具有细胞靶向特异性和诱导凋亡活性的嵌合蛋白的制作方法

专利名称：具有细胞靶向特异性和诱导凋亡活性的嵌合蛋白的制作方法
1．导论本发明涉及具有细胞靶向特异性和诱导细胞凋亡活性的嵌合蛋白。尤其是，本发明通过一种人白介素-2(IL2)和Bax之间的重组嵌合蛋白说明。所述的嵌合蛋白特异地靶向表达IL2受体(IL2R)的细胞并诱导细胞特异的凋亡。根据本发明，嵌合蛋白可以在任何结合特异细胞类型的分子和诱导凋亡的蛋白之间产生。上述嵌合蛋白用于体外或体内选择性地消除特异的细胞类型，并且可以用于治疗自身免疫病、癌症和诸如病毒感染的传染病。
2．发明背景2.1.免疫毒素单克隆抗体技术和重组DNA技术的出现导致发现大量的与特异细胞群体有关的细胞表面分子。根据这些分子的表达类型，构建了重组免疫毒素，以特异地靶向和摧毁表达上述分子的细胞。重组免疫毒素是一类靶向分子，设计用于识别和特异地摧毁表达特异受体的细胞，如癌细胞和涉及许多免疫系统失调的细胞。一般来说，免疫毒素利用一种细菌或植物毒素去摧毁不需要的细胞。通过基因融合技术设计并构建这些分子，它们由靶向细胞部分和杀死细胞部分构成，这是一种治疗用的这些药剂强有力分子的组合。免疫毒素的实例是生长因子或抗体的结合抗原结构域，包括融合各种毒素分子突变形式的抗体Fv部分(单链免疫毒素)。不过，数年来已经清楚，用上述“魔弹”进行靶向免疫治疗仍然存在许多问题，需要新的方法产生改善的重组免疫毒素。
每种重组免疫毒素表现为某些非特异毒性，并且在足够高的浓度下损伤不表达特异靶抗原的正常细胞。免疫毒素的这种非特异毒性是免疫毒素治疗的剂量限制因素。那一种组织被非特异毒性所影响依赖于用于免疫毒素制备的具体毒素，而免疫毒素透入组织和肿瘤的能力很大程度上依据于免疫毒素的大小。
较大稳定的偶联免疫毒素在血管中长时间存在(T1/25-15小时)，因此内皮细胞接触可以导致内皮细胞损伤的高浓度毒素。较小的分子，如快速离开血管系统的重组免疫毒素，可能具有不同的毒性。在人类中，用蓖麻蛋白和其他核糖体毒素以及假单胞菌外毒素A(PE)、白喉毒素(DT)制成的免疫毒素和它们的截短衍生物产生各种毒性。这些毒性包括血管渗漏综合症(主要是蓖麻蛋白免疫毒素)和肝脏毒性(PE衍生的免疫毒素)。蓖麻毒素A链特异地与内皮细胞结合，然后杀死这些细胞并损伤血管，可以解释在动物和人类中使用蓖麻免疫毒素时观察到的血管渗漏综合症。PE免疫毒素的非特异肝脏毒性有可能由于容易进入肝细胞和非常快速的非特异吸收和肝细胞的蛋白内在化引起。然而，也有可能除了在大多数免疫毒素中已移去的特异细胞结合位点(结构域Ⅰ)外，PE含有一个被肝细胞识别，具有低亲和力的额外位点，这是肝脏毒性的原因。
在临床应用免疫毒素中的另一个主要障碍是针对这些免疫毒素，主要是针对毒素部分的人类免疫应答。如PE和DT一样的细菌毒素是高度免疫原性的，并且不能用标准技术人源化。衍生于DT免疫毒素的使用受限制，这是因为在发达国家的许多人已进行过抗DT的免疫接种，并且许多成年人有针对DT的中和抗体。免疫原性是个问题，迄今为止仍未找到实用的解决方法。降低这些分子的免疫原性将极大地改善免疫毒素的临床应用。
免疫毒素成功应用的一个例子是消除表达高亲和力IL2受体(IL2R)的活化T细胞，而正常静止T细胞和它们的前体细胞不被清除。理论上，由IL2制备的免疫毒素能消除在各种疾病状态有关的表达IL2R白血病细胞或表达IL2R的免疫细胞，但不摧毁IL2R阴性的正常细胞，因此保留了T细胞免疫应答所需的抗原受体的全部细胞。
已经产生了一种嵌合蛋白IL2-PE40，并显示它能消除活化的T细胞(Lorberboum-Galski等，1988，美国国家科学院院报85:1922)。IL2-PE40对人、猿和鼠起源的表达IL2R的细胞系有极其强的细胞毒性。它也对ConA刺激的小鼠和大鼠脾细胞极强的细胞毒性，并且对抗原活化的小鼠细胞和淋巴细胞混合培养中细胞毒T细胞的产生有抑制作用(Lorberboum-Galski等，1988，生物化学杂志263:18650-18656；Ogata等，1988，免疫学杂志41:4224-4228；Lorberboum-Galski等，1990，生物化学杂志265:16311-16317)。
一种高度纯化的IL2-PE40制备物(Bailon等，1988，生物技术6:1326-1329)表现为(a)延缓和减轻大鼠中佐剂诱导的关节炎(Case等，1989，美国国家科学院院报86:287-291)，(b)明显延长小鼠中血管化心脏同种移植物的存活率(Lorberboum-GalSki等，1989，美国国家科学院院报86:1008-1012)和大鼠中角膜同种移植物的存活率(Herbort等，1991,Transplant 52:470-474)，(c)降低大鼠实验自身免疫眼色素视网膜炎的发生率和严重性(Roberge等，1989，免疫学杂志143:2766-2771)和(e)预防大鼠和小鼠中出现实验变应性脑脊髓炎和中枢神经系统的T细胞介导的疾病(Beraud等，1991，细胞免疫学133:379-389；Rose等，1991，神经免疫学杂志32:209-217)。不过，上述免疫毒素仍然存在上面提出的相同缺陷，尤其是人类宿主中非特异毒性和免疫原性。
2.2.诱导凋亡的蛋白多细胞谱系生物的发育和组织中稳态的维持需要严格地调节细胞死亡。死亡信号刺激后单个细胞执行自杀应答的能力，在其分化过程中变化极大。已经鉴定了程序性细胞死亡(凋亡)的阳性和阴性调节子。
高百分率的滤泡淋巴瘤具有特征性染色体易位，该易位把原癌基因Bcl-2置于免疫球蛋白重链基因座附近，导致Bcl-2表达的脱调节。发现Bcl-2作为程序性细胞死亡抑制子的作用(Vaux等，1988，自然334:440-442)。最近，其他Bcl-2同源物表现为抑制凋亡。然而，一个上述同源物Bax通过加速凋亡介导相反的效应。最近注意到不断扩大的Bcl-2相关蛋白家族具有同源性，这种同源性主要是熟知为Bcl-2同源结构域1和2(BH1和BH2)的2个保守区成簇状存在(Oltvai等，1993,细胞74:609-619；Boise等，1993，细胞74:597-608；Kozopas等，1993，美国国家科学院院报90:3516-3520；Lin等，1993，免疫学杂志151:1979-1988)。Bcl家族的成员包括Bax、Bcl-XL、Mcl-1,Al和DNA病毒中的几个开读框。另一个在Bax中保守的，与BH1和BH2不同的结构域，已被鉴定出来，并被命名为BH3。该结构域介导细胞死亡和结合蛋白的功能(Chittenden等，1995,EMBO J.14:5589-5596)。另一个促凋亡蛋白(pro-apoptotic)的成员仅含有BH3结构域，暗示该特殊的结构域可能在促进细胞凋亡中有独特的重要性(Diaz等，1997，生物化学杂志272:11350-11355)。
Bax能同源二聚体化并在体内和BCL-2形成异二聚体。过度表达的Bax克服Bcl-2的死亡抑制子活性(Oltvai等，1993，细胞74:609-619)。已发现在膀胱肿瘤中比Bcl-2更高的Bax表达水平与病人较好的治疗结果相关。在表达比Bax mRNA更多的Bcl-2的肿瘤患者中，观察到更常见的早期复发(Gazzaniga等，1996，国际癌症杂志69:100-104)。
最近有报道，一种Bax的剪接变体Bax-α在正常乳腺上皮中高含量地表达，而在所检查的40例癌组织样品中有39例仅检测到微弱或没有表达(Bargou等，1996，监床研究杂志，97:2651-2659)。有意思的是，在不同的组织亚型中发现Bax-α的下调节。而且，当在依赖于四环素的表达系统控制下把Bax-α转染到乳腺癌细胞系中，Bax恢复了癌细胞对血清饥饿和APO-I/Fas激发的凋亡的敏感性，并明显地降低在SCID小鼠中的肿瘤生长。因此，有人建议凋亡的脱调节可能对乳腺癌的病理发生有作用，至少部分是由于Bcl-2基因家族的成员之间不平衡引起的(Bargou等，1996，临床研究杂志97:2651-2659)。
在另一项研究中，对伴有Epstein-Barr病毒的52例何杰金氏病中Bax的表达，并比较免疫检测其他凋亡调节蛋白，Mcl-1、Bcl-2和Bcl-x的结果。Bax的表达经常在何杰金病中检出，这可解释一般对具有瘤形成失调的病人获得的良好化疗反应的结果(Rigal-Haguet等，1996,血液87:2470-2475)。
