专利名称：含有b组脑膜炎球菌膜孔蛋白和流感嗜血菌多糖的免疫偶联物的制作方法
技术领域：
本发明的领域是可用于在动物中引起免疫反应的疫苗。具体地，本发明涉及流感嗜血菌多糖-脑膜炎球菌外膜蛋白偶联物、其药物组合物及其用途。
背景信息流感嗜血菌是小的、多型的、革兰氏阴性球杆菌。分离物可分为六种抗原上不同的荚膜类型(a-f)以及无荚膜的、无法分类的菌株。流感嗜血菌可引起脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎、会厌炎、败血性关节炎、潜伏性发热菌血症、蜂窝组织炎、肺炎和积脓；有时此微生物引起新生儿脑膜炎和败血症。其它流感嗜血菌感染包括化脓性心包炎、心内膜炎、结膜炎、骨髓炎、腹膜炎、附睾睾丸炎、舌炎、悬雍垂炎和败血性血栓性静脉炎。在引进流感嗜血菌b型(Hib)偶联物接种之前，儿童中传染性疾病的大多数病例由可引起新生儿传染性疾病的b型无荚膜微生物引起。无荚膜菌株引起上呼吸道感染，包括中耳炎、鼻窦炎和支气管炎，并且可引起肺炎。
微生物来源是人类上呼吸道。传播模式推测是人到人，通过直接接触或通过吸入含生物的呼吸道分泌物小滴传播。无荚膜菌株的无症状建群是常见的；生物可从60％-90％的儿童咽喉收集。然而b型生物的建群是不常见的(在接种前期中为2％-5％的儿童)，并且看来在用普遍的Hib偶联物接种时更不常见。传染性的确切时期未知，并且可能只要在生物存在于上呼吸道中时就有传染性。
有引进有效疫苗之前，Hib是美国和其它国家最常见的儿童细菌脑膜炎的病因。脑膜炎和其它传染性疾病在3个月到3岁年龄儿童中最常见，并且约一半病例发生在小于12个月的婴儿中。传染性b型疾病在各个国家的不同人口中的年龄特异性发病率不同；在小于12个月的婴儿中的患病比例在具最高总发病率的人群中最高，导致中间年龄的病例更低。与脑膜炎和大多数其它传染性Hib疾病相反，会厌炎在小于12个月的婴儿中极少，其在接种前期的发病率高峰是2-4岁年龄。会厌炎也可能发生在更大的、未接种的儿童和成年人中。
传染性疾病多发于男孩、非洲人-美洲人、阿拉斯加爱斯基摩人、Apache和Navajo印度人、儿童护理中心人员、在过度拥挤条件下生活的儿童和未母乳喂养的儿童中。未免疫接种的儿童，特别是那些与患传染性Hib疾病的儿童持续紧密接触(如在家属中)的4岁以下儿童处于受此生物严重侵染的更大危险之中。其它影响传染性疾病的因素包括镰刀细胞病、无脾、HIV感染、某些免疫缺陷综合症和恶性肿瘤。如果没有随后接种疫苗，患记载的传染性感染的1岁以下婴儿的重发率危险是约1％。
自1988年引进Hib偶联疫苗以来，婴儿和幼儿中传染性Hib疾病的发病率减少了95％，并且目前由其它带荚膜类型引起的传染性疾病的发病率与由b型引起的传染性疾病的发病率相似。由于取得这样的成功，美国公共健康服务中心的目标是在他们国家消除5岁以下儿童中的Hib疾病。目前在此国家中传染性Hib疾病主要发生在未接种疫苗的儿童中以及年龄太小以至不能完成主要接种系列的婴儿中。
四种Hib偶联疫苗已在美国得到许可证。这些疫苗由直接或通过居间间隔分子与载体蛋白共价连接的Hib荚膜多糖(即磷酸聚核糖基核糖醇(PRP)或PRP寡聚体)组成。针对在组成和免疫原性方面不同并且因此它们的推荐用途不同的PRP偶联疫苗产生保护性抗体。例如，推荐PRP-D仅用于12个月和更大的儿童，而其它三种疫苗HbOC、PRP-T和PRP-OMP推荐用于2个月年龄开始的婴儿。
佐剂是增强对抗原免疫反应的物质，因此已用于很多疫苗和疫苗候选物。佐剂的免疫刺激效应不是抗原特异的，因为它们增强针对很多不同类型抗原的免疫反应。目前FDA同意用于人类的唯一佐剂是铝盐，但很多用于动物接种和更新的疫苗侯选物的佐剂是微生物来源的(61)，例如弗氏佐剂、小棒杆菌(Corynebacterium parvum)、胞壁酰二肽、破伤风类毒素。微生物物质免疫增强能力的机制未知。
已对病原奈氏球菌(脑膜炎奈氏球菌和淋病奈氏球菌)的主要外膜蛋白的佐剂可能性(36，37，39，40，60)和其免疫增强能力背后的机制进行研究。目的蛋白是来自淋病球菌的蛋白IA(PIA)和蛋白IB(PIB)以及来自脑膜炎球菌的1、2或3类蛋白(分别为C1、C2和C3)(4)。它们都作用为膜孔蛋白(41，43，62)，互相之间具有显著的氨基酸序列同源性，并且被认为是革兰氏阴性膜孔蛋白超家族的成员(26)。
已证明与疟疾肽单独用作免疫原或与其它蛋白共价连接相比，奈氏球菌膜孔蛋白与疟疾肽非共价结合时增强对这些肽的抗体反应(39，40)。另外，已证明与只有肽免疫小鼠时相比，来自A组链球菌(38)、流感病毒血凝集素(38)或Trypanosome bruceii(40)的肽掺入含淋病球菌膜孔蛋白的复合物时在小鼠中具有更大免疫原性。主要由2类蛋白组成的脑膜炎球菌外膜囊泡(OMV)用作增强针对在最近获得许可证的由Meck开发的流感嗜血菌b型疫苗中的流感嗜血菌多糖荚膜的免疫反应的载体(10)。而且，Livingston已开发了纯化的奈氏球菌膜孔蛋白用作抗黑素瘤疫苗中的佐剂。与正常黑素细胞相比，黑素瘤细胞在其表面表达高得多水平的人神经节苷脂GM2或GD3。为增强对GM2和GD3的免疫反应并且有可能诱导黑素瘤病人中的肿瘤免疫，将GM2和GD3与纯化的奈氏球菌膜孔蛋白非共价结合并用这些疫苗构建体免疫患恶性黑素瘤的志愿者。与只用这些神经节苷脂或与BCG结合免疫病人相比，在用膜孔蛋白/GM2或膜孔蛋白/GD3复合物免疫的病人中的抗GM2或抗GD3抗体反应大大增强(36，37)。另外，用膜孔蛋白/GM2免疫的病人中的肿瘤负担显著降低(个人通信，P.livingston)。
