专利名称：棉花曲叶病毒启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离出棉花曲叶病毒启动子，本发明还涉及利用这种启动子在植物中表达外源基因的方法。
植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括RNA聚合酶启动转录的信号，以指导合成相应的信使RNA分子，进一步指导蛋白质的合成。
目前，已有许多不同来源的启动子被用于转化植物。其中一大类是从根癌农杆菌中分离出来的，另一大类为植物本身来源的启动子，上述启动子控制的目标基因表达量往往较低，或存在植物种属、植物器官、组织特异性。最广泛使用的启动子则来自于植物病毒。花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)是双子叶植物转化中最常用的启动子之一，因为它在几乎所有组织中都能使外源基因高效表达。此外，为了提高外源基因的表达水平，通常将各种来源的增强子、顺式调控元件、非转译序列、内含子、外显子、3’端调控序列等等与启动子联合使用。如来自玉米胚乳蔗糖酶基因的内含子1在烟草细胞内可使GUS报道基因表达水平提高100倍，玉米胚乳蔗糖酶基因外显子1的存在能使报道基因在单子叶和双子叶植物中的表达水平提高10倍(C.Mass等，1991,The combination of novel stimulatoryelement in the first exon of the maize Shrunken-1 gene with thefollowing intron-1 enhances reporter gene expression up to 1000-fold.Plant Mol.Biol.,16:199-207)。
来自于植物双生病毒的启动子对于外源基因的表达具有潜在的应用价值。双生病毒(Geminivirus)是一类具有双生颗粒形态的病毒。双生病毒成员众多，侵害的作物十分广泛。依据病毒基因组结构及所依赖的昆虫传播媒体，该类病毒被划分为三个亚组。亚组Ⅰ和Ⅱ病毒的基因组为单组份，即只含有一个基因组成份，这两类双生病毒主要由叶蝉传播；它们的区别在于前者主要侵染单子叶植物，后者主要侵染双子叶植物。亚组Ⅲ病毒主要侵染双子叶植物，依赖粉虱传播，基因组大多为双组份，较大的为DNAA，小的为DNA B；其中也有些为单组份。
双生病毒突出的特点是基因组DNA为单链环状，其核苷酸长度约为2,400~3,000nt。该类病毒基因组转录最显著的特征是通过同一启动子区进行两个方向的转录。这一启动子具有两个方向的转录功能，因此本发明称该启动子为双向启动子；其中一个方向的启动子调控病毒复制蛋白基因的表达，另一方向则调控外壳蛋白基因的表达，因此两个方向的启动子分别被称为复制蛋白基因启动子和外壳蛋白基因启动子。双生病毒启动子具有典型的真核启动子特征，转录起始位点上游均存在TATA盒序列(P.A.Eagle等，1997,cis-elements that contribute to geminivrus transcriptionalregulation and the efficiency of DNA replication.J.Virol.,71:6947-6955)。
X.Zhan等(X.Zhan等，1991,Analysis of the potential promotersequence of African cassava mosaic virus by transcient expression oftheβ-glucuronidase gene.J.Gen.Virol.,72:2849-2852)分离了亚组Ⅲ的非洲木薯花叶病毒(ACMV)基因组的双向启动子区，烟草原生质体瞬时表达表明，复制蛋白基因启动子驱动的GUS(报道基因)活性比CaMV35S启动子的低40倍。外壳蛋白基因启动子本身活性极低，ACMV编码的AC2蛋白在CaMV35S启动子控制下可使外壳蛋白基因启动子活性增强3倍(Haley,A.等,1992,Regulation of African cassava mosaic virus promotersby the AC1,AC2,AC3 gene products.Virology,188:905-909)。
R.J.Hayes等(R.J.Hayes等,1989,Replication of tomato goldenmosaic virus DNA B in transgenic plants expressing open readingframes(0RFs)of DNA A:requirement of ORF AL2 for production ofsingle-stranded DNA.Nucl.Acids Res.,17:10213-10222)以TGMV作基因载体导入根癌农杆菌进行植物转化，发现TGMV外壳蛋白基因启动子被AC2激活后的新霉素磷酸转移酶(报道基因)活性不如CaMV35S启动子的强，比CaMV35S启动子低2倍。
C.Brough等(C.Brough等，1992,Kinetics of tomato golden mosaicvirus DNA replication and coat protein promoter activity in Nicotianatabacum protoplast.Virology,187:1-9)发现，以非复制型的TGMV作载体进行植物转化，外壳蛋白基因启动子驱动的GUS基因瞬时表达活性比CaMV35S启动子强约2倍。而复制型的TGMV外壳蛋白基因启动子活性约为CaMV35S启动子的60-90倍。