已经克隆和鉴别了诱导凋亡蛋白家族不断增加的其他成员。Bak是Bcl-2家族的一个新成员，它在各种类型的细胞中表达并且在酵母中与Bcl-2同源物Bcl-x2结合(Farrow等，1995，自然374:731-733；Chittenden等，1995，自然374:733)。在Bax的一个结构域已鉴定为对细胞毒活性和与Bcl-xl的结合必需的，并足以引起上述作用。在Bax和Bip1中，已经鉴别了与BH1和BH2不同的与上述结构域相似的序列。发现所述的结构域在介导与Bcl-2家族成员相互作用的多种细胞死亡调节蛋白的功能中，起关键的重要性(Chittenden等，1995，EMBO J.14:5589-5596)。
在撤除神经生长因子的交感神经元中Bak的过度表达加速凋亡并阻止ElB 19K共注射的保护效应。已知腺病毒ElB 19K蛋白抑制通过E1A、肿瘤坏死因子α、FAS抗原和神经生长因子撤除所诱导的凋亡(Farrow等，1995，自然374:731-733)。Bak的表达诱导血清撤除的成纤维细胞快速和广泛的凋亡，因此有可能Bak直接涉及活化细胞死亡的机制(Chittenden等，1995，自然374:733-736)。也有报道，在正常和成瘤的结肠和粘膜中，免疫反应性的Bak表达与上皮细胞凋亡的位点定位一致。在人结肠癌细胞系HT29和培养的大鼠正常小肠细胞系lEC18中，诱导凋亡与增加Bak的表达相伴随，但与其他Bcl-2同源蛋白的表达变化并不一致(Moss等，1996，生物化学生物物理研究通讯223:199-203)。因此，也有人建议Bak是与肠细胞凋亡最密切相关的内源Bcl-2家族成员(Moss等，1996，生物化学生物物理研究通讯223:119-203)。
不过，不同于Bax,Bak能抑制在Epstein-Barr病毒转化细胞系中细胞死亡。具有独特Bak信使RNA分布的组织包括那些含有长期存活，终末分化的细胞类型(Krajewski等，癌症研究56:2849-2855)，表明诱导细胞死亡的活性是广泛分布的，并且凋亡的组织特异调节最初被抑制凋亡的分子调节所控制(Kiefer等，1995，自然374:736-739)。
Bcl2家族的另一个成员是Bad,Bad拥有BH1和BH2结构域的关键氨基酸基序。Bad缺乏负责其他家族成员的整体膜定位的经典C-末端信号锚定序列。Bad选择性地与Bcl-XL和Bcl-2二聚体化，但不和Bax、Bcl-Xs-Mcl1，A1或自身二聚体化。Bad逆转Bcl-XL的死亡抑制子活性，但对Bcl-2的作用没有影响(Yang等，1995，细胞80:285-291；Ottilie等，1997，生物化学杂志272:30866-30872；Zha等，1997，生物化学杂志272:24101-24104)。
与细胞促进存活蛋白，Bcl-2和Bcl-XL，和病毒促进存活蛋白，Epstein Barr病毒-BHRF1和腺病毒EIB-19 kDa相互作用的另一个成员是Bik。在瞬时转染测定中，Bik促进细胞死亡的方式，与其他Bck-2家族的促进死亡成员Bax和Bak相似。Bik的这种促进死亡活性能被Bcl-2、Bcl-XL、EBV-BHRF1和ElB-19kDa蛋白的同时表达所抑制，表明Bik可能是一种细胞和病毒抗凋亡蛋白的共同靶物。尽管Bik不含有与Bcl-2家族特征性的BH1和BH2保守结构域的明显同源性，但它与Bax和Bak享有一个9个氨基酸的结构域(BH3)，BH3结构域可能是这些蛋白促死亡活性的关键决定分子(Boyd等，1995，癌基因11:1921-1928；Han等，1996，分子细胞生物学16:5857-5864)。
Bcl-2家族由各种配对的调节凋亡的拮抗和激动蛋白组成。它们的功能是否互相依赖仍未确定。为说明该问题使用遗传途径，Knudson等(1997、自然遗传学16:358-363)，最近利用Bcl-2和Bax的得失功能模型发现，Bcl-2缺乏小鼠的特征，凋亡和胸腺发育不全在小鼠中大部分缺乏，同时也缺乏Bax。在缺乏Bcl-2时，单一拷贝的Bax促进凋亡。相反，Bcl-2的过度表达仍然抑制缺乏Bax时的凋亡。虽然体内竞争存在于Bax和Bcl-2之间，每一种能独立地调节凋亡。已经表明Bax在脂膜中形成通道，并且在中性和酸性pH下激发脂质体包被的羧基荧光素的释放。在生理pH下，该释放能被Bcl-2阻断。在平面脂双层中，Bax形成pH和电压依赖的离子传导通道。所以，Bax的促凋亡效应可能通过一种内在的成孔活性所引发，该成孔活性能被Bcl-2所拮抗(Antonsson等，1997年科学277:370-372)。本家族的2个其他成员，Bcl-2和Bcl-1，也表现为在脂膜中形成孔道(Schendel等，1997，美国国家科学院院报94:5113-5118)。
在本发明之前，未见报道含有Bcl-2原凋亡成员的融合蛋白，也没有预测到当对细胞外源加入诱导凋亡的上述分子时，是否能保持生物学活性。
3．本发明概述本发明涉及具有细胞靶向特异性和诱导凋亡活性的嵌合蛋白。本发明的嵌合蛋白由一种细胞特异的靶向部分和诱导凋亡的部分组成。细胞特异的靶向部分提供给嵌合蛋白细胞特异的结合特性，而诱导凋亡的部分进入靶细胞后诱导程序性细胞死亡。在靶向细胞部分的编码序列和诱导凋亡蛋白的编码序列之间融合的多核苷酸重组表达，产生本发明的嵌合蛋白，这种方法是优选的。上述嵌合蛋白可能比本领域目前所用的免疫毒素更优越，因为它们来源于人类，因此可预期降低人类接受者的免疫原性。此外，嵌合蛋白通过诱导凋亡杀死靶细胞，而凋亡不引起细胞内的细胞器释放到细胞外环境中，导致炎症反应。当细胞通过凋亡通路死亡，细胞皱缩和凝集，但细胞器和细胞质膜保持它们的完整性，并且在细胞内含物渗漏之前，死亡细胞快速地被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，因而激发最低程度的组织或全身应答。
本发明也涉及嵌合蛋白的药物组合物，产生上述蛋白的方法和体外和体内使用这些蛋白的方法，尤其是上述组合物和方法用于消除特异的不需要靶细胞，和治疗各种疾病症状以及使用这些蛋白用于疾病诊断。
本发明部分地根据本申请者的发现部分纯化的重组嵌合蛋白，IL2-Bax，特异地靶向IL2R+细胞，IL2R+细胞包括但不局限于T细胞、B细胞、单核细胞和天然杀伤细胞。该蛋白通过诱导这些细胞凋亡杀死靶细胞。本发明所包括的各种用途包括但不局限于，治疗自身免疫病、移植排斥、移植物抗宿主病、癌症、超敏反应和传染病。
4．附图简述

图1PSY1质粒的构建图，该质粒编码一种T7启动子的控制下由IL2和Bax-α(命名为IL2-Bax)组成的嵌合蛋白。数字代表相应的氨基酸。
图2嵌合蛋白IL2-Bax编码序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和推导的其氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3含有IL2-Bax嵌合蛋白的细胞级分的SDS-PAGE分析。IL2-Bax在大肠杆菌BL21(λDE3)中过表达，然后按下列6.1.2.节中描述的方法分离成亚级分。每种亚级分的样品和Laemmli样品缓冲液混合并上样到10％的聚丙烯酰胺凝胶上。
泳道1，用含有SDS的抽提缓冲液B处理过的不可溶级分。2，用含有尿素的抽提缓冲液C处理过的不可溶级分。3，用含有Gu-HCL的抽提缓冲液A处理过的不可溶级分。4，可溶级分。M，分子量标记。箭头表示IL2-Bax嵌合蛋白的位置。
图4含有IL2-Bax的级分和针对Bax蛋白的抗体的免疫印迹结果。
泳道1，可溶级分。2，用含有Gu-HCL的抽提缓冲液A处理过的不可溶级分。3，用含有尿素的抽提缓冲液C处理过的不可溶级分。4，用含有SDS的抽提缓冲液B处理过的不可溶级分。5，一种从MCF-7细胞中抽提的已知表达Bax蛋白(用“*”指示)的蛋白。箭头表示IL2-Bax嵌合蛋白的位置。
图5A和BIL2-Bax对靶细胞系(5A)和非靶细胞系(5B)的蛋白合成的影响。把不同浓度的IL2-Bax(用Gu-HCL处理的不可溶级分)加入到各种细胞系中。测定[3H]亮氨酸掺入到细胞中蛋白的数量。结果以未接触IL2-Bax的对照细胞百分率表示。
图6A-DFACS分析接触过IL2-Bax的新鲜淋巴细胞。分离的新鲜淋巴细胞与IL2-Bax，嵌合蛋白接触，然后通过FACS分析凋亡细胞。所述的细胞未被处理(6A)或被地塞米松(6B)、1μg/ml的IL2-Bax(6C)或10μg/ml IL2-Bax(6D)处理。