奈氏球菌膜孔蛋白作用为佐剂的机制未知。开发了嗜血菌多糖荚膜-脑膜炎球菌OMV偶联疫苗的Merch组(10，35，36)认为这可能是由于2类蛋白介导T细胞刺激作用。它们起初证明2类蛋白可以直接刺激T淋巴细胞，并且因此他们将2类蛋白重新命名为脑膜炎球菌免疫增强蛋白(MIEP)(35)。然而，后来证明只有高浓度(＞50μg)变性2类蛋白可刺激T细胞，而天然蛋白没有这样的效应(56)。而且，既然大多数奈氏球菌膜孔蛋白用作疫苗侯选物或佐剂时是以其天然构型，那么变性膜孔蛋白对T细胞的非特异性刺激解释它们免疫增加能力的可能性很低。
最近几年，关于抗原识别、淋巴细胞刺激和抗体合成所需的T和B淋巴细胞之间的相互作用的细节已得到详细阐述。在目前T淋巴细胞刺激作用模型中，已表明抗原呈递细胞(APC)和T淋巴细胞之间的二套信号是必需的(24，25，51)。第一套信号(信号1)通过抗原呈递细胞(如B淋巴细胞、树枝状细胞、巨噬细胞等)上的主要组织相容性(MHC)复合物和T淋巴细胞上的T细胞受体之间的相互作用传递。MHC复合物上的沟通常由来自已加工抗原(T细胞表位)的寡肽占据。反应的特异性由信号1赋予。第二套或共刺激信号(信号2)由B和T淋巴细胞之间相互作用过程中两套反受体的结合传递(
图1)。然后活化的T淋巴细胞释放细胞因子，细胞因子继而刺激效应细胞；例如使B淋巴细胞变成抗体生成细胞。已证明这些反受体的相互作用诱导共刺激在肿瘤免疫(1，3，8，11，51，55)、耐受性预防(19，45，54)以及细胞毒性淋巴细胞活性(1)方面是重要的。
T淋巴细胞反受体是CD28和CTLA-4。它们都是免疫球蛋白超家族的成员(9)。CD28存在于静止和活化的T细胞上(1，8，27，30，32，34，46)，而CTLA-4仅在活化的T细胞上表达(17，23，31，33，51)。活化T细胞上CD28的表达比CTLA-4高达20倍，但CD28与其B细胞反受体的亲和性低得多(31，33)。B淋巴细胞反受体是B7(14，20，32，48，49)以及最近发现的B7-2(2，12，13，16，24)。B7和B7-2是免疫球蛋白超家族的成员(13-15)，并且只存在于活化的B淋巴细胞上(14)。几条证据证明新配体B7-2与T淋巴细胞共刺激作用的关系(1)CTLA-4与活化的B细胞的结合仅部分地受抗B7单克隆抗体(mAb)抑制(24)，(2)源自B7表达缺陷小鼠的淋巴细胞仍可共刺激T细胞(12，13)，(3)只表达B7-2的转染子可以共刺激T细胞(13，16)，以及(4)B7-2特异的mAb可以抑制B细胞(24)或B7-2转染子(B)的T淋巴细胞共刺激作用。最初描述的B7抗原作为共刺激作用反受体的重要性是有争议的，因为B7-2的表达比B7的表达更早出现，并且活化的B淋巴细胞表面上呈递的B7-2比B7多(24)。T淋巴细胞共刺激作用和共刺激作用反受体的示意性说明在图1表示。
由各个研究者提供的初步证明是微生物产品可以刺激B淋巴细胞。Lin等已证明脂多糖(LPS)、促有丝分裂流感病毒和模拟病毒感染的抗原(多聚肌苷酸-多聚胞苷酸)都刺激B淋巴细胞，B淋巴细胞继而共刺激T淋巴细胞(25)。Vordermeier已证明纯化的鼠伤寒沙门氏菌膜孔蛋白(不含LPS)是有效的B细胞刺激剂，但对T淋巴细胞具有最低的效应(57，58)。另外，脑膜炎球菌外膜制品主要由作用为B细胞促细胞分裂原的脑膜炎球菌膜孔蛋白组成，并且不刺激T淋巴细胞(44，52，53)。这一证据证明奈氏球菌膜孔蛋白以及可能地其它革兰氏阴性膜孔蛋白可能能够刺激B淋巴细胞并增强B7-2表达。增强的B7-2表达可以介导T淋巴细胞共刺激作用，这可能是这些膜孔蛋白增强对其它抗原，例如此处所述的PRP多糖的免疫反应的机制。
发明概述本发明涉及流感嗜血菌b型(Hib)多糖-基本上纯的、重折叠的脑膜炎球菌外膜蛋白(rPorB)偶联物。
本发明也涉及制备Hib多糖-rPorB偶联物的方法，包括(a)得到Hib多糖；(b)氧化或水解所述多糖以产生醛基；(c)得到rPorB；并且(d)通过还原氨基化使含有醛基的多糖与rPorB结合。
本发明也涉及根据本发明得到的偶联物。选择性地，本发明的偶联物可以与DTaP(白喉、破伤风、无细胞百日咳疫苗)结合。
本发明也涉及含有本发明偶联物、选择性地包含DTaP和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明也涉及一种在动物中诱导针对流感嗜血菌的免疫反应的方法，包括将本发明的偶联物以有效量施用给动物以诱导所述免疫反应。
本发明部分涉及令人惊奇的发现，即与使用破伤风类毒素和重组合成的流感嗜血菌外膜P2蛋白作为抗原蛋白相比，本发明的Hib-rPorB偶联物在动物中诱导强得多的免疫反应。也可以获得与可从LederleLaboratories，Division of American Cyanamide Company，Pearl River，NY商业购买的Hib-CRM偶联物相比更强得多的免疫反应。CRM197是从白喉棒杆菌(Cornebacterium diphtheriae)C7培养物分离的白喉毒素的突变的、无毒性的变体(β197)。Seid，R.C.Jr等，Glycoconj.J.6489-498(1989)。
而且，本发明的偶联物尤其在也包含DTaP的组合物中有用，因为用传统载体蛋白如破伤风类毒素观察到成分间的免疫学相互作用以及表位抑制。本发明的偶联物克服了这一复合疫苗组合物中的严重限制因素。
