环戊烯酮的衍生物的制作方法

专利名称：环戊烯酮的衍生物的制作方法
技术领域：
本发明关于在医药领域中有用的、具有抗癌作用等生理活性的环戊烯酮衍生物以及该化合物的制造方法。
以往，临床治疗方法中使用的药物主要是烷基化剂、代谢抑制剂、植物生物碱等抗癌药、抗生素、免疫促进剂和免疫调节剂等多种药剂，但这些药物疗法还不能说已经十分完善。
研究报告指出，在这些药物中，由天然物质得来的前列腺素中在5员环上具有α，β-不饱和羰基的前列腺素A和J类能抑制DNA合成，可以作为安全性高的抗癌药，目前已经合成了它们的各种衍生物(参见特开昭62-96438)。
本发明的目的是，研制具有抗癌作用等生理作用的环戊烯酮衍生物，提供该化合物的制造方法以及含有该化合物的药物。
为了实现上述目的，本发明人进行了深入的研究，结果发现，使由[III]式表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(以下简称环戊烯酮)与醇和/或其反应性衍生物反应，可以生成由[II]式表示的环戊烯酮衍生物，该环戊烯酮衍生物具有很强的癌细胞增殖抑制活性等生理活性。
本发明可以概括如下本发明的第1发明是关于由下列通式[I]表示的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐。
式中，R1和R2是相同或不同的直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基、芳脂族基或H，但不包括R1＝R2＝H、或R1＝苄基时R2＝H的情况。
本发明的第2发明是关于由通式[II]表示的环戊烯酮衍生物的制造方法，其特征是，使由下列[III]式表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物与相当于由下列通式[II]表示的环戊烯酮衍生物的R3、R4的醇和/或其反应性衍生物同时或依次反应。
式中，R3和R4是相同或不同的直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基、芳脂族基或H。但不包括R3＝R4＝H的情况。
本发明的第3发明是关于一种药物，其特征是，该药物含有选自本发明的第1发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐中的化合物作为有效成分。
本发明的第4发明是关于一种药物，其特征是，该药物含有选自用本发明的第2发明的方法得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物作为有效成分。
在本发明的第3和第4发明中，优选的方案是，上述药物为抗癌药、细胞凋亡诱发剂。
附图的简要说明

图1是表示4-苄基环戊烯酮醚的1H-NMR谱的图。
图2是表示5-苄基环戊烯酮醚的1H-NMR谱的图。
图3是表示4，5-二苄基环戊烯酮醚的1H-NMR谱的图。
图4是表示4-叔丁基环戊烯酮醚的1H-NMR谱的图。
图5是表示5-叔丁基环戊烯酮醚的1H-NMR谱的图。
图6是表示4，5-二-叔丁基环戊烯酮醚的1H-NMR谱的图。
图7是表示(-)-环戊烯酮的对二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(-)-环戊烯酮的立体结构的图。
图8是表示(+)-环戊烯酮的对二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(+)-环戊烯酮的立体结构的图。
图9是表示4-叔丁基环戊烯酮醚或4，5-二-叔丁基环戊烯酮醚的量与足浮肿增加率的关系图。
发明的实施方式下面具体地说明本发明。
本发明中使用的由[III]式表示的环戊烯酮，其4位和5位的羟基的立体构型包括顺式异构体和反式异构体两种情况。在本发明中，可以使用顺式环戊烯酮，反式环戊烯酮，或者顺式环戊烯酮与反式环戊烯酮的混合物。另外，也可以使用它们的旋光物。
顺式环戊烯酮可以用化学合成法制备[参见(Helvetica Chimica Acta)、第55卷、第2838-2844页(1972)]。反式环戊烯酮也可以用化学合成法制备[参见(Carbohybrate Res.)、第247卷、第217-222页(1993)]，另外，还可以通过对糖醛酸(例如葡糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡糖醛酸内酯)等进行加热处理而制备(参见PCT/JP97/03052说明书)。在本发明中，也可以使用含有环戊烯酮的上述加热处理物、其部分精制物以及精制物。
例如，糖醛酸使用D-葡糖醛酸，将其1％溶液在121℃下加热处理4小时，使加热处理物中生成环戊烯酮。用溶剂萃取该加热处理物中的环戊烯酮，浓缩萃取物。然后用硅胶柱色谱分离该浓缩物，浓缩溶出的环戊烯酮级分，用氯仿从浓缩物中提取环戊烯酮，对提取的浓缩物进行正相柱色谱分离，离析加热处理物中的环戊烯酮。