许煜泉等(许煜泉等，1998，烟草黄矮双生病毒中双向启动子的活性及其调节控制，病毒学报，14:68-74)分离了亚组Ⅲ的烟草黄矮双生病毒的双向启动子区，以GUS作报道基因，在烟草原生质体和玉米细胞悬浮液中的瞬时表达表明，复制蛋白基因启动子活性最强，相当于CaMV35S启动子的15-20％。外壳蛋白基因启动子活性最弱，但可被C1:C2蛋白(相当于AC2蛋白)激活而使活性增强3倍。
前人对双生病毒双向启动子的研究大多采用瞬时表达的方式，X.Zhan等(X.Zhan等，1991,Analysis of the potential promoter sequence ofAfrication cassava mosaic virus.by transcient expression of theβ-glcuronidase gene,J.Gen.Virol.,72:2849-2852)虽采用根癌农杆菌转化的方法对ACMV复制蛋白基因启动子作了研究，但也发现比CaMV35S低。综上文献报导，目前分离到的双生病毒复制蛋白基因的启动子活性普遍比CaMV35S的低。本发明从属于双生病毒亚组Ⅲ的棉花曲叶病毒中分离启动子，以GUS作报道基因，研究其表达强度。
棉花曲叶病毒是新近发现的双生病毒，最近几年在巴基斯坦、苏丹、印度流行严重。据巴基斯坦1993-1994年统计，棉花受害面积达900,000公顷，产量损失高达80％(M.Ali等,1995,Cotton leaf curl virus in thePunjab,current situation and review of work.Multan:Central CottonResearch Institute/Ministry of food,Agriculture and Livestock,Government of Pakistan/Asian Development Bank)。研究证实，CLCuV由粉虱传播，侵害的作物非常广泛，包括法国豌豆、秋葵、烟草、番茄、棉花等，主要产生叶脉增厚和叶片变黄等症状。目前已发现了至少9种不同的CLCuV株系，X.Zhou(X.Zhou等,1998,Four DNA-A variants amongPakistani isolates of cotton leaf curl virus and their affinities toDNA-A of geminivirus isolates from okra.J.Gen.Virol.,79:915-923)等根据不同株系的基因组DNA序列，研究了CLCuV的进化。至今尚未见有关将CLCuV的双向启动子应用于植物基因工程的报导。
植物基因工程在植物的抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、改良作物品质、提高作物固氮能力、雄性不育、延熟保鲜、改变花色和花型等方面取得了较大突破。然而，目标基因表达量低或不稳定等不良因素往往制约了植物基因工程飞速发展的步伐。开发新型的高效启动子不失为一较理想的策略。
目前使用的启动子的强度普遍较低，或存在植物种属、器官、组织的特异性。
本发明的目的是提供一种普遍适用于双子叶植物或单子叶植物转化的超强启动子系统，使外源基因的表达量在现有的基础上进一步提高，更广范围地在植物体内进行组成型表达。
本发明提供了一种植物病毒的双向启动子。
本发明提出的双向启动子为双生病毒基因组的一部分，在基因组学上又称为大基因间区(Large intergenic region,LIR)。LIR包含了双生病毒基因组双向转录的启动子区及其调控元件，对于病毒的复制及双向转录至关重要。
具体地说，本发明的启动子为棉花曲叶病毒基因组的一部分。更具体地说，本发明的启动子具有图1所示的序列。
本发明的双向启动子最好来自棉花曲叶病毒(CLCuV)基因组的LIR区，是天然提纯的或PCR方法分离的或者参照图1所示的序列化学合成的。CLCuV属于双生病毒亚组Ⅲ，该病毒存在相当大的变异，目前在巴基斯坦就已发现了9种不同的株系。在本发明的一个优选实施方案中，所述的启动子是从一种未知的CLCuV病毒株系中分离的双向启动子，其DNA序列如图1所示。
本发明提供的启动子可分别使用不同的方向驱动外源基因的表达，也可同时在启动子的两个方向连接外源基因，也可将其中的调控序列分别与其他启动子组成复合启动子使用。本领域熟练技术人员应知道，将启动子除TATA盒核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全丧失，因此也可根据需要将启动子的调控元件发生改变后使用。因而，与图1所示序列具有80％同源性的DNA序列也包括在本发明的范围之内。
本发明提供的启动子最好是包含了基因转录起始位点(通常称为+1)上游的序列，不包含转录起始位点至转译起始位点(通常为ATG密码子)之间的序列。真核生物转录起始位点的特征一般为YYYAYA(Y为嘧啶)，转录起始于第4位的A。根据已发表的其它双生病毒的资料及同源性比较，复制蛋白基因方向启动子的转录起始位点为基因组第2606核苷酸位置的A，外壳蛋白基因方向启动子的转录起始位点为基因组第255核苷酸位置的T。
本发明还提供了一种将所说的双向启动子应用于植物中表达外源基因的方法。该方法包括以下步骤a．将克隆到的双向启动子与待表达的外源基因相连，以此构建植物表达载体；b．将构建好的植物表达载体导入植物细胞；c．在适宜的培养条件下将转化后的植物细胞再生，得到表达外源基因的植株。