附图简述图1表示T淋巴细胞共刺激作用的图示。
图2描绘了表示B1HB1030发酵模式的图。
图3表示用于偶联的纯化rPorB的染色SDS-PAGE胶。
图4描绘了表示对于带有各种载体蛋白的Hib偶联物，大鼠中Hib多糖特异的IgG反应的柱形图。
图5A-5H描绘了表示通过ELISA测量的用Hib-TT、Hib-rPorB和Hib-rP2免疫的spragne Dawley大鼠的血清抗体的表。
图6A和6B描绘了表示对于带有不同载体蛋白的Hib偶联疫苗，大鼠中PRP特异的ELISA IgG反应的数据。两个不同Hib-rPorB制品得到测试(-1和-2)。图6A是图6B中所示表格数据的图示。
图7描绘了表示由Hib偶联疫苗在CD-1小鼠中引发的多糖特异IgG的图。
图8描绘了表示由Hib偶联疫苗在大鼠中引发的多糖特异IgG的图。
发明详述本发明涉及在动物中诱导免疫反应的疫苗，包含与Hib多糖连接的脑膜炎球菌B组膜孔蛋白以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中疫苗可以有效量施用以在动物中诱导对流感嗜血菌的免疫反应。在优选实施方案中，动物是哺乳动物，选自人、牛、猪、绵羊和鸡。在另一优选实施方案中，哺乳动物是人。
术语“rPorB”是指成熟的、重折叠的脑膜炎奈氏球菌2类或3类外膜蛋白及其包含T7基因φ10衣壳蛋白的氨基酸1-20或1-22的融合体。成熟的2类和3类rPorB及其融合体的高水平表达、重折叠和纯化的方法描述于(47)和美国专利No.5,439,808中，其公开内容在此引用作为参考。重组膜孔蛋白以高水平从大肠杆菌表达(根据美国专利No.5,439,808或从酵母表达(根据08/792,302)。在优选实施方案中，从已用编码rPorB的基因转化的宿主BL21(DE3)ΔompA表达的3类rPorB是基本上纯的并且根据美国专利No.5,439,8-3重新折叠。
流感嗜血菌荚膜多糖可以按照本领域普通技术人员熟知的方法分离。参见Schneerson等，实验医学杂志152361-376(1980)；Marburg等，J.Am.Chem.Soc.1085282(1986)；Jennings等，免疫学杂志1271011-1018(1981)和Beuvery等，Infect.Immunol.4039-45(1983)。在优选实施方案中，对生物进行培养，对培养物上清进行微量过滤，并且使滤液通过300,000分子量截除滤膜。然后例如用100,000分子量截除滤膜使透过液浓缩。然后用温和的氧化剂如间高碘酸盐将此100,000-300,000分子量物质氧化，产物通过30,000分子量膜过滤，然后用5,000分子量滤膜浓缩以得到可直接用于偶联的带醛基的多糖。优选的多糖具有约5,000-50,000的分子量。更优选的多糖具有10,000-50,000的分子量，然而，如果需要，可以使用其它分子量范围。
本领域技术人员将理解疫苗的荚膜多糖-蛋白载体偶联物可以用几种不同方法制备。使多糖与蛋白载体偶联的共价键类型以及制备它们的方法为本领域技术人员熟知。关于可以将两部分连接起来的化学方法的细节可见于美国专利No.5,623,057、5,371,197、5,192,540、4,902,506和4,356,170，其内容在此全面引用作为参考。综述见微生物学和免疫学贡献，第10卷，偶联疫苗，卷编辑J.M.Curse和R.E.lewis，Jr.，1989和(29)。一个这样的方法是Schwartz和Gray[Arch、Biochim、Biophys.181542-549(1977)]中描述的还原氨基化方法。此方法涉及制备以带有还原末端基团形式的多糖，并使荚膜多糖与rPorB在氰氢硼化物离子或另一还原剂存在的情况下反应。还原基团可以通过选择性地水解或特定的氧化切割或结合两者形成。
本发明的疫苗包含取决于给药途径的有效量的Hib-rPor偶联物。尽管皮下或肌肉给药途径是优选的，本发明的脑膜炎球菌B组膜孔蛋白、融合蛋白或疫苗也可以通过腹膜内、静脉内或鼻内途径给药。本领域技术人员将理解对于任何具体治疗方案，给药量可不经过过多实验容易地得到确定。预测适当的量在每动物5-50μg范围内，更优选地每动物约10μg。
本发明的疫苗可以象胶囊、液体溶液、悬浮液或用于口服的酏剂这样的形式或无菌液体形式如溶液或悬浮液形式使用。优选地使用任何惰性载体如生理盐水、磷酸缓冲盐水或者其中偶联疫苗有适当溶解性的任何这样的载体。疫苗可以单剂量制品形式或在可用于大量接种疫苗计划的多剂量瓶中。制备和使用疫苗的方法参照雷明顿药物科学，MackPublishing Co.，Easton，PA，Osol(编缉)(1980)；疫苗新趋势和发展，Voller等(编缉)，University Park Press，Baltimore，MD(1978)。
本发明疫苗可进一步包含增加流感嗜血菌特异抗体合成的佐剂。这样的佐剂包括但不限于各种油制剂如弗氏完全佐剂(CFA)、硬脂酰酪氨酸(ST，见美国专利No.4,258,029)，称作MDP的二肽、皂苷、氢氧化铝和淋巴细胞因子。
弗氏佐剂是与免疫原性物质混合的矿物油和水的乳剂。尽管弗氏佐剂是有效的，但是通常不将它施用给人类。替代地，佐剂alum(氢氧化铝)或ST可用于施用给人类。偶联疫苗可吸附到氢氧化铝上，在注射后从其上缓慢释放。根据Fullerton，美国专利No.4,235,877，偶联疫苗也可以包裹在脂质体内。
