专利名称：从东北红豆杉中提取紫杉酚的方法
技术领域：
本发明涉及本发明总体上涉及药物和来源于植物的药物产品，具体地涉及从植物东北红豆杉叶中提取紫杉酚(TAXOL)的方法。
2．现有技术的描述TAXOL(紫杉酚)是一类称之为taxane的药物。这种类型的药物促进微管蛋白的聚合并稳定胞内微管的结构。该过程具有抑制细胞间期和有丝分裂功能必需的微管的正常动态识别的作用。紫杉酚还可以加强辐射的细胞毒作用。
紫杉酚的药物动力学根据输注剂量和持续时间变化非常大。注射后，紫杉酚的血浆浓度以双相模式衰减。从135mg／mL到175mg／mL的24-小时增量输注使Cmax增加87％，而血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)保持恒定。3小时的增量输注使Cmax增加68％，AUC增加89％。对于紫杉酚的24小时输注，稳态平均表观分布体积的范围为227-688L／m2，显示出广泛的血管外分布或组织结合。体外研究表明有89％-98％的紫杉酚与人血清蛋白结合。紫杉酚在人体内可以被肝代谢。研究证明大量经非肾脏清除。紫杉酚在肾或肝功能不良患者体内的沉积还未曾得到确定。
在两项接受剂量135mg／mL或175mg／mL紫杉酚治疗的卵巢癌患者的研究中，反应率分别为22％和30％，92位患者中6位有完全反应，18位有部分反应。反应持续时间分别为7．2和7．5个月，存活率中值分别为8．1和15．9个月。471位接受剂量为135mg／mL或175mg／mL紫杉酚持续达3小时输注治疗的乳腺癌患者的Ⅲ期研究表明，总反应率为26％，其中17位有完全反应，99位有部分反应。反应持续时间的中值为3．5个月，存活时间的中值为11．7个月。
TAXOL不能用于对聚氧乙烯化蓖麻油(Cremaphor EL)或TAXOL超敏的患者。患者应当预先用皮质类固醇激素(例如，地塞米松和苯海拉明)和H2-受体拮抗剂(甲氰咪胍或雷尼替丁)治疗。对接受ketaconazole联合给药的患者的治疗应当谨慎。2％接受紫杉酚治疗的患者表现出严重的超敏反应，其特征在于呼吸困难、血压过低、血管神经性水肿和无显著特点的风疹。一例可能与应用TAXOL有关的进行性低血压，导致患者死亡。其它副作用包括骨髓抑制、异常ECG、末梢神经疾病、肌痛和关节痛、秃头症、注射区的反应、恶心、呕吐、腹泻和粘膜炎。连续的安全监护导致极少有肝坏死、肝性脑病、静脉炎和蜂窝组织炎的报道。可购得的TAXOL是一种澄清、无色到微黄色的粘性溶液，其以30mg／5mL包装于单剂量小瓶中。用合适的胃肠外用液体稀释到0．3-1．2mg／mL后，每3周用135mg／ml紫杉酚静脉输注24小时以上，用于治疗卵巢癌。对于乳腺癌，其剂量水平为175mg／mL，给药方式相同。除非嗜中性粒细胞和血小板计数分别恢复到1500细胞／mm2和100，000个细胞／mm2，否则不益重复应用TAXOL。
国家癌症研究所在廿世纪六十年代对TAXOL进行了研究，检测了35，000种植物药材，以寻找可以产生抗癌制品的植物。据报道从短叶紫杉树皮中提取的抗癌材料对患有白血病、肺癌和其它类型癌症的患者具有有益效果。按照国家癌症研究所公布的统计数字，据报道，TAXOL已治愈30％接受TAXOL治疗的卵巢癌患者。同样，通过应用TAXOL，已治愈50％患乳腺癌的患者和20％患有肺癌的患者。Schiff另外报道了TAXOL用于阻碍癌的生长的有效性(Schiff，P．BJ．Fant和S．B．Horwitz，自然，277，665(1979))。另外，在1971年完成了对TAXOL的解析分析(E．K．Rowinsky等，国家癌症协会杂志，82，11247(1990))。
在1992年12月，食品和医药管理局(FDA)批准紫杉酚的天然型在一线药物或随后的化疗失败后用于治疗转移性的卵巢癌，紫杉酚用于治疗转移性乳腺癌的应用在1994年4月得到上市批准。
TAXOL是含有不饱和碳的复杂化合物。尽管有研究者在1994年报道了TAXOL的全合成，但该方法过于昂贵，以至于人们认为它肯定不能以产业规模可行地制备出这种TAXOL。因此，TAXOL目前只能通过天然资源获得，即从紫杉树获得。
因此，对TAXOL的需求不断增加。但是，TAXOL的供应却不足以满足目前患有癌症患者的需要。TAXOL太稀有了，以至于不能提供足够的量用于测试它对皮肤癌和其它类型癌症有效性的研究。
