专利名称：：在植物中生产猪生殖和呼吸综合征口服疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在植物中生产动物疫苗。更具体地讲，本发明涉及表达获自或源于猪生殖和呼吸综合征病毒的至少一个基因。本发明还涉及相关蛋白的纯化和服用，以便在猪体内诱导保护性抗体的产生。本发明背景猪生殖和呼吸综合征(PRRS)是作为一种重要的猪传染病出现的。自从这种病于1987年在美国首次发现以来(Keffaber1989)，PRRS已快速蔓延，并且现在已成为世界范围内养猪业的一个严重问题。在依阿华州的一个地区，这种病导致了85000头猪的死亡，而在欧洲，在1990/91的冬季估计出现了超过一百万头以上的死亡(Anon1990，综述文献参见Meredith1995)。在加拿大，PRRS感染在安大略和魁北克更加流行，不过，还报导了在其他省份的爆发情况(Morin和Robinson1991，Dea等1992，Sanford1992)。临床现象从严重爆发到持续感染不等。饲养母猪的严重症状包括流产、早产和死胎，而对小猪来说，呼吸疾病更常见的是导致高达80％的断奶前死亡(Loula1991，综述文献可以参见Chritianson和Joo1994)。持续感染的动物可能在临床上没有症状，但会持续释放病毒，并且它是向新生动物传播病毒的重要来源。在严重爆发情况下，受感染的饲养场，可能平均损失其每年断奶小猪生产的10％。由PRRS病毒感染在每头母猪上所造成的直接损失估计为70-350美元，并且每头母猪的潜在的效益损失还有440美元(Meridith1995，Muirhead1992，Polson1990)。由于延长了达到屠宰重量所需要的平均时间(达7天)所导致的生长速度降低造成了幼猪/肥育猪的损失。另外，很多国家禁止从受感染的国家进口活猪和精液，这进一步造成了加拿大生猪出口的经济损失(Anon1992)。迫切需要建立合适的控制措施，以防PRRS病毒的感染，以使加拿大，特别是有大量养猪场的安大略的养猪业保持活力和竞争力。在临床上，大部分猪在从初次感染中恢复之后变得对进一步的PRRS病毒感染有免疫力。用失活的PRRS病毒免疫的母猪还能防止流产。以上发现表明，主动的免疫能够诱导对保护猪不受PRRS病毒感染来说重要的中和抗体反应(Albina1992)。通常，有两种类型的疫苗能对动物进行主动免疫减活疫苗和灭活疫苗。减活疫苗通常更具有免疫原性，因此可以诱导更高效价的抗体反应和持续时间更长的免疫反应。不过，常规减活疫苗是通过诸如自发突变或随机突变的不确定的机制产生的。因此，活的疫苗具有在免疫时恢复该疫苗菌株的毒力和实际发病的潜力。相反，失活的灭活疫苗是安全的，但通常在免疫原性方面较差，并需要大剂量的抗原。因此，生产专门供兽医使用的这种疫苗成本太高。现代重组DNA技术，使得我们能够通过在植物中生产重组亚基PRRS病毒抗原来开发安全的、有效的、低成本的疫苗。含有哺乳动物基因蛋白的转基因植物的育成是植物生物技术的一个重大发展(Lefebvre等1998)。从那时起，业已表达了多种哺乳动物基因，并且业已认识到植物是有效的、低成本的、不用灭菌的生物反应器，它具有生产对医药和工业有价值的蛋白的巨大潜力。植物是高等真核生物，并且能够正确使蛋白折叠和糖基化，而细菌系统不能。可以用表达PRRS病毒抗原的植物饲养猪，并因此使得猪对所述病毒性疾病免疫。我们的方法可用于开发未来的兽医用疫苗候选物，这种疫苗不仅能保护猪免受PRRS病毒感染，而且还能使动物不受很多其他传染病的感染。猪生殖和呼吸综合征(PRRS)是一种在猪身上新鉴定的传染病，并且业已成为一种养猪业中最重要的疾病。最近业已分离了PRRS的致病剂，并且它似乎属于已知为Arterivirus类型的不确定类型的病毒(Plagemann和Meonnig1992，Meulenberg等1993)。Arterivirus还包括三种其他病毒马贫血病毒、猴出血热病毒、和小鼠乳酸脱氢酶病毒。猪体内的PRRS病毒是一种包膜病毒，含有15kb的单链RNA基因组，具有阳性极性。最近业已用在欧洲分离的原形Lelystad病毒测定了其完整的基因组序列(Meulenberg等1993)。PRRS病毒及其他arteriviruses似乎具有冠状病毒的基因组组构和表达策略(Snijder等994)。在病毒基因组中鉴定了8个开放读框(ORFs)。人们认为ORF1a和1b编码病毒基因组复制和转录所必需的RNA聚合酶。ORF7编码与病毒基因组RNA相互作用并将其包入衣壳的核壳蛋白。计算机预测业已表明，ORF2-6编码与病毒外膜相关的膜蛋白。在上述潜在的膜蛋白中，ORF5是一种主要结构蛋白，业已在纯化的病毒颗粒中鉴定到这种蛋白(Loemba等1996)。ORF6也是一种膜蛋白，但它与其他arteriviruses不同，它不是诱导中和抗体反应的抗原。ORF2、ORF3、和ORF4蛋白尚未鉴定，因此，其生物学功能在目前大多未知。对于小鼠的乳酸脱氢酶病毒来说，用单克隆抗体进行的研究业已表明，ORF5蛋白是诱导中和抗体的一种主要病毒抗原(Plagemann和Moennig1992)。还有报导说ORF2可能在小鼠中诱导中和抗体方面起着次要作用。在JP08205858和US5,510,258中分别披露了在上皮细胞或组织培养系统中生产PRRS病毒蛋白。类似地，US5,510,258提供了一种用于生产PRRSV的组织培养基础系统。在WO96/04010和WO94/18311中，将一种绿猴肾细胞系用于生产所述病毒，而在WO95/31550中，所述疫苗是用一种杆状病毒表达系统生产的。另外，EP732340披露了用一种合适的宿主系统作为杆状病毒的优选宿主生产糖基化形式的PRRSV。后一个申请还涉及ORFS2-4的表达。WO96/21012涉及用苜蓿和烟草作为植物表达系统生产免疫球蛋白。上述文献没有一件披露或暗示用植物宿主制备获自PRRS病毒的蛋白。当给小鼠口服从转基因植物组织中提取的粗制蛋白时，发现这种在转基因植物中产生的细菌抗原(大肠杆菌肠毒素)能有效免疫小鼠(Haq等1995)。业已将植物用于生产疫苗抗原，用于诸如乙型肝炎病毒和Norwalk病毒的病毒疾病免疫(Mason等1992，1996)。所述抗原可用于小鼠的口服免疫，并且就Norwalk病毒抗原来说相当通过杆状病毒感染的昆虫细胞培养产生的抗原。