在另一优选实施方案中，将本发明的偶联物与用于接种动物的其它免疫原结合。因此，本发明的偶联物可与用于施用给动物的DTaP或DTaP IPV结合。DTaP是白喉、破伤风和无细胞百日咳组合疫苗，可从Amvax，Inc，Beltsville，Maryland得到。在优选实施方案中，无细胞百日咳是可从Amvax，Inc得到的氧化形式。
在另一优选实施方案中，本发明涉及一种在动物中诱导针对流感嗜血菌的免疫反应的方法，包括将本发明的疫苗以有效量施用给动物以诱导免疫反应。选择性地，本发明的疫苗可与有效量的上述其它免疫原一起施用以在动物中产生多个免疫反应。
下面实施例是举例说明但不是限制本发明的方法和组合物。本领域常见的条件和参数变化的其它适当修饰和调整在本发明的精神和范围之内，这一点对本领域技术人员来说是明显的。实施例实施例1 rPorB表达、分离、重折叠和纯化细菌菌株、生长条件和试剂使用标准技术从B组脑膜炎奈氏球菌44/76(血清型15)分离基因组DNA并将其用作聚合酶链式反应的模板以扩增如别处所述的3类蛋白基因(47)。将扩增产物克隆入用于转化感受态大肠杆菌DH5α的pET17b质粒(Novagen，Inc)的Nde I和XhoI位点。从所选的DH5α克隆分离质粒DNA并将其用于转化大肠杆菌BL21[DE3]-ΔompA。用羧苄青霉素选择转化子并通过加入IPIG至0.4mm终浓度来诱导表达。
rPorB在大肠杆菌中的过量表达和重折叠过程诱导后在不同时间表达的rPorB蛋白水平通过使用Novex系统(Novex，San Diego，CA)在8-16％梯度胶中对细胞抽提物进行SDS-PAGE，接着进行拷马斯亮蓝染色和使用IS-1000型数字成像系统(Alpha Innotech Co.，SanLeandro，CA)的光密度分析来监测。过量表达的rPorB通过使用Stansted空气驱动细胞破碎仪(Stansted Fluid Power Ltd.)在TEN缓冲液(50mmTris-HCl，1mm EDTA，100mm NaCl，pH8.0)中重新悬浮和裂解细菌细胞，接着离心并分离含有以包涵体(IB)形式积累的rPorB的沉淀来分离。用TEN缓冲液中的0.5％脱氧胆酸盐洗沉淀之后，再用TEN缓冲液洗两次，通过使用水浴超声波仪在新鲜制备的8M尿素溶液中重新悬浮并超声处理IB使蛋白溶解。通过使用去污剂辅助的重折叠方法实现rPorB重折叠成其天然构象。将等体积的尿素溶解的IB和10％Z 3-14(Calbiochem)混合并将最后的膜孔蛋白提取物上样到在由100mmTris-HCl，20mm NaCl，10mm EDTA，20mm CaCl2和0.05％Z 3-14，pH8.0组成的缓冲液中平衡的Sephacryl S-300(5×100cm)柱(PharmaciaBiotech Inc.)上。含有rPorB的组分通过SDS-PAGE鉴定、汇集并上样到在25mm Tris-HCl，200mm NaCl，1.0mm EDTA和0.05％Z 3-14，pH8.0中平衡的Hiload Q-Sepharose HP离子交换(2.6×20cm)柱(Pharmacia)柱上。采用0.2-10mm NaCl梯度并以单峰洗脱rPorB。通过使用装有二级管阵列检测仪的HP Model 8453紫外/可见光快速扫描分光光度计(Hewlett-Packard Company，Palo Alto，CA)测定280nM处的吸收，使用根据Mach等(42)基于PorB芳香族氨基族含量计算的41,960摩尔消光系数评估蛋白浓度。实施例2 PRP多糖合成、纯化和氧化。
使用MAE II培养基如下进行B型流感嗜血菌的14升发酵。从超低液氮冷冻室的4mL接种培养瓶中得到流感嗜血菌B型菌株Eagan并在室温下解冻30分钟。用1mL接种培养物接种装有50ml MMEII培养基(100mg/L氯高铁血红素)的250ml摇瓶培养瓶以制备种菌I(SI)。SI培养瓶在摇床培养箱(Innova 4330，New Brunswik Sci)中于37℃和150RPM培养10小时。使用12mL SI接种2.8L Fernbach培养瓶中的600ml MMEII(100mg/L氯高铁血红素)以制备SII。SII培养瓶在摇床培养箱中于37℃和150RM培养9小时。使用600mL[4％(体积/体积)种菌]SII培养物接种20L BIOFLO IV发酵罐(New Brunswick Sc.)中的13.4L MMEII(10g/L木糖，10mg/L氯高铁血红素)。发酵模式的例子在图2中表示。发酵10小时后，使用具有0.2μm孔径、0.14m2表面积等级由聚砜制成的中空纤维筒(Milipore)通过微量过滤开始收集。将透过液无菌过滤到20L大玻璃瓶中并将大玻璃瓶放在2-8℃直至进一步处理。然后使滤液通过300,000分子量截除(NWCO)滤膜(Milipore)并保留透过液。然后将此透过液上样到100,000(MWCO)滤膜(Milipore)上并使之浓缩至20mg/ml以上。用间高磺酸钠于50℃氧化存留物2小时。使氧化的PRP通过30,000 MWCO滤膜(Milipore)超滤并保留透过液。然后将此透过液上样到5,000 MWCO滤膜(Milipore)上，浓缩至大于90mg/ml的浓度，逆着DI水渗滤并冷冻干燥。实施例3 PRP-PorB偶联物制备用于偶联的纯化的rPorB在图3中表示。将前述的氧化PRP多糖加入rPorB溶液(在pH8.5的0.25M HEPES，0.2M NaCl和0.05％Zwitlergen 3，14中10mg/ml浓度)以制备10mg/ml多糖溶液。将溶液混合1分钟，之后加入氰氢硼化钠至6mg/ml终浓度。