环戊烯酮的物性列出如下。环戊烯酮的质谱分析是采用DX302质谱仪(日本电子社制造)进行的。另外，使用重氯仿溶剂的NMR谱的测定是采用JNM-A500(日本电子社制造)。旋光率、UV吸收谱和红外吸收光谱(IR)分别是使用DIP-370型旋光计(日本分光社制造)、UV-2500分光光度计(岛津制作所制造)和FTIR-8000红外分光光度计(岛津制作所制造)。
MS m/z 115〔M+H〕+1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)其中，1H-NMR的化学位移值是以CHCl3的化学位移值为7.26ppm表示的。
旋光度[α]D200°(c 1.3、水)UVλmax 215nm(水)IR(KBr法)在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1有吸收。
对离析的环戊烯酮进行光学离析，可以得到(-)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
例如，将环戊烯酮溶解在乙醇中，向该乙醇溶液中添加己烷/乙醇(94/6)，制备环戊烯酮溶液。例如使用Chiral Pack As(ダィセル化学工业)柱，在柱温40℃、流动相己烷/乙醇(94/6)条件下对该试样溶液进行HPLC，可以将环戊烯酮光学离析。
离析的(-)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮[以下简称(-)-环戊烯酮]的旋光度是[α]D20-105°(c 0.30、乙醇)，(+)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮[以下简称(+)-环戊烯酮]的旋光度是[α]D20+104°(c 0.53、乙醇)。另外，旋光度是用上述DIP-370型旋光计(日本分光社制造)测定的。
随后，按上面所述的方法，采用质谱分析、核磁共振(NMR)对(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮分别进行结构分析，测定UV吸收光谱和红外吸收光谱。结果，这两种旋光物显示出与光学离析前的环戊烯酮相同的结果。
设经过光学离析的(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮分别作为对二甲氨基苯甲酰基衍生物，使用J-720型圆二色性分散计(日本分光社制造)，测定圆二色性光谱(CD)，将所得结果用于二苯甲酸酯手性规则[参见J.Am.Chem.Soc.、第91卷、第3989-3991页(1969)]，确定其立体构型。
图7中示出(-)-环戊烯酮的对二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(-)-环戊烯酮的立体结构。图中，纵轴表示摩尔圆二色性，横轴表示波长(nm)。另外，上述立体结构用[IV]式表示如下
图8中示出(+)-环戊烯酮的对二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(+)-环戊烯酮的立体结构。图中，纵轴表示摩尔圆二色性，横轴表示波长(nm)。另外，上述立体结构用[V]式表示如下
如同图7、8和[IV]式、[V]式所示，(-)-环戊烯酮是(-)-(4R，5S)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮，(+)-环戊烯酮是(+)-(4S，5R)-反式-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
以上使用的环戊烯酮或其旋光物可以用任一方法制造，可以用说明书中所述的方法制造，也可以用其它化学合成方法合成，在本发明中也可以使用环戊烯酮的反式体、顺式体、它们的混合物以及它们的旋光物。
将环戊烯酮和/或其旋光物与具有直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基或芳脂族基的醇和/或其反应性衍生物同时或依次反应，在反应液中生成本发明的由通式[II]表示的环戊烯酮衍生物或其旋光物。
具有烷基的醇可以使用具有直链或支链烷基的醇，烷基链的链长可以根据环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等适当选择。
具有直链烷基的醇例如可以使用甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十二烷醇、十四烷醇、十六烷醇、十八烷醇等。
具有支链烷基的醇例如可以使用异丁酸、叔丁醇、异戊醇、叔戊醇等。
