专利名称：腺苷二磷酸核糖基化因子样蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核糖基化因子样蛋白，特别涉及一种腺苷二磷酸(ADP)核糖基化因子样蛋白。
ADP核糖基化因子(ARFs)是一族蛋白，每个因子大小约为20千道尔顿，并能结合和水解GTP。ARFs也具有加强霍乱毒素ADP-核糖基转移酶活性的特性[Kahn等人，生物化学杂志(J Biol Chem)2596228-6234，1984；和Tsai等人，生物化学杂志2631768-1772，1988]。ARF家族的一些成员参与调控多种细胞如酵母和人细胞的细胞囊泡的转运。
ARF样蛋白(ARL)家族以氨基酸序列同源与ARFs相关，像ARFs一样，ARL家族以结合和水解GTP为特征。然而，ARLs可以区别于ARFs，因为它不加强霍乱毒素的ADP-核糖基转移酶活性。
本发明的特征在于一种特异性结合具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的ARL3多肽的抗体，这个序列可以由SEQ ID NO.1的序列的DNA分子编码。所谓“特异性结合”是指抗体跟具有序列为SEQ IDNO.2的ARL3多肽结合，但在那份试样中不和其它分子特异性结合。例如，本发明的抗体不与酵母ARF和ARL家族的其它成员结合。
本发明的特征还在于一个转基因剔除酵母(例如啤酒酵母)，它有一个同源间断位于内源ARL3基因上，其中的间断阻止一种功能性的ARL3蛋白的表达，与具有野生型ARL3基因相关的剔除酵母的表型包括15℃左右的损伤生长。这种损伤生长可以代表该温度下的野生型酵母生长的50％、10％、5％、或1％。这个间断可以包括一段核酸序列插入到位于亲代酵母基因组上的野生型ARL3基因。或者，该间断可以包括在突变的但有功能的ARL3基因中的插入。在一些实施例中，核酸序列可以编码多肽(比如，一个基因赋予转基因剔除酵母可选择的表型)。例如亲本酵母不能在缺少尿嘧啶的培养基中生长，而可选择的表型可以在缺少尿嘧啶的培养基中生长。
本发明的抗体可被用来分离和克隆能表达出与SEQ ID NO.2同源之多肽的基因。这样一个抗体也可用于测定样品中ARL3的含量。本发明的转基因剔除酵母还可用来识别参与囊泡转运的基因。这些基因可以通过弥补由于ARL3序列的间断造成的生长缺陷来加以识别。
本发明其它之特征或优点根据以下的附图
、发明详述和权利要求将是显而易见的。
本发明涉及对一种表达的酵母ARL3多肽及编码它的核酸的识别。这种多肽和核酸然后用于生产抗体。该抗体分别与ARL3多肽，ARL3基因上有间断的转基因剔除酵母特异性结合。
I、抗体多克隆和单克隆抗ARL3抗体都属于本发明的范围。多克隆抗ARL3抗体可以通过用ARL3抗原免疫接种一个合适的动物，如兔，来制备。免疫接种动物体内抗ARL3抗体的效价可通过标准技术来长期监测，比如用固定化的ARL3的酶联免疫吸附测定(ELISA)。抗ARL3的单克隆抗体分子可从哺乳动物中分离(如从哺乳动物的血中)，然后用一种公知的技术进行纯化，如用蛋白A色谱获得IgG片段。在免疫接种后的一个合适的时间，如当抗ARL3抗体效价最高时，抗体产生细胞可从实验对象中获得，再用标准技术来制备单克隆抗体，比如杂交瘤技术，它最早由Kohler等人，自然(Nature)256495-497，1975；Kozbor等人(1983)今日免疫学(Immunol Today)472，1983；和Cole等人，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96，1985.描述。生产各种单克隆抗体杂交瘤技术是公知的[例如Coligan等人eds.，当前免疫学技术(Current Protocols in Immunology)，John Wiley& Sons，Inc.，New York，NY，1994]。简单地说，一个无限增殖细胞系(典型的如骨髓瘤)与从用ARL3抗原免疫的哺乳动物获得的淋巴细胞(如脾细胞)融合，得到的杂交瘤细胞的上清液培养物被筛选来识别能产生与ARL3结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
任意公知的用于淋巴细胞和无限增殖细胞系融合的方法，可用于制备抗ARL3单克隆抗体[例如，当前免疫学技术，见上文；Galfre等人(1977)自然26655052；R.H.Kenneth，in Monoclonal AntibodiesA NewDimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，NewYork(1980)；and Lerner(1981)Yale生物医学杂志(J.Biol.Med.)，54387-402]，而且本领域熟练的技术人员会认识到有如此多样的方法，并且每种都有用。典型的如，无限增殖细胞系(如，骨髓瘤细胞)和淋巴细胞由同种哺乳动物获得。例如，鼠源杂交瘤细胞可通过融合淋巴细胞和鼠源无限增殖细胞系，例如一个对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷培养基(HAT培养基)敏感的骨髓瘤细胞系融合来制得的。上面所说的淋巴细胞是从一个用本发明免疫原性制剂免疫接种的老鼠身上取得。大量骨髓瘤细胞系的任一种根据标准技术可被用作融合配体，如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-X63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可由ATCC获得。典型地，HAT-敏感鼠骨髓瘤细胞系和鼠脾细胞利用聚乙二醇(PEG)融和。由融合制得的杂交瘤细胞然后用HAT培养基筛选。这种培养基能杀死非融合的和非再生性的融合骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞没有转化，几天后死亡)。生产本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞系可通过筛选结合ARL3抗体的杂交瘤培养物的上清夜来检测，如利用标准的ELISA测试。