目前，TAXOL主要从紫杉树的树皮获得。该树皮含有大约重量比为0．02％的TAXOL。因为为了有效提取TAXOL，必须从树上取下树皮，而树在除去树皮后即死去。由于必须种植新树且该新树必须在可以剥离其树皮前成熟，这限制了可从每棵树提取的TAXOL的量，也严重限制了可以提取的TAXOL的总量。事实上紫杉树生长非常缓慢，这进一步阻碍了制备TAXOL的努力。从环境的观点看，不断地根除紫杉树可以对紫杉树赖以生存的生境产生严重的影响。
从紫杉树叶提取TAXOL的方法在韩国专利Nos．95-10903，95-25034和97-1339中报道。这些专利属于用于分析紫杉树叶中TAXOL含量的技术。它们没有公开商业可行的从紫杉树叶提取TAXOL的方法。决定用于制备TAXOL制品的经济实用性的主要要素是从紫杉树叶中除去叶绿素。叶绿素使纯化柱所用的硅胶填充材料失活，所述硅胶填充材料是紫杉树叶提取物的纯化所必须的。
本发明提供了一种方法，它不仅公开了从紫杉树叶中有效除去叶绿素，还公开了从紫杉树叶中提取基本上纯的TAXOL的提取方法。具体地，本发明还公开了从1kg紫杉树叶中提取出80-100mg、纯度为至少98％的TAXOL的方法。
图2a为根据本发明指示过程的第一个实施例的方块流程图。
图2b为根据本发明指示过程的第一个实施例的方块流程图的继续部分。
优选实施方案的详细描述本发明教导了一种从东北红豆杉植物的叶中提取TAXOL的方法，包括利用几种分离和纯化技术的多步过程。该过程指示了一种史无前例的经济实用地提取TAXOL的方法。下面是根据本发明指示的过程的三个实施例。
在20升的池中浓缩上述甲醇提取液，操作在低于大气压下进行。加入10升氯仿，随后加入10升蒸馏水。剧烈搅拌所得到的溶液，静置，得到两相。除去杂质所在的极性水相。
氯仿相在浓缩池中浓缩，操作在低于大气压下进行。然后使浓缩液通过安伯来特(Amberlite)IRA-416离子交换树脂柱，其尺寸为25cm直径×60cm，由玻璃制成。将流速为300毫升／分钟的40％(体积比)甲醇用作洗脱溶剂。
洗脱液以1升为单位分段收集。选择第1-20号洗脱组分，丢弃其它洗脱组分以去除溶液中的叶绿素。将有用的洗脱液段进行浓缩，并使之通过硅胶60的硅胶柱(70-230目，默克公司)。使用的洗脱溶剂为苯和丙酮混合液，体积比从7∶1变化至1∶1，以流速150毫升／分钟通过玻璃柱。这是分离纯化过程的第一阶段。洗脱液以500ml为单位分段收集，只选择第63-75号粗母液部分。
浓缩收集到的粗母液部分，并使之通过尺寸为3．1cm直径×25cm的Lichroprep RP-18(40-63μm，默克公司)玻璃柱。洗脱液使用流速为50毫升／分钟的无水甲醇。这是分离纯化过程的第二阶段。洗脱液以300ml为单位分段收集，只选择第20-25号段作为母液组分。
浓缩收集到的母液组分，并使之通过半制备性HPLC(日本Shimadzu产的SCL-8A HPLC，和日本Eyela制造的DC-1200组分收集器)，这是分离纯化步骤的最后一个阶段。使用的柱为预先填装的ODS(十八烷基硅烷)柱(SG120柱，Shiseido公司，日本)，其尺寸为2cm直径×20cm。
洗脱溶剂为流速为20毫升／分钟的60％(体积比)甲醇。洗脱液以20ml为单位分段收集，选择第32-37号洗脱液段作为母液部分。后者经冷冻干燥得到900mg纯度为98．5％的白色TAXOL粉末。
将母液部分浓缩至其原始摩尔浓度的两倍，在0℃下结晶，得到880mg纯度为99．1％的白色TAXOL粉末。
2)在除去含有叶绿素的洗脱液段组分后，有用的组分用由正己烷／乙基乙炔按体积比变化在3∶1至1∶1之间的混合物做洗脱溶剂进行洗脱；将母液浓缩并使之通过半制备性HPLC，得到960mg纯度为98．7％的白色TAXOL粉末。
权利要求
1．一种从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，所述的方法包括(a)将应用甲醇作为溶剂从所述的紫杉树叶得到的提取物浓缩；(b)将所述紫杉树叶得到的所述提取物分布在两相系统中，所述的两相包括水相和氯仿相；(c)应用强阴离子交换树脂作为分离手段，分离所述的两相系统；(d)应用普通的柱色谱作为纯化手段，将所述的上步分离中从所述的氯仿相中得到的母液纯化；(e)应用反相柱色谱作为纯化手段，进一步纯化从所述的纯化步骤中得到的母液；(f)应用半制备性高压液相色谱作为纯化手段，进一步纯化从所述的纯化步骤中得到的母液。
2．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中所述用于将所述提取物浓缩的所述溶剂为无水甲醇。