具有链烯基的醇可以使用具有直链或支链链烯基的醇，链烯基的链长、不饱和度以及不饱和键的位置可以根据环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等适当选择。
具有直链链烯基的醇例如可以使用丙烯醇、烯丙醇、丁烯醇、3-己烯-1-醇等。
具有支链链烯基的醇例如可以使用香叶醇、法呢醇、龙牛儿基香叶醇、松香油、沉香醇、橙花叔醇、橙花醇等。
具有芳基的醇例如可以使用苯酚、甲酚、硝基苯酚、氯苯酚、溴苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、萘酚等，可以根据生成的环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等选择所使用的具有芳基的醇。
具有芳脂族基的醇例如可以使用苯甲醇、苯乙醇、苯酰甲醇、苯代乙二醇、苯基丙醇等，可以根据生成的环戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等选择所使用的具有芳烷基的醇。
本发明中使用的醇的反应性衍生物例如可以举出卤代烷、芳基卤、酸酯、重氮基化合物、盐、醇的脱水物链烯等，可以根据要达到的目的制备所使用的醇的反应性衍生物。
醇以及/或其反应性衍生物与环戊烯酮的反应，可以按照式II所示的环戊烯酮衍生物中的R3和R4相同的方式进行，也可以按照R3与R4中任一个为未反应的H的方式进行，也可以按照R3与R4不同的方式进行。即，可以使环戊烯酮的2个羟基同时反应，也可以仅使任意一个反应，也可以使R3与R4不同的醇及/或其反应性衍生物同时与环戊烯酮反应，也可以使R3与R4不同的醇及/或其反应性衍生物依次与环戊烯酮进行反应。此时，通过保护环戊烯酮中的一个羟基，可以高效率地制备R3与R4不同或R3与R4中任一个被醚化的环戊烯酮衍生物。
另外，本发明提供的式I表示的环戊烯酮中，该环戊烯酮衍生物的R1与R2可以相同，也可以是R1与R2中任一个为未反应的H，R1与R2也可以不同。
环戊烯酮或其旋光物与醇及/或其反应性衍生物反应，生成的环戊烯酮衍生物或其旋光物具有很强的癌细胞增殖抑制活性，可以以该活性作为指标从反应液中提纯、分离环戊烯酮衍生物或其旋光物。提纯、分离的方法可以采用化学方法或物理方法等公知的纯化方法，可以将凝胶过滤法、利用分子量分级薄膜的分级法、溶剂萃取法、分馏法、使用离子交换树脂、正相、反相等各种色谱法等以往公知的纯化方法组合使用，提纯和离析反应生成物中的环戊烯酮衍生物或其旋光物。
例如，在氩气气流下，将环戊烯酮或其旋光物与苯甲醇或叔丁基醇的三氯乙酰亚胺酸酯溶解在三氯甲烷中，添加三氟化硼二乙醚络合物的二氯甲烷溶液使之反应，生成本发明的环戊烯酮衍生物。
将环戊烯酮或其旋光物溶解在四氢呋喃中，添加卤代烷与氢化钠使之反应，生成本发明的环戊烯酮衍生物。
将环戊烯酮或其旋光物溶解在二噁烷中，添加氢氧化钙和硫酸二甲酯使之反应，生成本发明的环戊烯酮衍生物。
将环戊烯酮或其旋光物溶解在二氯甲烷中，添加二异丙基乙胺与三乙基氧翁四氟硼酸盐使之反应，生成本发明的环戊烯酮衍生物。
将环戊烯酮或其旋光物溶解在二氯甲烷中，添加三氟甲烷磺酸与链烯使之反应，生成本发明的环戊烯酮衍生物。
以上生成的本发明的环戊烯酮衍生物根据需要可以采取溶剂萃取、柱色谱法、薄层色谱法等其它公知的方法提纯、分离。
由本发明得到的环戊烯酮衍生物的旋光物，可以通过消旋混合物的机械分离进行离析，优先选用结晶法离析，作为非对映立体异构物盐或包合物结晶而离析，采用酶·微生物的动力学离析，以及采用色谱进行离析。
采用色谱进行离析，可以使用气相色谱、液相色谱或薄层色谱等，可以使用与它们相适应的手性固定相。
采用液相色谱进行光学离析，可以采用使用手性固定相的方法、使用手性洗提液的方法以及作为非对映立体异构物的分离等方法。
手性固定相可以使用酰胺系固定相、尿素系固定相、配位基交换型固定相、多糖·多糖衍生物固定相、蛋白质固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等。
洗提液可以使用己烷系、醇系、水(缓冲液)系等，与上述固定相组合适当使用。
本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物的盐，有些是可以用作药物的盐，可以采用公知的方法转换。
本发明所得到的式I或式II表示的环戊烯酮衍生物(以下简称本发明的环戊烯酮衍生物)或其旋光物或者它们的盐，具有抗癌活性、癌细胞增殖抑制活性、细胞凋亡诱发活性、拓扑异构酶(トポィソ メラ一ゼ)II阻碍活性、癌细胞分化诱导活性、抗风湿活性、慢性关节风湿抑制作用、ファス抗原产生诱导活性、抗菌活性、抗病毒活性、肝功能改善活性、热激蛋白诱导活性、血液成分正常化活性、癌免疫增强活性、抗炎活性、肿瘤坏死因子产生抑制活性、一氧化氮产生抑制活性、免疫调节活性，例如延迟型过敏反应抑制活性、淋巴细胞幼年化反应抑制活性、混合淋巴细胞反应抑制活性、IgE产生抑制活性、角叉菜胶浮肿抑制活性等的生理活性，利用这些活性，含有选自本发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物作为有效成分的药品，作为作用于机体防御机构的药品、例如作用于抗体产生机构的制剂如抗炎剂、抗过敏剂、抗风湿剂、干扰素诱导剂等，作用于糖代谢的医药如糖尿病治疗剂，作用于病原微生物的医药如抗菌剂、抗病毒剂等有用。所以本发明得到的医药，作为对本发明化合物或其旋光物或者它们的盐具有感受性的疾病的医药，对治疗或预防例如癌症、病毒性疾病、风湿、糖尿病、过敏、自身免疫性疾病、炎症等疾病的药物极为有效。