作为制备分泌单克隆抗体杂交瘤的替代方法，一种抗ARL3的单克隆抗体可通过利用ARL3筛选一个重组组合免疫球蛋白文库(如噬菌体抗体展示文库)，从而分离结合ARL3的免疫球蛋白文库成员来识别和分离。产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可从市场获得(例如药用重组噬菌抗体系统，目录号No.27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒分类号No.240612)。另外，特别适合于生产和筛选抗体展示文库的方法和实例可在以下文献中找到美国专利NO.5223409；PCT公开号WO92/18619；PCT公开号WO91/17271；PCT公开号WO92/20791；PCT公开号WO92/15679；PCT公开号WO93/01288；PCT公开号WO92/01047；PCT公开号WO92/09690；PCT公开号WO90/02809；Fuchs等人，生物技术(Bio/Technology)91370-1372，1991；Hay等人，人抗体杂交瘤(Hum Antibod Hybridomas)381-85，1992；Huse等人，科学(Science)2461275-1281，1989；和Griffiths等人，EMBO J 12725-734，1993。
另外，重组抗ARL3抗体，例如包括人和非人部分的嵌合和人源化单克隆抗体都属于本发明的范围内。这些单克隆抗体可由标准重组DNA技术制备。这些嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术来生产，例如利用下面文献中描述的方法PCT公开号No.WO87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开号No.WO86/01533；美国专利号4816567；欧洲专利申请125,023；Better等人，科学2401041-1043，1988；Liu等人，美国科学院年报(Proc Natl Acad Sci USA)843439-3443，1987；Liu等人，免疫学杂志(J Immunol) 1393521-3526，1987；Sun等人，美国科学院年报84214-218，1987；Nishimura等人，癌症研究(CancerRes)47999-1005，1987；Wood等人，自然314446-449，1985；Shaw等人，国家癌症研究杂志(J Natl Cancer Inst)801553-1559，1988；Morrison，科学2291202-1207，1988；Oi等人，生物技术4214，1986；美国专利号5225539；Jones等人，自然321552-525，1986；Verhoeyan等人，科学2391534，1988；和Beidler等人，免疫学杂志1414053-4060，1988。
II.转基因酵母生产本发明转基因酵母的第一步在于制备一个DNA序列(“靶分子”)。这个序列可以在携带ARL3基因的酵母细胞中特异性中断一个ARL3基因并使之丧失功能。靶分子然后用于转染酵母细胞和间隔那些细胞中有功能的ARL3基因。
根据本发明，能够间隔该细胞中居留的一个有功能的ARL3基因的DNA靶分子，可由本领域公知的知识和方法来制得。
本发明的DNA靶分子有两个功能。这两个功能就是整合到自身存在的ARL3抗基因上(靶基因位点)和间断与那个位点相关的ARL3基因的表达，使得非功能性的ARL3表达成为可能。这两个关键的功能依赖于靶分子的两个基本结构特征。
这个靶分子的第一个结构特征是一对与靶基因位点上挑选出区域同源的一对区域。这种同源性(就序列同一性和长度而言)引起靶分子通过碱基配对机制(同源重组)来整合到转染细胞中靶基因位置上挑选出的位点。
同源重组是DNA分子之间或分子内部通过碱基配对机制在序列特异位点(一个或几个)上的DNA区段的重组。本发明涉及一种特殊形式的同源重组，有时称为“基因靶”在基因靶中，一个外源“靶分子”(或“靶片段”)被引入到细胞内。靶分子与待修饰或替代的染色体基因(“靶基因”)有一个或多个同源区。靶基因和靶分子之间的同源区导致外源序列的位点特异性整合。当然，外源基因可能被设计来纠正停留基因上一个存在的缺陷，或是是一个功能性停留基因失活(间断)。本发明还涉及间断ARL3基因。影响已存在于细胞内一个特殊基因结构的基因靶有待区别于其它形式的稳定转化，这其中外来DNA的整合表达是非位点特异性的，从而不能预计其影响细胞中现存的任意特殊基因的结构。
本发明之靶分子的第二个基本特征是一个位于同源区之间的间断序列。这个间断序列通过整合靶分子替代那个靶基因部分后阻止自ARL3靶基因的功能蛋白的表达。
本领域的技术人员将会认识这一点，即本发明许多的ARL3基因靶分子实施例可以被构建来实现上面具体列出的结构和功能要求。下面的实施例描述了用于生产本发明转基因酵母的ARL3基因靶分子的实际构建。以下讨论提出用于生产其它ARL3基因靶分子的设想和参数。