上述方法中所说的双向启动子是一种植物病毒来源的双向启动子。
具体地说，该启动子来源于棉花曲叶病毒。优选该启动子具有图1所示的序列。该启动子是天然提纯的或化学合成的。
上述方案中使用的启动子由于在两个方向均有功能，因此被称为双向启动子。它可以在不同方向连接基因。
上述方案中使用的启动子最好是包含了基因转录起始位点(通常称为+1)上游的序列，不包含转录起始位点至转译起始位点(通常为ATG密码子)之间的序列。真核生物转录起始位点的特征一般为YYYAYA(Y为嘧啶)，转录起始于第4位的A。根据已发表的其它双生病毒的资料及同源性比较，复制蛋白基因方向启动子的转录起始位点为基因组第2606核苷酸位置的A，外壳蛋白基因方向启动子的转录起始位点为基因组第255核苷酸位置的T。
上述方案中使用的启动子最好是包含了启动子本身的调控外源基因表达的所有顺式调控元件，如根特异性、叶肉细胞特异性、种子胚乳特异性、花器官特异性、果实特异性、维管组织特异性等等组织特异性元件及诱导性调控元件如损伤诱导等，以及所有的增强外源基因表达的增强子元件、降低外源基因表达的负调控元件等。本领域熟练技术人员应知道，组成型表达的启动子往往由许多模块化(Modular)的顺式调控元件组成，这些调控元件决定了基因表达的特性，可与其它所有来源的在植物中表达外源基因的启动子组合在一起使用。因此，双向启动子的顺式调控元件也包括在本发明的范围之内。
上述方案中使用的启动子最好是不仅包含病毒基因转录所需的核心启动子序列如TATA盒，还包含了其它顺式调控元件，也包含了与病毒复制相关的序列如非常保守的发夹环结构及其周边序列5’-GCTCCAAAAAGCGGCCATCCGTATAATATTACCGGATGCCGCGCTTT TTTTTTTGTG-3’。将启动子除TATA盒等核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全丧失，因此也可根据需要将双向启动子的调控元件发生改变后使用。因而，与图1所示序列具有80％，最好是具有99％同源性的DNA序列也包括在本发明的范围之内。
上述方案中使用的启动子最好是可增添各种来源(包括CLCuV本身)的调控元件如CaMV35S启动子，章鱼碱合成酶基因(ocs)启动子(L.Comai等，1985,Expression in plants of a mutant acroA gene from Salmonellatyphimurium confers tolerance to glyphosate.Nature,317:741-744)，甘露碱合成酶基因(mas)启动子(K.E..McBride等，1990,Improvedbinary vectors for Agrobacterium-medidated plant transformation.Plant Mol.Biol.,14:269-276)等来源的顺式调控元件(如增强子元件)等，组成复合启动子使用。此外，该双向启动子也可置于各种转译增强因子等调控序列的上游来调控外源基因的表达，转译增强因子如来自苜蓿花叶病毒(AMV)的非转译序列AMV(S.A Jobling等,1987,Enhancedtranslation of chimaeric message RNAs containing a plant viraluntranslated leader sequence.Nature,325:622-625)，以及来自烟草花叶病毒(TMV)的Ω因子(K.Richards等，1978,Nucleotide sequenceat the 5’extremity of tobacco mosaic virus RNA,Eur.J.Biochem.,84:513-519)等。在嵌合基因构建物中，也可以部分或全部地插入其它的所有旨在增强外源基因表达的DNA序列，其中包括但不限于内含子如水稻肌动蛋白基因Actin1内含子1，来自玉米蔗糖合成酶基因Sh1内含子1、玉米Ubquin内含子1、玉米乙醇脱氢酶基因1-S内含子1等等内含子以及外显子如玉米蔗糖合成酶基因Sh1外显子1及3’端表达调控序列如PⅠ-Ⅱ基因终止子。
本发明的方法中双向启动子可以是以复制蛋白基因方向与外源基因相连，也可以外壳蛋白基因方向与外源基因相连。CLCuV外壳蛋白基因启动子本身活性极低，它可受病毒基因组编码的AC2蛋白的激活调控。因而在本发明的方法中，当启动子以外壳蛋白基因方向与启动子相连时，可使用本发明提供的AC2蛋白基因(DNA序列见图2)。
本发明提出的AC2蛋白基因可与各种来源的启动子融合，达到调控外壳蛋白基因启动子表达的目的。其中的启动子包括但不限于CLCuV本身来源的启动子、CaMV35S启动子、番茄E8启动子、Gt3启动子、rolc启动子、CoYMV启动子、rbcs启动子、hsp70启动子、PⅠ-Ⅱ启动子等等。
本发明提出的方案中使用了GUS作报道基因，出于本发明的目的，报道基因定义为融合于目标启动子下游的一段核苷酸序列，启动子的转录可使报道基因转录并转译生成一些易于测定的生物化学物质，如β-葡糖苷酸酶(GUS)。本发明通过测定β-葡糖苷酸酶活性来测定启动子在烟草和棉花细胞中的表达强度。
本发明提出的方案中的外源基因，是指所有旨在改变植物本身遗传性状的基因。其中包括但不限于所有的非编码蛋白基因如RNA基因(包括但不限于所有的正义RNA基因和反义RNA基因等等)，以及所有的编码基因(包括但不限于抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂、品质改良基因等)都可与该启动子组成嵌合表达结构并置于载体中，在细胞中表达。