图7A-CFACS分析接触过IL2-Bax的新鲜淋巴细胞。分离的新鲜淋巴细胞与IL2-Bax嵌合蛋白接触，然后通过FACS分析凋亡细胞。所述的细胞未被处理(7A)，或被1μg/ml IL2-Bax(7B)或10μg/mlIL2-Bax(7C)处理。
图8A-EFACS分析接触过IL2-Bax的HUT102。HUT102细胞与IL2-Bax嵌合蛋白接触，然后用FACS分析特征为凋亡的细胞。结果以对数模式表示。所述的细胞未被(8A)，或被1μg/ml IL2-Bax(8B)、2μg/ml IL2-Bax(8C)、4μg/ml IL2-Bax(8D)或5μg/ml IL2-Bax(8E)处理。
图9A-CFACS分析接触过IL2-Bax的CEM细胞。GEM细胞与IL2-Bax嵌合蛋白接触，然后用FACS分析特征为凋亡的细胞。结果以对数模式表示。所述的细胞未被处理(9A)，或被1μg/ml IL2-Bax(9B)或5μg/ml IL2-Bax(9C)处理。
5．本发明详述本发明涉及嵌合蛋白，嵌合蛋白的药物组合物，产生嵌合蛋白的方法和使用所述蛋白的方法。为便于清楚地讨论，本发明描述的特异组合物、程序和方法用IL2和Bax举例说明；它们仅为实施本发明加以说明。相似的程序和技术等同地可应用于，构建在任何细胞特异的靶向部分和诱导凋亡部分之间的其他嵌合蛋白。
5.1.嵌合分子的构建虽然本发明的嵌合蛋白可以通过化学合成法产生或通过2个部分之间的化学连接产生，优选的方法是，它们通过在调节序列的控制下把细胞特异的靶向部分的编码序列和诱导凋亡蛋白的编码序列融合产生，调节序列指导融合的多核苷酸在合适的宿主细胞中表达。2个全长的编码序列的融合能通过分子生物学领域众所周知的方法获得。优选的是，融合的多核苷酸仅在第一编码序列的5’末端含有AUG翻译起始密码子，但不存在第二编码序列的起始密码子，以避免产生2个编码产物。此外，引导序列可置于该多核苷酸的5’末端，以把表达的产物靶向到宿主细胞中特异位点或室区中，便于基因表达后的分泌或随后的纯化。2个编码序列也能不用任何连接子直接融合，或由五聚体Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复1-3次组成的柔性多连接子融合。通过插入到VH和VL之间，上述连接子已被用于构建单链抗体(scFv)(Bird等，1988，科学242:423-426；Huston等，1988，美国国家科学院院报85:5979-5883)。设计该连接子能在2个β折叠片之间正确相互作用，形成单链抗体的可变区。其他可以使用的连接子包括Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp C Chau dhary等，1990，美国国家科学院院报87:1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(Bird等，1988，科学242:423-426)。
5.1.1细胞特异的靶向部分本发明的嵌合蛋白由一种细胞特异的靶向部分和一种诱导细胞凋亡的部分组成。细胞特异的靶向部分赋予该分子细胞类型特异的结合，其选择的依据是被靶向的具体细胞群体。广泛种类的蛋白适合用作细胞特异的靶向部分，这些蛋白包括但不局限于针对受体的配体，如生长因子、激素和细胞因子，以及抗体或其结合抗原的片段。
由于在各种谱系的造血细胞中已经鉴定出了大量的细胞表面受体，特异地针对这些受体的配体或抗体可用作细胞特异的靶向部分。在一通过下面6节实施例中说明的实施方案中，IL2被用作嵌合蛋白的细胞特异的靶向部分，以靶向IL2R+细胞。此外，诸如B7-1,B7-2和CD40等其他分子可用于特异地靶向活化的T细胞(白细胞抗原数据手册，1993,Barclay等(编著)，学术出版社)。另一方面，B细胞表达CD19、CD40和IL4受体，可以被结合这些受体的部分靶向。上述部分的实例包括CD40配体、IL4、IL5、IL6和CD28。消除诸如T细胞和B细胞的免疫细胞，在治疗自身免疫病、超敏反应、移植排斥应答和治疗淋巴样肿瘤中，特别有用。自身免疫病的实例是多发性硬化病、风湿性关节炎、胰岛素依赖的糖尿病、全身性红斑狼疮、硬皮病、眼色素层炎(Uviatis)等。更具体而言，由于已知髓鞘碱性蛋白是多发性硬化病中免疫细胞攻击的主要靶点，该蛋白可以用作细胞特异的靶向部分，用于治疗多发性硬化病(WO97/19179；Becker等，1997，美国国家科学院院报94:10873)。
其他可以用于靶向特异细胞亚群的细胞因子，包括白介素类(IL1-IL15)、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、肿瘤坏死因子、转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子等(Thompson(编著)1994，细胞因子手册，学术出版社，圣地亚哥)。
此外，一些细胞表面分子在肿瘤细胞中高度表达，这些分子包括激素受体如人绒毛膜促性腺激素受体和促性腺激素释放激素受体(Nechushtan等，1997，生物化学杂志272:11597)。因此，相应的激素可用作癌症治疗中细胞特异的靶向部分。
抗体是最广泛的细胞特异靶向部分，因为它们能抗任何目的细胞表面抗原。已经产生了抗细胞表面受体、肿瘤相关抗原和诸如CD抗原等白细胞谱系特异标记的单克隆抗体。通过本领域众所周知的方法，可方便地从杂交瘤细胞中分离抗体可变区基因。然而，由于抗体在2条重链和2条轻链之间组装，优选的是把scFv用作本发明的细胞特异靶向部分。上述scFv由VH和VL结构域通过一个柔性连接肽连接成单一肽链组成。而且，抗体的重链Fc部分被用于靶向表达Fc受体的细胞，如使用IgE抗体的Fc部分靶向到肥大细胞和嗜碱性细胞。这些细胞类型的特异靶向作用，可用于治疗人类和动物中IgE介导的超敏反应(Helm等，1988，自然331:180-183；PCT/IL96/00181)。
5.1.2诱导凋亡的部分BCl2家族的促凋亡蛋白特别适合用作本发明诱导凋亡的部分。可预期上述人源蛋白能降低许多由细菌毒素组成的免疫毒素的免疫原性。在下面第6节实施例说明的一个具体实施方案中，bax编码序列和IL2编码序列融合，产生嵌合蛋白IL2-Bax。虽然Bax是优选的诱导凋亡部分，其他适合用于本发明的该家族其他成员包括Bak(Farrow等，1995，自然374:731；Chittenden等，1995，自然374:733；Kiefer等，1995，自然374:736,Bcl-XS(Boise等，1993，细胞74:597；Fang等，1994，免疫学杂志153:4388)Bad(Yang等，1995，细胞80:285)，Bid(Wang等，1996,Genes Develop10:2859-2869),Bik(Bovd等，1995，癌基因11:1921-1928),Hrk(Inohara等，1997,EMBO J 16:1686-1694)和Bok(Hsu等，1997，美国国家科学院院报94:12401-12406)。编码这些蛋白的核苷酸序列在本领域已知，因此在表达载体中与细胞特异的靶向部分的编码序列融合，可方便地获得cDNA克隆。
已经研究了一些Bcl-2家族成员的特异结构域的有关诱导凋亡的活性。例如，Bak的GD结构域包含凋亡功能(美国专利号5,656,725)。此外，表明Bax和Bipla享有一个同源的结构域。因此，任何Bcl-2家族的生物学活性结构域可以用作诱导凋亡的部分，实施本发明。
半胱天冬酶(Caspases)也在凋亡中起中心作用，并且可能最佳地构成凋亡一致的核心机制的一部分。半胱天冬酶被称为凋亡的介导者。由于推进细胞死亡需要的蛋白CED-3的识别为与哺乳动物半胱氨酸蛋白酶白介素1β-转换酶(ICE)具有序列一致性，已经鉴别出了该家族至少10个相关的半胱氨酸蛋白酶。这些蛋白的特征是，在P1位置几乎对天冬氨酸绝对的专一性。所有的半胱天冬酶(ICE样蛋白酶)含有一个保守的QACXG(其中X是R,Z或G)的五肽活性位点基序。半胱天冬酶作为非活性的原酶合成，该原酶包含一个把一个大亚单位和一个小亚单位连接在一起的N-末端肽(原结构域)。半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-3的晶体结构显示该活性酶是一种异四聚体，含有2个小亚单位和2个大亚单位。凋亡过程中半胱天冬酶的活化导致包括多(ADP-核糖)聚合酶和核纤层蛋白等细胞关键底物的裂解，由此促进凋亡激烈的形态变化(Cohen,1997,Biochem.J.326,1-16)。因此，把半胱天冬酶用作诱导凋亡的部分也在本发明的范围之中。