用农杆菌属介导的转化转化植物，并且通过直接喂给植物组织或作为粗制蛋白提取物服用所述抗原。业已通过在植物病毒的表面上表达病毒表位，然后用所述改性病毒感染易感宿主生产了抗诸如貂肠病毒的动物疾病和诸如脊髓灰质炎的人类疾病的植物产生的疫苗(Dalsgaar等1997，Haynes等1986)。所述植物病毒是从组织中纯化的，并给实验动物服用。尽管该系统是非常有效的，但它所能产生的抗原的大小局限于37个氨基酸，这就要求抗原的表位图是完整的(Yusibov等1997)。情况并不总是这样，特别是对新发现的疾病来说，表达完整长度的蛋白是唯一的选择。另外，表达是瞬时的，并且在农业水平上污染也是一个问题。用植物作为生物反应器的引人注目的证据是在两篇最近的论文中提出的，第一篇论文证实了一种分泌性免疫球蛋白的四条链在植物中的正确表达和组装，而且这种抗体具有所有的功能(Ma等1995)。新的研究业已扩展到人类血红蛋白的主题，并且进一步证实了植物作为生物反应器的用途(Diercyk等1997)。上述例子基于农杆菌属介导的转化，如果需要，它可以用种子再生形成稳定的转基因植物。尽管一直以来植物都是药理学的活性制品来源，植物基因工程的出现产生了无数新的可能性(Ma和Hein1995，Goddjin和Pen1995)。业已证实烟草本身特别适用于用异源基因转化，并且有时可以作为植物转化的模型系统(Horsch等1989)。尽管所述集中在作物保护方面的生物技术尚未发现在烟草生产上的用途，烟草仍然具有作为生物反应器的主要作用。烟草叶片能够产生高水平(8-10％)的可溶性蛋白(组分1蛋白，F1P)(Woodleif等1981)，并且业已建立了中试系统，以便纯化该组分，用作高蛋白实用添加剂(Montanari等1993)。我们业已将所述F1P系统改进成表达绒杜父鱼Ⅱ型抗冻蛋白的转基因烟草，并确定了能使转基因蛋白产量最大的农业条件(待批的加拿大申请2，188，220；Kenward1995)。通过使该系统基于局部改良的烟草突变型(81V9)消除了尼古丁污染最终制品的所有潜在可能，所述突变型仅具有有限的合成烟草生物碱的能力(Chaplin1977)。考虑到口服运送食用植物组织的转基因蛋白的潜在可能性，这一点特别重要。苜蓿在作为在植物生产蛋白的生物反应器方面具有某些独特的优点。以全植株为基础计算蛋白含量通常为20％，并且可以根据管理措施而更高。这一特征以及高的植物产量的特征，使得每公顷的苜蓿作物能比在安大略的任何其他作物产生更多的蛋白。这主要是因为根瘤上的根瘤菌具有非常有效的固氮作用，而叶片又起着有效储存器的作用。结果，在不使用高成本并且破坏环境的氮肥的情况下，在植物中可以达到高的蛋白含量。由于苜蓿还是多年生的，苜蓿植株还能够提供额外的环保作用，例如将雪(和水分)保持在大田中，并减轻风和土壤流失；多年生的习性还消除了一年生作物所需要的整地和种植的成本。随着植物重组蛋白的生产从小试规模到中试规模的改变。必须强调管理问题(Miele1997)。从管理和工业安全角度出发，非粮食种类对于生物活性蛋白的生产来说是理想的。烟草和苜蓿是非粮食作物，因此将表达编码生物学活性蛋白的基因的转基因植物材料意外泄露到人类食物链中机会几乎为零。其他植物生物反应器系统不具有这一优点。在加拿大生产烟草可进一步降低基因泄露到地方植物种群中的危险，因为在加拿大没有天然存在的野生烟草物种。采用烟草系统，蛋白生产是基于叶片而不是种子或根，当结合在开花之前收获叶片的事实时，实际上不存在在未来的种植季节中出现不可控制的生物反应器植物的危险。在加拿大，烟草不能越冬，因此不会在下一个季节中有宿根再生。用于转基因蛋白生产的背景基因型和系统强调了多种潜在的管理问题，并开始解决有可能损害产品质量的生物学活性次级代谢物的问题。本发明提供了一种低成本生产能够在猪体内诱导针对PRRS病毒的保护性抗体产生的病毒抗原蛋白的方法。本发明概述本发明涉及在植物组织中表达动物疫苗。更具体地讲，本发明涉及在植物中表达获自PRRS病毒的至少一个基因，并给猪服用该基因产物。根据本发明，提供了一种制备至少一种猪生殖和呼吸综合征病毒蛋白的方法，该方法包括以下步骤获得编码所述蛋白的基因，将所述基因插入适于转化植物的载体，用所述载体转化植物，以及生长所述转化的植物。该方法可以使用天然基因序列或合成基因序列。另外，本发明涉及上述方法，其中，收获所述转化的植物，以便获得收获的组织，从收获的组织中提取蛋白，并在提取步骤之后选择性地纯化所述蛋白。本发明还提供了通过该方法制备的蛋白。本发明还涉及上述方法，其中，对天然或合成基因序列进行修饰，以便增强所述基因在植物组织中的表达和其所编码蛋白的稳定性。本发明还包括上述方法，其中修饰包括用一个异源信号序列取代其天然信号序列，一个ER滞留基序(retention)，一个裂解位点，和一个HIS标记。本发明还提供了一种上述方法，其中，所述基因编码ORF5蛋白。本发明还涉及上述方法，其中，所述植物是烟草植物或苜蓿植物。本发明还涉及序列1所示的DNA分子，和含有该DNA分子的载体，所述DNA分子操作地与启动子、增强子和终止子区连接，另外，本发明提供了含有上述载体的植物。本发明还涉及一种使猪对猪生殖呼吸综合征免疫的方法，包括用上述载体转化植物，生长所述转化植物，收获所述转化植物以便获得收获的组织，对猪喂给所述收获的组织，如果需要重复喂养步骤。本发明还包括提供上述方法，其中，从所述收获的组织中提取由存在于所述载体上的DNA分子编码的蛋白并作为食品添加剂或作为注射剂给猪施用。另外，本发明还涉及给猪服用非收获的植物组织。附图的简要说明通过以下说明本发明的上述和其他特征变得明显，其中，结合附图进行说明，其中图1表示合成PRRS病毒ORF5基因的核苷酸序列的例子。对天然成熟蛋白序列进行改变，原始碱基在上面示出。来自烟草的PR1b分泌信号出现在1-93号碱基上，成熟PRRS病毒ORF5编码区出现在94-621号碱基上，凝血酶裂解位点出现在622-636号碱基上，组氨酸尾出现在649-666号碱基上，以及KDEL基序出现在667-678号碱基上。图2表示用寡核苷酸模块构建合成PRRS病毒ORF5基因的简化克隆方案的例子。模块Ⅰ-Ⅲ表示独立的寡核苷酸，首先将这些寡核苷酸退火，然后连接，然后扩增以便产生具有特殊限制位点的DNA双链，所述限制位点可以对完成的合成基因进行酶促组装。为了进行克隆，将一个BamHI限制位点添加在该序列的5’末端，而将Kpn1序列添加在3’末端。