重组DNA的技术包括但不限于分子克隆实验指南(J.Sambrook等，1989,“Molecular cloning,a laboratory manual.”Cold Spring HarborLaboratory Press.Cold Spring Harbor,N.Y.)，转化植物的方法使用了许多对本领域熟练技术人员来说非常熟知的技术，其中包括但不限于基因枪转化、农杆菌叶盘转化、PEG转化等。以上技术都涉及使用DNA载体来传递用于转化的核苷酸序列，适用于本发明的载体包括但不限于带有用于选择转基因材料的标记基因的载体。
本发明提出的启动子可用于在双子叶植物(包括但不限于棉花、烟草)中表达基因，还能用在单子叶植物中驱动基因的表达，但是双子叶植物启动子在单子叶植物中的表达水平有所不同。烟草是常用的模式植物，因为它易于再生，用根农杆菌Ti质粒载体转化的效率特别高。双子叶植物如(但不限于此)棉花、番茄、油菜、法国豌豆、秋葵、大豆、烟草等等，单子叶植物如禾本科植物水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦等等是优选的转基因宿主。
本发明提出的对转化植株的基因表达产物的检测，以评价启动子的表达强度，并且分析启动子在植物体内的表达的组织化学定位，使用了许多对本领域熟练技术人员来说非常熟知的技术，其中包括但不限于用于GUS酶活性分析的荧光分光光度法，用于组织化学分析的徒手切片法，冰冻切片法等技术。
本发明最后还提出了一种方案，即为了提高双向启动子中外壳蛋白基因启动子的表达强度，使用来自CLCuV基因组的AC2蛋白因子。
本发明提出的AC2蛋白基因是从CLCuV病毒侵染的植物组织总DNA中分离的。它来源于棉花曲叶病毒基因组，可采用PCR方法分离或天然提纯或通过化学的方法合成的。
本发明的AC2蛋白的核酸序列及相应的氨基酸序列(见图2)，若通过缺失或点突变等方式改变其中的碱基，不会使AC2蛋白完全丧失功能。
本发明提出的AC2蛋白若通过增添其它蛋白的序列以组成融合蛋白等，不会使AC2蛋白完全丧失功能。
本发明提出的AC2蛋白基因可与各种来源的能在植物中表达的启动子融合，达到调控外壳蛋白基因启动子表达的目的。其中的启动子包括但不限于CLCuV本身来源的启动子、CaMV35S启动子、番茄E8启动子、Gt3启动子、rolc启动子、CoYMV启动子、rbcs启动子、hsp70启动子、PⅠ-Ⅱ启动子。
有益效果本发明提出的双向启动子在两个方向上都有功能。其中一个方向，即复制蛋白(Replication protein,RP)基因启动子可使外源基因在双子叶植物中的平均表达量是CaMV35S启动子的5-6倍，最高达10余倍。
该方向的启动子可在植物根、茎、叶器官中高效表达外源基因(见下表)，其中根部表达强度最高。
CLCuV复制蛋白基因启动子驱动的GUS表达活性在转基因烟草不同器官中的比较
注表中的数据来自农杆菌转化获得的稳定表达GUS基因的6株转化植株(T0代)苗期测定结果。数字以平均值±标准差表示，单位为pmoles MU/mg蛋白/min,CLCuV PRP表示CLCuV复制蛋白基因启动子，CaMV 35S表示CaMV 35S启动子。
进一步的组织化学定位证实，复制蛋白基因启动子在叶片的叶肉细胞(包括栅栏组织、海绵组织)和维管束均有表达活性；茎部横切面染色结果表明，内外韧皮部、皮层及木质部周围的薄壁细胞也有GUS染色。在花器官中，花萼，花瓣，子房，柱头，花药均显示染色。未成熟果实的外果壁、成熟种子的胚和胚乳均有染色反应。
另一方向的启动子即外壳蛋白基因启动子单独的表达活性非常低，仅为本底的5倍(图4)，但经AC2蛋白因子的激活后，瞬时表达活性提高(见下表)。AC2基因可作为一种基因表达调控的开关，控制外壳蛋白基因启动子驱动的基因表达的开启与关闭。
CLCuV外壳蛋白基因启动子驱动的GUS基因在棉花和烟草叶片组织中的瞬时表达活性相对比较
注用每种构建物植物表达产物经组织化学染色后的蓝色斑点数目和强度表不启动子的瞬时表达活性相对值。用+/-表示极低的活性，++表示高活性，+++表示较高活性，++++表示极高的活性。CP启动子表示外壳蛋白基因方向启动子；RP启动子表示复制蛋白基因方向启动子；CaMV35S启动子表示花椰菜花叶病毒35S启动子；AC2表示CLCuV的AC2蛋白基因。
图1显示来自CLCuV双向启动子的序列。注上行数字表示序列的碱基序号，下行数字表示相应于CLCuV基因组的碱基序号。单划线部分为PCR扩增引物。阴影部分碱基为与发表序列不同的碱基。
图2显示来自CLCuV的AC2基因的核酸序列及推测的氨基酸序列。注以CLCuV侵染的烟草叶片总DNA为模板，通过PCR方法获得AC2基因。PCR产物全长521Nt，包括450Nt的编码序列(即145个氨基酸)、两个终止子(星号表示)及52Nt非编码序列(小写字母表示)。划线部分的序列表示PCR扩增引物。上行数字表示序列的碱基序号，下行数字表示相应于氨基酸的序号。
图3为一条线图，表示经质粒载体pRPGUS2300转化后，稳定转化的烟草不同植株的GUS酶活性。转基因植株叶器官GUS活性测定荧光值的激发波长为365nm，发射波长为455nm。CLCuV PRP:CLCuV复制蛋白基因启动子-gus转基因植株；CLCuV PCP:CLCuV外壳蛋白基因启动子-GUS转基因植株；CaMV P35S:CaMV 35S启动子-GUS转基因植株；CK未转GUS基因的对照组织。GUS活性计算值为未除去本底的数值，单位为pmoleMU/mg蛋白质/min。