最近克隆和鉴定了几种新蛋白，这些蛋白介导主要是半胱天冬酶的蛋白活性所需的，涉及凋亡通路的因子。鉴别出的一个因子是过去熟知的电子传递蛋白，细胞色素c(Lin等，1996，细胞86:147-157)，命名为Apaf-2。除了细胞色素c外，活化半胱天冬酶-3需要2个其他的胞液因子Apaf-1和Apaf-3。Apaf-1是一种与秀丽隐杆线虫CED-4同源的蛋白，而Apaf-3被鉴别为半胱天冬酶的成员，半胱天冬酶-9。在细胞色素c的存在下，2种因子通过它们各自NH2末端CED-3同源结构域相互结合，该事件导致半胱天冬酶的活化。活化的半胱天冬酶-9轮流裂解和活化半胱天冬酶-3(Liu等，1996，细胞86:147-157；Zou等，1997，细胞90:405-413；Li等，1997，细胞91:479-489)。另一个涉及凋亡通路的蛋白是DNA片段化因子(DFF)，这是一种45和40kd亚单位的异二聚体，在半胱天冬酶-3的下游起作用，以激发基因组DNA片段化成核小体片段(Liu等，1997，细胞89:175-184)。
5.2.嵌合蛋白的表达根据本发明，一种编码嵌合蛋白、突变多肽、嵌合蛋白的生物活性片段或其功能类似物的多核苷酸，可用于产生重组DNA分子，该重组DNA分子在合适的宿主细胞中指导表达嵌合蛋白、嵌合蛋白片段或其功能类似物。
由于遗传密码的内在简并性，编码基本上相同或功能上相等的氨基酸序列的其他DNA序列，可以用于实施本发明，以克隆和表达该嵌合蛋白。上述DNA序列包括那些在严格条件下能与嵌合序列或它们的互补序列杂交的序列。在此所用的短语“严格条件”指的是下列杂交条件(1)使用低离子强度和清洗的较高温度，如50℃下0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS；(2)在杂交过程中使用如甲酰胺的变性剂，例如42℃下，50％(vol/vol)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸钠缓冲液，以及750mM NaCl,75mM柠檬酸钠；或(3)使用42℃下，50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl,0.075M焦磷酸钠，5×Denhardt’s溶液，超声过的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，并在0.2×SSC和0.1％SDS中42℃下洗膜。
根据本发明可用的改变DNA序列包括不同核苷酸残基的缺失、添加或替换，结果该序列编码相同或功能上相等的融合基因产物。自身基因产物可以在嵌合序列中含有氨基酸残基的缺失、添加或替换，结果出现沉默变化，因而产生一种功能上相同的嵌合蛋白。上述氨基酸替换可以根据涉及残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或两亲性质进行。例如，负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸；具有不带电荷极性头部基团而基团具有相似亲水性值的氨基酸包括下列甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；以及具有非极性头部基团的氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。
可构建本发明的DNA序列，以便为各种末端改变嵌合编码序列，这些序列的改变包括但不局限于修饰基因产物的加工和表达。例如，用本领域众所周知的技术，如定点诱变，可引入突变插入到新限制性位点，以改变糖苷化类型、磷酸化等修饰。
在本发明的一个替代实施方案中，使用本领域众所周知的化学方法，能全部或部分合成嵌合蛋白的编码序列。例如见，Caruthers等，1980,Nuc.Acids Res.Symp.Ser.7:215-233；Crea and Horn,180,NucAcids Res 9(10):2331；Matteucci and Caruthers,1980,Tetrahedron Letter 21:719；Chow and Kempe,1981,Nuc AcidsRes.9(12):2807-2817。例如，用固相技术能合成各部分的活性结构域，该技术是从树脂中切下蛋白，用制备性高效液相层谱纯化，然后化学连接形成嵌合蛋白。(如见Creighton,1983，蛋白，结构和分子原理，W.H.Freeman and Co.,N.Y.50-60页)。合成肽的构成可通过氨基酸分析或测序确认(如Edman降解程序，见Creighton,1983,蛋白，结构和分子原理，W.H. Freeman and Co.,N.Y.34-49页)。另外，根据本领域众所周知的方法(Brinkmann andPastan,1994,Biochemica et Biophysica Acta 1198:27-45)，用化学连接子可以偶联通过合成或重组方法产生的嵌合蛋白的2个部分。
为了表达生物活性嵌合蛋白，把编码嵌合蛋白或功能相等物的核苷酸序列插入到一种合适的表达载体中，即含有插入的编码序列转录和翻译必需的元件。嵌合基因产物，以及用重组嵌合表达载体转染或转化的宿主细胞或细胞系，能用于各种目的。这些用途包括但不局限于产生抗体(即，单克隆或多克隆抗体)，这些抗体与所述蛋白的表位结合，以有利于对这些蛋白的纯化。
能使用本领域的技术人员众所周知的方法构建含有嵌合蛋白编码序列和合适转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组NDA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。例如见，如下书中描述的技术，Sambrook等，1989，分子克隆实验室手册，冷泉港实验实，N.Y.和Ausubel等，1989，当代分子生物学方法，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.。
可以利用各种宿主表达的载体系统，表达嵌合蛋白的编码序列。这些系统包括但不局限于微生物，如用含有嵌合蛋白编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有嵌合蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有嵌合蛋白编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)转染的昆虫细胞系统；用含有嵌合蛋白编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统，或用含有嵌合蛋白编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化植物细胞系统，或动物细胞系统。应该注意，由于大部分诱导凋亡蛋白引起哺乳动物细胞中的程序性细胞死亡，优选的是；本发明的嵌合蛋白在原核生物或更低等的真核生物细胞中表达。第6节说明，IL2-Bax可以有效地在大肠杆菌中表达。
每种系统的表达元件在它们的长度和特异性方面有变化。依据所用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译元件的任一个，包括组成性和可诱导性启动子，可用于表达载体中。例如，当克隆到细菌系统中时，能用可诱导的启动子，如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子；巨细胞病毒启动子)等；当克隆到昆虫细胞系统中时，能用如杆状病毒多角体启动子等启动子；当克隆到植物细胞系统中时，能用来源于植物细胞基因组的启动子(如，热休克启动子；RUBISCO小亚单位的启动子；叶绿素α/β结合蛋白的启动子)。或来源于植物病毒的启动子(如CaMV的35 S RNA启动子；TMV外壳蛋白启动子)；当克隆到哺乳细胞系统时，能用来源于哺乳动物细胞基因组(如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子；当产生含有多拷贝的嵌合DNA的细胞系时，利用合适的可选择标记，可用基于SV40、BPV和EBV的载体。