源于苜蓿花叶病毒的前导序列出现在10-45号碱基上，源于烟草的PR1b分泌信号出现在49-143号碱基上，成熟PRRS病毒天然ORF5蛋白编码区出现在144-663号碱基上。作为密码子优化方法的一部分进行的单个碱基改变或增加限制位点通过在天然序列的上面用单个的黑体字母表示。凝血酶裂解位点出现在664-681号碱基上，组氨酸尾出现在692-709号碱基上，而ER保留信号出现在710-721号碱基上。图3表示用于构建构成所述合成基因的模块的寡核苷酸序列的例子。图4表示用于构建合成ORF5的包括模块Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ的引物的完整序列。引物1-12分别为序列鉴定号2-13。图5表示用天然ORF5基因构建(pCAMTerX-ORF5A)或合成ORF5基因构建(pCAMTerX-ORF5B)转化的烟草植物的Northern分析。图5A和B获自用pCAMTerX-ORF5A转化的植物的叶片组织获得的RNA的Northern印迹，图5C和D获自用pCAMTerX-ORF5B转化的植物的叶片组织获得的RNA的Northern印迹。“λ”表示分子大小标记；“81V9”是未转化的(对照)植物。图6表示用合成基因构建(pPSP-ORF5B)转化的烟草植物的Western分析。用标准技术从植物中分离蛋白，用SDS-PAGE分离，并转移到膜上，用对ORF5专一的多克隆抗血清探测。所述抗血清是从猪体内获得的。泳道M是预染色分子量标记；泳道1是未转化的植物(对照)；而泳道2-9是转基因植物。本发明提供了低成本生产能够在猪体内诱导针对PRRS病毒的保护性抗体产生的病毒抗原蛋白的方法。为了在植物中表达所需要的蛋白，可以使用编码感兴趣的PRRS病毒的蛋白，例如ORF5蛋白的基因。还希望构建编码感兴趣的蛋白，例如ORF5蛋白的合成基因，以便其表达产物与天然病毒蛋白相同。为了优化所述异源基因在植物中的表达，可以视需要改变或设计天然或合成基因，以便相应的蛋白以高于天然基因的水平产生。优选设计具有与天然基因有大约60-90％同源性的合成基因，对该基因进行修饰，并在植物中高水平表达。所述合成基因更优选包括与天然基因的大约80-90％的同源性。在下面的实施例中，披露了一种包括82％的同源性的基因，不过，可以理解的是，该实施方案不应被示为是任何意义上的限定。还希望对天然或合成基因作进一步的修饰，以便可以优化所述基因的表达和所述蛋白的稳定性或纯化。例如，可以对所述基因的5’或3’区进行修饰，以便增强所述基因的表达，并将其产物引导至合适的细胞间区室中，以便确保其稳定性。下面解释对天然基因的修饰，以便天然和合成基因包括KDELER滞留基序，PR1b信号序列，和裂解位点和组氨酸尾，以便有利于其编码蛋白的纯化。不过，这些改变仅仅被示为是例子，因为还可以使用其他5’、3’、或内部修饰来优化表达蛋白的表达，稳定性以及选择性地，纯化。还希望在植物组织中表达编码具有抗原特性的片段的所述PRRS病毒的需要的ORF基因的片段或部分。为了证实本发明，举例说明了编码源于PRRS病毒的ORF5蛋白的天然和合成基因。例如，该合成基因具有序列1的核苷酸序列(还可参见图1)，不过，编码PRRS病毒的ORF’s或这些ORF’s的组合的其他基因可以方便地取代所述举例说明的合成基因(例如，参见图1)。编码所述成熟蛋白的合成基因优选包括类似于在植物中高水平表达的基因的密码子偏倚性，所述蛋白具有一个能进行简单提取的基序，并且所述成熟蛋白被引导至所述细胞的一个区室，以便增强该产物的稳定性，例如，内质网(ER)的腔。不过，还涉及其他位点，例如胞外分泌，以便简化提取方案，或叶绿体或线粒体区室。在定向引导至ER的情况下，所述表达产物还要进行进一步的体内加工，包括信号肽的裂解。所述改性的天然或合成基因还包括一个C末端基序，该基序使得所编码的蛋白滞留在ER中。我们业已获得了从在加拿大的养猪场的病害爆发中分离到的PRRS病毒(PA-8)，并且克隆了该病毒基因组的3’末端的4kb并进行了测序(Yoo1997)。该片段含有ORF2-7的完整的编码序列。ORF5包括600个核苷酸，它编码一种200个氨基酸的多肽。预测的ORF5蛋白含有在其N-末端具有一个疏水性信号序列，以及两个其他疏水性结构域，这些结构域可能是跨膜区。在前50个氨基酸的片段中还发现了4个推测的N-连接糖基化位点。为了插入疫苗病毒基因组中，通过工程方法合成了完整的ORF5序列，并且我们能够构建重组疫苗病毒(Yoo1997)。这种重组疫苗病毒携带ORF5基因，该基因位于受疫苗病毒晚期启动子控制的病毒基因组的胸苷激酶基因座上。在用该重组疫苗病毒感染细胞时，特别鉴定到一种分子量为25kD的多肽。这种肽能与在大肠杆菌中产生的针对ORF5蛋白的单特异性抗体专一性起反应。以上结果表明，ORF5基因是有功能的，并可用于在植物系统中表达蛋白。不过，可以理解的是，本发明还涉及源于PRRS病毒的其他推测的ORF’s的使用，并且可以单独使用，或者视需要与其他ORF’s组合使用。“基因”是指一种特定的核苷酸序列，包括编码区或其片段，并选择性地包括调节该基因表达的启动子和终止子，以及基因表达所需的其他位点，例如，聚腺苷酸化信号，由它调节转录的终止。“编码区”或“结构基因”是指任何DNA片段，它在遗传学转录和翻译之后决定多肽的一级结构。另外，还可以视需要使用包括编码区或结构基因的感兴趣的区域的片段。“合成基因”是指通过化学方法合成的结构基因的DNA序列。合成基因可以包括感兴趣的基因的片段或完整的编码区。另外，合成基因还可以包括增强该基因表达的调控元件，或有利于该蛋白产物稳定性的基序。还希望一种合成基因选择性地包括可用于分离和纯化由所述合成基因编码的蛋白或蛋白片段的区。“DNA调控区”是指基因组序列上的任何区，它具有控制与该调控区操作连接的DNA序列表达的特性。所述调控区可以包括启动子或增强子区，以及本领域技术人员所了解的其他调控元件。“启动子”是指位于编码区5’末端的核苷酸序列或其片段，它含有启动转录和调控转录速度所需的所有信号。用于举例说明本发明的启动子是本领域技术人员所公知的组合型启动子。不过，如果需要组织特异性基因表达的话，例如进行种子或叶特异性表达，则也可以使用对上述组织专一的启动子。另外，正如本领域技术人员所公知的，还可以使用诱导型启动子，以便在通过提供对诱导表达的合适刺激诱导表达之后调控所述基因的表达。