘤及绒毛膜癌。
癌症与腺癌是最常见的(占癌症所致死亡的90％)，故为本发明所欲治疗/预防的靶疾病。最重要的癌症与腺癌为呼吸途径(尤其是支气管起源者)、乳房、结直肠及胃的癌症。但前列腺、卵巢、淋巴组织与骨髓、子宫、胰脏、食道、膀胱及肾的癌症与腺癌也造成显著的死亡数，所以是应该接受治疗的。
优选的疫苗是以预防性疗法予以使用，但就这些疾病的慢性特性与其缓和及复发的倾向性看，疫苗也可施用于已诊断出患有上述一种或多种疾病的病人，以维持病人于缓和状态。
根据以鼠进行的早期研究，据认为本发明的经修饰TNFα同系物也可作为上述疾病的急性期的一部分治疗或至少可将病人带入缓和状态且维持稳定状态。
目前无特定的有效剂量范围，因为疫苗尚未在可能患有上述疾病的人类进行测试。
不论何种剂量，将由负责医师开出处方。
根据本发明的实施方案，疫苗含有两种经不同修饰的TNFα分子的混合物，此TNFα分子含有来自破伤风类毒素的两种不同的T细胞抗原决定部位，例如P2与P30。此混合物可随机含有适量的药学上可接受的佐剂。
根据本发明另一方面，疫苗不含有上述经修饰人TNFα分子，但含有一包括可操作连接在调节该DNA序列在人表达的启动子序列的非传染性、非整合的编码该分子的DNA序列的构建体，其量是以使该构建体得到摄入且该构建体的表达量足以诱发抗TNFα的中和抗体反应。
此类疫苗即所谓的DNA疫苗的用途说明于美国专利5,589,466和5,580,859，此两专利在此引用作为参考，尤其是有关接种方法的说明。
DNA疫苗可包括病毒表达载体，例如逆转录病毒表达载体。
通常本发明疫苗可调制成经口或非经肠方式施用，尤其皮下，肌肉或皮内接种。
本发明另外包括借助于施用本发明疫苗而诱发抗体，优选地是单克隆抗体的用途，尤其是诊断用途。
本发明另外涉及测试人类体液是否存在TNFα的方法，包括使含本发明经修饰TNFα的组合物与人类体液样品接触，及测定该抗体是否与样品中的TNFα结合。
本发明也涉及使用体外免疫分析法来测定人类体液中的TNFα从而诊断TNFα相关疾病的方法。
此类方法涉及使用三明治式分析法，ELISA分析法或相当的分析法，其可未经扩大或使用抗生物素/生物素技术等予以扩大。
可使用本领域技术人员熟悉的下列分析法鉴定疫苗/重组蛋白以考马斯亮蓝或银染色的SDS-PAGE凝胶(提供分子大小与纯度的资料)，IEF(等电点聚焦)(提供等电点资料)，内毒素LAL分析法(提供纯度资料)，宿主细胞蛋白(提供纯度资料)，
质谱分析(提供分子量资料)，SE-HPLC与UV测定图谱(提供分子量分布资料)，N-末端序列(提供同一性资料)，圆二色法(提供三级结构的资料)，SE-HPLC与malls测定法(提供光闪射所测知的三级结构资料)，氨基酸组成(提供同一性资料)，在异源物种中的免疫原性(小鼠，大鼠或兔子)，蛋白印迹法中对抗体的反应性，NMR光谱，晶体结构，完整氨基酸序列测定。优选实施方案的实验部分与说明1.介绍先前申请案WO95/05849中，已知T细胞抗原决定部位经修饰的鼠TNFα分子可诱发高效价的与天然(野生型)鼠TNFα交叉反应的抗体。这些抗体能在体外及体内干扰TNFα与其受体。对抗TNFα的免疫接种已在患有TNFα引起的疾病的数种动物模型中证实具有有利的功效，例如实验性恶病质，胶原关节炎及实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)。尽管所使用的两种经修饰鼠TNFα分子(命名为MR103和MR106)并未最佳化而使其对MHC II类单元型的DBA/1及SJL小鼠中具有免疫原性获得这些动物试验结果。上述小白鼠品系分别用于胶原关节炎及EAE实验。另一实验中，不同的经修饰鼠TNFα分子(MR105)显示会提供更强的免疫反应，该重组型鼠TNFα是使用甲醛共轭至大肠杆菌蛋白上。
MR103、MR105及MR106为小白鼠分子，再者，根据先前申请案WO95/05849并未导出有关经T细胞抗原决定部位适当取代的人经修饰TNFα分子的免疫原性及这类分子诱发TNFα中和自身抗体的潜在能力的结论，因为它们都是活性分子。2.人TNFα构建体的发展适合人类使用经修饰人TNFα分子的TNFα疫苗一般应符合下列要求a.其对大部分人群应具免疫原性。b.其最好应能诱发TNFα中和抗体c.其应不具有任何残留的TNFα生物活性此外，选择制法时，其它实施参数，例如重组表达水平，纯化容易度，溶解度等，也应予以考虑。2.1.经修饰TNFα的免疫混杂性人TNFα疫苗的发展过程中，其目标在于生产最终对代表大量的不同HLA II类人群的最大可能比例具有免疫原性的经修饰人TNFα分子。因此，使用混杂的T细胞抗原决定部位，而不是用于先前动物试验的MHC特异抗原决定部位。由先前申请案WO95/05849不能得知这些抗原决定部位如何影响这类分子诱发中和抗体的能力。
选择科学性文献中早已充分鉴定的两个由破伤风类毒素(TT)衍生的T细胞抗原决定部位，P2与P30。这些抗原决定部位是已知在TT中具免疫显性的，且能够与人类人群中至少80％HLA II类分子结合。
使用这些TT抗原决定部位，预期可测试TNFα构建体于体外对经TT免疫的献血者所产生的外周血单核细胞(PBMC)及T细胞系的免疫原性。
P2抗原决定部位的氨基酸序列是QYIKANSKFIGITEL且对应TT氨基酸830-844，而P30抗原决定部位的序列是FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE且对应至TT氨基酸947-967。将P2及P30取代至两个不同的人TNFα分子中，将分别置换约10％及15％的天然TNFα序列。当此两种抗原决定部位插入同一个TNFα分子时，此分子约有25％被置换，有人可能会害怕这将严重干扰剩下的TNFα分子的天然部分。所以决定发展两种TNFα分子，每个分别含有P2或P30。同时使用此两种分子，预期对至少80％人群具免疫原性。极有可能部分由P2或P30抗原决定部位及部分由TNFα外侧区域组成的截断型分子也会增加免疫原性，进而造成构建体对接近100％的人群具有免疫原性。
虽然，所有鼠TNFα构建体可能在所有被测试的小白鼠品系中诱发抗体，参考上述MR103、105及106的讨论，但优选的预期将是，外来T细胞抗原决定部位插入TNFα的某些位置会比其它位置更有利于借助于MHC II类分子将抗原决定部位呈递至T细胞。因此决定生产一系列不同的、P2及P30抗原决定部位插入分子中的不同位置的经修饰人TNFα分子，参见图4。随后在体外T细胞分析法中测试全部分子，其基础是从许多健康经TT免疫的献血者所分离的外周血单核细胞(PBMC)或P2/P30特异T细胞系。
但与预期相反的是，虽然可预见少量的差异，P2及P30抗原决定部位的分子内位置并非抗原呈递细胞处理及后续呈递至TT细胞的能力所必要的。因此，P2插入位置132至146、65至79及76至90、且P30插入位置40至60及132及152(TNFα2-5、2-3、2-7、30-2、30-5)皆被处理且呈递至T细胞。故由上述讨论可知，这些分子极有可能最后在人群中普遍具有免疫原性。2.2经修饰人TNFα分子诱发中和抗体的能力如上所述，由先前WO95/05849描述的鼠研究并不能推测哪一个位置是能够诱发中和TNFα抗体的最适合位置，因为这三个同系物MR103、MR105及MR106皆能够诱发抗体，尽管其取代区域不同。因此生产了一组P2或P30插入不同位置的不同的人TNFα分子。此取代作用任意分布在整个分子。然后以体外生化及生物学分析法分析注射这些分子于兔子所诱发的抗体，以得知其干扰TNFα生物活性的能力。
本案说明人于未公开研究中已知，根据插入的抗原决定部位的分子内位置可观察所诱发的自体抗体的不同且涵盖全部的特异性。与根据TNFα分子的结构数据所预期的结果相当不同，观察到P2或P30在前β折叠中的取代作用会使分子的TNFα生物活性完全丧失，但却同时保留此经修饰分子诱发TNFα中和抗体的能力。
在上述位置含有P2或P30的分子已证实对于诱发中和抗体特别有效。所以此类分子的任一个是用于人TNFα疫苗的潜在候选者。2.3不同TNFα构建体的生物活性疫苗中使用有毒性的分子如TNFα显然行不通。所以经修饰TNFα分子必须无毒性，即没有任何残留的TNFα活性。
所以，以体外TNFα依赖的生物分析法及受体结合分析法测试全部突变TNFα蛋白以检查这些分子是否无毒性。清楚显示这些经修饰TNFα分子(TNF2-5、2-3、2-7、30-2及30-5)皆无TNFα生物活性。因此符合了这些分子作为普遍使用的无毒性疫苗而诱发抗-人TNFα中和抗体的所有必要条件。实施例1遗传构建程序决定制造10个不同的经修饰人TNFα分子-其中5个含有P2抗原决定部位，另5个含有P30抗原决定部位。这些抗原决定部位分布在分子内的不同位置。使用多种标准限制酶与PCR为主的诱变技术进行遗传构建。遗传构建体以图示于图4a和4b。编码经修饰TNFα分子的DNA序列及其对应氨基酸序列示于SEQ ID NO1-SEQ ID NO20。突变型人TNF2-5基因的构建、克隆与突变策略，及随后的TNF2-5同系物的表达，分离与纯化将由下列实施例加以说明。TNF2-5的构建与制造突变型人TNF2-5基因的遗传构建、克隆及突变策略编码突变型人TNF2-5同系物的基因的遗传构建法以及所有其它遗传构建法根据以传统PCR为基础的突变技术。