在细菌系统中，根据表达的嵌合蛋白的计划用途，可优先地选择许多表达载体。例如，当产生大量的嵌合蛋白时，指导表达高水平的蛋白产物，这些产物可容易纯化的载体，是合乎要求的。上述载体包括但不局限于，pHL906载体(Fishman等，1994，生物化学33:6235-6243)，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983,EMBOJ.2:1791)(其中，嵌合蛋白编码序列可连接到载体中具有LacZ编码区的框中，结果产生一种杂合AS-lacZ蛋白)；pIN载体(Inouye和Inouye，1985，核酸研究13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989，生物化学杂志264:5503-5509；等载体。
一种能用于表达嵌合蛋白的替代表达系统是昆虫系统。在上述的一个系统中，苜宿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)被用作载体，以表达外源基因。该病毒在草地夜蛾细胞中增殖。嵌合蛋白编码序列被克隆到该病毒的非必需区中(例如多角体基因)，并置于AcNPV启动子的控制之下(例如多角体启动子)。所述的嵌合蛋白编码序列成功地插入，将导致多角体基因的失活和产生非闭合的重组病毒(即，病毒缺乏由多角体基因编码的蛋白外壳。然后，这些重组病毒被用于感染插入基因在其中表达的草地夜蛾细胞中(如见Smith等，1983，病毒学杂志，46:584;Smith，美国专利号4,215,051)。
为了有效地翻译插入的嵌合蛋白编码序列，也需要特异的启动信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在全长嵌合基因的情况下，包括其自身起始密码子和邻近序列被插入到合适的表达载体中，就不需要另外的翻译控制信号。不过，在该嵌合蛋白编码序列不包括其自身起始密码子的情况下，必须提供包括ATG。
密码子的外源翻译控制信号。而且，起始密码子必须与嵌合蛋白编码序列的开读框协调一致，以保证翻译全长的插入片段。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以各种来源，包括天然和合成的。表达的效率能被包括合适的转录增强子元件、转录终止子等增强(见Bittner等，1987，酶学方法153:516-544)。
此外，可以选择宿主细胞系，调节插入序列的表达，或以所需的特异方式修饰和加工基因产物。上述蛋白产物的修饰(如糖苷化)和加工(如裂解)，对于蛋白的功能来说是重要的。在嵌合蛋白中存在的一致N-糖苷化位点，为了得到最优的嵌合蛋白功能需要合适的修饰。对于蛋白的翻译后加工和修饰来说，不同的宿主细胞有不同的特点和特异机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以保证所述的嵌合蛋白的正确修饰和加工。为实现本目的，可使用真核宿主细胞，这些细胞拥有使初始转录体的合适加工，嵌合蛋白的糖苷化和磷酸化的细胞装置。上述哺乳动物宿主细胞包括但不局限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等。
为了长期高产量地产生重组嵌合蛋白，优选的是稳定表达。例如，可以构建稳定表达嵌合蛋白的细胞系。不是使用含有病毒复制起源的表达载体，用由合适的表达控制元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷化位点等)和可选择的标记分子控制的嵌合编码序列、转化宿主细胞。导入外源DNA后，使工程细胞在丰富培养基中生长1-2天，然后转移到选择培养基中。在重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并且允许细胞把质粒稳定地整合到它们的染色体中，然后生长形成转化灶，最后该转化灶被克隆，扩大形成细胞系。
能用的许多选择系统包括但不局限于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等，1977，细胞11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Szybal ska和Szybalski,1962，英国国家科学院院报48:2026)和腺苷磷酸核糖基转移酶基因(Lowy等，1980，细胞22:817)，这些基因能分别用在tk-、hgprt-和aprt-细胞中。另外，能用抗代谢物抗性作为选择的基础，如dhfr基因赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等，1980，美国国家科学院院报77:3567；O’Hare等.,1981，美国国家科学院院报78:1527)；gpt基因赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Bery,1981，美国国家科学院院报78:2072)；neo基因赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，分子生物学杂志150:1)；和hygro基因赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，基因30:147)。已经披露其他的选择基因，即trpB使细胞取代色氨酸利用吲哚；his D允许细胞取代组氨酸利用组氨醇(Hartman和Mulligan,1988，美国国家科学院院报85:8047)；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性(McConlogue L.,1987，分子生物学现代通讯，冷泉港实验室编著)。
5.3.蛋白纯化本发明的嵌合蛋白能通过本领域熟知的技术纯化，如用高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析等技术。用于纯化一种具体蛋白的真实条件，部分地依据于净电荷、疏水性、亲水性等因素，这些因素对本领域的技术人员来说是显而易见的。
有关亲和层析纯化，可用特异地与所述蛋白结合的任何抗体。为了产生抗体；可把各种动物，包括但不局限于兔子、小鼠、大鼠等，用嵌合蛋白或其片段注射免疫。通过侧链功能基团或与侧链功能基团连接的连接子，把蛋白与合适的载体连接，如牛血清白蛋白(BSA)连接。根据宿主物种，可用各种佐剂增加免疫应答，这些佐剂包括但不局限于弗氏佐剂(完全或不完全的)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、多胺、肽、油乳化剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在地用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒杆菌。
可以使用任何通过培养的连续细胞系产生抗体分子的技术，制备针对嵌合蛋白的单克隆抗体。这些技术包括但不局限于，由Koehler和Milstein原创的杂交瘤技术(1975,自然256:495-497)，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，现代免疫学4:72；Cote等，1983，美国国家科学院院报80:2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss,Inc,77-96页)。此外，可用为产生“嵌合抗体”开发的技术(Morrison等，1984，美国国家科学院院报81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然312:604-608；Takeda等，1985，自然314:452-454)，这些技术把来自合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自合适生物活性的人抗体分子的基因拼接在一起。另外，可修改披露用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)，产生用于嵌合蛋白纯化和检测的嵌合蛋白特异的单链抗体。