诱导型启动子的使用可能是必要的，因为有时异源蛋白的组成型合成的使用可能是有毒的或者抑制植物的正常生长，其结果是，只有转化后再生的植物是能以极低水平表达异源蛋白的植物。在缺少诱导物的条件下所述DNA序列或基因不能转录。通常，专一性结合诱导型启动子以便激活转录的蛋白因子是以失活形式存在的，然后通过诱导物将其直接或间接转化成活性形式。所述诱导物可以是化学制剂，如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚化合物或通过热、冷、盐或毒粒因子产生的生理学胁迫或通过诸如病毒的病原体或致病剂的作用间接产生。可以通过将诱导物异源施加到细胞或植物上使含有诱导型启动子的植物细胞接触该诱导物，例如通过喷雾、浇灌、加热或类似方法使用。“组成型启动子”是指指导一种基因在植物的所有部分表达并且在植物发育中连续表达的启动子。已知组成型启动子的例子包括与CaMV35S转录物相关的启动子和农杆菌属Ti质粒胭脂氨酸合酶基因。本发明的嵌合基因结构还可包括一个3’非翻译区。3’非翻译区是指一个基因的一部分，包括DNA片段，该片段含有聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其他调控信号。所述聚腺苷酸化信号的特征通常是完成在mRNA前体的3’末端添加聚腺苷酸尾。聚腺苷酸化信号被普遍认为存在与规范形式5’-AATAAA-3’具有同源性，不过，其变化也是常见的。合适的3’区的例子是3’转录的非翻译区，它含有农杆菌属肿瘤诱导(Ti)质粒基因的聚腺苷酸化信号，如胭脂氨酸合酶(Nos基因)和植物基因，如大豆储存蛋白基因，和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亚基。因此，源于本发明构建物的结构基因的3’非翻译区可用于构建在植物中表达的嵌合基因。本发明的基因构建物还可以视需要包括其他增强子，翻译或转录增强子。上述增强子区对本领域技术人员来说是众所周知的，并且可以包括ATG起始密码子和相邻序列。所述起始密码子必须处于编码序列的读框内，以确保整个序列的翻译。所述翻译控制信号和起始密码子可源于多种来源，包括天然和合成来源。翻译起始区可以由所述转录起始区或所述结构基因的来源提供。所述序列还可源于被选择用于表达所述基因的启动子，并且可以进行特别修饰，以便增强mRNA的翻译。为了有利于转化植物细胞的鉴定，本发明的构建物还可进行进一步的操作，以便包括植物选择标记。有用的选择标记包括能产生对诸如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等的抗生素的抗性的酶。类似地，还可以使用能产生通过颜色改变鉴定的化合物的酶，如GUS(β-葡糖醛酸酶)或发光鉴定，如荧光素酶。“转化”是指遗传信息的稳定的种间转移，这种转移可以通过表型证实。可以用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等将本发明的构建物导入植物细胞，这些方法为本领域技术人员所公知。本发明的一部分还涉及含有本发明嵌合基因构建物的转基因植物。由植物细胞再生全植株的方法在本领域中是公知的，并且对本发明来说获得转化和再生植株的方法已不重要。一般，转化的植物细胞是在合适的培养基中培养的，所述培养基可含有诸如抗生素的选择制剂，而将选择标记用来有利于转化植物细胞的鉴定。一旦形成愈伤组织，可以通过采用合适的植物激素按照已知方法促进芽的形成，并将所述芽转移到发根培养基上，以便再生植株。然后将所述植株用于建立重复的世代，用种子或用植物繁殖方法建立。“密码子优化”是指选择合成寡核苷酸结构模块的合适的DNA核苷酸，以及随后的结构基因或其片段的酶促组装，以便接近植物体内的密码子使用。有关文献中披露了用密码子优化构建合成基因的方法，该方法局限于细菌基因，如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringeinsus)杀昆虫晶体蛋白的细菌基因和两种昆虫基因(有关综述参见Kozeil等1996)。该方法成功应用于细菌基因(例如，Adang等1996，Sardana等1996)。密码子优化的昆虫基因对所述变化没有反应，并且随后证实了需要纠正细胞定向使得由于密码子优化产生的所有改进黯然失色(Hightower等1994，Florack等1995)。业已证实，ER保留信号可显著提高二硫键结合的转基因蛋白的浓度，因此，通过定点诱变将KDELER滞留基序添加到ORF5cDNA的3’末端(Schouten等1996，Kunkel1985)。尽管业已发现针对ER的腔的蛋白的源于小鼠的某些天然信号能在植物中正确起作用，但并不是在任何情况下都能够确保如此，不过，使用PR1b信号序列能确保异源蛋白的正确定向，并且在某些场合下使用植物信号可提高转基因蛋白浓度(Schouten等1996，Horack等1995，Denecke等1990)。尚没有报导披露在包括本文所披露的元件的组合的植物中表达异源基因，所述组合包括使用天然植物ER定向信号，密码子优化和ER滞留基序以及相同的合成基因。“ORF5蛋白”是指存在于Arterivirus家族成员中的两种已知跨膜外膜糖蛋白中的一种。为了使表达水平和转基因蛋白产量最大，在DNA水平上检测ORF5基因，然后优化其编码区，以便在植物中表达，使用类似于由Sardana等1996年披露的方法。密码子使用的标准误差(密码子使用偏倚性的指标)是通过如下方法计算的首先求出天然ORF5基因的每一个密码子相对高水平表达的植物基因的使用的比例偏差的平方，然后计算平均方差。所使用的公式为SDCU=Σn=1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N]]>其中Xn表示密码子n在高水平表达的植物基因中的使用频率，而Yn表示密码子n在感兴趣的基因中的使用频率，而N表示在感兴趣的基因中密码子的总数。使用Murray等(1989)的数据编制双子叶植物的高水平表达基因的密码子使用表。本发明合成PRRS病毒ORF5基因的组装是通过本领域公知的标准方法进行的。为了加强在植物中的表达而设计的ORF5前蛋白是通过酶促方法用化学合成的寡核苷酸双链片段组装在DNA载体上。