本发明的化合物或其旋光物或者它们的盐，对以下癌细胞的增殖具有抑制作用，例如人前骨髓性白血病细胞HL-60、人急性淋巴芽球性白血病细胞MOLT-3、肺癌细胞A-549、SV40形质转换肺细胞WI-38VA13、肝癌细胞Hep G2、结肠癌细胞HCT 116、人结肠癌细胞SW480、人结肠癌细胞WiDr、胃癌细胞AGS、骨髓瘤细胞等，以选自本发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物作为有效成分，将其与公知的药用载体组合形成制剂，制成抗癌药。本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的癌细胞增殖抑制作用对本发明没有任何限制作用，例如，本发明的制癌作用还包含对于癌细胞的细胞凋亡诱发作用、拓扑异构酶的阻碍作用。
抗癌药一般可以按下述方法制造，将选自环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物与药学上允许的液体或固体的载体配合，必要时添加溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固形制剂或通常液剂、悬浮剂、乳剂等溶液剂。另外，还可以制成干燥制品，在使用之前添加适当的载体，形成液状。
药用载体可以根据上述给药方式和剂型加以选择，对于经口给药的制剂来说，例如可以使用淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，在制备经口给药的制剂时，还可以配入粘结剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂、着色剂、香料等。
另一方面，对于非经口给药的制剂来说，将本发明的有效成分即选自环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物溶解或悬浮于作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理食盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，必要时添加杀菌剂、稳定剂、等张化剂、镇痛剂等，制成制剂。
本发明的抗癌药可以采用与制剂形态相应的适当给药途径给药。给药方法没有特别的限制，可以内用、外用或注射。注射剂例如可以通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射给药，外用剂也包括栓剂等。
抗癌药的给药量可以根据制剂形式、给药方法、使用目的以及患者的年龄、体重、症状等适当设定，不是一成不变的，一般地说，制剂中所含的、选自环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物的量为成人每日0.1μg～200mg/kg。当然，给药量根据各种条件而有所变化，有的时候比上述给药量少，也有的时候比上述给药量多。本发明的药剂除了直接经口给药外，还可以添加到日常的任何食品饮料中摄入。
本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐具有细胞凋亡诱发活性，可以从这些化合物中选择至少一种化合物作为有效成分，制成细胞凋亡诱发剂。细胞凋亡诱发剂可以按照上述抗癌药中所述的方法制成制剂，并按抗癌药中所述的方法给药。
细胞凋亡诱发剂的给药量可以根据制剂形式、给药方法、使用目的以及患者的年龄、体重、症状等适当设定，不是一成不变的，一般地说，制剂中所含的、选自环戊烯酮衍生物或其旋光物或它们的盐的量为成人每日0.1μg～100mg/kg。当然，给药量根据各种条件而有所变化，有的时候比上述给药量少，也有的时候超过上述给药量范围。本发明的药剂除了直接经口给药外，还可以添加到日常的任何食品饮料中摄入。
一般认为，细胞凋亡作用与病理学上所说的细胞死亡即坏死不同，是从一开始就编入细胞本身的基因中的死亡。即，任何外部或内部的因素都可能诱发编程细胞凋亡作用的基因活化，基于该基因而生物合成编程性细胞死亡基因蛋白质，或有时可以使细胞内存在的不活性型编程死亡蛋白质活性化。由于生成的编程性细胞死亡蛋白质的作用使细胞本身分解，导致死亡。本发明的细胞凋亡诱发剂可以在所希望的组织和细胞中诱发这种细胞凋亡作用，以自然的形式从生物体中排除不需要的细胞或病源细胞，因而是极其有用的。