5.4.嵌合蛋白的用途一旦嵌合蛋白被表达和纯化，通过本领域众所周知的方法就能容易地确定其均一性和功能活性。例如，用Western印迹分析法，利用针对所述蛋白的2个部分的抗体鉴别蛋白。此外，可用荧光标记或放射标记的二抗的结合测定法，检测嵌合蛋白与靶细胞的特异结合能力。
5.4.1体外和离体用途本发明的嵌合蛋白能用于靶向细胞混合群体中的特异细胞类型，然后通过诱导凋亡消除靶细胞。例如，在部分切除治疗时把细胞输到接受者之前的骨髓制备物或运动的外周血中，可用IL2-Bax清除IL2R+白血病细胞。为了降低移植对宿主疾病的发展，在同种基因或异种基因骨髓移植之前，可用该嵌合蛋白消除在供体细胞制备物中的IL2R+细胞。它也被用于离体清除在任何体液，如脑脊液、胸膜液和Sinovial液，中的特异细胞亚群。
本发明的嵌合蛋白也用作诊断试剂。例如，可以使用IL2-Bax检测在体液中存在的自身免疫表达IL2R的细胞，或检测IL2R+淋巴瘤的组织起源。使用特异针对诱导凋亡部分的第二抗体，能容易地检测嵌合蛋白与靶细胞的结合。在此方面，该第二抗体或嵌合蛋白可与一种可检测的标志物如荧光素，酶或同位素连接，以便于检测嵌合蛋白与细胞的结合。
5.4.2体内用途本发明的嵌合蛋白本来就可给受治疗者施用，或以药物组合物的形式用于治疗癌症、自身免疫病、移植排斥、创伤后免疫应答和靶向诸如HIV的gp120等病毒抗原治疗传染病。更具体而言，把IL2-Bax用于消除涉及免疫细胞介导失调的活化IL2R+细胞，这些失调包括淋巴瘤、自身免疫病、移植排斥、移植物抗缩主病、局部缺血和中风。包含本发明蛋白的药物组合物可通过这些方法制造，所用的方法有常规混合法、溶解法、颗粒化法、制成糖衣丸法、研磨法、乳化剂化、胶囊法、包埋法或冻干加工法。药物组合物也可以用常规的方法使用1种或多种生理学上可接受的载体制成，这些载体有稀释剂、赋形剂或辅料，它们有利于所述的蛋白加工成能药学上使用的制备物。合适的制剂将依赖于所选择的施用途径。
有关局部施用，可按本领域众所周知的方法，把本发明的蛋白制成溶液剂、胶体剂、软膏、乳膏、悬浮剂等。
全身用制剂可设计通过注射施用的方法，如皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射，也可设计成通过透皮、透粘膜、吸入剂、口腔或肺的施用法。
注射施用时，本发明的蛋白可制成水溶液，优选的是生理学上可兼容的缓冲液如Hank′、Ringer′s液或生理盐水缓冲液。所述的溶液可含有组方药剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
另外，这些蛋白可以用粉末的形式，使用前用一种合适的载体如无菌无致热原的水溶解。
透粘膜施用时，适合于渗透屏障的穿透剂可用于制剂中。上述穿透剂一般来说在本领域中熟知。
口服施用时，把这些蛋白与本领域众所周知的药学上可接受载体结合，容易地把蛋白制成制剂。上述载体使本发明的蛋白制成片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液状剂、胶体剂、糖浆、浆剂、悬浮剂等，经待治疗的病人口服吸收。用于口服固体制剂例如粉末、胶囊和片剂时，合适的赋形剂包括如糖类的填充剂，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制备物如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；颗粒剂和结合剂。如果有必要，可加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐类和藻酸钠。
如果有必要，固体剂量形式可以用标准技术制成包有糖衣或包有肠溶衣的。
在用例如悬浮剂、酏剂和溶液剂的口服液体制剂时，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乙二醇、油类、乙醇等。此外，可以加入香味剂、防腐剂、增色剂等。
作为颊部施用时，可按常规方法把这些蛋白制成片剂、锭剂等。
作为吸入剂施用时，根据本发明使用的蛋白以气溶胶喷雾的形式，方便地从压力罐或喷雾器中喷出，辅以使用适合的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在压力气溶胶的情况下，剂量单位可以通过一个传递测定量的阀确定。用于吸入剂或吹入剂的胶囊和明胶药室可以制成含有一种所述蛋白的粉末混合物和合一种合适的粉末基质如乳糖或淀粉。
这些蛋白也可以制成直肠或阴道组合物，如栓剂或滞留灌肠剂，如含有常规的栓剂基质例如可可油或其他甘油酯。
除了前面描述的制剂外，这些蛋白也可以制成储存制备物。上述长期作用的制剂可以通过植入法(例如皮下或肌肉内)或肌肉内注射施用。因此，例如，用合适的聚合或疏水材料(例如在可接受的油中的乳化剂)或离子交换树脂，或作为节制的可溶衍生物，例如作为节制的可溶盐类，与这些蛋白制成制剂。
此外，可以使用其他的药物输送系统。脂质体和乳剂是众所周知的输送载体的例子，可把它们用于输送本发明的蛋白。也可以使用某些有机溶剂如二甲基亚砜，尽管使用时一般引起较大的毒性。另外，也可以使用持续释放系统输送所述的蛋白，如含有治疗剂的固体聚合物的半渗透基质。已经确立了各种持续释放材料，它们被本领域的技术人员众所周知。根据它们的化学性质，持续释放胶囊可以几周直至100天释放所述的蛋白。根据嵌合蛋白的化学性质和生物学稳定性，可以利用使蛋白稳定的其他策略。
由于本发明的蛋白可以含有负载的侧链或末端，它们可以作为自由酸或自由碱或作为药学可接受的盐类包括在上面所述的任一种制剂中。药学可接受的盐类是那些基本上保留自由碱的生物学活性并通过与无机酸反应制备的盐类。药学可接受的盐类比它们相应的自由碱形式更容易溶于水或其它protic溶剂中。
5.4.3.有效剂量大体来说，本发明的蛋白以有效量使用，如获得预期的目的。作为治疗或预防疾病病症的用途时，本发明的蛋白或其药物组合物，可用治疗有效量施用或使用。治疗有效量是有效地改善或预防所治疗病人的症状，或延长所治疗病人成活率的剂量。治疗有效量的确定方法完全在本领域的技术人员能力范围之内，尤其在本发明所提供的详细公开内容之中。
作为全身施用时，治疗有效剂量最初可从体外测定的结果估计。例如，在动物模型中能确定剂量，以获得包括在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。上述信息可用于更准确地确定人类中的使用剂量。
使用本领域众所周知的技术，从体内数据如动物模型中也可以估计初始剂量。本领域具有普通技能的人员；可根据动物数据容易地优化用于人类的施用量。
剂量和施用间隔期可以逐个调整，以提供足以维持治疗效应的蛋白血浆水平。用于注射给病人施用的一般剂量范围大约为0.1～5mg/kg/天，优选地大约0.5～1mg/kg/天。
治疗有效的血清水平可以通过每天施用多组剂量获得。
在局部施用或选择吸收的情况下，所述蛋白的有效局部浓度可以与血浆浓度无关。本领域的技术人员，不用过分的实验就能优化局部治疗有效剂量。
所施用的蛋白数量，当然也依据于被治疗者的状况、治疗者的体重、疾病严重性、施用方式和处方医生的判断水平。
所述的治疗可以间歇地重复进行，而症状可以检测或甚至症状不可以检测时也可以。治疗可以单独进行或和其他药物结合进行。在自身免疫失调的情况下，用于与本发明的IL2-Bax结合使用的药物，包括但不局限于类固醇和非类固醇抗炎药剂。
5.4.4.毒性优选地，在此所描述的治疗有效剂量的嵌合蛋白将提供治疗收益，不引起基本毒性。