本发明实际生产中可以变化的靶分子参数包括同源区的长度、靶基因位点上的哪一区作为靶分子的同源区而被复制、间断序列的长度、间断序列的同一性和靶基因的哪一序列要被靶分子替代。
与靶分子的间断序列侧面相接的同源区的长度可以有相当大的变动，而不会对本发明实际应用中有显著的影响。同源旁侧区必须有足够的长度，以至在ARL3基因位点上一条靶分子链和一条转染细胞染色体链之间形成有效的异源双链。增加同源区的长度可促进异源双链的形成，从而增加靶效率。然而，将会认识到的是随每个额外的同源碱基对增加而增长的寻靶效率最终减弱，并会被靶分子构建中的实际困难所抵消，因为同源区已超出几千个碱基对。每个同源区长度的有效范围是50到5000个碱基对，而500个是较好的。值得进一步指出的是在DNA靶分子中同源区的精确长度在实际中依赖于ARL3基因位点上和周围限制位点的定位。关于基因靶对同源长度要求的讨论，请见Hasty等人，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)115586-91，1991。
对选择靶基因位点哪个区域作为靶分子上的同源区来复制有相当大的自由度。基本的限制是要被间断区替代的ARL3靶基因序列必须位于靶分子中被作为同源区复制的靶基因位点区域之间，并且靶基因序列的替代必须使得ARL3基因非功能化。应该提到的是在靶分子中作为同源而挑选出的靶基因位点核苷酸序列整合到靶分子上后保持不变。这些靶基因位点序列仅仅被靶分子中同样(同源)的序列替代。靶基因位点上挑选出的区域与靶分子上同源区之间的同一性是靶分子释放间断序列精确进入ARL3靶基因的途径。挑选出的同源区域可能位于ARL3编码序列中，但并不必然是这样。例如，在本发明的一个实施例中，一端同源区可能定位于ARL3基因的5’端，而另一同源区可能定位于ARL3基因的3’端。ARL3的启始密码子和ARL3编码序列5’末端区可能位于挑选出的同源区之间，并被间断序列所取代，结果蛋白的任何部分都无法表达。当间断序列包含一个选择性的标记(或其它基因)，可能会有一个终端密码子位于最小要求的标记编码序列的下游，和标记编码序列的阅读框内，来阻止可能会产生具有ARL3活性ARL3融合蛋白的转录连读。实际情况是，除了某些ARL3基因关键位点位于同源区之间(使得同源区被中断)的要求外，在选择同源区上的主要限制因素是获得克隆的序列和其中限制位点的存在。优选地，作为同源区挑选出的区域不包括在修饰的基因组中已知发生于其它处的超过20个核苷酸的更长序列。靶分子和其它(非靶的)基因组上位点的广泛同源性可能削弱寻靶效率，即采用通过转移靶分子进入非靶位点上的非产物性异源双链的方法。
在本发明靶分子中分离同源区的中断序列的长度也可能有相当大的变化而不会在实际中有显著的后果。中断序列的最短长度为一个碱基对。插入单个的碱基对到ARL3编码序列中会形成一个框漂移突变，从而阻止一个功能性基因的表达。或者，一个碱基对的替代也会导致蛋白质关键位点上一个氨基酸的替代和非功能性蛋白的表达。然而应该承认的是单个碱基对的替换容易通过自发突变恢复到野生型序列。基于这个原因，长于一个碱基对的间断序列有时候更有用处。在另一个极端上，过长的间断序列不可能较一个中等长度的间断序列带来更大的好处，而有可能削弱转染或寻靶的效率。这种情况下的过长基因的长度是比靶基因上挑选出的同源区之间的距离长许多倍。间断序列的长度可以从2到2000个碱基对。作为替代地，间断序列的长度大约等于与靶分子上同源区相称的靶基因位点区域间的距离。
选择间断序列有很大的自由度，因为间断功能是序列非特异性的。然而，间断区域的核苷酸序列不表达一个对转化细胞有害的功能性ARL和蛋白或多肽是很有必要的。间断序列也应不与转化细胞基因组上的位点广泛同源。这种同源有可能减小靶分子的靶效率，还可能严重破坏它的功能。
对本发明的一些实施例来说，优选的是间断序列具有双重功能，即既是一个选择性标记，又是一个间断序列。在那些实施例中，间断序列的长度和同一性将在很大程度上取决于选择性标记编码序列和相关表达控制序列。选择性标记基因给予那些占据和整合靶分子的细胞以阳性选择。选择性标记的需要依赖于选择哪种方法来生产转染细胞和转基因酵母。这些方法的选择依次取决于本发明的实施应用哪种酵母。选择性标记包括抗生素抗性基因、新霉素磷酸转移酶(“neo”)、或胸腺嘧啶激酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶、腺嘌呤核苷脱氨酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、天冬酰胺合成酶和CAD(氨甲酰磷酸合成酶/天冬氨酸转氨甲酰酶/二氢乳清酸酶)。
在这个讨论中，靶分子被描述为一个线性DNA分子。然而，应认识到，本发明的一个靶分子也可以以环状DNA分子的形式包埋。一个环状靶分子可包括被间隔区分隔的一对同源区，就如一个线性靶分子。替代性地，一个环状靶分子可以包括一个单个的同源区。一旦整合到靶基因位点上，环状分子变得线性化，每头有一段同源区。这样，单个的同源区有效地变为两个同源区，这在以下文献有描述Watson等人，基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)(第四版)，Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif.，p.606。环状靶分子与单个同源区的一个不同的方面在于它把间断序列插入靶基因，中断它而不替换任何靶基因。第二个不同方面在于单个同源区必须位于靶基因内，将其5’端定位在ARL3编码序列的一个关键位点。
