专利名称:改善了靶细胞受体结合活性的融合蛋白质的制作方法
技术领域:
本发明涉及出假单胞菌衍生的重组毒素与细胞因子连接而成的融合蛋白质,特别是涉及以重组DNA技术修饰作为导向部分的细胞因子,以提高与毒素部分融合所产生的融合蛋白质的靶细胞受体结合活性。
可使用连接到生长因子、细胞因子、抗体、激素及其他细胞导向分子上的毒素杀伤携带特异性受体的有害细胞[Pastan et al.,Cell 47641(1986);Vitetta et al.,Science 2381098(1987)]。可使多种细胞或植物来源的毒素或内毒素作为细胞毒性剂,但其中使用最为广泛并且最具开发前景的是由铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的假单胞菌外毒素A(PE)。已知PE进入真核细胞后,通过催化细胞内ADP的核糖基化而失活延伸因子(EF-2),进而抑制真核细胞中的蛋白质合成,导致细胞死亡。
X射线晶体学研究和突变分析证明,PE分子包括有三个与产生细胞毒性有关的结构区负责与敏感细胞结合的氨基末端受体结合区(Ⅰ区)、负责使毒素与分子转位到细胞溶质内的中间转位区(Ⅱ区),以及负责失活靶细胞蛋白质并引起细胞死亡的羧基末端酶促活性区(Ⅲ区)。其中Ⅰ区包括介导细胞结合的Ⅰa区(氨基酸1-252)和目前未完全了解其功能的Ⅰb区(氨基酸365-399)。对Ⅰ区的突变分析显示,第57位赖氨酸(Lys57)在受体结合中起到重要作用,并已显示Glu553、Tyr481和His626对ADP核糖基化活性是不可缺少的。研究表明,Ⅱ区的某些部分对PE分子保留细胞毒性具有重要作用。为消除PE分子的非特异性细胞结合活性而删除了Ⅰa区,同时保留转位和ADP核糖基化功能的部分EP分子称为PE40(分子量约40KDa)。
近年来,关于嵌合毒素的基础和应用研究主要集中在PE分子上。研究者试图通过对PE分子各不同功能区或个别氨基酸的删除或取代来降低毒素分子的非特异毒性,提高对靶细胞的特异毒性、改善分子的受体结合活性和对靶细胞的内化能力,以及降低嵌合毒素的免疫原性或插入不同的识别分子。例如,美国专利5,705,163的主题涉及PE分子的羧基未端在其细胞毒活性中的作用,以及PE分子羧基末端上适于插入为选择性杀伤靶细胞所需的识别分子(导向分子)的特定区域;美国专利5,821,238公开了缺失Ⅱ区之氨基末端的1至28个氨基酸(例如氨基酸364直接连接到残基381上的经修饰的PE),从而显著提高了对靶细胞的细胞毒性的修饰的PE。美国专利5,621,078公开了用丙氨酸取代残基265和287上的两个半胱氨酸;或者用丙氨酸取代残基265、287、372和379上的四个半胱氨酸,以得到改变了生物学活性(包括提高了细胞杀伤活性并降低了受体结合活性)的修饰的PE分子(还参见欧洲专利申请6,383,599)。
然而,一个不容忽视但目前未引起普遍关注的问题是,为了使嵌合分子与靶细胞表面受体更有效地结合,它必须具有适当的空间构象。这种适当地构象不仅取决于嵌合分子的毒素部分,而且也在很大程度上受到导向(或寻靶)部分的影响。两个部分融合后,在形成新的二维和三维结构时,导向部分应有足够的配体结合基团暴露于受体分子,并与之稳定地结合。特别是在使用已删除了受体结合区(Ⅰa区)的PE40作为毒素部分的情况,这一点就显得尤为重要。本发明人在成功地构建了可选择性地杀伤表达的细胞介素6(IL-6)受体的IL6-PE融合蛋白质的基础上,试图进一步对IL6分子进行必要的修饰,进而将其偶联到同样经过修饰的PE40分子上。结果令人惊奇地发现,与未修饰IL6-PE40相比,经修饰IL-6后制得的融合蛋白质大大提高了其受体结合活性和对携带IL-6受体之靶细胞的细胞毒活性,从而成功地完成了本发明。
本发明的一个目的是提供包括连接到细胞毒性蛋白质上的IL-6的融合蛋白质,特征在于其中作为导向部分的IL-6的氨基末端最多的超过28个氨基酸的缺失。
根据本发明这一目的的优选实施方案,其中所说的IL-6是缺失了氨基末端22个氨基酸的IL-6。
根据本发明这一目的的优选实施方案,其中所说的细胞毒性蛋白质是PE40。
本发明的另一个目的是提供含有上述修饰的IL-6-PE40融合蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
根据本发明这一目的的一个特别优选的实施方案,其中所说的IL-6-PE40融合蛋白质分子中作为导向部分的IL-6是缺失了氨基末端22个氨基酸的修饰的IL-6。
本发明的再一个目的是涉及按本发明的方法制得的修饰的IL-6-PE40融合蛋白质作为抗肿瘤剂的应用。
图1显示用于表达IL6(△1-22)-PE40的重组质粒pKIL6P40的构建。
图2显示IL6(△1-22)-PE40对各种培养的肿瘤细胞系的蛋白质合成抑制作用;●-●,SP2/0细胞;▲-▲,HepG2细胞;■-■,HL-60细胞;※-※,Hep2细胞;○,L929细胞;△,K562细胞;□,HeLa细胞。