在此所描述的蛋白毒性可以用细胞培养或实验动物，通过标准的药学程序确定，例如测定LD50(50％群体致死剂量)或LD100(100％群体致死剂量)值确定。毒性和治疗效应之间的剂量比值是治疗指数。表现为高治疗指数的蛋白是优选的。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据，能用于确定在人类中使用无毒性的剂量范围。在此所述的蛋白剂量优选地位于，包括具有较小或没有毒性的有效剂量的循环浓度范围之内。依据采用的剂量形式和使用的施用途径确定的范围之内，所述的剂量可以改变。由每位医生依据病人的症状选择正确的制剂、施用途径和剂量。(如见，Fingl等，1975，治疗的药理学基础，第1章，第1页)。
前面描述了本发明，通过说明的方式提供下列实施例，但本发明不限于这些实施例。
6．实施例诱导IL2R+细胞特异凋亡的嵌合蛋白的产生6.1.材料和方法6.1.1.IL2-BAX编码序列的构建用于表达IL2-Bax嵌合蛋白在T7启动子控制下的质粒，按图1所示的方法构建。用HindⅢ和PpoMⅠ切开携带融合基因IL2-PE40的pHL906，然后抽提该载体片段(Fishman等，1994，生物化学33:6235-6243)。使用从新鲜人淋巴细胞分离的RNA，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码人Bax-α的cDNA。分离的总RNA，根据制造商推荐的条件使用逆转录系统(Promega，美国)，被逆转录成第一链cDNA。用10mM Tris-HCl pH7.6,1mM EDTA把cDNA稀释成总体积1ml，然后贮存于4℃。用该cDNA和覆盖全长编码区的一对合成寡核苷酸引物5’CGCAATTCAAGCTTTGGACGGGTCCGGGGGA 3’(SEQID NO:3)(有义)和5’CGGAATTCAGGTCGTTCAGCCCATCTTCTTC 3’(SEQID NO:4)(反义)，通过PCR产生编码Bax的片段。把反应混合物在DNA热循环仪中(MJ Research Inc.,Watertown,MA)温育33个循环。每个循环由95℃ 1min，65℃ 1min和72℃ 2min组成。用EcoRⅠ和HindⅢ酶消化编码Bax的片段，然后与pHL906载体连接。得到的质粒，被命名为pSY1，含有人IL2编码序列与人Bax编码序列的5’末端融合而成的序列。该质粒通过限制性内切酶消化和DNA序列分析证实。称之为IL2-Bax的嵌合分子的核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ ID NOS:1和2)，在图2中披露。
6.1.2.蛋白表达和部分纯化含有融合编码序列的pSY1质粒被转化到大肠杆菌BL21菌株(λDE3)中，然后表达IL2-Bax嵌合蛋白。表达细胞的沉淀被悬浮在含有0.2mg/ml溶菌酶的50mM Tris-HCl pH810,1mM EDTA中，超声(3次30s的冲击)，然后30000×g离心30min。移取上清液(可溶级分)，保存用于分析。沉淀用3种抽取缓冲液之一变性1)抽提缓冲液A:6M盐酸胍，0.1M Tris-HCl pH8.6,1mMEDTA，0.05M NaCl和10mM DTT，然后4℃下搅拌30min。通过30,000×g离心15min澄清悬浮液，弃去沉淀。在重折叠缓冲液中(50mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA,0.25M NaCl,0.25M L-精氨酸和5mM二硫苏糖醇)，把蛋白溶液以1∶100稀释，然后4℃保持48h。重新折叠的蛋白溶液针对磷酸盐缓冲液(PBS)透析。
2)抽提缓冲液B:20mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl,1mMEDTA,1％NP-40,1％脱氧胆酸，0.1％SDS。测定其活性之前，该级分相对于PBS透析。
3)抽提缓冲液C:在8M尿素，50mM Tirs HCl pH8.0,1mMEDTA,10mM DTT(v/w 1∶1)温育1hr,35,000×g离心15min。用不含有二硫苏糖醇的重折叠缓冲液(见上面)，把上清液以1∶100稀释。
各种级分(可溶级分，用3种不同方法处理的不可溶级分)通过凝胶电泳确定性质(图3)。
6.1.3.蛋白印迹分析按(Fishman和Lorberboum-Galski,1997，欧洲免疫学杂志27:486-494)描述的方法，把电泳样品转移到硝酸纤维素膜上，然后进行免疫印迹。根据制造商的说明，使用ECL检测试剂盒(Amersham,BukingIhamshire,uK)。来自已知表达Bax蛋白的MCF-7细胞(乳腺癌细胞系)的蛋白抽提物，被用作阳性对照。抗人Bax的抗体从pharmingen(圣地亚哥，加利福尼亚)获得，以1∶2,500稀释比例使用。抗人IL-2的抗体从Endogen获得，以1∶5,000的稀释比例使用。
6.1.4.鉴定凋亡细胞的测定法用Ficoll-Isopaque梯度(1.077)(pharanacia)分离来自健康供体的人外周血淋巴细胞，并立即使用。用补加10％胎牛血清，200μg/ml L-谷氨酸，50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μg/ml谷氨酰胺和5×10-5M α-β巯基乙醇的R9MI 1640培养基，把淋巴细胞培养在5％CO2的空气中。加入逐步增加浓度的IL2-Bax(不可溶级分，经6M Gu-HCl处理过)到淋巴细胞中，维持22hr。然后细胞用下列溶液染色A．碘化丙锭(PI，3.5μg/ml)B．用含去垢剂的碘化丙锭测定细胞周期(0.7ml PI缓冲液50μg/ml PI,0.1％柠檬酸钠，0.1％Tritonx100，加入到～106个细胞的细胞沉淀中)。然后用FACS分析细胞。
HUT102细胞(靶T细胞)和GEM细胞(非靶T细胞)，用逐步增加浓度的IL2-Bax温育过夜。200×g离心的细胞沉淀，用2ml冷70％乙醇4℃固定60min。然后离心细胞，用1mlPBS清洗并重新悬浮在0.5ml的PBS中。把0.5ml RNAse(Ⅰ-A型，Sigma,St Louis,Missouri,1mg/ml溶在PBS中)加到样品中，接着和1mlPI(Sigma,100μg/ml PBS)溶液温和地混合。温合过的细胞在暗处室温下温育15min，然后暗处4℃一直保存到测定。单个细胞核的PI荧光用FACS流式细胞仪测定。同时测量颗粒的前向散射和侧向散射。通过适当地提高前向散射的阀值，从分析中排除细胞碎片(Nicoletti等，1991，免疫方法杂志139:271-279)。
6.1.5.细胞毒性测定把细胞(0.2ml培养基中104个)接种在96孔微孔板中，接着加入各种浓度的嵌合蛋白(用在PBS中的0.25％BSA稀释)。24小时温育后，加入[3H]亮氨酸(2-5μCi/孔)6-13hr。然后把所述的微孔板在-70℃放几个小时，然后37℃快速融化。该步骤可消除生长在悬浮液中的靶细胞。把细胞收集到滤膜上，然后用β计数器测量掺入的放射活性。结果以未接触任何蛋白的细胞的对照实验百分掺入值表示。所有测定以三次重复孔进行。
6.2.结果编码IL2-Bax嵌合蛋白的表达质粒构建在T7启动子的控制之下。该质粒在大肠杆菌中表达，然后抽提嵌合蛋白。使用抗Bax和IL2的抗体通过免疫印迹分析，进一步确定所述蛋白的特性(图4)。该嵌合蛋白能与针对Bax和IL2的抗体反应，结果证实克隆和产生全部在编码框内的全长IL2-Bax嵌合蛋白。
通过定量测定法测定蛋白合成的抑制，检测IL2-Bax嵌合蛋白对HUT102和MT-1细胞(人T细胞系统)和αB4细胞(小鼠T细胞)的细胞毒活性；有所这些细胞已知表达对IL2的高亲和力受体。按Lorberboum-Galski等描述的方法(1988，生物化学杂志263:18650-18656)，用细胞毒测定法检测来自3种不同条件处理产生的可溶和不可溶级分。如图5A所示，所有3种表达IL2R的细胞系，尽管具有不同的敏感性，对所述的嵌合蛋白产生剂量依赖的应答。不同敏感性是每种细胞系表达不同数目的IL2R所致。用含有Gu-HCl或SDS的乙醚抽提缓冲液处理过的不可溶级分对各种细胞表现为最高的活性。因此，进一步实验主要用这些部分纯化的级分进行(用Gu-HCl或SDS抽提的不可溶级分)。在全部实验中，以前表现为对IL2R+细胞有细胞毒性的IL2-PE嵌合蛋白，用作阳性对照。
也检测IL2-Bax对各种IL2R阴性细胞的影响这些细胞是CEM细胞(一种缺乏IL2R的人T细胞系)和Km3(一种非T、非B的人干细胞系)。图5B显示这些细胞系不受IL2-Bax嵌合蛋白的影响。由于用Gu-HCl处理过的级分的活性不具有任何非特异的细胞毒性，进一步把该级分用于下列实验。