一个在它ARL3基因上有纯合间断并由于ARL3间断而展示一个可观察表型的转基因酵母可被用来鉴别其他基因，这些基因生物化学途径方面的功能受ARL3蛋白的影响。例如，一个ARL3剔除转基因酵母在15℃显示生长缺陷。一个编码酵母多肽的DNA载体文库然后被引入这些剔除酵母。一个在15℃显示野生型生长的转染剔除酵母可被推测含有一个编码蛋白的载体，这个蛋白抵消了温度敏感生长表型。所以，对由那个载体编码的多肽的分析可以识别参与囊泡转运的基因或蛋白。
若没有进一步的细致工作，人们会认为一个本领域熟练的技术人员，基于上面的公开和下面所述ARL多肽和核酸的分离，能利用本发明达到它的最大限度。以下实施例将被阐明，仅作为本领域普通熟练技术人员能够从生物材料中分离ARL多肽或核酸，并不以任何形式局限于未公开的部分。本发明公开所引用的任何文献已包括在参考文献中。
实施例ARL3酵母的鉴别利用酵母DNA作为模板和Lpe21p基因上或下游的互补序列为引物，通过聚合酶链式反应克隆ARL3酵母(yARL3)基因。(GenBank登记号U39205)。
PCR扩增的条件如下95℃ 1分钟，52℃ 1分钟，72℃ 1分钟进行35个循环；接着72℃ 10分钟。反应环境为在总体积100微升中加入50mM KCl，10mM Tris-Cl(pH 8.3)，1.5mM MgCl2，0.01％明胶，20mM/dNTP，0.1％ Tween-20，25pmol/扩增引物，和2.5单位Taq聚合酶。反应混合物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳。所有PCR产物进行纯化和亚克隆。ARL3基因用双脱氧链终止法测序。(Sanger等人，美国科学院年报745463-5467，1977)酵母ARL3基因测序揭示如下开放阅读框atgggtaacatttttagttcaatgtttgacaaactatggggttcaaacaaagaattgcgtatattgattttgggtttggatggtgcaggtaaaactaccatcttatatcgtttacaaattggcgaagtagtcactacaaagccaaccattggtttcaatgtagagacgctaagttataaaaacttaaaattgaacgtctgggatcttggtggtcaaacaagtatcaggccctactggaggtgttattatgcagacactgctgcagttattttcgttgttgattcgactgataaagatcgtatgtctacagcctctaaggaacttcatttgatgttacaggaagaagaattgcaagatgcagcactgctggtttttgcaaataaacaagaccaaccgggtgcattaagtgccagtgaagtctccaaagaactgaatcttgtagaattgaaggacagaagttggtctatcgtagcatccagtgcaattaaaggcgaaggtattaccgaaggtttagattggttgattgatgttataaaagaggaacagtta(SEQ ID NO1).
这个阅读框编码酵母ARL3氨基酸序列MGNIFSSMFDKLWGSNKELRILILGLDGAGKTTILYRLQIGEVVTTKPTIGFNVETLSYKNLKLNVWDLGGQTSIRPYWRCYYADTAAVIFVVDSTDKDRMSTASKELHLMLQEEELQDAALLVFANKQDQPGALSASEVSKELNLVELKDRSWSIVASSAIKGEGITEGLDWLIDVIKEEQL (SEQ ID NO2).
正如预期的一样，酵母ARL3氨基酸序列包含共有的GTP结合蛋白序列WDXGGQ(SEQ ID NO3)和NKQD(SEQ ID NO4)，即上面序列带下划线的部分。
酵母ARL3基因的间断为了研究yARL3的功能，我们制备了啤酒酵母菌株，其中ARL3开放阅读框被一个URA3标记基因间断。
将啤洒酵母菌株在如Sherman等人，酵母遗传学方法中，冷泉港实验室，冷泉，NY，1986，所述的酵母培养基中生长。YPD和YPGal分别包含1％细菌用酵母抽提物，2％细菌-蛋白胨，和2％葡萄糖或2％半乳糖；SD包含0.7％ Difco-酵母氮基(没有氨基酸)和2％葡萄糖。对营养缺陷型的菌株关键的营养是以如下面文献中的浓度提供Sherman等人，见上文，孢子的形成、生长、和交配的完成在如下文献中有描述Lee等人，细菌学杂志(J Bacteriol)1715795-5802，1989。采用乙酸锂方法如Ito等人，细菌学杂志153163-168，1983描述转化酵母。
PCR产生的yARL3 DNA被亚克隆进入可形成pGyL3的pGEM-7Zf质粒中。酵母URA3基因被插入如下yARL3基因单个EcoNI位点。包含酵母URA3基因和两个hisG重复序列的3.8-kb DNA片段利用BglII和BamHI的消化从质粒PNKY51[在Alani等人，遗传学(Genetics)116541-545，1987中有记载]中切下来。5’突出端用Klenow充满.包含yARL3基因的质粒pGyL3在内部EcoNI位点被线性化。突出末端用Klenow片段充满.cDNA被连接到3.8-kb hisG-URA3-hisG片段上，形成pGyL3U。