借助于传统PCR克隆法，使用人工合成的引物I与II从市售人cDNA库，CLONTECH Laboratories厂，Palo Alto，CA，USA(图16，1)(表I及SEQ ID NO21及22)获得编码人TNFα可溶部分的天然DNA序列。将天然基因插入市售大肠杆菌表达载体pET28c，其可购自Novagen，Madison，WI 53711，USA，此插入方式使该基因由IPTG可诱导启动子同框架转录。
进行TNFα突变同系物TNF2-5的遗传构建法，是将PCR突变技术施加至天然DNA序列。将编码T细胞抗原决定部位的核酸序列掺入人工合成的(即引物“mut2-5”，表1及SEQ ID NO27)、介于TNF同源的DNA的3’及5’-退火延伸端两者之间的75个单元体的寡核苷酸，因此“mut”引物能在选择用于TNF2-5的特定位置上与天然人TNFα基因序列退火(参见图16，2a)。“mut”寡核苷酸中，编码T细胞抗原决定部位的密码数目完全与TNF同源的DNA的3’-与5’-退火延伸端两者间所删除的TNF密码数目吻合。诱变引物用于制造含有编码T细胞抗原决定部位的DNA以及从下列TNFα序列(或3’端)嵌入的抗原决定部位的(见图16，2a)的PCR产物。在抗原决定部位嵌入点的前(或5’端)延伸的TNFαDNA，是使用引物I及III提供(表1，SEQID NO23)(图16，2b)第二种PCR产物。第二种PCR产物提供。用两次反应两个最远端的引物(I，II)将这两种PCR产物在最后一次PCR反应中连接在一起(图16，3)。然后以类似天然基因的表达克隆方法将完整的突变型TNF2-5DNA序列导入市售的大肠杆菌表达载体，使其在转化细胞中IPTG可诱导的启动子下转录。
用于构建其它同系物(TNF2-1、2-3、2-4、2-7、30-1、30-2、30-3、30-4及30-5)的“mut”引物分别示于SEQ ID NO23-26及28-33。表1引物I 人TNF-αFW 24个单元体Nco I位点5’-GAC AAG CCC ATG GTC AGA TCA TCT-3’引物II人TNF-alpha Rev 30个单元体Xba I位点5’-TCT CTA GAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC-3’引物“mut2-5”突变型寡P2-5(tt830-44) 75个单元体5’-G AAG GGT GAC CGA CAG TAC ATT AAG GCC AAT TCG AAG TTC ATTGGC ATC ACT GAG CTG TCT GGG CAG GTC TAC TT-3’引物III 人TNF-αRev2’nd21个单元体5’-CCC AAA GTA GAC CTG CCC AGA-3’培养重组细菌、回收及溶解包涵体TNF2-5同系物的蛋白纯化TNF2-5蛋白的制法类似其它重组TNF分子的制法。
1.将携带含有编码重组蛋白的TNF基因的IPTG诱导的质粒载体的转化大肠杆菌菌株接种在含有50μg/ml羧苄青霉素(Carbenicillin)的20mlTB培养基中，37℃培养过夜。
2.将过夜培养物以1∶25稀释于含有50μg/ml羧苄青霉素的250mlTB培养基中使培养物生长至OD450为1。添加IPTG至终浓度为1mM诱导重组蛋白的表达。37℃剧烈振荡培养过夜。
3.以-3500xg离心，从培养基回收重组细胞。以BSB缓冲液清洗细胞团块一次。每50克湿重的细菌使用150ml BSB。
4.以最大振幅，超声振荡4次，各30秒，直到细菌悬浮液完全均质化。进行超声振荡是使用配有9.5mm标准探针(Soniprep 05 38 121-1154)的MSE Soniprep 150超声振荡器。
5.每克细胞团块添加8μl PMSF(50mM)及80μl溶菌酶溶液(10mg/ml)。室温温育30分钟。
6.每克细胞团块中添加4mg脱氧胆酸，混合并保存于37℃。
7.当此溶液变粘稠时，每克细胞团块添加20μl DNAse(1mg/ml)，以及MgCl至终浓度为5mM，混合并于室温保存30分钟。
8.以最大振幅，在冰上超声振荡5次，每次30秒，每次间隔30秒，直到溶液变成非粘稠性的流体。
9.以20,000xg离心1小时，保留上清液以供检查清洗步骤是否所有包涵体都沉淀出来。
10.将细胞团块再次悬浮于MiliQ水中(每克大肠杆菌用1毫升水)，摇荡1小时。
11.以20,000xg离心1小时，保留上清液以供检查是否所有包涵体都沉淀出来。
12.将细胞团块再次以每克大肠杆菌溶解于1毫升的比例悬浮于1M尿素，摇荡1小时。
13.以20,000xg离心1小时，保留上清液以供检查是否所有包涵体都沉淀出来。
14.将细胞团块再次以每克大肠杆菌溶解于1毫升的比例悬浮于1M胍，摇荡1小时。
15.以20,000xg离心1小时，保留上清液以供检查是否所有包涵体都沉淀出来。
16.将细胞团块再次悬浮于25毫升6M胍+20mM Tris pH8.0，摇动过夜。
17.以20,000xg离心1小时，保留含有重组蛋白的包涵体上清液，保留沉淀以检查是否所有包涵体皆被溶解。
18.使蛋白溶液对MiliQ水充分透析，随后将此溶液冷冻干燥。
19.将冷冻干燥后的物质以浓度20mg/ml溶于20mM Tris，6M胍，30％2-丙醇(pH8.0)，。可温和搅动使其溶解过夜。以Superdex 200管柱(XK16，Pharmacia厂，直径1.6公分，高度750公分)检查单体的存在。操作缓冲液以1ml/min进行。与相同缓冲液下的标准物进行比较。
20.在经过平衡缓冲液平衡的Superdex 200管柱(XK26，Pharmacia厂；高度100公分，直径2.6公分)上进行凝胶过滤从而纯化蛋白。以平衡缓冲液分析。施加约为1％总管柱体积的样品体积。
21.通过透析将重组蛋白再折叠。以平衡液将蛋白稀释至0.1mg/ml，将此溶液置入经煮沸的透析袋中，以20mM Tris，4M尿素(pH8.5)透析，换液三次，室温下过夜。将透析袋转放至Tris缓冲液中(20mM Tris，150mM NaCl(pH8.0))。换液三次，第一次置于室温。冷室中过夜。
在经过Tris缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl(pH8.0))平衡过的Superose 12管柱上评估再折叠情形。与标准物比较。保存 重组蛋白是以冷冻干燥保存。
可根据如下所述大量生产经修饰TNFα分子起始物用水透析过滤500升的大肠杆菌发酵培养物至约50升。1)清洗细胞A)融化冷冻的细胞淤浆B)以4000xg离心细胞10分钟C)将细胞团块再次悬浮于50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0。
重复步骤B)及C)三次。2)匀浆细胞A)以Rannie匀浆器于700巴匀浆细胞，五次循环B)以16,500xg离心包涵体30分钟C)用3M胍，1M NaCl，5mM EDTA，20％蔗糖，及50mM Tris，pH8清洗包涵体三次。以16,500xg离心包涵体30分钟。3)溶解包涵体将细胞团块再次悬浮于6M胍，10mM DTT，150mM NaCl，5％乙醇，50mM Tris，pH8.0。每100mg细胞团块使用约1ml缓冲液。4)超离心包涵体A)以0.45μ滤纸除去粗制杂质B)以30KD滤纸除去高分子量成分C)以5KD滤纸浓缩包涵体。5)缓冲液变换制备进行离子交换层析所用的样品。利用透析过滤法将缓冲液变换为含6M尿素，1mM DTT的50mM Tris，pH8。6)SP-Sepharose纯化法将蛋白添入SP-Sepharose管柱。以四倍体积的A缓冲液清洗管柱，以100％B缓冲液洗脱蛋白，汇集所有含TNFα的组份。A缓冲液6M尿素，1mM DTT，50mM Tris/Cl，pH8。B缓冲液6M尿素，1M NaCl，1mM DTT，50mM Tris/Cl，pH8。7)再折叠入TNFα以含6M尿素，1mM DTT，50mM NaCl，5％乙醇于20mM Tris/Cl，pH8.8将汇集的蛋白稀释至约0.1mg TNFα/ml，通过透析过滤法逐步以下列缓冲液组合物除去尿素A)含2M尿素，1mM DTT，150mM NaCl的20mM Tris/Cl，pH8.8-于5℃过夜；B)含1M尿素，1mM DTT，150mM NaCl的20mM Tris/Cl，pH8.8-于5℃8小时；C)含1mM DTT，150mM NaCl的20mM Tris/Cl，pH8.8-5℃过夜；D)含150mM NaCl的20mM Tris/Cl pH8.8-5℃过夜。8)保存人TNFα同系物浓缩蛋白至1.0mg/ml，将样品保存于-20℃。TB培养基根据使用说明，将Terrific Broth(GIBCOBRL 22711-22)溶于MiliQ水。以121℃高压高温灭菌20分钟。
羧苄青霉素的100倍母液(50mg/ml)。