图3显示IL6(△1-22)-PE40与未经修饰的IL6-PE40嵌合毒素对SP2/0细胞系的蛋白质合成抑制作用的比较。结果以相对于未加嵌合毒素的阴性对照组的百分抑制率表示。●-●,IL6(△1-22)-PE40;△-△,IL6-PE40。
图4显示部分纯化的IL6(△1-22)-PE40对与SP2/0细胞浆膜结合的125I-IL6的置换。○,IL6(△1-22)-PE40;●,IL6-PE40。
图5显示纯化的IL6(△1-22)-PE40和未修饰的IL6-PE40对接种肿瘤细胞(SP2/0细胞系)的BALB/c小鼠体内肿瘤生成的影响。结果以治疗10天后带瘤小鼠的百分数表示。交叉线用方框代表IL6(△1-22)-PE40;竖直线直方框代表IL6-PE40。
本发明涉及改良的靶细胞特异性嵌合毒素,特别是涉及通过修饰所说的嵌合毒素分子中的导向部分以改善所说的嵌合毒素与靶细胞受体的结合特异性及稳定性。作为一个典型实例,本发明具体描述了包括由IL-6的受体结合部分和PE的活性区域组成的融合蛋白质,其制备方法、含有基本上纯的所说的融合蛋白质的药物组合物,以及所说的药物组合物在控制肿瘤细胞生长中的应用。
人白细胞介素(IL-6)是正常哺乳动物细胞产生的一种多功能细胞介素,其具有刺激多种类型的细胞分化与生长的功能。已知成熟的人IL-6由184个氨基酸组成,分子氨基端主要是生物学活性区,羧基末端主要是受体结合区,两区域形成反向平行的A、B、C、D四个螺旋束。已证实天然IL-6缺失第1-28位氨基酸对分子整体的生物学活性没有明显影响。但如缺失Arg31或Asp35则可使其活性分别降低50和10,000倍。根据对人和鼠IL-6原始结构的疏水性和同源性比较,推测残基Glu29-Leu34虽不是分子的活性部位,但它们与羧基末端形成一个疏水中心,对分子的正确折叠起着重要作用。有人证明缺失Glu29可使生物学活性降低约500倍(Brakenoff,et al.,J.Immunol.145561,1990)。然而,既使缺失至第49位Asn残基,仍没有丢失分子的受体结合活性,并且已知其中第29至34位氨基酸残基是构成IL-6活性结构临介区域(Brakenoff,J.Immunol.,1431175,1989)。从三维空间结构上看,31位和35位残基与118位和121位残基形成的受体结合位点在空间上恰好与157-160位残基形成的位点处于两个相反方向,它们在两个方向上结合两个受体亚单位gp130。其中31+35位残基处于A螺旋中,118和121位残基处于C螺旋中,改变这四个残基将导致分子不能与gp130结合,进而丧失生物学活性(Kishimoto,Blood.741,1989)。
另一方面,已知白细胞介素6受体(IL-6R)由IL-6受体结合蛋白(gp80)和信号转导蛋白(gp130)两个亚单位组成。其中,gp80负责与配体IL-6的结合及随后与gp130亚基偶联,gp130则主要参与信号转导,因此通常将gp80称为IL-6R。IL-6R分布于淋巴细胞及多种类型的非淋巴细胞上,但肿瘤细胞上IL-6R的数目要比非肿瘤细胞(包括淋巴细胞)高2-20倍(如参见Yawata et al.,EMBDJ.121705,1993)。
在一些肿瘤发生时,往往伴有IL-6R表达的异常和其亲和力的改变。例如,已知多发性骨髓瘤病人的血浆中具有高水平的HL-6和可溶性IL-6R。现已证明,IL-6R的高水平表达是诱发骨髓瘤的重要环节之一。另外,发现培养的肝癌细胞系(HepG2)、髓样白血病细胞系(HL-6)、前列腺癌细胞系(PC-3)等肿瘤细胞系均以高水平表达IL-6R。这些表达水平约相当于同一组织来源的正常细胞的5-200倍。而且其中高亲和力受体的数目约占总受体数目的10%,高、低亲和力受体的KD值相差约100倍。
基于上述基础研究和临床分析,我们确定使用氨基末端缺失22个氨基酸的IL-6[即IL-6(△1-22)]作为PE分子的载体或导向部分,与缺失完整PE分子之Ia区的PE40(作为毒素部分)融合,以制备肿瘤细胞靶特异性的嵌合毒素IL-6(△1-22)-PE40。就IL-6与PE40的连接方式而言,虽然有人已证明IL6-PE40、IL6-PE40-PE40和PE40-IL6-PE40三种连接方式所得到融合蛋白质中以IL6-PE40的细胞毒性为最强(Siegall,C.B.et al.,J.Biol.Chem.26516318,1990),但考虑到嵌合毒素的受体结合能力、效率及特异性、分子大小和免疫原性,以及融合蛋白质的细胞穿透能力等综合因素,特别是考虑到其潜在的临床实用性,发明人确定以表现有最小LD50值的IL-6-PE40结合方式制备本发明的嵌合毒素。
可按照本领域技术人员已知的重组DNA技术(例如参见Sambrook et al.,Molecula CloningA Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,2thed.,1989)完成各种操作。首先,可用适当的核酸内切酶从携带PE40基因的起始质粒如pVC8中切出编码PE40毒素的核苷酸片段,并用同样的核酸内切酶从质粒pBluescript中切出较大的载体片段。然后于T4 DNA连接酶存在下,将PE40基因片段连接到载体pBluescript上。经酶切鉴定后,得到携带PE40基因的重组中间质粒pBluescript-PE40。