即，本发明的细胞凋亡诱发剂在排除自身免疫疾病患者的自身反应性淋巴细胞、癌细胞、病毒感染细胞等依然有效，通过在所希望的组织和细胞中诱发这种细胞凋亡作用，以自然的形式从生物体中排除不需要的细胞或病源细胞。作为本发明的细胞凋亡诱导剂有效的疾病，例如全身性红斑狼疮、免疫介在性系球体肾炎、多发性硬化症、胶原病等自身免疫性疾患、风湿等。
本发明的细胞凋亡诱发剂可以在细胞凋亡作用诱发方法中使用。即，使用本发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐作为有效成分，可以诱发细胞凋亡作用，该方法对于弄清细胞凋亡诱发机理以及筛选细胞凋亡诱发剂和细胞凋亡诱发抑制剂等十分有用。
角叉菜胶足浮肿的模型，是通过在足部皮下注射发炎剂角叉菜胶，诱导巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞，由这些细胞的产生的炎症性因子使血管通透性亢进，引起浮肿。本发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐具有角叉菜胶浮肿的抑制作用，含有选自这些化合物的化合物作为有效成分的医药，作为治疗或预防有必要抑制血管通透性亢进的炎症性疾病，例如慢性关节风湿等的抗炎剂、抗风湿剂有用。
本发明提供了含有从本发明得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐中选择至少一种化合物作为有效成分的拓扑异构酶阻碍剂，以及使用从这些化合物中选择至少一种化合物作为有效成分的拓扑异构酶的阻碍方法。该拓扑异构酶阻碍剂作为抗癌剂有用，该拓扑异构酶阻碍方法对进行生化学研究和筛选抗癌剂有用。
另外，通过本发明，提供了含有从本发明的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物中选择的至少一种化合物作为有效成分的药品，可以作用于机体防御机构，例如作用于抗体产生机构的制剂如抗炎剂、抗过敏剂、抗风湿剂、干扰素诱导剂等，作用于糖代谢的医药如糖尿病治疗剂，作用于病原微生物的医药如抗菌剂、抗病毒剂、拓扑异构酶阻碍剂等，可以按照抗癌剂的方法进行制剂化，按照抗癌剂的方法用量给药。
通过本发明得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或它们的盐，可以通过将环戊烯酮与任意的醇或其反应衍生物高效制造，通过本发明可以提供式II表示的环戊烯酮衍生物或旋光物或它们的盐。
含有本发明得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐作为有效成分的食品或饮料的制造方法没有特别的限制，可以采用烹饪、加工以及常用的食品或饮料的制造方法制造，只要制得的食品或饮料中含有有效量的选自具有生理作用的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐的化合物即可。
本发明得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐，将其以生理活性的有效量给药时没有发现毒性。例如，在经口给药的场合，以300mg/kg的剂量将4-叔丁基环戊烯酮醚或其旋光物或者它们的盐、4，5-二叔丁基环戊烯酮醚或其旋光物或者它们的盐给小鼠一次性经口给药时，没有发现死亡例。
本发明所得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐可以简便地制造，由于具有各种生理作用，在医药、食品等领域中具有广泛的应用前景。
实施例下面通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。另外，实施例中的％表示重量％。
实施例1(1)将10g D-葡糖醛酸(Sigma公司制造G5269)溶解在1升的水中，在121℃下加热4小时，然后减压浓缩至10ml左右。向其中添加醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2混合液的上层40ml，混合后离心分离，在减压下将所得上清液浓缩至约10ml。
将上述提取液加到柱色谱用硅胶BW-300SP(2×28cm，富士Silycia化学社制造)上，以醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2的上层作为洗提液，用空气压缩机加压至0.2kg/cm2，以每分钟5ml的流速进行分离。按照每1级分10ml进行分级分离，每1级分取一部分，用薄层色谱分析，从第61至80级分中含有高纯度的环戊烯酮。将这些级分汇集到一起，减压下浓缩，然后用40ml的氯仿萃取，在减压下浓缩萃取液，得到100mg的环戊烯酮。