将羧苄青霉素二钠盐(Sigma，C1389)溶于MiliQ水，浓度为50mg/ml。经0.2μM滤纸(Sterifix 0409 9206)将此溶液过滤灭菌。IPTG的100倍母液100mM将1.19克IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(IPTG，USB17884)溶入50ml MiliQ水。经0.2μM滤纸(Sterifix 0409 9206)将此溶液过滤灭菌。BSB缓冲液细菌悬浮缓冲液50mM TRIS(Trisma base，Sigma T1503)，0.5M NaCl(Ridel-de.Haen 31434)，5mM DTT(DL-苏糖醇，Sigma D-0632)，pH8.0。PMSF50mM，苯基甲基磺酰氟，SIGMA#P-7626，溶于2-丙醇。溶菌酶溶液10mg/ml来自鸡蛋白的III级溶菌酶(EC3.2.1.17)，SIGMA#L-7001。脱氧胆酸(7-脱氧胆酸)Sigma#D-6750DNAse1mg/ml Dnase I，脱氧核糖核酸酶I(EC.3.1.21.1)，Boehringer商品编号1284932。尿素尿素(GibcoBRL 15716-020)胍盐酸胍(Sigma G4505)2-丙醇电泳缓冲液
20mM TRIS(Trisma base，Sigma T1503)，8M尿素(Gibco BRL 15716-020)，0.1％β-巯基乙醇，pH8.0平衡缓冲液20mM Tris(Trisma base，Sigma T1503)，8M尿素(GibcoBRL 15716-020)，0.1％β-巯基乙醇。实施例2经P2及P30修饰的TNFα分子的表达，纯化与再折叠重组蛋白在表达，纯化及再折叠的过程中有不同的表征是早已熟知的。所有蛋白都可由大肠杆菌表达，得到表达量在2-20％范围内。使用市售的兔子抗人TNFα多克隆抗体的蛋白印迹实验可以识别所有蛋白。
然后将TNFα构建体逐个地在250ml培养基中表达，每批的量为3-4升。全部经修饰TNFα蛋白是以包涵体形式表达，如上所述制备纯度85％以上的经再折叠的蛋白制剂。
以标准BCA分析法测定蛋白含量。所有蛋白的纯化是以每种分子至少进行三次独立操作，各独立的蛋白批次全部予以测试并发现结果类似。此蛋白以0.2-1.0mg/ml的浓度于PBS中保存于-20℃直到使用。
标准质量控制分析包括SDS凝胶电泳，对个别的蛋白制剂同时以考马斯亮蓝染色及银染色。发现蛋白全部具有预期的分子大小且纯度超过85％。
在位置4嵌入抗原决定部位的分子(TNF2-4及TNF30-4)，仅以相当低的量表达(约2％)。此外，这些分子极难纯化，尤其再折叠时更是困难重重。这两个分子，尤其是TNF30-4，极不易溶于PBS且在保存过程中易于沉淀。实施例3不同TNFα构建体的生物活性纯化的TNFα分子的直接生物活性是以L929生物分析法测试，此分析法是测定TNFα生物活性的标准体外分析法。如图6所见，经P2或P30修饰的TNFα分子中没有一个能够在所测试的浓度下(高达60mg/ml)杀死L929细胞。市售重组TNFα分子却在约0.6ng/ml具有充分活性。野生型TNFα制剂在测试的全部剂量范围中也具有充分活性。实施例4经修饰TNFα分子诱发中和抗体的能力以10种构建体中的每一种免疫兔子，以观察这些构建体是否可诱发能够在体外中和具生物活性的TNFα的抗体。使用每组三只兔子，每只兔子皮下接种100mg存在于Freunds完全佐剂中的TNFα，接着每隔第三周接种100mg存在于Freunds不完全佐剂中的TNFα。
在18周的整个免疫过程中，以规则间期收集血液样品并以常规的ELISA分析法测定血清的抗-TNFα活性，其中使用市售的纯、无修饰人TNFα作为抗原。
免疫过程中，所有兔子皆产生抗-TNFα抗体，最高产量或抗体效价在每组的十进位区隔内变化。平均抗体效价示于图7。TNF2-5、TNF2-7、TNF2-3、TNF2-1及WT-TNFα在2-4周内诱发100的效价，但TNF2-4的反应明显较慢。类似动力学可在TNF30蛋白上观察到，其中也发现TNF30-4有较慢的反应。
以L929分析法及固相受体结合分析法测定这些血清干扰人TNFα与其受体的能力。
L929分析法中，混合液加至L929细胞之前，将免疫血清与未免疫的对照血清的稀释物添加至市售的人TNFα。重复测试两次由各组的三只兔子所得的血清并计算平均值。由于正常血清有增加颜色测定系统的背景值的倾向，所以所有数值皆减去此背景值并计算相对抑制百分比。免疫计划的第14周时，所有兔子的抑制能力结果示于图8。
TNF2-5的后β-折叠的各股片段中没有取代作用比其它构建体明显优越，此分子与具完全毒性的WT-TNFα分子诱发中和抗体的能力相当(数据未显示)。在Dβ-股有一个小片段被取代的TNF2-3和在后β-折叠各股上无任何取代片段的TNF2-7皆能诱发抑制性抗体，且对于TNF2-7的中和抗体效价在接着的三周内明显增加(数据未显示)。TNF2-4与TNF2-1分别含有后β-折叠的G-与Bβ-股，不能在L929分析法中诱发中和抗体。
TNF30蛋白的结果差异较大，虽然TNF30-3似乎在第14周功效最好。TNF30-1及TNF30-4在后β-折叠的G及Bβ-股分别有取代作用，但在L929分析法中不会诱发中和抗体。
固相受体结合分析法中，将重组人55KDTNFα受体1(TNF-R55)固着于微量滴定板上，添加适量稀释的市售生物素化的人TNFα。然后用经辣根过氧化酶标记的链霉抗生物素蛋白及显色底物测定对受体的特异结合情形。测定经免疫兔子血清时，将上述试剂添加至生物素化的人TNFα溶液，然后将此混合液加至经TNF-R55包被的微量滴定板上。测定每组三只兔子的全部血清且计算平均值。未免疫兔子的血清作为阴性对照组。背景值极低且此方法十分敏感。结果示于图9。
可发现的是，分别由L929分析法及固相受体结合分析法获得的TNFα2构建体的结果几乎相同。固相分析法中，TNF30-2、30-3及30-5之间的差异不如L929分析法观察到的明显。然固相分析法是更有再现性的，因为其根据生化特性，而非细胞特性，且正常血清值在此分析法中并不减去。
对TNF2-3、TNF2-5、TNF2-7、TNF30-2、TNF30-3、TNF30-5及WT-TNFα任一者的对应血清分别计算其血清相对量(以百分比计)，借此得知抑制TNFα结合的最大抑制作用的一半值(IC50值)。假设类似曲线会出现在对抗TNF2-1、TNF2-1、TNF30-1及TNF30-4的抗血清，则以外推法进行，也计算这些血清的IC50值。结果示于表II。表II固相分析法中兔子抗人TNFα血清的IC50值
可发现的是，TNF2-5在兔子诱发抗-鼠TNFα中和抗体的能力相与野生型(WT)鼠TNFα相当。TNF2-1、TNF2-4、TNF30-1及TNF30-4皆含有后β-折叠的B股或G股的取代作用，它们极少诱发或甚至完全不能诱发这类抗体。此现象令人惊异地发现，虽然后β-折叠的B股与G股并不参与受体的结合，然而此区域的突变却会导致参与受体结合的人TNFα区域的干扰。TNF30-2及TNF30-3似乎同样成功地诱发中和抗体。实施例5经修饰TNFα分子刺激经P2及P30免疫的健康献血者的T细胞的能力由于经修饰TNFα分子中的P2及P30抗原决定部位的位置预期也会影响嵌入抗原决定部位的抗原处理与呈递，进而影响其免疫原性，所以以不同的T细胞分析法加以测试全部10种分子。使用多克隆外周血分子细胞(PBMC)分析法，使用常规的免疫学方法测定具有嵌入P2及P30抗原决定部位的TNFα肽及重组蛋白建立多个P2及P30特异T细胞系。
首先在已知PBMC增殖分析法中测定28位健康的志愿者(献血者)对TT及P2与P30肽的反应。根据这些结果，将能够对TT、P2及P30肽产生明显反应的19位个体筛选出来以进一步实验。虽然反应程度变化极大，此现象清楚证实了P2与P30是不加选择且免疫显性的T细胞抗原决定部位。
除了这28位志愿者，另外也选出7位志愿者。因为上述理由，这些献血者有一些人进行筛选其对P30或P2的反应能力。用TT进一步接种几个进一步产生强的T细胞反应。第二组志愿者中有一些人也用于诱发P2或P30的特异T细胞系以研究P2与P30经修饰的TNFα合成肽与经修饰分子的抗原呈递情形。图10显示三位志愿者对TT及P2与P30肽的多克隆，PBMC增殖反应的代表性范例。
自约100mg/ml开始至少以6种不同浓度，重复测试三次全部10种重组蛋白，所有PBMC实验皆对每个个体重复进行2-3次。细胞内摄入经3H标记的胸嘧啶的情形是用于评估T细胞增殖情形，实验是于96孔板的规模下回收与计数。从每条滴定曲线计算所得的最大增殖指数(PI)，作为实验组孔洞的CPM平均数除以无抗原孔洞(只有PBS)所得的CPM平均数的关系。T细胞增殖数据进行重复三次，Con A及P2与P30分别用来作为阴性与阳性对照。图11中，三组实施例显示使用不同的经P2及P30修饰的TNFα分子由两位不同献血者所进行的实验。
JH只对P2反应，然而SR对P2与P30两者反应。此现象也由经P2及P30修饰的TNFα蛋白的增殖反应反映出来，其反应程度不一，但皆可刺激PBMCs。
图12显示由34组实验计算而得的增殖指数(PIs)。虽然因为PBS背景不同，不同实验之间很难定量比较PIs，但似乎可清楚得知，全部构建体多多少少皆能够引起增殖反应。
第二组志愿者中，有些个体在实验前1-2个月予以免疫接种以对抗TT。由这些人所得的PI值(HB、MR、KG及MW)都属于全部经修饰TNFα构建体所测得的最高PIs，且此数值易于计算。另有三位个体(DL、ID及LS)免疫接种超过5年，其皆显示PIs低于平均值。此结果支持所测得的PIs是抗原特异的。第一组志愿者最后一次TT免疫接种日期的数据，但其免疫状态显然极易变化。