然后在四种脱氧核苷三磷酸存在下,使用合成的寡核苷酸引物,并以pUC19-IL-6 cDNA作为模板,经PCR反应扩增氨基末端缺失22个氨基酸的IL-6(△1-22)。
在标准反应条件下,将已用同样的核酸内切酶双酶切的携带PE40基因的中间质粒与N端截短的IL-6基因一起进行连接反应。用所得的连接反应混合物转化适当的大肠杆菌细胞并保温后,挑选抗生素抗性菌落并对被转化菌株所包含的质粒DNA进行酶切鉴定。选择连接正确的重组质粒进行DNA序列分析。
用适当的内切酶切割如上得到的重组质粒,然后将包含PE40和IL-6(△1-22)核苷酸编码序列并带有适当的酶切位点的DNA序列连接到质粒载体pKK-223-3中。经进一步的酶切鉴定后得到以高水平表达本发明的IL-6(△1-22)-PE40融合蛋白质的重组表达质粒pKIL6P40。图1显示了重组表达质粒pKIL6P40的构建策略。
用如上得到的重组表达质粒pKIL6P40转化适当的大肠杆菌宿主细胞,并在适于表达所需的融合蛋白质的条件下,培养被转化细胞。培养后收获并经超声处理破碎细胞。超离心收集包涵体并在适当的缓冲液中经变性和复性处理,再次超速离心并收集上清液,将该上清液对磷酸盐缓冲盐水透析后得到IL-6(△1-22)-PE40融合蛋白质的粗提物。
可用细胞毒性检测法检测粗提物或经离子交换和凝胶过滤层析后得到的部分纯化的融合蛋白质的细胞毒活性。部分纯化过程中使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Western印迹法监测洗脱的蛋白质样品。
由于融合蛋白质主要以包涵体形式积聚在细胞的不溶性部分中,从而有利于通过对不溶性部分的变性和复性部分纯化重组蛋白质。
部分纯化的部分富集了IL-6(△1-22)-PE40融合蛋白质,故可使我们能够检测其体外细胞毒活性。经进一步离子交换和凝胶过滤纯化后,蛋白质产物的纯度约达到96%。经SDS-PAGE分析各纯化步骤的洗脱产物,显示于一条相当于59KD分子大小的主带。用放射标记的PE40所作的免疫印迹分析进一步证实这些数据。
可用四项基本试验鉴定由IL-6和PE40连接而成的杂交分子的性质(1)ADP核糖基化试验用于检测抑制哺乳动物蛋白质合成的IL-6(△1-22)-PE40的酶促活性;(2)竞争性结合抑制试验检测杂交分子对结合于小鼠骨髓瘤SP2/0细胞膜囊泡表面IL-6受体上的放射标记之IL-6的抑制作用,借以估计IL-6(△1-22)-PE40的IL-6受体结合活性;(3)细胞毒性试验检测IL-6(△1-22)-PE40对各种原代培养物及细胞系的细胞毒活性;(4)体内抗肿瘤活性试验用接种骨髓瘤细胞系的活体动物模型估测IL-6(△1-22)-PE40的体内抗肿瘤活性。所有试验中使用按同样方法制备的未经修饰的IL6-PE40和在同样条件下表达并提取的PE40作为对照。
通过检测蛋白质合成抑制作用来估计部分纯化的IL-6(△1-22)-PE40对不同恶性增殖细胞系的细胞毒活性。结果发现,本发明的融合蛋白质能够以剂量依赖方式杀伤细胞,并且在不同细胞系之间有着较大差异。由表1和图2所示的结果可以看出,本发明的IL6(△1-22)-PE40融合蛋白质对所试验的几个肿瘤细胞系表现的细胞毒性强弱依次是骨髓瘤SP2/0细胞系,肝腺癌HepG2细胞系,急性髓样白血病HL-60细胞系,喉癌Hep2细胞系。引起50%细胞死亡的IL-6(△1-22)-PE40的量依次为0.3、0.7、0.9、1.3μg总蛋白质/孔(表1)。这些实验结果还显示,本发明的融合蛋白质对纤维瘤L929细胞系和子宫颈癌HeLa细胞系的细胞毒性相对小得多。另外,虽然急性髓样白血病细胞(HL-60)对IL-6(△1-22)-PE40十分敏感,但在相同浓度下融合蛋白质对慢性白血病细胞系(K562)的毒性作用则明显较小。这些结果可能与某些肿瘤细胞表面的IL-6受体数目有关,并且提示在肿瘤发育的不同阶段,其细胞表面受体的数目、分布及受体-配体亲和性可能有所变化。因此,在临床实践中,根据病人所患肿瘤的细胞来源和性质,并基于必要的体外细胞毒性和敏感性试验,预先确定病人是否适于使用本发明的融合蛋白质并选择适当的用药剂量将是十分重要的。
表2和图4显示本发明的IL-6(△1-22)-PE40与作为阳性对照的IL6-PE40融合蛋白质对SP2/0骨髓瘤细胞系的IL-6受体结合活性和细胞毒性(ID50)的比较。这些结果清楚地表明,与未对导向部分修饰的IL-6-PE40融合蛋白质相比,本发明的IL-6(△1-22)-PE40显著地提高了抑制放射标记的白细胞介素-6与SP2/0细胞膜上白细胞介素6受体结合的能力,并且提高了其杀伤SP2/0细胞的能力。总地说来,这些结果进一步提示IL-6(△1-22)-PE40似乎比未经修饰的IL-6-PE40具有更好的靶特异性和细胞毒活性。