采用使用Palpack型S柱的正相HPLC分离该级分，用215nm的紫外线吸收进行检测，结果纯度为98％。
将113.9mg上述环戊烯酮溶解在2.85ml乙醇中，再向该乙醇溶液中添加己烷/乙醇(94/6)3.85ml，制成17mg/ml的环戊烯酮溶液。用0.5μm的过滤器过滤该溶液，将其作为光学离析HPLC试样溶液。
按以下条件对该试样溶液进行光学离析HPLC，分别收集前峰的(-)-环戊烯酮和后峰的(+)-环戊烯酮的级分，减压干固，分别得到(-)-环戊烯酮43.2mg和(+)-环戊烯酮43.0mg。
光学离析HPLC条件柱Chiral Pack AS(Daicel化学工业)2.0cm×25.0cm柱温度40℃移动相己烷/乙醇(94/6)流速14.0ml/分检测UV210nm试样注入量150μl(2.55mg)按上述条件再次进行光学离析，以使所得到的(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮两者总共含有约1％的对映体。结果，从前峰的(-)-环戊烯酮30.0mg中得到19.7mg不含对映体的(-)-环戊烯酮，从后峰的(+)-环戊烯酮37.4mg中得到27.7mg的不含对映体的(+)-环戊烯酮。另外，(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮的光学离析HPLC的溶出时间分别为33分钟和40分钟。
(2)在氩气气流下，将44mg的环戊烯酮和492mg的苄基2，2，2-三氯乙酰亚胺酯(Aldrich公司制，14，033-3)溶解在2.5ml三氯甲烷(和光纯药公司制，135-02441)中。边搅拌边向其中缓慢添加28μl/ml的三氟硼酸化硼乙醚络合物(和光纯药公司制，022-08362)的二氯甲烷1ml。在室温下搅拌8小时后，减压浓缩，使用氯仿∶甲醇＝19∶1作为展开溶剂利用硅胶薄层色谱精制4-苄基环戊烯酮醚、5-苄基环戊烯酮醚以及4，5-二苄基环戊烯酮醚。4-苄基环戊烯酮醚的Rf值为0.3、5-苄基环戊烯酮醚的Rf值为0.45、4，5-二苄基环戊烯酮醚的Rf值为0.8。收率4-苄基环戊烯酮醚为3.7％、5-苄基环戊烯酮醚为3.7％、4，5-二苄基环戊烯酮醚为2.5％。
(3)通过核磁共振法(NMR)确认由实施例1-(2)所得到的4-苄基环戊烯酮醚、5-苄基环戊烯酮醚、以及4，5-二苄基环戊烯酮醚的构造。核磁共振装置使用JNM-EX270 FT NMR系统(日本电子公司制)。另外，1H-NMR的化学位移值是以四甲基硅烷的化学位移值为0ppm表示。结果如下所示。
4-苄基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.47(1H，dd，J＝6.0Hz，J＝1.68)，δ7.36(5H，m)，δ6.3(1H，dd，J＝6.0Hz，J＝1.33Hz)，δ4.88(1H，d，J＝11.55)，δ4.75(1H，d，J＝11.55)，δ4.55(1H，m)，δ4.28(1H，m)，δ2.78(1H，m)5-苄基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.39(6H，m)，δ6.22(1H，dd，J＝6.24Hz，J＝1.32Hz)，δ5.09(1H，d，J＝11.87)，δ4.79(1H，m)，δ4.77(1H，d，J＝11.87)，δ3.98(1H，d，J＝2.97)，δ2.06(1H，m)4，5-二苄基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.47(1H，dd，J＝6.27Hz，J＝1.98)，δ7.34(10H，m)，δ6.29(1H，dd，J＝6.10Hz，J＝1.49Hz)，δ4.88(1H，d，J＝11.85)，δ4.74(1H，d，J＝11.85)，δ4.71(2H，d，J＝11.55)，δ4.56(1H，m)，δ4.33(1H，d，J＝2.64)这些衍生物的1H-NMR谱如图1～3所示。即，图1为4-苄基环戊烯酮醚的NMR谱、图2为5-苄基环戊烯酮醚的NMR谱、图3为4，5-二苄基环戊烯酮醚的NMR谱。图1～图3的横轴表示化学位移值(ppm)、纵轴表示信号的强度。
(4)在氩气气流下，将44mg的环戊烯酮和287mg的叔丁基2，2，，2-三氯乙酰亚胺酯(Aldrich公司制，36，478-9)溶解在2.5ml三氯甲烷中。一边搅拌边向其中缓慢添加28μl/ml的三氟硼酸化硼乙醚络合物的二氯甲烷溶液1ml。在室温下搅拌8小时后，减压浓缩，按实施例1-(2)同样使用硅胶薄层色谱精制4-叔丁基环戊烯酮醚、5-叔丁基环戊烯酮醚以及4，5-二叔丁基环戊烯酮醚。4-叔丁基环戊烯酮醚的Rf值为0.35、5-叔丁基环戊烯酮醚的Rf值为0.27、4，5-二叔丁基环戊烯酮醚的Rf值为0.73。收率4-叔丁基环戊烯酮醚为9.2％、5-叔丁基环戊烯酮醚为1.9％、4，5-二叔丁基环戊烯酮醚为11％。