IL2-Bax诱导IL2R+细胞凋亡的能力用凋亡测定法确定。图6A-6D显示，用IL2-Bax处理过的新鲜分离的淋巴细胞群体中凋亡细胞的增加，并且该嵌合蛋白的效应是剂量依赖的。凋亡细胞的范围为总细胞群体(图7A-7C)的2％-14％(表1A,B)。在此方面，应该注意从健康供体中新鲜分离的淋巴细胞通常仅含有低水平的表达IL2R的细胞，因此可预期在新鲜的淋巴细胞中受IL2-Bax靶向的细胞百分率也低。
地塞米松(10-7M)，一种熟知的在各种细胞中的凋亡诱导剂，被用于进行凋亡的所有实验。不过，从根本上来说各种细胞对该试剂的反应是不同的，这是众所周知的。也显示为地塞米松是一种新鲜淋巴细胞中的弱凋亡诱导剂(图6B)。已知对该试剂非常强烈反应的2B4细胞，被用作检测凋亡的对照细胞。总的结论是，重组嵌合蛋白IL2-Bax对IL2R+细胞有特异性的细胞毒作用，但是不影响IL2R-细胞。而且，该嵌合蛋白的细胞毒效应由诱导凋亡所介导，如由诱导新鲜分离的人淋巴细胞程序性细胞死亡的能力所证实。
表1通过FACS分析IL2-Bax对新鲜淋巴细胞的效应A．第一次实验处理 M1 M2 M1-2对照7.1 1.9 5.2地塞米松9.5 2.8 6.7IL2-Bax,1μg 17.5 413.5IL2-Bax,5μg 24.3 4.3 20IL2-Bax,10μg 42.1 9.1 35每个M1或M2值是重复数据的平均值。
B．第二次实验处理 UL UR UL+UR对照2.362.12 4.48IL2-Bax,1μg4.985.56 10.54IL2-Bax,10μg 14.71 16.84 31.55每个UL或UR值是重复数据的平均值。
图8A-8E表明在接触IL2-Bax的HUT102细胞中，以剂量依赖的方式增加凋亡细胞群体(M1值代表亚G1凋亡细胞群体)。在测定的最高浓度下，IL2-Bax诱导凋亡细胞群体的百分率增加3.6倍。相反，缺乏IL2R表达的CEM细胞未显示凋亡细胞群体的增加(图9A-9C)，证实IL2-Bax效应的特异性。
本发明不受所例证的实验方案的范围所限制，应该认为这些实施方案说明本发明的一个方面，并且功能上相等的任何序列属于本发明的范围之中。确实，除了在此显示和描述的方法之外，根据前面的描述和所附的简图，本发明的各种修饰方法对本领域的技术人员来说是易而显见的。应当认为，上述修饰方法位于所附的权利要求范围之内。
在此引用的全部出版物，作为整体引入仅供参考。
权利要求
1．一种嵌合蛋白，包括细胞特异的靶向部分和诱导凋亡部分。
2．权利要求1的嵌合蛋白，其中所述的诱导凋亡的部分是一种来源于人的蛋白。
3．权利要求2的嵌合蛋白，其中诱导凋亡的部分是一种BCL2家族的促凋亡成员或其活性结构域。
4．权利要求3的嵌合蛋白，其中诱导凋亡的部分是Bax或其活性结构域。
5．权利要求4的嵌合蛋白，其中所述的活性结构域是BH3结构域。
6．权利要求1的嵌合蛋白，其中诱导凋亡的部分是半胱天冬酶。
7．权利要求1的嵌合蛋白，其中诱导凋亡的部分是细胞色素C。
8．权利要求1的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分与表达白介素2受体的细胞结合。
9．权利要求1的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是白介素。
10．权利要求9的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是白介素2。
11．权利要求1的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是白介素2，而诱导凋亡的部分是Bax-α。
12．权利要求1的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是髓鞘碱性蛋白。
13．权利要求1的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分与肿瘤细胞结合。
14．权利要求13的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是促性腺激素释放激素。
15．权利要求1的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是抗体或其片段。
16．权利要求15的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是单链抗体。
17．权利要求15的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是IgE抗体的Fc片段。
18．权利要求1的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是细胞因子。
19．权利要求18的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是表皮生长因子。
20．权利要求18的嵌合蛋白，其中细胞特异的靶向部分是胰岛素样生长因子。
21．权利要求1的嵌合蛋白，该嵌合蛋白通过一种重组DNA方法产生。
22．权利要求1的嵌合蛋白，该嵌合蛋白通过一种化学偶联方法产生。
23．权利要求1的嵌合蛋白，其中该2种部分通过一种多连接子连接。
24．一种药物组合物，该组合物包括权利要求1-22任一项的嵌合蛋白。
25．一种抑制表达白介素2受体的细胞生长的方法，该方法包括施用一种有效量的嵌合蛋白，所用的嵌合蛋白包括对表达白介素2受体的细胞特异的靶向部分和诱导凋亡的部分。
26．一种治疗自身免疫病的方法，该方法包括施用一种治疗有效量的嵌合蛋白，所用的嵌合蛋白包括靶向白介素2受体的部分和诱导凋亡的部分。
27．权利要求25的方法，其中自身免疫病是多发性硬化病。
28．权利要求25的方法，其中自身免疫病是类风湿性关节炎。
29．权利要求25的方法，其中自身免疫病是胰岛素依赖的糖尿病。
30．一种预防移植排斥的方法，该方法包括施用一种治疗有效量的白介素2-Bax嵌合蛋白，用于消除白介素2受体阳性细胞。
31．一种治疗移植物抗宿主病的方法，该方法包括施用治疗有效量的白介素2-Bax嵌合蛋白，用于消除IL2R阳性细胞。
32．一种治疗局部缺血后免疫应答的方法，该方法包括施用治疗有效量的白介素2-Bax嵌合蛋白，用于消除白介素2受体阳性细胞。
33．一种治疗恶性或恶性前期细胞的方法，该方法包括施用治疗有效量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包括细胞特异的靶向部分和诱导凋亡部分，并且该嵌合蛋白能消除恶性或恶性前期细胞。
34．权利要求32的方法，其中细胞特异的靶向部分是促性腺激素释放激素。
34．一种检测IL2R阳性细胞的方法，该方法包括将细胞混合物与IL2-Bax接触并选出与IL2-Bax结合的细胞。
35．一种治疗超敏反应的方法，该方法包括施用一种治疗有效量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包括IgE抗体的Fc部分和诱导凋亡部分。
36．一种治疗传染病的方法，该方法包括施用治疗有效量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白包括靶向细胞的部分和诱导凋亡部分，所述的靶向细胞部分与由细胞表达的传染病病原的抗原结合。
全文摘要
本发明涉及一种具有细胞靶向特异性和诱导凋亡活性的嵌合蛋白。尤其是,本发明通过一种人白介素－2(IL2)和Bax之间的重组嵌合蛋白说明。该嵌合蛋白特异地靶向表达IL2受体(IL2R)的细胞并诱导细胞特异的凋亡。
文档编号C07K14/435GK1299417SQ99805712
公开日2001年6月13日 申请日期1999年3月2日 优先权日1998年3月2日
发明者S·亚科尼, Y·阿扎, R·贝洛斯托特斯基, A·本-耶胡达, R·I阿凯兰, H·罗尔伯布姆－加尔斯基 申请人:耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司