然后用本领域已知方法将所述合成PRRS病毒ORF5基因转入植物基因组。还要涉及的是可以根据需要和具体情况用多种方法给动物服用含有异源蛋白的转基因植物。例如，如果所述蛋白是口服使用的话，可以收获所述植物组织并直接喂给动物，或者在喂养之前将收获的组织干燥，或者在不进行事先收获的情况下让动物食用所述植物。将所述收获的植物组织作为动物饲料的饲料添加剂使用也属于本发明的范围。另外，从转基因植物获得的蛋白可以在用作饲料添加剂之前提取，提取成粗制、部分纯化、或纯化形式。给猪服用上述任何形式的蛋白会导致保护动物不受PRRS病毒影响的抗体的产生。计算密码子使用的标准误差(SDCU)，其结果为87.0。如图1(序列1)所示，当用植物中更常用的密码子代替罕见的密码子时，SDCU降低4倍达到20.6。通过组装3个各自为大约200bp的DNA模块(模块Ⅰ、模块Ⅱ、和模块Ⅲ参见图1和2，以及图4所示序列；图4中的引物1-12分别是序列鉴定号2-13)构建所述合成ORF5基因。每一个模块含有在5’和3’末端突出的限制位点，以便用于通过标准方法进行克隆，并容许连接该合成模块，以便形成完整的ORF5编码区。完整的ORF5编码区含有5’NcoⅠ和BamHⅠ限制位点，以及3’BspHⅠ和KpnⅠ限制位点。通过使用植物中高水平表达基因常用的密码子设计长度大约为60-90bp的重叠寡核苷酸，构建ORF5合成基因的单个模块(图3)。在94℃下将寡核苷酸(各自为100皮摩尔)的中央配对变性1分钟，用35分钟时间冷却到60℃以便退火，在60℃下保持5分钟，在此期间添加5.25个单位的ExpandDNA聚合酶(BoehringerMannheim)。然后用5分钟时间将该反应混合物加热到68℃，并在68℃下进行2小时的补平反应。将10微升所得到的双链DNA片段用作PCR扩增的模板，使用10皮摩尔的5’和3’的引物，和5.25个单位的ExpandDNA聚合酶，350微摩尔dNTP’s，1.75毫摩尔氯化镁。然后用标准方法对扩增的DNA片段进行凝胶纯化。按照生产商推荐的方法将相当于模块Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR片段导入pGEMTEasy克隆载体中。通过用相当于在所述片段的5’和3’末端导入的酶位点的限制酶消化将模块Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ从pGEMTEasy载体上切除。通过连续的克隆步骤将所述片段组装成完整的合成基因，组装到pBluescript(KS+)克隆载体上。例如，通过分别用BamHⅠ和HindⅢ、HindⅢ和XbaⅠ，XbaⅠ和KpnⅠ消化将模块Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ从所述载体上释出。将模块Ⅱ和Ⅲ同时导入用HindⅢ和KpnI消化过的pBluescript中(三联连接)上。然后用BamHⅠ和HindⅢ消化该载体(pBS23)，并加入模块Ⅰ以便完成所述合成基因。由于ORF5信号序列将所述蛋白正确引导到内质网(ER)的腔中的能力尚不清楚，用获自烟草光合相关蛋白1b(PR1b)信号序列的推测的信号序列取代ORF5基因上的前29个氨基酸。所述取代是通过设计两种其他引物用于构建密码子优化的ORF5基因的模块Ⅰ而进行的。这两种引物的一个例子如图3所示(序列鉴定号2和3；还可参见图4的模块Ⅰ中的引物1-4)。对两种合成基因(一种具有PR1b信号另一种具有天然信号)进行比较，并发现PR1b信号会导致以较高水平合成蛋白(资料未提供)。为了有利于从植物组织中纯化ORF5蛋白，在所述天然蛋白序列的末端和KDEL基序的开始部分之间插入C末端凝血酶裂解位点和组氨酸尾(NOVAGEN，剑桥)。通过修饰用于构建模块Ⅲ的合成寡核苷酸加入该序列。因此，制备的基因结构包括PR1b序列，模块Ⅰ-Ⅲ(合成ORF5)，裂解位点HIS标志，和KDEL基序。对所述合成的PRRS病毒ORF5基因进行测序，并发现其编码与天然ORF5基因相同的蛋白。所不同的是可根据情况添加PR1b序列，HIS标志序列，或KDEL基序。将重复的35S增强子-启动子+AMV前导序列(Kay等1987；Jobline和Gehrke1987)和源于烟草的p1275组成型启动子系统(B.L.MikiWO97/282268)用于构建包括所述合成ORF5基因的载体。对于重复的35S和p1276表达系统来说，将天然的和密码子优化的ORF5基因作为Nco1-BamHⅠ片段插入仅靠所述启动子的下游，并位于T-DNA臂序列之间。根据其组成元件将重复的35S载体命名为pCAMTerX-ORF5A或pCAMTerX-ORF5BpCAMTerX-ORF5A包括天然ORF5基因；pCAMTerX-ORF5B含有所述合成ORF5成熟蛋白编码区，PR1b信号序列和KDELER滞留基序；由于35S启动子已知是在苜蓿中表达的(Maggio等1996)，还用“Purdue超级启动子”对于表达合成ORF5基因制备一套平行的构建物(Ni等1995，植物杂志，7卷；661-676页)。所述超级启动子使用农杆菌属章鱼氨酸和甘露氨酸合酶启动子和激活物的亚域启动异源基因在植物中的高水平组成型表达。将天然ORF5或合成ORF5基因克隆到源于二元载体pBISN1的pBI101.2上，该载体携带所述超级启动子，以便产生pPSP-ORF5A和pPSP-ORF5BpPSP-ORF5A包括所述天然基因，pPSP-ORF5B含有合成的ORF5A成熟蛋白编码区，PR1b信号序列和KDELER滞留基序。将所述质粒转入携带无臂Ti质粒pEHA104的农杆菌属菌株EHA105中。位于该质粒上的植物选择标记是新霉素磷酸转移酶(nptⅡ，VandenElzen等1985)。只将最好的表达构建物与p1275启动子一起使用，得到载体p12760RF5。为了制备载体p12760RF5，用5’NcoⅠ和3’BspMⅠ裂解合成的ORF5基因，并连接到pRND400二元载体上，该载体含有位于NcoⅠ限制位点上游的p1275启动子。位于该基因3’末端的BspHⅠ突出端和NcoⅠ限制位点是相容的，并且连接在一起之后可破坏这两个位点。将ORF5基因导入植物基因组然后用本领域的标准方法用农杆菌属介导的转化将各种合成的ORF5基因构建物转化入烟草(Horsch等1989)。