基因间断突变株通过一步基因取代法构建[Rothstein，酶学方法(Methods Enzymol)101202-211，1983]。简单地说，4.8-kb DNA片段通过用XhoI和BamHI的消化作用从pGyL3U上切下来，用于转化各种Ura-菌株，选择尿嘧啶原养型。URA+细胞的DNA印迹分析证实yARL3基因包含一个额外的相对于hisG-URA3-hisG基因的3.8-kb的片段。完成URA3和一个hisG重复序列的消除可参见Lee等人，见上文所述。yARL3和yARL1或yARL3和yARF3的双缺失在酵母arl3突变株(arl3hisG，ura3)，arl1突变株(arl1hisG，ura3)，和arf3突变株(arl3hisG，ura3)中进行。
一个包含yARL3hisG-URA3-hisG序列的DNA片段用于转化ura3/ura3二倍体酵母(SEY6210.5；Ito等人，见上文)。Ura+转化体被分离出，并用于验证yARL3两个基因组拷贝之一的正确替代。验证的杂合子二倍体然后进行孢子形成和四分体分裂。在30℃孢子萌芽时，大多数二倍体细胞形成四个可存活的孢子。Ura+孢子而不是Ura-用免疫沉淀测定包含yARL3的替换和缺失yARL3的蛋白(过程描述如下)。既然每个含有arl3间断的单倍体菌株是可存活的，yARL3在最适的30℃生长条件下不是关键基因。所有在含葡萄糖或半乳糖的培养基中的对数生长得到的酵母总RNA(野生型或arl3突变株)进行电泳；转移至GeneScreenPlus，用yARL3 DNA探针，剥离后，用酵母β-tubulin探针杂交。0.8-kb的yARL3 RNA在葡萄糖中生长不受抑制，在arl3突变株中也检测不到。
yARL3和yARF3双缺失的细胞，或yARL3和yARL1双缺失的细胞都是可存活的。特殊基因的正确间断被用PCR在从突变株菌落得到的基因组DNA上得到证实。这个结果证明了yARL3对细胞的存活并不关键。而且，已发现缺失不能被yARL1和yARF3所弥补。
为了研究yARL3的间断是否影响生长，野生型和arl3突变株的生长速度以及yARL3的过表达株要被测定。我们利用九个氨基酸的流感病毒HA抗原决定簇[Wilson等人，细胞(Cell)37767-778，1984]融合到它的C端来构建一个重组yARL3克隆体。HA-标记的等位基因(yARL3-HA)位于ADHl启动子的控制之下，这个启动子驱动野生型和arl3突变株酵母内的表达。
yARL3 cDNA的3’末端被改变使得它在其编码的蛋白的C端包含HA抗原决定簇序列YPYDVPDYA(SEQ IN NO5)。通过一个两步重组PCR技术引入Q78L替代。在一级PCR反应中，产生5’-和3’-DNA片段重叠。5’-寡聚核苷酸引物gcacatatgtttcatttagtcaagg(SEQ ID NO6)和5’Q78L寡聚核苷酸引物ctcagtgattctagaccacctacatccc(SEQ ID NO7；点突变已经用下划线标出)用于扩增5’片段。3’片段是用3’Q78L寡聚核苷酸引物gatgtaggtggtctagaatcactgagatc(SEQ ID NO8)结合3’端反义寡聚核苷酸引物ctttggatccttctttatcatttataaatcg(SEQ ID NO9)制得。在第二阶段融合PCR反应中，重叠片段的适合碱基对与5’和3’末端引物结合产生Q78L突变株的全长序列。Q78L突变株DNA的全长序列然后被纯化，亚克隆，突变由序列分析来验证。yARL3-HA和yARL3(Q78L)序列的XhoI-XbaI片段亚克隆进入pVT101U质粒中的XhoI-XbaI位点，这个表达质粒包含可分别产生pVT101yL3HA和pVT101yL3(Q78L)的ADH1启动子[Vernet等人，基因(Gene)52225-233，1987]。
在葡萄糖合成培养基中，arl3突变株和yARL3过表达酵母显示出比野生型酵母的生长速度低10％。30℃时，没有在过量表达野生型yARL3或yARL3(Q78L)的酵母中观察到显著的生长缺陷。
在不同的温度也测定了不同酵母突变株的生长。野生型和arl3突变株酵母细胞用携带无插入(pVT101U)的，yARL3(Q78L)插入的，或野生型yARL3的载体进行转化。在37℃和30℃时，所有酵母和野生型菌株生长得差不多。然而在15℃，arl3突变株的生长受到严重的损害。如预期的一样，yARL3的表达弥补了arl3突变株生长缺陷，证实了无效突变的生长缺陷是由yARL3间断引起的。而且，野生型酵母yARL3(Q78L)的过表达在15℃下引起生长缺陷。可以想象到(Q78L)yARL3的过表达影响到15℃下yARL3介导的囊泡转运。
ARL抗体为制造特异性结合于yARL3的抗体，重组制造、分离yARL3蛋白，然后按下面方法注入兔子。
酵母yARL3开放阅读框架通过PCR，利用一个在起始蛋氨酸上掺入唯一的NdeI位点和终止密码子后六个核苷酸处掺入唯一BamHI位点的引物获得。对于His标记的yARL3融合蛋白，包含yARL3编码区的DNA片段通过使用一个序列特异性引物扩增酵母基因组DNA制得。PCR产物被纯化、退火至pET15b表达载体(Novagen)，产生pET15byL3.对于非融合蛋白，PCR产物用NdeI和BamHI消化、纯化、和退火至pT7表达载体(Haun等人，基因11237-43，1992)，产生pT7yARL3。包含表达质粒的BL21(DE3)细胞生长到密度A600＝1.0，这时加入异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷至浓度为1mM来诱导表达。经过3小时，离心收集细胞，在20mMTris(pH7.4)和1mM EDTA中洗一次，-80℃储藏至取用。对于大规模生产重组蛋白，5毫升过夜培养物用来接种1升LB含氨苄青霉素培养液(100毫克/毫升)。培养物在37℃下摇晃培养。当A600达到0.6-0.8时，用0.5mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷诱导3小时产生蛋白质，细菌用离心收集。细胞沉淀悬浮于10毫升含有0.5毫克/毫升的溶菌酶磷酸缓冲盐溶液(pH7.4)中，并用超声波破碎。溶菌产物在加入Triton X-100至1％(V/V)后离心。His-标记的融合蛋白利用Ni2+-NTA树脂根据制造商(Qiagen，Chatsworth，CA)的说明进行分离。纯度用SDS-PAGE测量，并用考马斯蓝染色。蛋白的量用考马斯蓝或银染法(BioRad)测定。