然后将溶液在28-30℃水浴中放置16-24小时。通过加入pH8.5的2M乙醇胺溶液并于28-30℃再温育16-24小时来停止偶联反应。然后将反应混合物上样到用含有0.01％硫柳汞的PBS预平衡和走电泳的Superdex 200制备级柱上。将通过280nm紫外吸收监测的、此柱排出体积中洗脱的组分收集、合并，并在它们的分析之前贮存于4℃。进行两种化学分析以评估PRP含量[5-甲基间苯二酚/氯化铁/盐酸分析(50)]和rPorB含量[拷马斯蛋白分析(5)]。实施例4 PRP-rPorB偶联物在大鼠中的评估在第0、28和49天用未吸附或预吸附在氢氧化铝(Alhydrogel，Superfos，Denmark)(元素铝终浓度1mg/ml)上的、0.5ml含0.01％硫柳汞PBS中的10μg偶联PRP皮下注射10只一组的雌性Sprague-Dawley大鼠(4-6周大)。在第0，28，38，49天取血，并在第59天对动物放血。
ELISA血清抗体测量通过前述还原氨基化制备用于ELISA的人血清白蛋白(HAS)(Sigma，St.Louis，MO)偶联物。将氧化PRP多糖加入HAS，接着按描述的(28)用NaBH3CN还原。通过凝胶过滤层析分离偶联物并将其冷冻干燥贮存于-70℃。通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测定PRP特异抗体的效价。用PBS(0.01磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.4)中的PRP-HAS偶联物以0.25μg/孔(100μl/孔)通过于27℃温育一小时来涂覆96孔聚苯乙烯平底微量滴定板(NONC Polysorb)(Nunc，Naperville，IL)，接着进行PBS-Tween[PBS中0.05％(体积/体积)Tween20]洗涤(5次)。所有随后的温育在室温进行。PBS用于所有所需的洗涤。然后用PBS和0.1％(重量/体积)IgM ELISA用无脂干奶粉以0.15ml/孔阻断涂覆的滴定板1小时，然后洗涤。将血清一式两份以100μl/孔在平板中稀释2倍并温育1小时，然后洗涤。以100μl/孔加入抗体偶联物[过氧化物酶标记的羊抗免(Kirkegaard & Perry Lab，Gaithersburg，MD]并温育30分钟，然后洗涤。以0.05ml/孔加入1∶1染料和底物溶液(kirkegaard & Perry TMB和过氧化物)并温育10分钟。然后用1MH3PO4以0.05ml/孔中止过氧化物酶反应，并使用650nm为参考波长，以450nm波长在Molecular Device Emax微量滴定板读出器(MolecularDevice，Menlo Park)上对滴定板读数，在几个无血清对照加样孔中测定背景吸收并计算每个加样孔的平均值。对于每个血清稀释液，减去平均背景吸收，然后平均重复实验的血清吸收值。使用改进的Scatchard曲线图进行随后的数据分析，其中相对于吸收时间的倒数稀释度(X轴)标绘吸光度(y轴)(18，22)。在使之平衡和抗体过量的条件下，对每一血清稀释系列得到直线；将此线外推到X轴以确定抗体效价。在每个滴定板上使用已事先测定抗体效价的正对照血清以提供使所有血清标准化的参照，使滴定板与滴定板和天与天之间的差异达到最小。在图4和5A-5H中表示了比较PorB-PRP偶联物(有和无alum)与由破伤风类毒素CRM制备的偶联物的这些分析的结果。实施例5 Hib-rPorB、Hib-TT和两种商业购买Hib疫苗的比较对Hib-rPorB偶联物(Hib-rPorB-1和Hib-rPorB-2)、Hib-TT(破伤风类毒素)偶联物以及两种商业购买疫苗即来自Lederle Laboratories，Division of American Cyanamide Company，Pearl River，NY的HbOC(CRM载体)和来自Connanght Laboratories，Inc.，Swiftwater，PA的PRP-T(破伤风类毒素载体)的免疫刺激效应进行比较。
在1、28天和49天用10μg偶联的PRP剂量免疫大鼠(4-6周大)。除了接种前样品，在28、38、49和59天取血清样品。结果在图6A和6B中表示。ELISA IgG效价参考抗多糖抗体。
图6A中的数据图示表明Hib-rPorB偶联物产生比其它偶联疫苗至少高两个数量级的反应。B表示相应的表格数据。“反应者”定义为表现比免疫前高4倍或更高的IgG ELISA效价，其中所有免疫前数值是＜50并将其调整为25进行计算。使用5.0μg和0.5μg偶联物量在小鼠中进行比较Hib-TT、Hib-rPorB-1和Hib-rPorB-2的相似实验。数据在图7中表示。
最后，将Hib-rPorB的8个不同制剂(图8中的A-H)与Hib-TT和Hib-CRM偶联物比较。正如大鼠中抗多糖IgG抗体的ELISA分析所表明的，Hib-rPorB制剂一直比Hib-TT或Hib-CRM偶联物的刺激作用高2个数量级。此数据在图8中表示。
现已充分描述了本发明，但本领域普通技术人员将理解。本发明可以在条件、配方和其它参数的广泛和等效范围内实施，而不影响本发明的范围或其任何实施方案。在此充分地全面引入此处引用的所有专利、专利申请和公开文献作为本文的参考。
参考文献1.Azuma，M.，M.Cayabyab，D.Buck，J.H.Phillips和L.L.Lanier，1992，CD28与B7相互作用共刺激由小的、静止T淋巴细胞介导的初级同种异型增殖反应和细胞毒性，实验医学杂志175353-360。