将源于品种81-V9的体外无菌生长的低烟碱烟草植物用作原始材料。与来自温室生长植物的叶片相比，无菌体外材料的使用可降低由于污染造成的损失。为了进行转化，用解剖刀将切除了中脉的叶片材料切成1平方厘米的片段，并使上皮一侧向下放在含有MS盐、B5维生素、3％蔗糖、1mg/lBAA(6-苄基氨基嘌呤)和0.1mg/lNAA(α-萘乙酸)的固体培养基(培养基1)上预培养2天。将生长在LB培养基中的过夜培养物稀释大约50％，然后用各自含有包括上面鉴定的五种构建之一的载体的农杆菌属菌株进行感染。将叶片外殖体快速浸入(大约30秒)，并放在Whatman2号滤纸上吸印，去掉多余的细菌。然后将其送回培养基1上培养2天。为了抑制细菌生长，并开始转化组织的选择，将所述外殖体转移到含有500微克/毫升羧噻吩毒霉素-棒酸复合剂(SmithKlineBeecham，Oakville)和选择剂，100微克/毫升卡那霉素(Sigma，St.Louis)的培养基上。每隔2-3周将所述外殖体转移到新的培养基上，在3-5周内开始出现芽。一旦形成明确的茎，将所述芽切除，并转移到装有由MS盐、B5维生素、3％蔗糖、500μg/ml头孢氨噻或羧噻吩青霉素-棒酸复合剂和100μg/ml卡那霉素组成的固体培养基的Magenta盒中。在根形成之后，将推测的转基因植物转移到温室中。为了确保每一个植物是由独立的转化过程产生的，在该方法的初期将所述外殖体分裂成单独的片段，并且从每一个片段中仅选择一个芽。为了进行苜蓿转化，制备携带辅助质粒pMP90和pBISN10RF5A-E五种二元载体中的一个的根癌农杆菌菌株C58C1的过夜液体培养物。将所述细菌继代到新的液体培养基中，并在光学密度=1.0时使用该培养物。从温室生长的苜蓿植物上收获幼小叶柄(每个茎上的3个最小的叶柄)，并通过在75％的乙醇中浸泡30秒然后在4％的次氯酸钙中浸泡20分钟进行消毒，然后将所述叶柄放在无菌水中漂洗，3次更换无菌水，并切成长度为1厘米的片段。将所述叶柄片段浸入农杆菌属培养物中1分钟，从细菌培养物中取出，并直接放置到诱导培养基(含有100微摩尔乙酰丁香酮，无抗生素)上，并在25℃下在黑暗中培养2天。然后将所述叶柄在无菌的1/2浓度的MS盐溶液(Sigma，pH5.8)中浸泡2分钟，并转移到含有500毫克/升头孢氨噻和50毫克/升卡那霉素的诱导培养基上。大约每隔10-14天将所述叶柄转移到新的平板上。在几周之后，出现小的愈伤组织，保留愈伤组织直到形成体细胞胚。将所述胚放在1/2含有50毫克/升卡那霉素和1％(w/v)蔗糖MS培养基(pH5.8)上发芽。将绿色长形的胚分别转移到发芽培养基上，不附带任何愈伤组织，然后放置在该培养基上直到根、芽和叶形成。然后将单独的小植株种植到花盆中的土壤中，并转移到温室中进一步生长。用对所述转基因的5’和3’末端专一的引物通过PCR筛选每一个推测的转基因烟草和苜蓿植物中所述转基因的存在(参见图4)。例如，图1的转基因可使用具有下列序列的引物上游引物5’GCAAATGCCTCAAACGATTCAAGC3’，(温度60℃)；和下游引物3’TCTCAAAGTCGCCTTGTTACCCC5’(温度59℃)，不过，还可以使用其他引物组合(其他引物参见图4)。用标准方法从植物组织中提取DNA，并进行30轮次的扩增，扩增使用15皮摩尔的两种引物，100mMdNTP’s，2mM氯化镁，一个单位Taq聚合酶和50ng的DNA模板。用不会裂解T-DNA臂内部的限制酶消化源于阳性植物的DNA，并用需要的转基因作为探针进行Southern分析。通过标准方法用50μCi的[α32P]CTP随机标记探针。所有洗涤是在高严格条件下进行的。从含有天然ORF5基因的转基因植物中分离RNA，并用逆转录PCR(RT-PCR)或Northern分析(参见表1)进行分析。为了进行RT-PCR，首先用不合RNase的Dnase处理10微克RNA，将其中的2微克用于cDNA合成。将寡聚dT(12-18)05.μg与RNA混合，并加热到90℃，让其冷却到70℃，然后在冰上冷却。第一股链的合成是在42℃下在含有10mMDTT，0.5mMdNTP，50mMTris-HCl，pH8.3，75mM氯化钾，3mM氯化镁和200个单位的上标转录Ⅱ逆转录酶(GibcoBRL生命技术公司)的缓冲液中进行50分钟。在70℃下加热15分钟使所述酶热失活。然后按上述方法用2微升的逆转录反应物作为模板和对ORF5专一的引物进行PCR。在检验过的30个植株中的27个中检测到ORF5的转录物。通过标准技术用从含有天然或合成ORF5基因的转基因植物中提取的20微克RNA进行Northern印迹分析。与在同一个印迹上电泳的λHindⅢ片段相比，在Northern印迹上检测到的转录物(参见图5A-D)对于天然ORF5来说其大小为1200-1400碱基，而对于合成ORF5来说为1500-1800碱基。上述估计的大小大于天然基因(602bp)或合成基因(752bp)，这可能是因为具有来自启动子(例如35SCaMV，250bp)，终止子(nos终止子250bp)，和polyA尾(长度未知)的附加序列。为了增强转基因表达并确保在表达水平选择到具有稳定大田性状的大量的(25-30)初级转化体，筛选拷贝数，并对单拷贝高表达品系进行大田性状评价。用标准方法(例如，Northern和Western印迹，Sambrook等1989)评价表达水平。如上文所述，通过PCR筛选30个含有天然ORF5基因的转化体和23个含有合成ORF5基因的转化体，并通过RT-PCR(仅适用天然ORF5基因)和Northern印迹分析进行分析。还对用pPSP-ORF5A转化的烟草植物进行Northern分析。用对ORF5表达产物专一的多克隆抗血清通过Western分析检测上述转基因烟草植物中的8个的蛋白表达。所述抗体是从猪体内获得的。在上述含有PSP-ORF5A构建的植物中，发现有7个表达ORF5基因产物(图6)。表1含有天然ORF5的转基因植物的分析总结<tablesid="table1"num="001"><table>转基因植物PCR筛选逆转录PCRNorthern分析A阳性阳性阳性B阳性阳性阳性C阳性阳性阳性D阳性阳性阳性</table></tables>用ELISA对转基因蛋白产量进行定量。用在大肠杆菌中合成的GST-ORF5融合蛋白在兔体内产生ORF5蛋白的单特异性多克隆抗体。