图4为一条线图，表示经质粒载体pRPGUS2300、pCPGUS2300、pBI121转化后，稳定转化的烟草中GUS酶活性平均值。转基因植株叶器官GUS活性测定荧光值的激发波长为365nm，发射波长为455nm。CLCuV PRP:CLCuV复制蛋白基因启动子-gus转基因植株；CLCuV PCP:CLCuV外壳蛋白基因启动子-GUS转基因植株；CaMV P35S:CaMV 35S启动子-GUS转基因植株；CK:未转GUS基因的对照植株。GUS平均活性计算值为未除去本底的数值，在条线图的上方以数字表示，单位为pmoleMU/mg蛋白/min。
图5为一条线图，表示经pRPGUS2300转化后，稳定转化的烟草中根、茎、叶不同器官中GUS酶活性。GUS活性测定荧光值的激发波长为365nm，发射波长为455nm。CLCuV PRP:CLCuV复制蛋白基因启动子-GUS转基因植株；CK未转GUS基因的对照植株。GUS活性计算值为未除去本底的数值，单位为pmoleMU/mg蛋白/min。
实施例通过在棉花叶片中瞬时表达携带有启动子序列与GUS基因融合而形成的构建物的农杆菌转化烟草测定GUS活性，评价双向启动子的效率。下文将说明载体的制备方法和转化方法。
启动子的克隆按B.D.Harrison等(B.D.Harriso等，1997,Detection andrelationships of cotton leaf curl virus and allied whitefly-transmitted geminiviruses occuring in Pakistan.Ann.Appl.Biol.,130:61-75)的方法，从受CLCuV侵染的烟草叶片中提取总DNA，以下面的寡核苷酸为引物(5’端引物5 ’-CGGGAGCTCATGATTACGGGAGCGTAAAATAC-3’；3’端引物5’-CGCGGTACCATGGTGGCAATCGGTGTACACTC-3’)，通过PCR的技术得到双向启动子片段P1P2。两端引物中分别添加了KpnⅠ-SacⅠ双酶解位点。PCR扩增片段经KpnⅠ-SacⅠ限制性酶切之后，插入质粒pGEM7Zf(+)(购自Promega公司)的相同双酶解位点中，得到pGEM7ZP1P2。
包含嵌合RP启动子-GUS基因的表达载体构建质粒pAMVGUS融合有一段2.137kb含GUS基因和nos终止子结构的NcoⅠ-SalⅠ双酶解片段。将该片段克隆在pGEM7ZP1P2的P1方向启动子(复制蛋白基因启动子)的下游，即NcoⅠ-XhoⅠ双酶解位点中，得到质粒pRPGUS。该质粒可作瞬时表达载体，为进一步构建植物转化载体，将pRPGUS包含有RP启动子-GUS-nos终止子的表达结构的约2.5kb SacⅠ-XbaⅠ片段，插入pCAMBIA2300(购自CAMBIA公司)的相同双酶解位点中，得到适合于农杆菌转化的植物表达载体pRPGUS2300。植物表达载体对照pBI121含有来自于CaMV的35S启动子-GUS基因表达结构。
包含嵌合CP启动子-GUS基因的表达载体构建质粒pDMC203融合有一段含GUS基因和nos终止子结构的片段。将pGEM7ZP1P2经XhoⅠ-BspHⅠ双酶解后得到的启动子片段插入pDMC203的XhoⅠ-NcoⅠ双酶解位点中，得到质粒pCPGUS。该质粒可作瞬时表达载体。为进一步构建植物转化载体，将pCPGUS包含有CP启动子-GUS-nos终止子的表达结构的约2.5kb BglⅡ-XhoⅠ双酶解片段插入植物表达载体pCAMBIA2300(购自CAMBIA公司)得到适合于农杆菌转化的植物表达载体pCPGUS2300。
反式作用因子AC2的分离及其表达载体的构建以受CLCuV侵染的烟草叶片中提取的总DNA为模板，以下面的寡核苷酸为引物(5’端引物5’-CGCGAATTCCTAGACGAGGAAAAGAAGAC-3’；3’端引物5’-CGGGTCGACTCTATTAATTGAAATTACACCGAG-3’)，通过PCR的技术得到AC2基因片段。将其5’端用EcoRⅠ酶解，3’端用Klenow酶补平后插入克隆载体pBluescriptKS(+)的SmaⅠ-EcoRⅠ双酶解位点中得到pBlueAC2P。质粒pBPFΩ7包含有非转译增强序列Ω因子、CaMV35S启动子和nos终止子的基因表达载体。将pBlueAC2P经EcoRⅠ-XbaⅠ双酶解后插入pBPFΩ7载体中的相同双酶解位点中，得到pBPFAC2表达载体。再将pBPFAC2经HindⅢ酶解后插入pCPGUS2300的相同酶解位点中，得到复合表达载体pCPGUS230AC2。
棉花和烟草叶片的瞬时表达与分析棉籽经浓硫酸脱绒后用自来水冲净。剥出种仁，分别用30％次氯酸钠浸泡15分钟、0.1％氯化汞浸泡4分钟、10％H2O2浸泡20分钟消毒，无菌水冲洗后接种于发芽培养基(GA7培养盒)中；烟草种子的消毒采用30％次氯酸钠浸泡10分钟。上述处理过的棉花和烟草种子均于光照/黑暗周期比为16/8小时，温度为25℃的条件下培养30-40天，将无菌苗的叶片用于转化。叶片平铺在无激素的MS基本培养基上，用pRPGUS、pCPGUS、pCPGUS230AC2质粒DNA进行基因枪的转化。金粉的制备和转化的方法参照文献(任延国等，1998，水稻psbA启动子诱导的GUS基因在烟草叶绿体中的瞬间表达，农业生物技术学报，3:78-83)。暗培养3天后，进行组织化学染色(R.A.Jefferson,1987,Assaying chimeric genes in plants:the GUS gene fusion system.Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)，并经70％乙醇脱色以除去叶绿素。结果表明，外壳蛋白基因启动子单独的表达活性非常低，但经AC2蛋白因子的激活后，瞬时表达活性提高。