仅仅根据PI值的平均大小，不可能筛选出优选的TNFα2或TNFα30蛋白。原因可能是由所用个体的接种状态不同，及具有可变反应状态的个体所获得的PBMC分析法的多变特性所致。令人惊喜的是，TNFα中P2及P30的全部嵌入位置似乎皆能得到处理而呈递给T细胞。为了排除抗原制剂仍可含有明显浓度的非特异促细胞分裂剂的可能，即使经过重复的亲和层析，凝胶过滤及透析，还要进行其它实验。
来自第二组的志愿者已知对P2无反应，但对P30有反应和与此志愿者与具有相反反应结果的志愿者进行PBMC分析法的测试。图13显示DL及ID对P2、P30以及TNFα2与TNFα30蛋白的反应。
可预见的是，可获得对个别T细胞抗原决定部位与个别经修饰的TNFα分子特异反应。但不能发现DL有对抗TNFα30蛋白的明显增殖反应(上图)，且ID无对抗TNFα2蛋白的明显增殖反应(下图)，此结果支持TNFα纯化制剂中无非特异的促细胞分裂剂。
上述可能性甚至可另外使用第二组志愿者分离而得的P2及P30特异T细胞系加以检查，此细胞系已培养至少6周，以进行至少三回合使用个别合成的P2及P30肽的刺激作用。两种这类实验的结果示于图14。
可预见P2及P30特异T细胞系只由其对应的P2及P30蛋白刺激。再者，再次可发现全部TNFα构建体皆能够诱发T细胞增生，再次强调抗原的处理虽对于呈递P2及P30的量重要，但似乎并非抗原呈递的重要定性的限制因子。
文献已报导T细胞抗原决定部位的外侧区域会影响抗原性肽类结合至MHC II类分子。因为选择嵌入P2或P30的TNFα的位置中，没有一个阻碍抗原表达，所以调查嵌入抗原决定部位的不同外侧TNFα序列是否会影响T细胞对P2及30抗原决定部位的反应，这是区别结合至人HLA II类分子的结果。表III所示的肽代表合成的嵌入的抗原决定部位以及人TNFα外侧氨基酸。这些肽命名为PP2-5、PP30-3等。命名为Pep2-1至Pep30-5的氨基酸序列示于序列表中的SEQ IDNO34至SEQ ID NO42。表III代表P2与P3及其侧翼TNFα区域的合成肽<
这些肽是用于刺激P2与P30特异的T细胞系。刺激P30细胞系的结果示于图15。可发现来自MR及KG的P2特异T细胞系当被该肽或对应的TNFα2蛋白刺激时，呈递平行的刺激图像。由此清楚得知，TNF2-5是优良且有潜力的抗原，这些数据进一步支持所观察的T细胞增殖现象是抗原特异的。当来自MR及KG的P30特异T细胞系由肽或蛋白刺激时，一般在刺激反应上无质的差异(数据未显示)。来自HC的P30特异T细胞系倾向于识别TNF30-3，并与TNF30-2稍有反应。结论已制造且鉴定10种不同的经修饰人TNFα蛋白。其构建为含有2个已知且不经选择的T细胞抗原决定部位，P2与P30，以在至少85％的人群中具有潜在的免疫原性。
所有蛋白皆可得到表达及纯化，虽然TNF2-4及TNF30-4的产量较低。TNFα中这类肽的突变位置似乎干扰再折叠，故造成蛋白的溶解度低。这些经修饰TNFα分子中没有一个可测出TNFα生物活性。
用全部10种蛋白与天然TNFα免疫兔子。免疫接种后2-3个月，所有血清中可测到对人的未经修饰TNFα有强烈交叉反应的高效价抗体。
这些抗体干扰天然TNFα的生物活性的能力，是以两种不同的体外分析法-L929生物分析法与固相受体结合分析法加以测定。两种分析法皆显示基本上相同的结果，即TNF2-1、TNF2-4、TNF30-1及TNF30-4不能诱发显著的中和抗体，但TNF2-5与其它构建体比较更优良。TNF30-2及TNF30-3在诱发中和抗体的能力上同等有效，且为合理有效的TNF30-5的两倍。
有些令人惊喜的是，未能观察到这些分子刺激PBMC增殖的能力有明显差异。可表明的是，此现象并非因为抗原制剂中有促细胞分裂剂的存在，根据这些数据可推断，P2与P30所选用的位置都能使个别抗原决定部位表达出来。此反应的特异性进一步使用抗原决定部位特异的T细胞系，以及代表嵌入的抗原决定部位与外侧TNFα序列的合成肽以验证经修饰TNFα蛋白而加以证实。由这些实验可清楚证实，TNF2-5、TNF30-2及TNF30-3(其它构建体中)是最强的潜在免疫原。序列表(1)基本信息(i)申请人(A)名称Parmaceutisk Laboratoium Ferring A/S(B)街道Indertoften 10(C)城市Vanloese(E)国家Denmark(F)邮政编号(Zip)DK-2720(ii)发明名称经修饰的THFα分子和编码该THFα分子的DNA以及含有该THFα分子和该DNA的疫苗(iii)序列数42(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类
(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(C)鉴定方法实验(D)其它信息/密码子_起始＝1/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”/证据＝实验/基因＝“tnfp2-1”/标准_名称＝“THF2-1”(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT CAG TAC ATT AAA GCC AAT 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn1 5 10 15TCT AAA TTC ATC GGT ATA ACT GAG CTG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC 96Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn1 5 10 15Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否
(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/密码子_起始＝1/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”/基因＝“tnfp2-3”/标准_名称＝“THF2-3”(xi)序列描述SEQ ID NO3ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His160 165 170 175GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220TTC CAG TAC ATA AAG GCC AAC TCC AAG TTT ATC GGC ATC ACC GAG CTC 240Phe Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu225 230 235ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链
(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/密码子_起始＝1/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”/基因＝“tnfp2-4”/标准_名称＝“THF2-4”(xi)序列描述SEQ ID NO5ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His160 165 170 175GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230235ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270AAG CCC CAG TAT ATC AAG GCC AAT TCG AAA TTC ATC GGC ATC ACG GAG 384Lys Pro Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu275 280 285CTC GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC 432Leu Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu115 120 125Leu Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO7的信息