(5)按实施例1-(3)相同的方法利用NMR确认由实施例1-(4)得到的4-叔丁基环戊烯酮醚、5-叔丁基环戊烯酮醚、以及4，5-二叔丁基环戊烯酮醚的构造。结果如下所示。
4-叔丁基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.34(1H，dd，J＝5.94Hz，J＝0.99)，δ6.25(1H，dd，J＝6.10，J＝1.49)，δ4.59(1H，m)，δ4.08(1H，d，J＝2.31)，δ2.85(1H，m)，δ1.33(9H，s)5-叔丁基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.37(1H，dd，J＝6.27Hz，J＝1.98)，δ6.23(1H，dd，J＝6.27，J＝1.32)，δ4.75(1H，m)，δ4.04(1H，d，J＝2.63)，δ2.23(1H，m)，δ1.32(9H，s)4，5-二叔丁基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.35(1H，dd，J＝6.27Hz，J＝1.65)，δ6.24(1H，dd，J＝6.26，J＝0.99)，δ4.62(1H，ddd，J＝3.3，J＝1.65，J＝0.99)，δ4.16(1H，d，J＝3.31)，δ1.38(18H，s)这些衍生物的1H-NMR谱如图4～6所示。即，图4为4-叔丁基环戊烯酮醚的NMR谱、图5为5-叔丁基环戊烯酮醚的NMR谱、图6为4，5-二叔丁基环戊烯酮醚的NMR谱。图4～图的横轴表示化学位移值(ppm)、纵轴表示信号的强度。
实施例2将4-苄基环戊烯酮醚、5-苄基环戊烯酮醚、或4，5-二苄基环戊烯酮醚的1.22、2.44、4.88、9.77、19.5、39.1、78.1、156、313、625、1250、2500、5000或10000μg/ml溶液(在70％的乙醇水溶液中)、或作为对照的70％乙醇水溶液10μl，分别添加至装入96孔微量滴定板的加样孔中，风干后，将前骨髓性白血病细胞株HL-60细胞(ATCC CCL-240)在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中混悬形成1×105个/ml，分别取100μl添加至各加样孔中，在5％二氧化碳存在下37℃培养48小时。用光学显微镜观察细胞的形态，添加5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑噁溴化物(MTT；Sigma公司制)磷酸缓冲食盐水溶液10μl，继续培养4小时，然后用显微镜观察细胞的发育状况。另外，添加含有0.04N HCl的2-丙醇100μl，充分搅拌，测定590nm的吸光度。
结果表明，在4-苄基环戊烯酮醚的添加级分(最终浓度0.244μg/ml、1.20μM)2.44μg/ml、5-苄基环戊烯酮醚的添加级分(最终浓度1.95μg/ml、9.56μM)19.5μg/ml、4，5-二苄基环戊烯酮醚的添加级分(最终浓度15.6μg/ml、53.1μM)156μg/ml下，细胞增殖受到完全抑制。没有发现细胞凋亡小体的形成。另外添加低浓度级分时与添加水作为对照时没有发现差别。
(2)按实施例2-(1)相同的方法测定4-叔丁基环戊烯酮醚、5-叔丁基环戊烯酮醚、或4，5-二叔丁基环戊烯酮醚对HL-60细胞的增殖的影响。
结果表明，在4-苄基环戊烯酮醚的添加级分(最终浓度31.3μg/ml、180μM)313μg/ml、5-苄基环戊烯酮醚的添加级分(最终浓度7.81μg/ml、46μM)78.1μg/ml、4，5-二苄基环戊烯酮醚的添加级分(最终浓度62.5μg/ml、280μM)625μg/ml下，细胞增殖受到完全抑制。没有发现凋亡小体的形成。另外添加低浓度级分时与添加水作为对照时没有发现差别。
上述化合物显示癌细胞增殖抑制活性以及细胞凋亡诱发活性。另外，这些化合物的旋光物也显示出同样的癌细胞增殖抑制活性和细胞凋亡诱发作用。
实施例3从セァック吉富(株)购入路易斯大白鼠(雄性，9周，体重约250g)，如下所示制成炎症模型，例如作为慢性关节炎风湿模型的角叉菜胶诱发足浮肿模型，评价被测物质。
将4-叔丁基环戊烯酮醚或4，5-二叔丁基环戊烯酮醚溶解在橄榄油中调节至各浓度，以1mg/10ml/kg或10mg/10ml/kg的给药量经口给予在实验开始前18小时绝食的大白鼠。在给予这些被测物质0.5小时后，将λ-角叉菜胶在生理食盐水(大冢制药)中混悬调整浓度为1％，以100μl/kg的给药量在大鼠足部注射，引起足部浮肿。用大白鼠足容积测定装置(ゥゴバジ一ル公司制)测定角叉菜胶注射3小时后大白鼠的右足容积。测定值表示经计算与给予角叉菜胶前测定的各大白鼠的右足容积的增加值。