从SDS-PAGE凝胶得到的变性的纯化蛋白用作抗原在兔子身上引发多克隆抗体，基本上如下面所述Harlow等人，抗体实验手册，Cold SpringLaboratory，Cold Spring，NY，1988。
兔子血清被收集，清洗，然后用于如下的免疫印迹试验。完整细胞抽提物用收集3毫升的A600单位/毫升培养物制备。细胞悬浮于RIPA缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1％ SDS，0.5％脱氧胆酸，150mM NaCl，和1％ NP-40]至最终A600为30。全细胞抽提物通过在4℃用玻璃珠涡流震荡2分钟，然后经简单离心澄清而制备。通过SDS-PAGE分离的蛋白以电泳的方式转移到Immobilon-P膜(Millipore公司)。与抗体的培养在含有0.1％ Tween20和5％干脱脂奶的磷酸盐缓冲液(pH7.4)于室温下进行60分钟。抗HA-单克隆抗体(HA.11，Berkeley AntibodyCO.，Richmond，CA)和辣根过氧化物共轭羊抗-鼠IgG+IgM(H+L)都以1∶5000稀释。束缚抗体用ECL系统根据制造商的说明(Amersham公司)检测。用印迹剥离方法(Amersham公司)从印迹上清除一级和二极抗体和鲁米诺底物。
在稀释到1∶5000后，特异于yARL3的多克隆抗体并不与yARF1，yARF2、yARF3或yARL1交叉反应。另外，抗yARF1、yARF2、yARF3、yARL1的多克隆抗体不能在蛋白质印迹上与yARL3反应。与yARL3抗血清的免疫印迹能探测到1-2ng的yARL3，而没有被重组yARF1、yARF2、yARF3、yARL1探测到信号(高达100ng)。这样，抗体特异于yARL3，而不和ARF或ARL家族的其它成员反应。
ARL的内源产物为了证实酵母中yARL3蛋白的存在，从野生型细胞、arl3突变株、过表达yARL3野生型细胞的溶菌物得到的蛋白用SDS-PAGE、考马斯蓝染色的凝胶分离。过表达yARL3通过抗yARL3抗体检测。
作为一个更灵敏的识别内源yARL3蛋白的方法，溶菌物从35S-标记的细胞中制得。酵母在含有200mM(NH4)2SO4的选择性基本培养基中于30℃下过夜培养至A600到0.5。经过37℃或15℃培养10分钟之后，细胞转移至不含硫酸盐的选择性基本培养基(最终OD600＝5)，再进行37℃培养10分钟或15℃培养30分钟。然后，加入30μCi每A600单位Pro-mix-L-[35S]-标记(35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸14.3mCi/ml混合物)。经过37℃培养5分钟或15℃培养20分钟后，加入5％(V/V)追加液(0.3％半胱氨酸(W/V)，0.4％蛋氨酸(W/V)，和100mM(NH4)2SO4)来终止标记。1毫升样品在指示时间移除，加入到等量的冰冷的溶于二倍量的蒸馏水中的20mM NaN3中。收集细胞并用溶于二倍量的二倍蒸馏水的10mM NaN3清洗。加入300微升玻璃珠和300微升溶菌缓冲液[50mM Tris-Cl(pH7.5)，1％ SDS，1mM EDTA，和1mM PMSF]，混合物室温剧烈震荡90秒，然后浸渍入沸水浴6分钟。利用抗yARL3，抗羧肽酶Y(CPY)或抗碱性磷酸酶(ALP)抗血清，基本遵照如下文献[Stirling等人，分子生物学细胞(Mol Biol Cell)3129-142]叙述进行免疫沉淀、电泳、和自放射显影。
利用yARL3抗体的免疫沉淀允许35S标记的从野生型和那些过表达yARL3(Q78L)酵母中得到的内源yARL3蛋白被检测到，但不包括arl3突变细胞。这些结果表明yARL3在酵母中以总蛋白的0.005％存在，略少于yARF1和yARF2的丰度，它们大约占总酵母蛋白的0.03-0.1％(Stearms等人，分子细胞生物学106690-6699，1990)。
ARL和囊泡运输为了评估yARL3在囊泡运输中的作用，对胞内和胞外的途径都进行了研究。首先，羧肽酶Y(CPY)的糖基化和蛋白水解过程及液泡碱性磷酸酶(ALP)都被进行了检测。CPY和ALP是通过远距分选结构(Cowles等人，EMBO J 162769-2782，1997)从内质网(ER)运送到高尔基体再至液泡的酶。细胞在允许温度(37℃)或非允许温度(15℃)下，用35S标记的半胱氨酸和蛋氨酸进行脉冲追踪。CPY和ALP然后进行免疫沉淀。
在ER核-糖基化的CPY前体酶的P1形式在高尔基器中通过进一步的糖基化转化为P2形式，最后在液泡中蛋白加工形成成熟形式。ALP是以酶原形式转移到液泡的II型膜蛋白。ALP从后高尔基体到液泡的分选据报道与CPY的不同(Cowles等人，见上文).到达液泡后，前体ALP在靠近其羧基端的一个位点断裂，产生一个成熟的跨膜蛋白。