2.Azuma，M.，D.Ito，H.Yagita等，1993，B70抗原CTLA-4和CD28的第二个抗体，自然36676-79。
3.Baskar，S.，S.Ostrand-Rosenberg，N.Nabavi，L.M.Nadler，G.J.Freeman和L.H.Glimcher，1993，BT的组成性表达恢复表达截短的主要组织相容性复合物II类分子的肿瘤细胞的免疫原性，美国国家科学院院报905687-5690。
4.Blake，M.S.和E.C.Gotschlich，1986，病原奈氏球菌表面蛋白的功能和免疫学特性，第377-400页，于M.Inouye，细菌外膜作为模型系统，John Wiley，New York。
5.Bradford，M.M.，1976，利用蛋白染料结合原理定量测定毫克量蛋白的迅速而敏感的方法，分析生物化学72248-254。
6.Butcher，S.，M.Sarvas和K.Runeberg-Nyman，1991，脑膜炎奈氏球菌的3类膜孔蛋白基因的克隆和结构，基因105125-128。
7.Carbonetti，N.H.和P.F.Sparling，1987，蛋白I，淋病奈氏球菌的主要外膜蛋白结构基因的分子克隆和特征分析，美国国家科学院院报849084-9088。
8.Chen，L.，S.Ashe，W.A.Brady等，1992，T淋巴细胞分子CD28和CTLA-4的B7反受体共刺激抗肿瘤免疫性，细胞711093-1102。
9.Connell，T.D.，D.Shaffer和J.G.Cannon，1990，淋病奈氏球菌蛋白II(opa)基因家族中高变区的所有组成成分的特征分析，分子微生物学4439-449。
10.Donelly，J.J.，R.R.Deck和M.A.Liu，1990，流感嗜血菌多糖-脑膜炎奈氏球菌外膜蛋白复合偶联疫苗的免疫原性，免疫学杂志1453071-3097。
11.Falkow，S.，1997，病原体是什么？ASM News 63359-365。
12.Freeman，G.J.，F.Borriello，R.J.Hodes等，1993，揭示B7缺陷型小鼠中功能选择性CTLA-4反受体，科学262907-909。
13.Freeman，G.J.，F.Borriel.R.J.Hodes等，1993，鼠B7-2，共刺激T细胞增殖和白细胞介素2合成的选择性CTLA-4反受体，实验医学杂志1782185-2192。
14.Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman和L.M.Nadler，1989，在活化和致瘤B细胞上独特表达的Ig超家族新成员B7，免疫学杂志1432714-2722。
15.Freeman，G.J.，G.S.Gray，C.D.Gimmi等，1991，人B淋巴细胞活化抗原B7的鼠同系物的结构、表达和T细胞共刺激活性，实验医学杂志174625-631。
16.Freeman，G.J.，J.G.Gribben，V.A.Boussiotis等，1993，B7-2的克隆共刺激人T细胞增殖的CTLA-4反受体，科学262909-911。
17.Freeman，G.J.，D.B.Lombrad，C.D.Gimmi等，1992，活化后在大多数T细胞中共表达的CTLA-4和CD28 mRNACTLA-4和CD28 mRNA的表达与淋巴因子合成不相关，免疫学杂志1493795-3801。
18.Fusco，P.C.，1983，对大肠杆菌菌毛的研究表型表达、血清型特异性和物理化学特征分析，博士论文，University of Pittsburgh，Pittsburgh，PA。
19.Gimmi，C.D.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，G.Gray和L.M.Nadler，1993，缺乏B7共刺激时由抗原呈递诱导的人T细胞克隆无反应性，美国国家科学院院报906586-6590。
20.Gimmi.C.D.，G.J.Freeman，J.G.Gribben等，1991，B细胞表面抗原B7提供诱导T细胞增殖和分泌细胞介素2的共刺激信号，美国国家科学院院报886575-6579。
21.Gotschlich，E.C.，M.E.Seiff，M.S.Blake和J.M.Koomey，1987，淋病奈氏球菌的膜孔蛋白克隆和基因结构，美国国家科学院院报848135-8139。
22.Hanson，M.S.和C.C.Brinton，Jr.，1988，大肠杆菌I型菌毛尖粘附蛋白的鉴定和特征分析，自然332265-268。
23.Harper，K.，C.Balzano.E.Rouvier，M.G.Mattei，M.F.Luciani和P.Golstein，1991，CTLA-4和C28活化的淋巴细胞分子在小鼠和人中的序列、信使表达、基因结构和染色体定位方面紧密相关，免疫学杂志1471037-1044。
24.Hathcock，K.S.，G.Laszlo.H.B.Dickter，J.Bradshaw，P.S.Linsley和R.J.Hodes，1993，共刺激T细胞活化的选择性CTLA-4配体的鉴定，科学262905-907。
25.Janeway，C.A.，Jr.和K.Bottomly，1994，淋巴细胞反应的信号和症状，细胞76375-285。