(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/功能＝“抗原”/产物＝“THF α同系物”/基因＝“tnfp2-5”/标准_名称＝“THF2-5”(xi)序列描述SEQ ID NO7ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His160 165 170 175GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285AAG GGT GAC CGA CAG TAC ATT AAG GCC AAT TCG AAG TTC ATT GGC ATC 432Lys Gly Asp Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile290 295 300ACT GAG CTG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Thr Glu Leu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile130 135 140Thr Glu Leu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/密码子_起始＝1/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”/基因＝“tnfp2-7”/标准_名称＝“THF2-7”(xi)序列描述SEQ ID NO9ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His160 165 170 175GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CAG TAC ATC AAA 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Gln Tyr Ile Lys225 230 235GCT AAC TCC AAA TTC ATC GGC ATC ACC GAA CTG GTT AAC CTC CTC TCT 288Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Gln Tyr Ile Lys65 70 75 80Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/密码子_起始＝1/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”/基因＝“tnfp30-1”/标准_名称＝“THF30-1”(xi)序列描述SEQ ID NO11ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT TTC AAC AAT TTT ACC GTA48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val160 165 170 175AGC TTT TGG CTC CGT GTA CCT AAG GTG TCG GCC TCG CAC CTG GAG CGC96Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val1 5 10 15Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/密码子_起始＝1/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”/基因＝“tnfp30-2”/标准_名称＝“THF30-2”(xi)序列描述SEQ ID NO13ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His160 165 170 175GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT TTC AAC AAC TTC ACA GTT AGC TTC 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe195 200 205TGG TTG AGG GTA CCA AAG GTC TCG GCC AGC CAC CTC GAG CAG GTC CTC 192Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Val Leu210 215 220TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe35 40 45Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/密码子_起始＝1/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”/基因＝“tnfp30-3”/标准_名称＝“THF30-3”
(xi)序列描述SEQ ID NO15ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His160 165 170 175GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220TTC AAC AAC TTT ACC GTC TCC TTC TGG CTT CGG GTA CCC AAG GTC AGC 240Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser225 230 235GCT AGC CAC CTC GAG GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ala Ser His Leu Glu Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO16Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser65 70 75 80Ala Ser His Leu Glu Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”
/基因＝“tnfp30-4”/标准_名称＝“THF30-4”(xi)序列描述SEQ ID NO17ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His160 165 170 175GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA TTT AAT AAT TTC ACC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Phe Asn Asn Phe Thr260 265 270GTG TCC TTC TGG TTG CGC GTC CCT AAG GTA AGC GCT TCC CAC CTG GAG 384Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu275 280 285AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO18Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Phe Asn Asn Phe Thr100 105 110Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..477(D)其它信息/密码子_起始＝1
/功能＝“抗原”/产物＝“THFα同系物”/基因＝“tnfp30-5”/标准_名称＝“THF30-5”(xi)序列描述SEQ ID NO19ATG GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His160 165 170 175GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser240 245 250 255GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285AAG GGT GAC CGA TTC AAC AAT TTC ACC GTA AGC TTC TGG CTT CGC GTC 432Lys Gly Asp Arg Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val290 295 300CCT AAG GTG TCT GCG TCG CAC CTC GAA GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ile Ile Ala Leu *305 310 315(2)关于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型
(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO20Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val130 135 140Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ile Ile Ala Leu *145 150 155(2)关于SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键misc_feature(B)位置1..24