在允许的温度下，arl3突变株类似于野生型细胞，容易将CPY和ALP从ER转变为高尔基和液泡形式。然而，arf1突变株如预料的一样以P1和前ALP的形式积累核-糖基化CPY。在非允许的温度下，arl3突变株中的碱性磷酸酶的加工被延迟，而羧肽酶Y的加工受很小地影响。这样，yARL3可以有一个不同于yARF1/yARF2的生物学功能，并参与一个截然不同的从ER到高尔基体或高尔基体到液泡的蛋白转运过程。
为确定yARL3是否在胞吞的途径中起作用，我们研究了yARL3对液相标记的摄取，Lucifer Yellow(LY)的影响。LY是一个小的荧光有机阴离子，它经常用作液相胞吞的标记物。摄取LY是时间和能量依赖性的，还需要对胞吞作用重要的特定蛋白。
LY CH的胞吞作用如下列文献所记载Dukic等人，酶学方法194697-710，1991。简单地说，收集1毫升A600单位/毫升的对数中期细胞，悬浮于90微升新鲜培养基中，再加入10微升LY CH(40毫克/毫升)。细胞在30℃培养30到90分钟，或15℃培养2到4小时，收集，在胞吞洗涤缓冲液[50mM琥珀酸和20mM NaN3(pH 5.0)]中清洗三次，再于同样的缓冲液中悬浮10微升。2.5微升细胞样品与等量1.6％低熔点的琼脂糖溶液在45℃混合，涂布于显微镜载玻片，用FIFC荧光显微观察。
野生型和arl3突变株细胞与LY在允许温度下(30℃)或非允许温度下(15℃)培养不同时间。细胞被清洗、固定、和在反相或荧光显微镜下观察。在允许的温度下，arl3突变株细胞培养30分钟后呈现LY积累缺陷，而90分钟后则不一样。野生型和arl3突变株的囊泡形态表现正常。在非允许温度下，发现LY的液相胞吞在培养2小时后，arl3突变株细胞与野生型细胞相比受到损害。经过非允许温度下与LY培养4小时，野生型细胞显示了明显的囊泡染色，而大部分arl3突变株细胞出现不清楚染色的囊泡。而且，arl3突变株在经过非允许温度下4小时培养后被发现含有大小不一的囊泡。
ARL亚细胞定位yARL3的细胞定位由如下决定。细胞从50毫升培养物中离心收集，在YPD中培养到指数中期(A600＝1)。细胞(0.5克)重复悬浮于冰冷的NaN3(10mM溶于二倍蒸馏水)清洗，然后离心。细胞与溶细胞酶一起培养形成原生质球，再悬浮于含有蛋白水解酶抑制剂(抑肽酶、亮抑肽酶、和抑胃肽酶分别1微克/毫升；1mM苯甲酰胺；和1mM PMSF)的冰冷溶胞缓冲剂[20mM三乙醇胺(pH7.2)，1mM EDTA和0.8M山梨醇]中。细胞在冰上在Doune匀浆器中用20振幅粉碎。细胞溶解物离心(450g)10分钟两次来去除未破碎细胞和细胞碎片。对细胞器梯度分离来说，在手动产生的五步蔗糖梯度(在溶解物缓冲液中加入0.8毫升60％、50％、40％、30％、20％蔗糖)上部上样0.8毫升澄清上清液，经过Beckman SW55离心机(170000g)4℃离心3.5小时。从顶部手动收集12个馏份。分级样品中的蛋白(100微升)用10％ TCA沉淀，SDS-PAGE分离，免疫印迹分析。
用蛋白印迹分析来确定yARL3、yARF1、Emp47p[高尔基标记蛋白；在Schroder等人，细胞生物学杂志(J Cell Biol)131895-912，1995有记载]的存在和各个馏份中的ALP(囊泡标记蛋白)。大多数的yARL3在梯度的上层，表现为一层透明可溶的细胞质形式。
既然yARL3看来可通过细胞溶解从膜上分离，yARL3的细胞内定位也就由间接的免疫荧光分析来测定。
细胞用5毫升含2％葡萄糖的基本选择性培养基培养，至密度为1-2×107细胞/毫升，然后按Schroder等人(见上文)所述的方法进行间接免疫荧光分析。但要作下述修正0.6毫升37％甲醛加入到每个培养基中起固定作用，培养基在30℃轻摇2小时。细胞经离心(2500Xg，5分钟)收集，5毫升0.1M磷酸钾(pH6.5)中清洗一次，悬浮于1毫升P溶液(1.2M山梨醇，0.1M磷酸钾，pH 6.5)中，与5至10微升的含有1％ β-巯基乙醇的溶菌酶(10,000u/ml P溶液)30℃培养30分钟。细胞用离心收集(3,000Xg，5分钟)、P溶液洗涤、悬浮于100-200微升P溶液中。细胞样品(30微升)放置于已涂布0.1％聚赖氨酸的多孔载玻片的每个孔内。随着非粘连过量细胞的吸入之后，载玻片用含有100mMTris-HCl(pH9.0)和150mM NaCl的清洗缓冲液冲洗1次，然后，用抗体封闭性缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 9.0)，150mM NaCl，5％脱脂奶，0.1％ Tween20)培养1小时。之后，在抗体封闭性缓冲液中用主抗体培养2小时。载玻片然后用清洗缓冲液冲洗2次。经过用次级抗体培养2小时，细胞再用清洗缓冲液充分冲洗。鼠单克隆抗-HA抗体12CA5，和异硫氰酸荧光素(FITC)-共轭次级抗体(Cappel)在使用前分别稀释为1∶1000和1∶300。Texas Red-共轭羊抗兔IgG抗体(Amersham公司)被用于检测抗体。
核可以通过使用已包括于固定溶液的H33258(2微克/毫升)染色来观察。多克隆抗Kar2抗体由Mark Rose博士惠赠。荧光显微成像通过一台Nikon Microphot SA显微镜实现。细胞在1000x点观察。
当yARL3-HA在野生型细胞中过量表达时，大部分免疫反应的yARL3典型的在ER染色情况下集中在核周围连续分布。在平行实验中，我们在抗yARL3-HA的HA-抗原决定基和抗Kar2p(Rose等人，细胞571211-1221，1989)的抗体12CA5中都观察到类似的染色模式。在上两者中，高尔基定位的典型点染和囊泡染色都不明显。因为yARL3使用一个多拷贝质粒过量表达，细胞与细胞间HA-yARL3水平大的变异没有观察到，而且更多的与网状染色一样分散的胞质yARL3被检测到。结合亚细胞梯度离心和间接免疫荧光分析的结果，yARL3很可能与ER膜部分相关。