对携带肿瘤移植物的实验动物的治疗实验将为本发明IL-6(△1-22)-PE40嵌合毒素的细胞毒性和临床适用性提供更为直接的证据。从图5所示的结果可以看出,在小鼠腹腔内接种SP2/0细胞后36小时用修饰的嵌合毒素处理小鼠,可见IL-6-PE40和本发明的IL-6(△1-22)-PE40均以剂量依赖方式阻止肿瘤发育,高剂量(40ng/天/小鼠)组有效率分别为80%和90%,低剂量组(20ng/天/小鼠)有效率分别为60%和70%。相反,只接受IL-6和PBS的对照组,则分别有70%和80%的小鼠腹腔内出现了肉眼可见的实体肿瘤。体内肿瘤生成抑制实验中对本发明的IL-6(△1-22)-PE40与未经修饰的IL-6-PE40融合蛋白质的比较研究进一步证明了上述体外实验的结果。
在对IL-6(△1-22)-PE40和IL-6-PE40的体外和体内肿瘤抑制实验中,出现这种显著差异的原因是多方面的,但我们推测可能是由于删除了IL-6分子中的前22个氨基酸,从而提高了嵌合毒素的受体结合效率,减少了毒素进入细胞的空间位阻以及分子折叠后更有利于细胞内蛋白酶对PE40的切割。
可将本发明的IL-6(△1-22)-PE40嵌合全毒素作为基本活性成分,并加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂,制成适于临床上用于肿瘤治疗目的的药物组合物。其中所说的载体或赋形剂包括但不只限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液、葡聚糖、乳糖及右旋糖苷等。根据所治疗的肿瘤类型及疾病严重程度的不同,可在本发明的药物组合物中加入一种或多种与本发明的嵌合毒素有辅助或协同作用的其他天然、合成或重组来源的活性化合物。另外,可在本发明的药物组合物中加入选自人血清白蛋白、低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸等氨基酸及金属Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等金属离子的蛋白质保护剂,以及选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂。
可通过常规给药途径,最好是胃肠道外途径投用本发明的药物组合物,例如通过静脉内、肌肉内、体腔内、器官腔内、皮内、皮下或粘膜内途径给药。本发明的药物组合物的用药剂量可从几毫微克至几毫克/天,但每个病人的具体用药剂量将取决于待治疗的疾病的性质、类型和严重程度、病人的年龄、体重、一般状况和对药物的敏感性,以及所使用的给药方式和途径等因素。
本发明的IL-6(△1-22)-PE40嵌合毒素的一个优选用途是治疗肿瘤,特别是治疗以IL-6为导向因子或配体结合因子的肿瘤,其中包括但不只限于肝癌、胃癌、喉癌、膀胱癌、结肠癌、乳癌、多发性骨髓瘤、淋巴癌、神经胶质瘤、急性髓性白血病和急性淋巴样白血病等恶性增生性疾病。IL-6(△1-22)-PE40的另一个优选的治疗应用是用于治疗自家兔疫病及其他由T和B细胞引起的免疫系统疾病,如器官移植物排斥反应、红瘢狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、多发性硬化症等。
另一方面,本发明的IL-6(△1-22)-PE40可以作为诊断试剂用于对手术切除的肿瘤或活体病理组织或细胞进行体外组织病理学检查、组织化学分析及进行细胞杀伤和特异性结合分析,借以判定靶肿瘤的治疗敏感性及用药剂量。
下列实施例旨在进一步举例描述本发明,而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
实施例1重组表达载体的构建Ⅰ.起始质粒的大量制备分别用携带PE40基因的pVC8(Novagen)、pUC19/IL-6和pBluescript SK质粒DNA(各100ng)转化感受态大肠杆菌JM105。然后将被转化的细胞接种于含氨苄青霉素(500μg/ml)的LB培养基中,37℃振荡培养24小时。提取质粒DNA后,分别用XbaI和EcoRI从pVC8中切出含PE40基因的约12kb片段。用同样的酶双酶切pBluescript,得到长约295kb的大的载体片段。于T4连接酶存在下,将PE40退火连接到pBluescript载体片段上,形成环化的质粒pBluescript-PE40。经酶切(NdeI+EcoRI和ApaI+SacI)鉴定后,于-20℃下保存备用。