26.Jeanteur，D.，J.H.Lakely和F.Pattus，1991，细菌膜孔蛋白超家族序列比较和结构预测，分子微生物学52153-2164。
27.Jenkins，M.K.和J.G.Johnson，1993，参与T细胞共刺激的分子，Curr.Opin.Immunol.5361-367。
28.Jennings，H.J.，A.Gamian，F.Michon和F.E.Ashton，1989，包含B组脑膜炎奈氏球菌和大肠杆菌K1细胞表面上的同型唾液多糖荚膜的独特分子间杀细菌表位，免疫学杂志1423585-3591。
29.Jennigns.H.J.和R.K.Sood，1994，作为人疫苗的合成糖偶联物，第325-371页，于Y.C.Lee和R.T.Lee，新糖偶联物制备和应用，Academic Press，New York。
30.June，C.H.，J.A.Bluestone，L.M.Nadler和C.B.Thompson，1994，B7和CD28受体家族，Immunol.Today 15321-331。
31.Lindsten，T.，K.P.Lee，E.S.Harris等，1993，CTLA-4结构的特征分析和人T细胞上的表达，免疫学杂志1513489-2499。
32.Linsley，P.S.，W.Brady，L.Grosmaire，A.Arufo，N.K.Damle和J.A.Ledbetter，1991，B细胞活化抗原B7与CD28的结合共刺激T细胞增殖和白细胞介素2的mRNA积累，实验医学杂志173721-730。
33.Linsley.P.S.，W.Brady，M.Urnes，L.S.Grosmaire，N.K.Damle和J.A.Ledbetter，1991，CTLA-4是B细胞活化抗原的第二个受体，实验医学杂志174561-569。
34.Linsley，P.S.，E.A.Clark和J.A.Ledbetter，1990，T细胞抗原CD28通过与活化抗原B7/BB-1的相互作用介导与B细胞的粘着，美国国家科学院院报875031-5035。
35.Liu，M.A.，A.Friedman，A.I.Oliff等，1992，具有促淋巴细胞有丝分裂活性、源自脑膜炎奈氏球菌的疫苗载体，美国国家科学院院报894633-4637。
36.Livingston.P.O.，1993，增强针对黑素瘤神经节苷脂疫苗的IgG抗体反应的方法，Ann.N.Y.Acad.Sci.690204-213。
37.Livingston，P.O.，M.J.Calves，F.Helling.W.D.Zollinger，M.S.Blake和G.H.Lowell，1993，GD3/蛋白体疫苗诱导针对神经节苷脂GD3的持续IgM抗体，疫苗111199-1204。
38.Lowell，G.H.，1990，改进肽和蛋白疫苗呈递的蛋白体、疏水性锚、iscoms和脂质体，第141-160页，于G.C.Woodrow和M.M.Levine，New generation Vaccines.Marcel Dekker，Inc.，New York。
39.Lowell，G.H.，W.R.Ballou，L.F.Smith，R.A.Wirtz，W.D.Zollinger和W.T.Hockmeyer，1988，蛋白体-脂肽疫苗疟疾CS肽免疫原性的增强，科学240800-802。
40.Lowell，G.H.，L.F.Smith，R.C.Seid和W.D.Zollinger，1988，通过疏水性足与蛋白体结合的肽在无佐剂的情况下变成高度免疫原性，实验医学杂志167658-663。
41.Lynch.E.C.，M.S.Blake，E.C.Gotschlich和A.Mauro，1984，膜孔蛋白的研究从完整细胞的自发转移以及从淋病奈氏球菌和脑膜炎奈氏球菌的纯化蛋白的重建，生物物理学杂志45104-107。
42.Mach，H.，C.R.Middaugh和R.V.lewis，1992，天然蛋白中色氨酸和酪氨酸的消光系数平均值的统计学测定，生物化学分析20074-80。
43.Mauro，A.，M.S.Blake和P.Labarca，1988，来自淋病奈氏球菌外膜的孔蛋白诱导的脂双分子层中电导率的电压控制，美国国家科学院院报851071-1075。
44.Melancon.J.，R.A.Murgita和I.W.DeVoe.1983，脑膜炎奈氏球菌活化B淋巴细胞和分离的脑膜炎球菌表面抗原，Infect.Immun.42471-479。
45.Mueller.D.L.，M.K.Jenkins和R.H.Schwartz，1989，克隆扩充对功能性克隆失活共刺激信号途径决定T细胞抗原受体占据的结果，免疫学年鉴7445-480。
46.Norton.S.D.，L.Zuckerman，K.B.Urdahl.R.Shefner.J.Miller和M.K.Jenkins，1992，C28配体B7通过给T细胞提供共刺激信号增强IL-2合成，免疫学杂志1491556-1561。
47.Qi，H.L.，J.Y.Tai和M.S.Blake，1994，大量奈氏球菌膜孔蛋白在大肠杆菌中的表达以及蛋白重折叠成天然三聚体，Infect.Immun.622432-2439。
48.Razi-Wolf，Z.，G.J.Freeman，F.Galvin，B.Benacerraf，L.Nadler和H.Reiser，1992，腹膜渗出细胞表达的主要共刺激分子鼠B7抗原的表达和功能，美国国家科学院院报894210-4214。