(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于克隆编码THFα的DNA的引物”/产物＝“结合THFα基因的引物”/证据＝实验/标准_名称＝“THFα引物1”/标记＝引物1(xi)序列描述SEQ ID NO21GACAAGCCCA TGGTCAGATC ATCT 24(2)关于SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键misc_feature(B)位置1..30(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα的DNA的引物”/产物＝“结合THFα基因的引物”/证据＝实验
/标准_名称＝“THFα引物3”/标记＝引物3(xi)序列描述SEQ ID NO22TCTCTAGAGG GCAATGATCC CAAAGTAGAC 30(2)关于SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键misc_feature(B)位置1..21(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα的DNA的引物”/产物＝“结合THFα基因的引物”/证据＝实验/标准_名称＝“THFα引物3”/标记＝引物3(xi)序列描述SEQ ID NO23CCCAAAGTAG ACCTGCCCAG A 21(2)关于SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置7..51(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准_名称＝“引物“mut2-1””/标记＝mut2-1/备注＝“引物“mut2-1”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P2的69-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO24ACCCCGAGTC AGTACATTAA AGCCAATTCT AAATTCATCG GTATAACTGA GCTGCAGCTC 60CAGTGGCTG 69(2)关于SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度73个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置15..59(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准_名称＝“引物“mut2-3””/标记＝mut2-3/备注＝“引物“mut2-3”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P2的73-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO25CCCAGGTCCT CTTCCAGTAC ATAAAGGCCA ACTCCAAGTT TATCGGCATC ACCGAGCTCA60TCAGCCGCAT CGC 73(2)关于SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度75个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置12..56(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准_名称＝“引物“mut2-4””/标记＝mut2-4/备注＝“引物“mut2-4”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P2的75-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO26AGTCGGTCAC CGAGCTCCGT GATGCCGATG AATTTCGAAT TGGCCTTGAT ATACTGGGGC 60TTGGCCTCAG CCCCC 75(2)关于SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度75个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置8..52(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准_名称＝“引物“mut2-5””/标记＝mut2-5/备注＝“引物“mut2-5”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P2的75-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO27GAAGGGTGAC CGACAGTACA TTAAGGCCAA TTCGAAGTTC ATTGGCATCA CTGAGCTGTC 60TGGGCAGGTC TACTT75(2)关于SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度80个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置14..58(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准_名称＝“引物“mut2-7””/标记＝mut2-7/备注＝“引物“mut2-7”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P2的80-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO28CACCCATGTG CTCCAGTACA TCAAAGCTAA CTCCAAATTC ATCGGCATCA CCGAACTGGT 60TAACCTCCTC TCTGCCATCA 80(2)关于SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度96个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置10..72(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准_名称＝“引物“mut30-1””/标记＝mut30-1/备注＝“引物“mut30-1”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P30的96-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO29ACCCCGAGTT TCAACAATTT TACCGTAAGC TTTTGGCTCC GTGTACCTAA GGTGTCGGCC 60TCGCACCTGG AGCGCCGGGC CAATGCCCTC CTGGCC 96(2)关于SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度100个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置12..74(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准_名称＝“引物“mut30-2””/标记＝mut30-2/备注＝“引物“mut30-2”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P30的100-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO30TCCTGGCCAA TTTCAACAAC TTCACAGTTA GCTTCTGGTT GAGGGTACCA AAGGTCTCGG60CCAGCCACCT CGAGCAGGTC CTCTTCAAGG GCCAAGGCTG 100(2)关于SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度100个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置12..74(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准名称＝“引物“mut30-3””/标记＝mut30-3/备注＝“引物“mut30-3”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P30的100-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO31CCCAGGTCCT CTTCAACAAC TTTACCGTCT CCTTCTGGCT TCGGGTACCC AAGGTCAGCG 60CTAGCCACCT CGAGGTCTCC