Ⅱ.在标准反应条件下,使用合成的寡核苷酸引物15’-CCGAGCTCGAATTCATGTCAGAACGAATTGACAAAC-3’(SEQ ID NO1)和引物25’-CTACATATGCCGAAGCCCTC-3’(SEQ ID NO2),并用质粒pUC19/IL-6的线性化cDNA作为模板,PCR扩增含IL-6(△1-22)基因的DNA片段。分别用SacI+NdeI双酶切扩增的IL-6片段和上文(Ⅰ)中所述的质粒pBluescript-PE40。回收所得到的SacI-NdeI片段后,按IL-6片段pBluescript-PE40约4∶1的摩尔比例混合,在T4 DNA连接酶存在下进行连接反应,以使IL-6(△1-22)片段连接到PE40基因的5’末端上,得到重组质粒pBIL6-PE40。
Ⅲ.用得到连接反应混合物转化大肠杆菌JM109,并将被转化的菌株37℃保温2小时。然后挑选阳性菌落,并提取质粒DNA进行酶切鉴定,进一步测定重组DNA的核苷酸序列,以证实IL-6(△1-22)和PE40的存在。分别用EcoRI消化(37℃,2小时)pBIL6-PE40和质粒pKK-223-3(Pharmacia),并电泳分离包含IL-6(△1-22)与PE40基因的片段(1700bp)和pKK载体片段。将所得两片段按4∶1的摩尔比例混合后进行连接反应,并用反应混合物转化大肠杆菌JM105。培养被转化的细胞,并对其所包含的质粒DNA进行酶切鉴定和序列分析,进一步证实IL-6(△1-22)和PE40融合基因的存在。SEQ ID NO3和SEQID NO4分别列出了IL6(△1-22)-PE40基因的核苷酸序列和由之编码的氨基酸序列。将如此得到重组表达质粒定名为pKIL6-PE40。
图1显示了用于表达IL6(△1-22)-PE40融合蛋白质的重组表达质粒中pKIL6-PE40的构建。
实施例2嵌合毒素的表达和纯化Ⅰ.用重组质粒pKIL6-PE40转化大肠杆菌JM105,并于37℃培养至对数生长期。扩大接种于含氨苄青霉素的LB培养基上培养至OD值约为1.0~1.2时加入IPTG诱导2.5小时。离心收集细胞并于-70℃放置3小时。融解冷冻的细胞沉淀物并悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA,0.2mg/ml溶菌酶)中,然后超声处理(3×30秒),并以25,000×g离心20分钟。除去上清(可溶部分)并将沉淀物悬浮于变性缓冲液(6M盐酸胍,0.2M Tris-HCl,pH8.4,1mM EDTA,50mM NaCl和10mM二硫苏糖醇)。再次离心后将蛋白质稀释到重折叠缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA,0.25M NaCl和5mM二硫苏糖醇)中(1∶50),并于4℃放置24小时。将重折叠的蛋白质对PBS透析后,用于细胞毒性试验,或用离子交换或凝胶过滤法进一步纯化。
Ⅱ.在复性的蛋白质溶液中加入DEAE-Sepharose Fast Flow树脂(Pharmacia)并混合均匀(4℃,30分),然后装入玻璃柱内,并用含0.1M NaCl的TE缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)洗柱(A280≈0)。用含有0.1-0.5mlNaCl梯度的TE缓冲液洗脱嵌合毒素。收集洗脱物并使用装有YM-35膜的Amicon浓缩器浓缩后,使浓缩物通过在含有0.4M NaCl的0.2M磷酸钾缓冲液(pH6.5)中平衡过的Sephacryl S-200 HR柱(Pharmacia)。用含0.1-0.5M NaCl梯度的TE缓冲液洗脱高纯度的嵌合毒素。收集洗脱的峰值部分并对PBS透析后分装保存(-20℃)。
实施例3样品检测与生物学分析Ⅰ.样品纯化步骤中,按照Chung和Collier(J.Infect.Immun,16832-841,1977)所述的方法,将各蛋白质制剂与[14C]NAD和富集延伸因子2的麦胚提取物一起保温,检测各洗脱部分的ADP核糖基化活性。同时,使用市售的Vectastain试剂盒(Vector Laboraories,Inc.)并用兔抗PE抗血清对各洗脱部分进行Western印迹分析。另外,用SDS-PAGE法检测蛋白质含量,并估计分子大小。
Ⅱ.使用已建株的各种肿瘤细胞作为靶细胞,检测本发明的IL6(△1-22)-PE40的细胞毒活性。简单地说,将常规培养的肿瘤细胞(200μl培养基各含约106个细胞)接种于96孔微量滴定板的各孔内,在5%CO2环境下37℃保温过夜后向各孔内加入不同浓度的IL6(△1-22)-PE40以及对照样品PE40。37℃保温24小时后加入3H标记的亮氨酸(Amersham,Corp.)(5μCi/孔),继续保温12小时。将平板置于-70℃冷冻2小时并37℃快速融解后,将细胞收获到玻璃纤维滤膜上,然后用β计数器检测掺入到细胞中的放射活性。结果以未接触蛋白质之对照组的百分掺入率表示。表1 IL6(△1-22)-PE40对不同组织来源的肿瘤细胞系的生长抑制作用 从表1和图2所示的结果可以看出,本发明IL6(△1-22)-PE40能够以剂量依赖方式杀伤多种不同组织来源的肿瘤细胞。从加入嵌合毒素后24小时的细胞死亡数所反映的对靶细胞氨基酸掺入量的抑制作用看,本发明的IL6(△1-22)-PE40对骨髓瘤、肝腺癌、急性髓样白血病及人喉癌等多种细胞系均具有显著的细胞毒活性(ID50值为0.3-1.3μg蛋白质/孔)。然而,对其他组织来源或不同发育阶段的肿瘤细胞系(纤维瘤和慢性髓样白血病细胞系)则表现出低得多的细胞毒性(ID50值为1.6-2.5μg蛋白质/孔)。