烟草的转化与分析将目的质粒转入根癌农杆菌LBA4404，然后挑取单菌落于20ml YEB培养基(含卡那霉素，利福霉素各为50微克/毫升)中28℃过夜培养，再按2％体积的量转接到无抗生素的YEB培养基中继续培养3小时，菌液用MS液体培养基稀释3倍。
采用叶盘法进行烟草的转化，详细方法参照文献(R.B.Horsch,1985,A simple method and general method for transfering genes into plant.Science,227:1229-1230)。取无菌苗的叶片，用打孔器打出圆形叶片，浸入含农杆菌的MS培养基中，10分钟后，在滤纸上吸干，转入共培养培养基于25℃暗培养2-3天后，将叶盘转入继代培养基。光照培养(光/暗周期为16/8小时，下同)3天后转入筛选培养基，继续培养7-10天后，转入再生培养基，待芽长至3-4cm时切下芽转入生根培养基。生根后，取长势较一致的植株进行GUS酶活性测定。测定方法参照文献(R.A.Jefferson,1987,Assaying chimeric genes in plants:the GUS gene fusionsystem.Plant Mol.Biol.Rep.,5:387-405)。测定结果表明，CLCuV RP启动子驱动的GUS酶活性平均值是CaMV35S启动子的5-6倍。
进一步的组织化学定位，仍参照文献(R.A.Jefferson,1987,Assayingchimeric genes in plants:the GUS gene fusion system.Plant Mol.Biol.Rep.,5:387-405)的方法，进行徒手切片并染色。观察结果表明，除花粉外，RP启动子在植物绝大多数器官和组织中表达，基本属组成型表达。
双子叶植物棉花的农杆菌转化将质粒载体pRPGUS2300通过电激的方法导入根农杆菌LBA4404，用根农杆菌介导转化法转化棉花，其操作程序如下棉籽经硫酸脱绒后用自来水冲洗，经10％H2O2浸泡2-4小时后置于无菌水中12-14小时，剥去种皮，放置于1/2MS的发芽培养基上。在28℃暗培养下发芽3-5天后，将无菌苗下胚轴切成0.5-1cm切段。取20ml经高压灭菌的液体YEB培养基加入相应的抗生素(卡那霉素50mg/L、利福霉素25mg/L)，挑取在平板上的单菌落，接种于20ml含有上述抗菌素的液体YEB培养基中，28℃的恒温摇床上过夜(150-180rpm)。取400μl此菌液转接于不含抗生素的液体YEB培养基中(20ml)，并添加2.5ml 100mmol/L的乙酰丁香酮，继续振荡培养3-5小时。转化程序将下胚轴用稀释至5×108个/ml的根农杆菌菌液浸泡10分钟左右，覆盖有滤纸的共培养培养基(MS无机盐，B5有机成分，30g/L葡萄糖和2,4-D及KT各0.1mg/L,pH5.8)上培养。筛选转化体转化后的下胚轴经三天暗培养后，转入添加了80mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的选择培养基上，经2-3个月培养(20-30天继代一次)诱导出转化愈伤，在MS培养基(MS无机盐、B5有机成分，30g/L葡萄糖，pH5.8)上继代4-5次以诱导胚状体的形成。5-6个月后将发育好的胚状体转移到分化培养基(MS无机盐、B5有机成分，去除激素及NH4NO3、KNO3加倍并添加谷氨酰胺1g/L、天门冬酰胺0.5g/L,pH5.8)进行胚状体的分化。每月继代一次，当小植株长出完整和健壮的根系并具有3-4片真叶之后，将其移栽或嫁接。
单子叶植物水稻的转化1．载体构建用SacⅠ/XbaⅠ双酶解质粒pRPGUS，回收PRP-GUS-Tnos片段并插入pCAMBIA1300载体的SacⅠ/XbaⅠ位点，得到质粒pRPGUSHyg。植物选择标记为潮霉素。
2．基因枪转化取开花后12-15天的灭菌幼胚或幼胚来源的胚性愈伤组织(从鲜黄、致密的胚性愈伤组织上分离出胚性小愈伤组织颗粒，直径大约1mm)作为基因枪转化的受体。待幼胚在诱导培养基培养2-3天后，仔细挑选无污染且盾片膨大的幼胚转移到盛有高渗培养基(诱导培养基+0.5M甘露醇)的平皿(直径9cm)上，并摆放在平皿中央2-3cm的枪击范围内(注意盾片端朝上)，高渗预培养4小时后进行枪击，胚性愈伤组织也需经高渗处理后再进行枪击。称取60mg的金粉(直径1.0μm)于1.5ml的Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇，在旋涡振荡器上振荡15分钟，然后13,000rpm离心3分钟，仔细去掉上清，再加入70％乙醇重复上述步骤一次。然后加入1ml的无菌重蒸水重悬，13,000rpm离心去上清，这一步骤重复三次，最后加入1ml无菌水。储存于-20℃冰箱。充分振荡起金粉悬液后取50μl，置于-灭菌的Eppendorf管中，加入5μl的DNA(1.0μg/μl)溶液，在涡旋振荡状态下缓慢加入50μl2.5M氯化钙溶液(高压灭菌)以及20μl0.1M亚精胺溶液(抽滤灭菌)，充分振荡约3分钟，静置10分钟(以保证DNA大分子在金粉表面的充分沉降)，10,000rpm离心5秒钟，弃上清(尽可能去除干净)再加入250μl无水乙醇，振荡，10,000rpm离心5秒钟，去上清，最后加60μl无水乙醇，重悬，供5枪之用(5-10μl一枪)。