TACCAGACCA AGGTCAACCT 100(2)关于SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度100个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置15..77(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准名称＝“引物“mut30-4””/标记＝mut30-4/备注＝“引物“mut30-4”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P30的100-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO32AGTCGGTCAC CCTTCTCCAG GTGGGAAGCG CTTACCTTAG GGACGCGCAA CCAGAAGGAC 60ACGGTGAAAT TATTAAATGG GGTCTCCCTC TGGCAGGGGC 100(2)关于SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度100个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键插入_seq(B)位置14..76(C)鉴定方法实验(D)其它信息/功能＝“用于PCR克隆编码THFα同系物的DNA的引物”/证据＝实验/生物＝“人类”/标准_名称＝“引物“mut30-5”/标记＝mut30-5/备注＝“引物“mut30-5”是合成法合成的包含编码与人THFα基因片段同源的DNA片段之间的T细胞抗原决定部位P30的100-mer寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO33GAAGGGTGAC CGATTCAACA ATTTCACCGT AAGCTTCTGG CTTCGCGTCC CTAAGGTGTC 60TGCGTCGCAC CTCGAAGGGA TCATTGCCCT CTAGAGTCGA 100(2)关于SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键肽(B)位置1..25(D)其它信息/标记＝Pep2-1/备注＝“Pep2-1是合成法制备的包含人T细胞抗原决定部位P2和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO34Ser Arg Thr Pro Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly1 5 10 15Ile Thr Glu Leu Gln Leu Gln Trp Leu2025(2)关于SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽
(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键肽(B)位置1..25(D)其它信息/标记＝Pep2-3/备注＝“Pep2-3是合成法制备的包含人T细胞抗原决定部位P2和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO35Ser Gln Val Leu Phe Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly1 5 10 15Ile Thr Glu Leu Ile Ser Arg Ile Ala20 25(2)关于SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键肽(B)位置1..25
(D)其它信息/标记＝Pep2-4/备注＝“Pep2-4是合成法制备的包含人T细胞抗原决定部位P2和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO36Ala Glu Ala Lys Pro Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly1 5 10 15Ile Thr Glu Leu Gly Asp Arg Leu Ser20 25(2)关于SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键肽(B)位置1..25(D)其它信息/标记＝Pep2-5/备注＝“Pep2-5是合成法制备的包含人T细胞抗原决定部位P2和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO37Glu Lys Gly Asp Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly1 5 10 15Ile Thr Glu Leu Ser Gly Gln Val Tyr20 25(2)关于SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键肽(B)位置1..31(D)其它信息/标记＝Pep30-1/备注＝“Pep30-1是合成法制备的包含人T细胞抗原决定部位P30和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO38Ser Arg Thr Pro Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg1 5 10 15Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Arg Ala Asn Ala20 25 30(2)关于SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型
(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键肽(B)位置1..31(D)其它信息/标记＝Pep30-2/备注＝“Pep30-2是合成法制备的包含人T细胞抗原决定部位P30和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO39Ala Leu Leu Ala Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg1 5 10 15Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Val Leu Phe Lys20 25 30(2)关于SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征
(A)名称/关键肽(B)位置1..31(D)其它信息/标记＝Pep30-3/备注＝“Pep30-3是合成法制备的包含人T细胞抗原决定部位P30和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO40Tyr Ser Gln Val Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg1 5 10 15Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Ser Tyr Gln Thr20 25 30(2)关于SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键肽(B)位置1..31(D)其它信息/标记＝Pep30-4/备注＝“Pep30-4是合成法制备的包含人T4细胞抗原决定部位P30和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO41
Gln Arg Glu Thr Pro Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg1 5 10 15Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu20 25 30(2)关于SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(iii)假设否(iii)片段类型内部的(vi)原始来源(A)生物人类(ix)特征(A)名称/关键肽(B)位置1..31(D)其它信息/标记＝Pep30-5/备注＝“Pep30-5是合成法制备的包含人T细胞抗原决定部位P30和人THFα侧翼序列的THFα同系物的截短形式”(xi)序列描述SEQ ID NO42Glu Lys Gly Asp Arg Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg1 5 10 15Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ile Ile Ala Leu20 25 30
权利要求