ARL的生物化学属性为了确定yARL3基因产物是否具有ARF活性，从大肠肝菌中合成和纯化的重组yARL3要进行如下测试。
纯化的His标记的yARL3或yARF1融合蛋白被测试其激发霍乱毒素催化的自发ADP核糖基化的能力。5微克该蛋白被加入100微升含50mM磷酸钾(pH 7.5)、5mM MgCl2、20mM胸腺嘧啶、0.1mM GTP、0.003％SDS，10μM[32P]NAD(2mCi)和1微克激活的CTA的反应混合物。于30℃培养1小时，加入1.0毫升冰冷的7.5％三氯乙酸终止反应。经过4℃过夜沉淀和离心，通过将混合物置于65℃水浴10分钟，蛋白溶解在60mMTris(pH 6.8)、10％甘油、5％2-巯基乙醇、3％ SDS和0.006％苯溴蓝中。蛋白在12％凝胶中通过SDS-PAGE分离，再转移到硝酸纤维素膜，其置于X射线胶卷曝光24小时。
GTP与纯化重组yARL3的结合由如下所述的过滤诱捕法Northup等人，生物化学杂志25811361-11368，1998测定。1微克的His标记的yARL3融合蛋白30℃在最终体积为50微升的溶液中培养，其中含20mMHEPES(pH7.5)，和100mM NaCl，1mM二硫苏糖醇，1mM EDTA，0.5mMMgCl220微克/毫升牛血清白蛋白(BSA)，和10μM[γ-35S]GTP(Amersham，＞1000Ci/mmol)。反应可选择性的包括3mM D，L-α-DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine)和2.5mM(0.1％)胆酸钠。二重或三重样品转移至2毫升冰冷的20mM Tris-HCl(pH 7.4)，100mM NaCl，10mM MgCl2，和1mM二硫苏糖醇，然后在0.45微米HA过滤器(Millipore，Bedford)中快速过滤。核苷酸结合于融合蛋白的数量用闪烁计数器计量。数据符合一级方程式。
GTP水解是通过[α-32P]GTP结合于5.0μM重组yARL3蛋白，如下面所描述(Randazzo等人，生物化学杂志26910758-10763，1994)来测定的，接着稀释到(1∶9)25mM HEPES(PH7.4)，100mM NaCl，2.5mMMgCl2，0.1％ Triton X-100，1mM二硫苏糖醇，加了牛脑磷酸肌醇(1毫克/毫升)的1mM GTP中，然后30℃培养。每隔5分钟，将样品转移到2毫升的冰冷的20mM Tris-CL(pH7.4)，100mM Nacl，10mM Mgcl2和1mM二硫苏糖醇中。GTP转变为GDP通过Northup等人，见上文所述的薄层色谱来测定，一个没有蛋白的空白作为背景，它将从含蛋白的样品中扣除。
His标记的yARL3融合蛋白在100μM GTP和SDS存在下，不能激发霍乱毒素蛋白的自动ADP核糖基化。GTP结合于yARL3是浓度依赖型的并在30℃培养60分钟后达到最大。使用DMPC/cholate，重组yARL3结合3.2±0.3pmol的GTP/微克蛋白。没有DMPC/cholate，yARL3结合1.5±0.2pmol的GTP/微克蛋白质。所以，结合于yARL3的GTP被加入的磷脂/洗涤剂所修饰。
其他实施方案需要理解的是尽管已结合具体的说明书阐明了本发明，前述的说明书试图解释而并不是限制本发明的范围。在不背离本发明的精神的情况下而做出的等效变化和修饰均应包括在本发明的范围内。
权利要求
1.一种特异性结合于由SEQ ID NO2氨基酸序列组成的多肽的抗体。
2.如权利要求1所述的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
3.一种在其内源ARL3基因上含有纯合间断的转基因剔除酵母，其中所述的间断阻止功能性ARL3蛋白的表达，且剔除酵母约在15℃相对于具有野生型ARL3基因的酵母生长受损。
4.如权利要求3的转基因剔除酵母，其中转基因剔除酵母是啤酒酵母。
5.如权利要求4的转基因剔除酵母，其中所述的间断包括将核酸序列插入到亲代酵母基因组的野生型ARL3基因中。
6.如权利要求5的转基因剔除酵母，其中的核酸序列编码多肽。
7.如权利要求6的转基因剔除酵母，其中多肽的表达把选择性的表型给予转基因剔除酵母。
8.如权利要求7的转基因剔除酵母，其中的亲代酵母不能在没有尿嘧啶的培养基中生长，且选择性的表型是指能在没有尿嘧啶的培养基中生长。
9.如权利要求3的转基因剔除酵母，其中所述的间断包括将核酸序列插入到亲代酵母的野生型ARL3基因中。
10.如权利要求9的转基因剔除酵母，其中所述的核酸序列编码多肽。
11.如权利要求10的转基因剔除酵母，其中多肽的表达把选择性的表型给予转基因剔除酵母。
12.如权利要求11的转基因剔除酵母，其中所述的亲代酵母不能在没有尿嘧啶的培养基中生长，选择性的表型是指能在没有尿嘧啶的培养基中生长。
全文摘要
本发明涉及一种与酵母ADP核糖基化因子样蛋白特异性结合的抗体和一种转基因剔除酵母,它在其编码酵母ADP核糖基化因子样蛋白的基因上具有间断序列。
文档编号C07K16/40GK1257873SQ99125548
公开日2000年6月28日 申请日期1999年12月3日 优先权日1998年12月21日
发明者李芳仁, 黄纯芳 申请人:永信药品工业股份有限公司