将基因枪(PDS-1000/He)放置于超净工作台上，以利于无菌操作。用70％的乙醇消毒真空室，可裂圆片及微弹载体用70％乙醇浸泡30分钟，晾干备用，阻挡网经高压灭菌。取包被DNA的金粉悬液(5-10μl)均匀点在无菌微弹载体的中央区域，于超净工作台上吹干备用。将可裂圆片(规格为1,100psi)装入固定盖、旋紧。将载有微弹的微弹载体及阻挡网装入微弹发射装置中。基因枪的轰击步骤包括(1)打开稳压电源、真空泵及氦气瓶阀的开关，调整系统压力为1,300psi。(2)将受体材料小心地放入样品室，射程可选60mm或70mm。(3)抽真空(真空度为27-28英寸汞柱)。(4)轰击。(5)排气，取出样品，用封口膜封上。枪击后的材料于高渗培养基上过夜后，转移到诱导培养基上培养5-7天。将上述材料转入含有hyg B的选择培养基上选择培养三次，暗培养，每次3-4周，粳稻使用hygB浓度依次为30mg/l、40mg/l和50mg/l。籼稻使用hygB浓度依次为10mg/l、20mg/l和40mg/l。将抗性愈伤组织转至含hygB 30mg/l的分化培养基上，先暗培养10天，再光照培养，待分化出的抗性小芽长至2-3cm时，将其转至含hyg B 30-50mg/l的生根培养基上(Hyg B籼稻用30mg/L，粳稻用50mg/L)。待长至完整的植株后，将其从固体培养基转至营养液中开放式培养。待生成新根后，将苗转入温室或大田。附培养基配制配方1．基本培养基(1L)大量元素 N6微量元素 MS铁盐 MS有机成分 B5MgCl2500mg谷氨酰胺 250mg脯氨酸 500mg水解酪蛋白 300mg蔗糖 30000mgGelrite2200mg2．诱导培养基(1L)基本培养基补加以下成分2,4-D 2mg3．选择培养基(1L)基本培养基补加以下成分2,4-D 2mgHyg B 30,40,50mg(粳稻)10,20,40或50mg(籼稻)4．分化培养基(1L)基本培养基补加以下成分KT 2-4mg6-BA 0.5-1mgNAA 0.25-0.5mgHgy B30mg甘露醇20-30g5．生根培养基(1L)大量元素1/2MS微量元素1/2MS铁盐1/2MS有机成分1/2B5MgCl2500mg谷氨酰胺250mg水解酪蛋白 300mg蔗糖20000mgGelrite 2200mg
权利要求
1．一种用于在植物中表达外源基因的棉花曲叶病毒(CLCuV)双向启动子。
2．按照权利要求1所述的启动子，其特征在于，它具有如下核苷酸序列1 GGTACCATGG TGGCAATCGG TGTACACTCT AATTCTCTGG402581 262041 CAATCGGTGT AACGGGGTGC AATATATAGG TGTACCCCAA802621 266081 ATGGCATTAT CGTAATTTGA GAAATCATTT CAAAATCCTC 1202661 2700121 ACGCTCCAAA AAGCGGCCAT CCGTATAATA TTACCGGATG 160270115161 GCCGCGCTTT TTTTTTTGTG GGCCCCCGAT TTACGAGATT 2001655201 GCTCCCTCAA AGCTAAATAA CGCTCCCGCA CACTATAAGT 24056 5241 ACTTGCGCAC TAAGTTTCAA ATTCAAACAT GTGGGATCCA 28096 135281 CTATTAAACG AATTCCCTGA TACGGTTCAC GGGTTTCGGT 320136 175321 GTATGCTTTC TGTGAAATAT TTGCAACTTT TGTCGCAGGA 360176 215361 TTATTCACCG GATACGCTTG GGTACGAGTT AATACGGGAT 400216 255401 TTAATTTGTA TTTTACGCTC CCGTAATCAT GAGCTC 436256 292
3．按照权利要求1所述的启动子，其特征在于，其核苷酸序列与权利要求2所示的序列具有80％的同源性。
4．按照权利要求1所述的启动子，其特征在于，它来源于棉花曲叶病毒基因组，是PCR方法分离的、天然提纯的或通过化学的方法合成的。
5．一种利用棉花曲叶病毒双向启动子在植物不同组织中高水平表达外源基因的方法，该方法包括以下步骤a．将克隆到的来源于棉花曲叶病毒双向启动子与待表达的外源基因相连，以此构建植物表达载体；b．将构建好的植物表达载体导入植物细胞；c．在适宜的培养条件下将转化后的植物细胞再生，得到表达外源基因的植株。
6．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a中来源于棉花曲叶病毒双向启动子具有权利要求2所示的核苷酸序列。
7．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b中来源于棉花曲叶病毒双向启动子的核苷酸序列与权利要求2所示的序列具有80％的同源性。
8．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a中双向启动子是以复制蛋白基因方向与外源基因相连。
9．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a中双向启动子是以外壳蛋白基因方向与外源基因和AC2蛋白的基因相连。