另外，还制备了在猪体内抗全PRRS病毒的多克隆抗体。将这两个抗体用于蛋白表达研究，并用于蛋白定量的ELISA。ORF5蛋白纯化在液氮和1×结合缓冲液中快速冷冻5克源于转基因烟草植物的叶片组织，通过米拉布过滤，以500×g的速度离心5分钟，通过0.45微米膜再次过滤。让滤液通过含有His-BindNi2+树脂的层析柱，并用10倍体积的结合缓冲液洗涤，然后用6倍体积的洗涤缓冲液洗涤。然后用6倍体积的洗脱缓冲液将ORF5蛋白洗涤液从所述柱上洗脱，在液氮中快速冷冻，并在-70℃下保存待用。动物的免疫实验为了在动物体内用在植物中产生的重组ORF5蛋白引起保护性免疫反应，可以考虑两种施用途径肌内施用和口服。肌内施用用ORF蛋白提取物对4组猪进行免疫，每一组有3只动物。所述4组由用苜蓿或烟草的正常植物提取物免疫的两个对照组，一个用苜蓿-ORF5蛋白免疫的组，和一个用烟草ORF5蛋白免疫的组组成，在第一次免疫之前将动物放血，并测定对PRRS病毒的免疫前抗体效价。将抗原与油基佐剂混合，每只动物使用大约100微克的ORF5蛋白进行肌内免疫，每隔3周免疫1次，共免疫3次。在免疫之后3周、6周、和8周采集外周血样，然后检查对ORF5蛋白和PRRS病毒有反应的特异性抗体的形成。口服用植物产生的ORF5蛋白使动物对PRRS病毒免疫的口服方法基于普通粘膜免疫系统的概念。业已证实，在身体的粘膜部位，特别是在肠道上诱导的免疫性能够通过所述普通粘膜免疫系统转移到身体的远侧粘膜部位(综述文献参见Kagnoff，1996)。在人体内，腺病毒感染呼吸道会导致急性呼吸道疾病。这种疾病在军人中被特别称为急性呼吸病(ARD)。业已开发了腺病毒疫苗，并且在美国军队中用作预防ARD的口服疫苗已有40年时间。业已证实该方法通过口服疫苗抗原能在呼吸道中非常有效地诱导粘膜免疫性。由于PRRS病毒在猪体内的初次感染部位是呼吸道，为了有效预防感染在呼吸道中诱导中和抗体反应是非常重要的。通过在猪体内的肠道部位服用ORF5抗原，可以在呼吸道部位诱导有效的免疫性，因此预防PRRS病毒感染。将4组猪，每组3只动物，用于饲养实验。两组动物通过口服食用正常植物(烟草和苜蓿)，另两组动物食用表达ORF5蛋白的转基因植物。在免疫之后3周和6周从所述动物体内采集血样，以便监测其循环系统中的抗体反应。还可以在肠道和呼吸道中检查抗体反应。当血清中出现抗体效价时，将所述动物宰杀，并收集肠道洗液和肺洗液，用于分泌抗体分析。特异性抗体分析通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血清样品中ORF5蛋白的特异性抗体的存在。在组织培养物中生长PRRS病毒，并通过不连续的蔗糖梯度离心纯化。将病毒抗原包被在ELISA平板上，并进行IgG检测ELISA。还通过噬斑减少中和实验检查所述血清样品中和病毒感染性的能力。检查肺洗液和肠洗液中分泌IgA抗体的存在和中和效价。为了检测IgA抗体，将PRRS病毒包被的平板与各种稀释比例的肠洗液或肺洗液一起培养，并将抗原-抗体复合物与二级抗猪IgA抗体一起培养。加入抗二级抗体缀合物和生色底物，以便形成颜色。还通过PRRS病毒噬斑减少实验检查了分泌的IgA中和病毒的能力。本文所引用的所有文献均被收作参考文献。业已结合优选实施方案对本发明进行了说明。不过，对本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离下面的权利要求书所述的本发明的范围的前提下可以作出多种改变和改进。参考文献AdangMJ，RocheleauTA，MerloDJ，MurrayEE(1996)合成杀昆虫晶体蛋白基因。美国专利5,567,862。AlbinaE，MadecF，CarioletR，和TorrisonJ.(1994)猪生殖和呼吸综合征病毒在受感染猪和农场单位的免疫反应和持续性。VetRec134567-573。Anonymous(1990)国内养猪场3530。Anonymous(1992)猪传染病新闻1353N。Anonymous(1995)确定孟山都加拿大公司的综合除草剂抗性canola品系GT73的环境安全性。决议文件DD95-02，加拿大农业和农产品，渥太华。ChaplinJF(1977)在烟草中育成不同的烟碱含量。美国化学协会会刊，173届会议，新奥尔良，LA。ChristiansonWT，和JooHS.(1994)。猪生殖和呼吸综合征综述。猪保健品210-28。DalsgaardK等(1997)预防目标动物得病毒病的由植物产生的疫苗。国内生物技术。15248-252。DeaSA，BilodeauRA，AthanassiousR，SauvageauRA，和MartineauGP.(1992)。在魁北克的猪流行性流产和呼吸综合征与在血清学上和Lelystad病毒有关的病毒相关。Proc12thCongrIntlPigVetSoc1116。DeneckeJ，BottremanJ，DeblaereR(1990)植物细胞中的蛋白分泌可以通过缺陷途径进行。植物细胞251-59。DieryckW，PagnierJ，PoyartC，MardenMC，GruberV，BournatP，BaudinoS，和MerotB(1997)源于转基因烟草的人血红蛋白。自然38629-30。Du等。植物细胞报导199413330Ferullo等。作物科学1996361011FlorackD，AllefsS，BollenR，BoschD，VisserB，StiekemaW(1995)在烟草中表达天蚕蛾杀菌肽B基因。Trans.Res.4132-141。GoddjinOJM，和PenJ(1995)作为生物反应器的植物。TIBTECH13379-387。HaqTA，MasonHS，ClementsJD，和ArntzenCJ(1995)用在植物中产生的重组细菌抗原进行口服免疫。科学268714-716。Horsch，R.B.，Fry，J.E.，Hoffman，N.L.，Eicholtz，D.，Rogers，S.G.，和Fraley，R.T.(1985)将基因转入植物的简单的通用方法。科学2271229-1231。JobiingSA，和GehrkeL(1987)含有植物病毒非翻译前导序列的嵌合信使RNA的强化翻译。自然325622-625。KagnoffMF(1996)粘膜免疫学新境界。