1.一种经修饰的人TNFα分子，将所述经修饰的TNFα分子接种人类宿主后，能诱发针对野生型人TNFα的中和抗体，此分子中人TNFα分子的至少一个肽片段被至少一个已知含有免疫显性T细胞抗原决定部位的肽或含有免疫显性抗原决定部位和包含至少一个TNFαB细胞抗原决定部位的人TNFα分子的一或两侧外侧区域的所述分子的截断形式所取代，其中取代作用造成前β-折叠、任一连接环和/或后β-折叠的B’、I或D股的任一股氨基酸序列的实质改变。
2.一种经修饰的人TNFα分子，将所述经修饰的TNFα分子接种人类宿主后，能诱发针对野生型人TNFα的中和抗体，此分子中人TNFα分子的的至少一个肽片段被至少一个已知含有免疫显性T细胞抗原决定部位的肽或含有免疫显性抗原决定部位和包含至少一个TNFαB细胞抗原决定部位的人TNFα分子的一或两侧外侧区域的所述分子的截断形式所取代，其中所述经修饰的TNFα分子基本上无TNFα活性。
3.根据权利要求2所述的经修饰的人TNFα分子，其中所述经修饰人TNFα分子以L929生物分析法测试时是基本上无TNFα活性，且其中在适当宿主体内诱发的针对该经修饰的人TNFα的抗体明显抑制L929生物测定中野生型TNFα的活性和/或该抗体明显抑制野生型TNFα与55kD TNFα受体1(TNFα-R55)或75kD TNFα受体(TNFα-R75)的结合。
4.一种经修饰的人TNFα分子，将此经修饰TNFα分子接种人类宿主后，能诱发针对野生型人TNFα的中和抗体，此分子中人TNFα分子的至少一个肽片段被至少一个已知含有免疫显性T细胞抗原决定部位的肽或含有免疫显性抗原决定部位和包含至少一个TNFαB细胞抗原决定部位的人TNFα分子的一或两侧外侧区域的所述分子的截断形式所取代，其中该取代作用可在TNFα分子区域内完成以基本上保留B股与G股的β-折叠结构。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，其中取代作用在涉及前β-折叠的任一股和/或连接环的TNFα分子区域内完成以基本上保留后β-折叠任一股的β-折叠结构。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，其中取代作用在涉及后β-折叠D股片段的TNFα分子区域内完成。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，其中取代作用包含前β-折叠H股的至少一个片段和与I股连接环的至少一个片段，优选地是第132至146位氨基酸。
8.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，其中取代作用包含H股和I股及完整连接环片段，优选地是第132至152位氨基酸。
9.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，其中取代作用包含D股片段、E股至少一个片段和完整连接环，优选地是第65至79位或第64至84位氨基酸。
10.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，其中取代作用包含完整C’和C股及D股片段，优选地是第40至60位氨基酸。
11.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，其中取代作用包含E股的至少一个片段和一个或两个连接环的前β-折叠的至少一个片段，优选地是第76至90位氨基酸。
12.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的TNFα分子，具有SEQ ID NO.8中所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的TNFα分子，具有SEQ ID NO.10中所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的TNFα分子，具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的TNFα分子，具有SEQ ID NO.20中所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-4中任意一项所述的经修饰的TNFα分子，具有SEQ ID NO.14中所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-11中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，其中嵌入的T细胞抗原决定部位是非选择性的，且已知对多数人HLA II类型具有免疫原性。
18.根据权利要求17所述的经修饰的人TNFα分子，其中抗原决定部位来自破伤风类毒素，优选地是抗原决定部位P2和/或P30。
19.根据权利要求1-18中任意一项所述的经修饰人TNFα分子的二聚体、寡聚体或多聚体。
20.一种分离DNA分子，编码根据权利要求1-18中任意一项所述的经修饰的TNFα分子。
21.一种载体，含有根据权利要求20所述的分离DNA。
22.一种表达载体，含有根据权利要求20所述的与表达调控序列可操作连接的分离DNA。
23.一种宿主，转化了权利要求22的表达载体。
24.根据权利要求23所述的宿主，选自细菌、酵母或其它真菌和昆虫、哺乳动物或禽细胞系。
25.一种制备根据权利要求1-18中的任意一项所述的经修饰的人TNFα分子的方法，包含在允许经修饰TNFα生产的适当条件下培养权利要求23的宿主细胞并回收如此产生的经修饰的TNFα。
26.根据权利要求1-18中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，以与佐剂分子，优选地具有免疫活性的佐剂如GM-CSF、HSP70或白细胞介素的融合蛋白形式。
27.一种对抗TNFα的疫苗，包含致免疫量的根据权利要求1-18中任意一项所述的一种或多种经修饰的人TNFα分子，以及选择性地药学上可接受的佐剂如磷酸铝、氢氧化铝、磷酸钙、胞壁酰二肽或iscom。
28.根据权利要求27所述的疫苗，用于预防或治疗由TNFα分子释放或活性所引发的疾病，例如慢性炎性疾病如类风湿性关节炎和炎性肠症包括空氏(Crohn’s)症和溃疡性结肠炎，以及癌症、多发性硬化症、糖尿病、牛皮癣、骨质疏松症及哮喘。
29.一种对抗TNFα的疫苗，包含插入适当表达载体的编码根据权利要求1-18中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子的DNA。
30.根据权利要求29所述的疫苗，含有包含与在人体中调控所述DNA序列表达的启动子序列可操作连接的编码根据权利要求1-18中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子的非传染性非整合型DNA序列的构建体，其量足以使所述构建体的摄入发生且足以使诱发针对TNFα的中和抗体反应的表达出现。
31.根据权利要求29所述的疫苗，含有病毒表达载体如逆转录病毒表达载体。
32.根据权利要求27-31中任意一项所述的疫苗，口服或经非肠胃途径如皮下、肌内或皮内途径给药。
33.通过施用根据权利要求27-31中任意一项所述的疫苗产生的抗体，优选地单克隆抗体的用途。
34.根据权利要求33所述的抗体的诊断用途。
35.一种测试人体液中TNFα分子存在的方法，包括将含有根据权利要求1-18中任意一项所述的经修饰的TNFα的组合物与人体液样品接触，并测定所述抗体是否与所述样品中的TNFα结合。
36.一种诊断TNFα相关疾病的方法，利用体外免疫分析法测定人体液中的TNFα。
37.根据权利要求35或36所述的疫苗，包括利用三明治分析法、ELISA分析法或同等物分析法，可以扩大或不扩大如利用抗生物素/生物素技术。
38.一种治疗或预防其病理生理学至少部分归功于TNFα释放或其活性的疾病的方法，包括给动物包括人类施用有效量的至少一种根据权利要求1-18中任意一项所述的经修饰的人TNFα分子，选择性与适当佐剂或载体混合。
39.经修饰的TNFα分子的用途，用于制备治疗或预防疾病的药物，所述疾病的病理生理学至少部分归功于TNFα释放或其活性。
全文摘要
本发明涉及一种经修饰的人TNFα分子,将所述经修饰的TNFα分子接种人类宿主后,能诱发针对野生型人TNFα的中和抗体,此分子中人TNFα分子的至少一个肽片段被至少一个已知含有免疫显性T细胞抗原决定部位的肽或含有免疫显性抗原决定部位和包含至少一个TNFαB细胞抗原决定部位的人TNFα分子的一或两侧外侧区域的所述分子的截断形式所取代,其中取代作用造成前β－折叠、任一连接环和/或后β－折叠的B’、I或D股的任一股氨基酸序列的实质改变。经修饰人TNFα分子或其编码DNA可以选择性地与药学上可接受的佐剂一起配制成对抗TNFα的疫苗用于预防或治疗慢性炎症疾病如类风湿性关节炎与炎性肠症、癌症、多发性硬化症、糖尿病、牛皮癣、骨质疏松症或哮喘。通过与含有该经修饰TNFα的组合物接触,测试人体液中TNFα的存在。
文档编号C07K16/24GK1252809SQ9880421
公开日2000年5月10日 申请日期1998年4月15日 优先权日1997年4月15日
发明者M·R·詹森, S·莫里生, H·艾尔斯纳, I·达鲁姆 申请人:费林药物实验室公司