10．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a中双向启动子中复制蛋白基因方向启动子是转录起始位点，即基因组第2606核苷酸位置的A上游的序列，外壳蛋白基因方向启动子是转录起始位点，即基因组第255核苷酸位置的T上游的序列。
11．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a中双向启动子是嵌合启动子，含有权利要求1-5中任一权利要求所述的启动子DNA的必需的部分，该部分启动子DNA能在植物中起作用并能与基因的编码序列相连接而使基因表达。
12．按照权利要求11所述的植物嵌合启动子，其特征在于，启动子包含有调控基因表达的调控元件，该调控元件包括能增强外源基因表达或调控基因在植物中表达部位的各种来源的DNA序列。
13．按照权利要求12所述的调控基因表达的调控元件是增强子、组成型表达、组织特异性表达、诱导型表达的调控元件。
14．按照权利要求11所述的植物嵌合启动子，其特征在于，在启动子下游包含所有旨在增强外源基因表达的序列。
15．按照权利要求14所述的旨在增强外源基因表达的序列是水稻Actin1内含子1、玉米Ubiquitin内含子1、玉米蔗糖合成酶基因Sh1内含子1、玉米乙醇脱氢酶1-S基因内含子1、玉米蔗糖合成酶Sh1外显子1、3’端表达调控序列PⅠ-Ⅱ基因终止子。
16．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a中双向启动子被置于各种转译增强因子序列的上游来调控外源基因的表达。
17．按照权利要求16所述的转译增强因子是来自苜蓿花叶病毒的非转译序列AMV，以及来自烟草花叶病毒(TMV)的Ω因子。
18．按照权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的AC2蛋白基因是与所有来源的启动子融合使用的，其中所述的所有来源的启动子包括CLCuV本身来源的启动子以及其它的所有组成型启动子、组织特异型启动子、诱导型启动子。
19．按照权利要求18所述的启动子是CLCuV双向启动子、CaMV35S启动子、番茄E8启动子、Gt3启动子、rolc启动子、CoYMV启动子、rbcs启动子、hsp70启动子、PⅠ-Ⅱ启动子。
20．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的外源基因包括所有旨在改变植物遗传性状的基因。
21．按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的植物包括双子叶植物和单子叶植物。
22．按照权利要求21所述的双子叶植物是棉花、番茄、油菜、法国豌豆、秋葵、大豆、烟草，以及单子叶植物是禾本科植物水稻、小麦、玉米、大麦、高粱、燕麦。
23．一种为了提高双向启动子中外壳蛋白基因启动子表达强度的来自CLCuV基因组的AC2蛋白因子。
24．按照权利要求23所述的AC2蛋白因子，它具有如下氨基酸序列Met Arg Ser Ser Ser56 His Leu Ile Asp Pro Cys Thr Gln Val Pro Ile Lys 1718 Val Gln His Arg Glu Ala Lys Arg Arg Asn Arg Arg 2930 Arg Arg Val Asp Leu Glu Cys Gly Cys Ser Tyr Tyr 4142 Leu Ser Ile Asn Cys His Asn His Gly Phe Thr His 5354 Arg Gly Thr His His Cys Ser Ser Ser Arg Glu Trp 6566 Arg Ile Tyr Leu Gly Gly Ser Lys Ser Pro Leu Phe 7778 Gln Asp His Gln Pro Arg Gln Pro Ser Ile His Asp 8990 Glu Tyr Gly His Thr His Asp Gln Asp Pro Val Gln 101102 Leu Gln His Ser Glu Ser Ser Gly Thr Ala His Val 113114 Phe Ser ASn Leu Pro Asn Leu Asp Asp Leu Thr Ala 125126 Ser Asp Trp Ser Phe Leu Lys Gly Ile Gln Asn Pro 137138 Ser Pro Gln Ile Ser Glu Gln Ser Arg Cys Asn Phe 149150 Asn 151
25．按照权利要求23所述的AC2蛋白因子，其特征在于，其氨基酸序列与权利要求24的序列具有80％的同源性。
26．按照权利要求23所述的AC2蛋白因子，其特征在于，它来源于棉花曲叶病毒基因组，是天然提纯的或通过化学的方法合成的。
全文摘要
本发明提供了一种用于在植物中表达外源基因的棉花曲叶病毒(CLCuV)双向启动子;一种利用棉花曲叶病毒双向启动子在植物不同组织中高水平表达外源基因的方法;和一种为了提高双向启动子中外壳蛋白基因启动子表达强度的来自CLCuV基因组的AC2蛋白因子。利用本发明的材料和方法可以提高外源基因在植物中的表达。
文档编号C07K14/01GK1230592SQ9910304
公开日1999年10月6日 申请日期1999年3月22日 优先权日1999年3月22日
发明者朱桢, 谢迎秋, 刘玉乐 申请人:中国科学院遗传研究所