今日免疫学171-7-59。KaffaberKK(1989)未知病因的生殖缺陷。AmerAssSwinePracNewsletter。11-10。KayR，ChanA，DalyM，和McPhersonJ(1987)重复35S启动子序列产生植物基因的强的增强子。科学2361299-1302。KenwardK(1995)在转基因烟草中表达鱼抗冻蛋白基因以提高抗冻性，并作为分子农业的模型。博士论文(Queens大学，波士顿)KunkelTA(1985)不进行表型选择的快速和有效的位点专一型诱变。ProcNatlAcadSci82488-492LefebvreDD，MikiBL，和LaliberteJF(1987)哺乳动物金属硫蛋白在植物中的功能。生物/技术51053-1056。LoulaT(1991)。神秘的猪疾病。Agri-pract1223-34。MaJKC，HiattA，HeinM，VineND，WangF，StabilaP，vanDolleweerdC，MostovK，和LehnerT(1995)分泌抗体在植物中的产生和组装。科学268716-719。MaJKC，和HeinMB(1995)在植物中产生的抗体的免疫治疗潜力TIBTECH13522-527。Maggio等1996植物分子生物学报导14(3)249MasonHS，Ba11JM，ShiJJ，JiangX，EstesMK，和ArntzenCJ(1996)Norwalk病毒衣壳蛋白在转基因烟草中的表达及其植物口服免疫原性。ProcNatlAcadSci935335-5340。MasonHS，LamDMK，和ArntzenCJ(1992)在转基因植物中表达乙型肝炎表面抗原。ProcNatlAcadSci8911745-11749。Meredith，MJ(1995)猪生殖和呼吸综合征。猪信息中心，剑桥大学。MieleL(1997)作为生物药物主的植物生物反应器管理因素。TIBTECH1545-50。MeulenbergJJM，HulstMM，deMeijerEJ，MoonenPJLM，desBestenA，WensvoortG和MoormanRJM.(1993)Lelystad病毒，猪流行性流产和呼吸综合征(PEARS)致病原，与LDV和EAV相关。病毒学19262-72。MontanariL，FantozziP，PedoneS(1993)将烟草组分1(F1P)用于给患者口服和肠内服用的用途。重金属评价。食品科技26259-263。MorinM，和RobinsonY.(1991)魁北克的猪生殖和呼吸综合征。VetRec120367-368。MuirheadMR(1992)Mysterydisease-blueearedpigdiseaseonabreedingandfatteningunit.VetRec130513-514.MurrayEE，LotzerJ，EberleM(1989)植物基因的密码子使用。核酸研究17477-498。Ni，M.，Cui，D.，Einstein，J.，Narasimhulu，S.，Vergara，C.E.，Gelvin，S.B.1995。源于章鱼氨酸和甘露氨酸合酶基因的嵌合启动子的强度和专一性。植物杂志7661-676。OdellJT，NagyF，ChuaNH(1985)鉴定花椰菜花叶病毒启动子活性所需要的DNA序列。自然313810-812。OembaHD，MounirS.，MardassiH，ArchambaultD.，和DeaS(1996)人对猪生殖和呼吸综合征病毒的主要结构蛋白的免疫反应动学力。Arch.Virol.141751-761。PlagemannPGW，和MoennigV.(1992)。乳酸脱氢酶病毒、马动脉炎病毒和猴出血热病毒一种新的正链RNA病毒。病毒研究进展4199-192。PoisonDD，MarshWE，和DialGD(1990)神秘猪病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DNA分子，包括序列鉴定号3所示序列。35．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号4所示序列。36．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号5所示序列。37．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号6所示序列。38．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号7所示序列。39．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号8所示序列。40．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号9所示序列。41．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号10所示序列。42．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号11所示序列。43．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号12所示序列。44．一种分离的DNA分子，包括序列鉴定号13所示序列。全文摘要披露了一种用于制备猪生殖和呼吸综合征病毒蛋白的方法。该方法包括获得编码所需蛋白的基因,然后将该基因插入适于转化植物的载体中,并用该载体转化植物。在所述转化植物生长之后,可以收获所需要的组织,并从所收获的组织中提取所述蛋白。本发明还涉及对猪进行抗猪生殖呼吸综合征免疫的方法,包括收获所述转化的植物,以便获得收获的组织,并用所述收获的组织喂养猪,或者从收获的组织中提取所述蛋白,并作为饲料添加剂或作为注射剂给猪施用所述蛋白。不过,如果需要还可以在收获之前直接用所述植物组织喂养。文档编号C07K14/08GK1295618SQ99804564公开日2001年5月16日申请日期1999年1月27日优先权日1998年1月27日发明者R·赖默森,J·张,D·尤,L·艾利森,J·布兰德勒申请人:加拿大农业及农业食品部,圭尔夫大学