3．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中所述的强阴离子交换树脂为安伯来特IRA-416(罗姆和哈斯公司，美国)。
4．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中所述的强阴离子交换树脂为Permutit ESB(Permutit AG，德国)。
5．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中所述的强阴离子交换树脂为Dowex 2-x8(陶氏化学公司，美国)。
6．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中用于所述两相系统的所述分离的洗脱溶剂为体积比范围在40-60％之间的甲醇。
7．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中所述用于将所述母液纯化的填充材料为硅胶。
8．如权利要求7所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中所述的硅胶为硅胶60(63-200μm)。
9．如权利要求7所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中所述的硅胶为硅胶40(63-200μm)。
10．如权利要求7所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中所述的硅胶为硅胶60(200-500μm)。
11．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用普通柱色谱用于将所述母液纯化的洗脱溶剂为苯和丙酮的混合物，其体积比范围在7∶1和1∶1之间。
12．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用普通柱色谱用于将所述母液纯化的洗脱溶剂为己烷和乙酸盐的混合物，其体积比范围在5∶1和1∶1之间。
13．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用普通柱色谱用于将所述母液纯化的洗脱溶剂为己烷和丙酮的混合物，其体积比范围在3∶1和1∶1之间。
14．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用反相柱色谱用于将所述母液纯化的填充材料为Lichroprep RP-18(40-63μm，默克公司，美国)。
15．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用反相柱色谱用于将所述母液纯化的填充材料为Lichroprep RP-2(25-40μm，默克公司，美国)。
16．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用反相柱色谱用于将所述母液纯化的填充材料为Lichroprep RP-8(40-63μm，默克公司，美国)。
17．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用反相柱色谱用于将所述母液纯化的洗脱溶剂为无水甲醇。
18．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用半制备性高压液相色谱用于将所述母液纯化的柱为ODS(十八烷基硅烷)柱。
19．如权利要求1所述的从紫杉树叶中提取TAXOL的方法，其中应用半制备性高压液相色谱用于将所述母液纯化的洗脱溶剂为体积比范围在50-65％之间的甲醇。
全文摘要
本发明公开了一种从东北红豆杉植物的叶中提取TAXOL R 的方法。该方法包括将从植物中得到的提取液浓缩,将水和氯仿相分离,和几步纯化程序在内的一系列步骤。另外,本发明公开了一种多步骤过程,其中在将提取物引入硅胶填充材料前有效除去叶绿素。这防止了提取液中由叶绿素造成的硅胶填充材料失活。
文档编号C07D305/14GK1290304SQ98812974
公开日2001年4月4日 申请日期1998年1月26日 优先权日1998年1月26日
发明者韩万愚, 洪南斗, 刘载国 申请人:韩万愚, 洪南斗, 刘载国