另外,从图3所示的比较试验结果还可以看出,本发明的IL6(△1-22)-PE40似乎较未经修饰的IL6-PE40毒素对SP2/0细胞具有更好的生长抑制作用。
为了证实细胞毒活性的特异性,实验中使用了在同样条件下表达并部分纯化的单纯PE40蛋白质作对照样品,结果未见PE40有实质性的肿瘤生长抑制作用(结果未示出)。
Ⅲ.基本上按照Qayum等人(Br.J.Cancer 6297-99,1990)所述的方法,用SP2/0细胞的胞浆膜进行IL6(△1-22)的特异性结合实验。简单地说,将SP2/0细胞(约106个)悬浮在含有10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM二硫苏糖醇、0.1%BSA,1mM EDTA的缓冲液中制备细胞匀浆。4℃离心(500×g)15分钟后,取上清再次以20,000×g离心20分钟并将浆膜沉淀物悬浮于上述缓冲液中。
按每孔100μg(终体积100μl)将如上制备的膜蛋白加于24孔滴定板中,然后各加入10-6M125I-IL-6,在加或不加[125I]标记的IL-6或IL6(△1-22)-PE40或IL-6-PE40条件下,4℃保温3小时。保温后,用5ml上述缓冲液通过Whatman滤纸洗样品并用γ计数器测定残留的放射活性(cpm)。所有结合试验样品均一式三份。在未标记的IL-6存在下确定非特异性结合。
图4显示了部分纯化的(过DEAE柱后)IL6(△1-22)-PE40(0)和IL6-PE40(●)在未标记的IL-6存在下置换与SP2/0细胞的胞浆膜结合的125I-IL-6的能力。其中B代表在竞争物IL-6、IL6(△1-22)存在时与膜结合的125I-IL-6的量(cpm);Bo代表在没有竞争物存在时与膜结合的125I-IL-6的量(cpm)。从中可以看出,加入渐增浓度的IL6(△1-22)-PE40融合蛋白质,可随浓度逐渐增加而逐渐置换与骨髓瘤SP2/0细胞浆膜结合的125I-IL-6。在同样条件下表达并纯化的IL6-PE40也得到相似的结果,但后者的置换能力显然低于前者。
Ⅳ.为了进一步研究本发明的IL6(△1-22)-PE40融合蛋白质对肿瘤细胞的体内杀伤能力,我们建立了骨髓瘤带瘤动物模型,并观察和记录了用本发明的嵌合毒素处理后小鼠体内实体瘤的发生率。简单地说,将饲养的雄性Balb/c小鼠随机分为6组,每组10只。实验组(第1-4组)分别经腹腔内注射(i.p.)约1.2×106个SP2/0骨髓瘤细胞。接种肿瘤细胞后36小时(第四天)按5和100μg天/小鼠的剂量分别用纯化的IL6(△1-22)-PE40和IL6-PE40治疗小鼠(i.p.)。对照组(第5和6组)则投用(i.p.)含等摩尔量IL-6的等体积的PBS。每天注射一次,连续治疗10天后处死带瘤动物,经开腹解剖观察,肉眼可见的实体瘤生成。
从图5所示的结果看出,修饰和未修饰的IL6-PE40均以剂量依赖方式阻止肿瘤发育,但与未修饰的IL6-PE40相比,本发明的IL6(△1-22)-PE40显然具有更强的肿瘤生长抑制活性。
序列表(1)一般信息(Ⅰ)申请人中国人民解放军农牧大学(Ⅱ)发明名称改善了靶细胞受体结合活性的融合蛋白质(Ⅲ)序列数5(Ⅵ)通讯地址(A)联系人朱平(B)街道西安大路175号(C)城市长春(D)邮编130062(E)国家中华人民共和国(V)计算机可读形式(A)介体类型3.5英寸软盘CXXⅢ(B)计算机IBM PC(C)操作系统WINDOWS95(D)软件WORD97(Ⅵ)电讯信息(A)电话86-0431-7962109(B)电传86-0431-7973911-66692(2)SEQ ID NO1的信息(Ⅰ)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO1CCGAGCTCGA ATTCATGTCA GAACGAATTG ACAAAC(2)SEQ ID NO2的信息(Ⅰ)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO2CTACATATGC CGAAGCCCTC(2)SEQ ID NO3的信息(Ⅰ)序列特征(A)长度492碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO3ATGTCAGAAC GAATTGACAA ACAAATTCGG TAGATCCTCG ACGGCATCTCAGCCCTGAGA AAGGAGACAT GTAACAAGAG TAACAGTTGT GAAAGCAGCAAAGAGGCACT GGCAGAAAAC CTGAACCTTC CAAAGATGGC TGCTGAAAAAGATGGATGCT