49.Reiser，H.，G.J.Freeman，Z.Razi-Wolf，C.D.Gimmi，B.Benacerraf和L.M.Nadler，1992，鼠B7抗原通过T细胞/CD3复合体提供活化鼠T淋巴细胞的有效共刺激信号，美国国家科学院院报89271-275。
50.Reuter，G.和R.Schauer，1994，唾液酸的测定，第168-199页，于W.J.Lennarz和G.W.Hart，酶学方法，第230卷，糖生物学技术，Academic Press，New York。
51.Schwartz，R.H.，1992，T淋巴细胞的共刺激白细胞介素2合成和免疫治疗中CD28、CTLA-4和B7/BB1的作用，细胞711065-1068。
52.Sparkes，B.G.，1983，脑膜炎球菌抗原的免疫调节活性，加拿大微生物杂志291611-1618。
53.Sparkes，B.G.，1983，脑膜炎球菌抗原对T细胞依赖型免疫反应的双重效应，加拿大微生物杂志291619-1625。
54.Tan，P.，C.Anasetti，J.A.Hansen等，1993，通过阻断CD28与其天然配体B7/BB1的相互作用诱导人T淋巴细胞中同种异源抗原特异的反应性低下，实验医学杂志177165-173。
55.Townsend.S.E.和J.P.Allison，1993，B7转染的黑素瘤细胞直接共刺激CD8+T细胞后的肿瘤排斥，科学259368-370。
56.Ulmer，J.B.，C.J.Burke，C.Shi，A.Friedman，J.J.Donnelly和M.A.Liu，1992，脑膜炎奈氏球菌2类蛋白在血细胞中的膜孔形成和促有丝分裂活性，生物化学杂志26719266-19271。
57.Vordermeier，H.和W.G.Bessler，1987，鼠伤寒沙门菌膜孔蛋白体外多克隆活化鼠B淋巴细胞，免疫微生物学175245-251。
58.Vordermeier，H.，H.Drexler和W.G.Bessler，1987，细菌膜孔蛋白和确定的膜孔蛋白片段多克隆活化人外周血淋巴细胞，免疫学通迅15121-126。
59.Ward，M.J.，P.R.Lambden和J.E.Heckels，1992，序列分析和脑膜炎球菌3类血清型蛋白和来自病原和非病原奈氏球菌物种的其它膜孔蛋白之间的关系，FEMS Microbiol.Lett.73283-289。
60.Wetzler，L.M.，M.S.Blake，L.Barry和E.C.Gotschlich，1992，淋病球菌膜孔蛋白疫苗评估Por蛋白体、脂质体和从rmp缺失突变体分离的泡疹之间的比较，J.Infect.Dis.166551-555。
61.White，R.G.，1976，微生物产品对免疫反应的辅助效应，微生物学年鉴30579-595。
62.Young.J.D.E.，M.S.Blake，A.Mauro和Z.A.Cohn，1983，掺入模式脂膜的淋病奈氏球菌主要外膜蛋白的特性，美国国家科学院院报803831-3835。
权利要求
1.流感嗜血菌b型(Hib)多糖-基本上纯的、重折叠的脑膜炎球菌外膜蛋白(rPorB)偶联物。
2.权利要求1的偶联物，其中所述多糖具有5,000-50,000范围的分子量。
3.权利要求1的偶联物，其中所述偶联物通过Hib多糖和rPorB的还原氨基化得到，其中使Hib多糖氧化或选择性地水解以产生醛基。
4.权利要求1的偶联物，其中所述偶联物通过Hib多糖和rPorB的还原氨基化得到，其中使Hib多糖氧化以产生醛基。
5.权利要求1-4中的任意一项的方法，其中所述rPorB是3类rPorB。
6.制备Hib多糖-rPorB偶联物的方法，包括(a)得到Hib多糖；(b)氧化或水解所述多糖以产生醛基；(c)得到rPorB；并且(d)通过还原氨基化使含有醛基的多糖与rPorB结合。
7.权利要求6的方法，其中所述Hib多糖被氧化并具有5,000-50,000范围的分子量。
8.权利要求6-7中的任意一项的方法，其中所述rPorB是3类rPorB。
9.按照权利要求6的方法得到的偶联物。
10.按照权利要求8的方法得到的偶联物。
11.一种药物组合物，包含权利要求1或9的偶联物以及药学上可接受的载体。
12.一种药物组合物，包含权利要求10的偶联物以及药学上可接受的载体。
13.一种在动物中诱导针对流感嗜血菌的免疫反应的方法，包括将权利要求1或9的偶联物以有效量施用给动物以诱导所述免疫反应。
14.一种在动物中诱导针对流感嗜血菌的免疫反应的方法，包括将权利要求10的偶联物以有效量施用给动物以诱导所述免疫反应。
15.权利要求13的偶联物，其中所述偶联物通过Hib多糖和rPorB的还原氨基化得到，其中使Hib多糖氧化以产生醛基。
16.权利要求14的偶联物，其中所述偶联物通过Hib多糖和rPorB的还原氨基化得到，其中使Hib多糖氧化以产生醛基。
17.权利要求13的方法，其中所述多糖具有5,000-50,000范围的分子量。
18.权利要求14的方法，其中所述多糖具有5,000-50,000范围的分子量。
19.权利要求13的方法，其中所述rPorB是3类rPorB。
全文摘要
本发明公开了流感嗜血菌b型多糖－脑膜炎球菌外膜蛋白偶联物、其药物组合物以及其在动物中诱导对流感嗜血菌的免疫反应的用途。
文档编号C07K14/195GK1272062SQ98808847
公开日2000年11月1日 申请日期1998年7月17日 优先权日1997年7月17日
发明者M·S·布拉克, F·密乔恩, P·C·福斯科, I·赫罗恩 申请人:北美疫苗公司