结果如图9所示，即图9表示各化合物与足增加率的关系图，纵轴表示增加率(％)，横轴表示各化合物的给药量(mg/kg)。图中A表示4-叔丁基环戊烯酮醚给药组，B表示4，5-二叔丁基环戊烯酮醚给药组。各化合物均显示有角叉菜胶诱发足浮肿的抑制作用。
实施例1调制的其他本发明环戊烯酮衍生物也与上述化合物同样具有角叉菜胶浮肿抑制作用。
实验例4在2μl用拓扑异构酸酶II[TopoGEN公司制，2单位/μl]2μl、10倍浓度缓冲液
2μl、0.1％牛血清白蛋白(宝酒造公司制)2μl、蒸馏水11μl以及对照的蒸馏水或水与4，5-二叔丁基环戊烯酮醚调配成各种浓度的混合物中，加入1μl的0.25μg/μl pBR322 DNA(宝酒造公司制)，在37℃下反应。反应30分钟后，添加1％月桂基硫酸钠、50％甘油、0.02％溴苯基蓝水溶液2μl，停止反应。
在由琼脂糖L03(宝酒造公司制)与TAE缓冲液[40mM Tris、5M醋酸钠、1mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、用醋酸调整PH为7.8]制备的1％琼脂糖凝胶上，加入20μl上述反应液，在TAE缓冲液中进行电泳。泳动后，将凝胶浸入1μg/ml的溴化工チジゥム水溶液中，在紫外线照射下观察DNA电泳模式。另外，在添加水的对照中DNA发生从超螺旋型到迟缓型的完全变化，但如阻碍拓扑异构酶II的活性，则超螺旋型到迟缓型的变化部分或完全被阻碍。
结果表明，当4，5-二叔丁基环戊烯酮醚在反应液中的浓度达到250μM以上时表现出拓扑异构酶的阻碍活性，在250μM时残存有中等程度的超螺旋型DNA，在500μM时超螺旋型DNA占大半，在1000μM时超螺旋型DNA几乎完全不减少。另外，4，5-二叔丁基环戊烯酮醚的旋光物与实施例1配制的其他的本发明化合物及其旋光物具有相同的活性。
以上本发明化合物仅对正常细胞分裂期稍有作用，但对由于细胞癌化在细胞整个分裂周期都高度存在的拓扑异构酶II具有阻碍活性。
实施例5注射剂(1)在生理食盐水(日本药典收载品)中添加1％的4-苄基环戊烯酮醚或5-苄基环戊烯酮醚，制成注射剂。
(2)在生理食盐水(与上述相同)中分别以0.5％和0.1％的浓度添加4-苄基环戊烯酮醚或者5-苄基环戊烯酮醚和甘草酸，制成注射剂。
实施例6片剂(1)制备含有100mg的4-苄基环戊烯酮醚和适量微晶纤维素的片剂，包上糖衣，制成片剂。
(2)制备含有0.1mg的5-苄基环戊烯酮醚、10mg甘草酸二钾和适量微结晶性纤维素的片剂，包上糖衣，制成片剂。
发明的效果本发明提供了具有抗癌作用、癌细胞增殖抑制活性、细胞凋亡诱发作用等生理活性的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐以及它们的制造方法。使用本发明得到的化合物作为有效成分的药物可以维持生物体的恒常状态，是非常有用的药品。
权利要求
1.由下列通式[I]表示的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐，
式中，R1和R2是相同或不同的直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基或芳脂族基或H，但不包括R1＝R2＝H、或R1＝苄基时R2＝H的情况。
2.由通式[II]表示的环戊烯酮衍生物的制造方法，其特征是，使由下列式[III]表示的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物与相当于由下列通式[II]表示的环戊烯酮衍生物的R3和R4的醇和/或其反应性衍生物同时或依次反应，
式中，R3和R4是相同或不同的直链或支链烷基、直链或支链链烯基、芳基、芳脂族基或H，但不包括R3＝R4＝H的情况；
3.药物，其特征是，含有选自权利要求1记载的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐中的至少一种化合物作为有效成分。
4.权利要求3所述的药物，其中，所述的药物是抗癌药。
5.权利要求3所述的药物，其中，所述的药物是细胞凋亡诱发剂。
6.药物，其特征是，含有选自由权利要求2记载的方法得到的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐中的至少一种化合物作为有效成分。
7.权利要求6所述的药物，其中，所述的药物是抗癌剂。
8.权利要求6所述的药物，其中，所述的药物是细胞凋亡诱发剂。
全文摘要
由下列通式(Ⅰ)表示的环戊烯酮衍生物或其旋光物或者它们的盐,式中,R
文档编号C07C49/753GK1261342SQ98806456
公开日2000年7月26日 申请日期1998年6月5日 优先权日1997年6月30日
发明者小林英二, 小山信人, 加藤郁之进, 稻见薰, 芝哲夫 申请人:宝酒造株式会社