TCCAATCTGG ATTCAATGAG GAGACTTGCC TGGTGAAAATCATCACTGGT CTTTTGGAGT TTGAGGTATA CCTAGAGTAC CTCCAGAACAGATTTGAGAG TAGTCAGGAA CAAGCCAGAG CTGTGCAGAT GAGTACAAAAGTCCTGATCC AGTTCCTGCA GAAAAAGGCA AAGAATCTAG ATGCAATAACCACCCCTGAC CCAACCACAA ATGCCAGCCT GCTGACGAAG CTGCAGGCACAGAACCAGTG GCTGCAGGAC ATGACAACTC ATCTCATTCT GCGCAGCTTTAAGGAGTTCC TGCAGTCCAG CCTGAGGGCT CTTCGGCATA TG(2)SEQ ID NO4的信息(Ⅰ)序列特征(A)长度1092碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO4GCCGAAGAGG GCGGCAGCCT GGCCGCGCTG ACCGCGCACC AGGCTTGCCACCTGCCGCTG GAGACTTTCA CCCGTCATCG CCAGCCGCGC GGCTGGGAACAACTGGAGCA GTGCGGCTAT CCGGTGCAGC GGCTGGTCGC CCTCTACCTGGCGGCGCGGC TGTCGTGGAA CCAGGTCGAC CAGGTGATCC GCAACGCCCTGGCCAGCCCC GGCAGCGGCG GCGACCTGGG CGAAGCGATC CGCGAGCAGCCGGAGCAGGC CCGTCTGGCC CTGACCCTGG CCGCCGCCGA GAGCGAGCGCTTCGTCCGGC AGGGCACCGG CAACGACGAG GCCGGCGCGG CCACCGCCGACGTGGTGAGC CTGACCTGCC CGGTCGCCGC CGGTGAATGC GCGGGCCCGGCGGACAGCGG CGACGCCCTG CTGGAGCGCA ACTATCCCACT GGCGCGGAGTTCCTCGGCGA CGGCGGCGAC GTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGACCTGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCAC CGCCAACTGG AGGAGCGCGGCTATGTGTTCG TCGGCTACCA CGGCACCTTC CTCGAAGCGG CGCAAAGCATCGTCTTCGGC GGGGTGCGCG CGCGCAGCCA GGACCTCGAC GCGATCTGGCGCGGTTTCTAT ATCGCCGGCG ATCCGGCGCT GGCCTACGGC TACGCCCAGGACCAGGAACC CGACGCACGC GGCCGGATCC GCAACGGTGC CCTGCTGCGGGTCTATGTGC CGCGCTCGAG CCTGCCGGGC TTCTACCGCA CCAGCCTGACCCTGGCCGCG CCGGAGGCGG CGGGCGAGGT CGAACGGCTG ATCGGCCATCCGCTGCCGCT GCGCCTGGAC GCCATCACCG GCCCCGAGGA GGAAGGCGGGCGCCTGGAGA CCATTCTCGG CTGGCCGCTG GCCGAGCGCA CCGTGGTGATTCCCTCGGCG ATCCCCACCG ACCCGCGCAA CGTCGGCGGC GACCTCGACCCGTCCAGCAT CCCCGACAAG GAACAGGCGA TCAGCGCCCT GCCGGACTACGCCAGCCAGC CCGGCAAACC GCCGCGCGAG GACCTGAAGT AA(2)SEQ ID NO5的信息(Ⅰ)序列特征(A)长度氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型蛋白质(Ⅲ)序列描述Met-Ser-Glu-Arg-Ile-Asp-Lys-Gln-Ile-Arg-Tyr-Ile-Leu-Asp-Gly-Ile-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys-Glu-Thr-Cys-Asn-Lys-Ser-Asn-Met-Cys-Glu-Ser-Ser-Lys-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Asn-Leu-Asn-Leu-Pro-Lys-Met-Ala-Ala-Glu-Lys-Asp-Gly-Cys-Phe-Gln-Ser-Gly-Phe-Asn-Glu-Glu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Ile-Ile-Thr-Gly-Leu-Leu-Glu-Phe-Glu-Val-Tyr-Leu-Glu-Tyr-Leu-Gln-Asn-Arg-Phe-Glu-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gln-Met-Ser-Thr-Lys-Val-Leu-Ile-Gln-Phe-Leu-Gln-Lys-Lys-Ala-Lys-Asn-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Thr-Pro-Asp-Pro-Thr-Thr-Asn-Ala-Ser-Leu-Leu-Thr-Lys-Leu-Gln-Ala-Gln-Asn-Gln-Trp-Leu-Gln-Asp-Met-Thr-Thr-His-Leu-Ile-Leu-Arg-Ser-Phe-Lys-Glu-Phe-Leu-Gln-Ser-Ser-Leu-Arg-Ala-Leu-Arg-Gln-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Gly-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asp-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Aln-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Gln-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Gln-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Len-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Glr-Asn-Trp-Thr-Val-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Gln-Gln-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Gln-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Gln-Asp-Leu-Asp-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Gln-Pro-Asp-Ala-Gly-Arg-Ile-Arg-Asp-Gly-Ala-Leu-Len-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Len-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Gln-Ala-Ala-Gly-Gln-Val-Gln-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Gln-Gln-Gly-Gly-Arg-Leu-Gln-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Gln-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Gln-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Arg-Gln-Asp-Leu-Lys-end
权利要求
1.包括连接到细胞毒性蛋白质上的修饰的IL-6的融合蛋白质,特征在于其中对所说的作为导向部分的IL-6的修饰包括删除氨基末端最多不超过28个氨基酸。
2.根据权利要求1的融合蛋白质,其中所说的修饰包括删除对作为导向部分的IL-6的氨基末端22个氨基酸。
3.根据权利要求1的融合蛋白质,其中所说的细胞毒性蛋白质是PE40。
4.含有权利要求1的修饰的IL6-PE40融合蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
5.根据权利要求4的药物组合物,其中所说的修饰的IL6-PE40融合蛋白质分子中作为导向部分的IL-6是缺失氨基末端22个氨基酸的IL-6。
6.根据权利要求5的药物组合物作为抗肿瘤剂的应用。
全文摘要
本发明涉及由假单胞菌衍生的重组毒素与细胞因子连接而成的融合蛋白质,特别是涉及以重组DNA技术修饰作为导向部分的细胞因子以提高与毒素部分融合所产生的嵌合毒素的靶细胞受体结合活性。本发明进一步涉及含有所说的融合蛋白质的药物组合物,以及所说的药物组合物在肿瘤治疗中的应用。
文档编号C07K14/435GK1293207SQ9912220
公开日2001年5月2日 申请日期1999年10月13日 优先权日1999年10月13日
发明者朱平, 柳增善 申请人:中国人民解放军农牧大学军事兽医研究所