专利名称：生产用于静脉给药的免疫球蛋白和其他免疫球蛋白产品的方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及一种从粗制血浆或粗制血浆蛋白组分中纯化免疫球蛋白，即免疫球蛋白G(IgG)方法。本发明也涉及一种免疫球蛋白产品和这种免疫球蛋白产品的医疗用途。
本发明的背景在19世纪40年代末就引进了用于预防和治疗一些传染性疾病的人正常免疫球蛋白(HNI)。通过Cohn & Oncley的冷冻乙醇分级分离法(Cohn E等，(1946)，美国化学学会杂志，68,459-475),(Oncley等，(1949)，美国化学学会杂志，71,541-550)，并且后来Kistler和Nitschmann也曾进行过改良的方法而制备的HNI，在皮下或肌肉给药时证实是安全、有效的，避免病毒感染的传播。
先天性或获得性免疫球蛋白的完全或部分缺失(分别是原发性和继发性免疫缺陷综合征)在频繁的普通或严重感染中会表现出来，尤其是细菌性感染。以前通过每周达几次的反复肌肉注射或皮下大量注射HNI进行终生治疗，尤其是肌肉内给药，是非常痛苦的。
在六十年代早期，曾经进行静脉途径HNI用药的尝试。试验显示约5％的健康志愿者和约95％的免疫球蛋白缺陷病人产生了程度不同的急性副反应，从呼吸困难到循环性休克，由于静脉应用HNI可以导致上述严重的副反应，因此禁止使用该给药方式。
这些副反应是由上述免疫球蛋白的聚集体引起的，这些聚集体可以强烈地激活补体系统参与其它副作用的发生。这在免疫球蛋白缺失的病人身上表现的尤其明显。尤其严重的一种过敏性副反应可见于产生IgA抗体的患者。因此，在制备过程中避免形成聚集体和/或减少这些聚集体的方法得到发展，大约二十年前测试了第一代用于静脉内给药的免疫球蛋白(IVIG)并发现它是适用的。
应用IVIG的初衷是为了减缓先天性或获得性免疫球蛋白完全或部分缺失的患者体内的感染性发作并减轻HNI给药时伴随的痛苦。IVIG的另一个优势是可以在短时间内大剂量免疫球蛋白给药，并且通过这个方法有可能很快获得血液中足够高的浓度。尤其治疗严重的细菌感染时迅速在感染病灶形成高浓度是有重要意义的。
近年来，进一步证实IVIG在治疗其它方法难以治疗的严重疾病是有效的，例如，以免疫学为基础的由血小板缺失造成的出血，原发性血小板减少性紫癜，一些罕见疾病例如川崎综合征和一些自身免疫性疾病例如多神经根炎(Guillain Barre综合征，又称急性热病性多神经炎)。其它一些现代难以治疗的疾病现在也在进行IVIG临床试验。IVIG在这些疾病中的作用机理只是部分阐明。IVIG的效应与IgG的免疫调节特性有关，例如封闭巨噬细胞的Fcγ-受体，增强IgG的代谢，下调细胞因子产量，并干预独特型/抗独特型网络，尤其与中和自身免疫的反应性活性有关。
第一代IVIG是通过胃蛋白酶切割初始原料制备的(Cohn组分Ⅱ)，切割的目的是去除免疫球蛋白聚集体。该方法不包括层析步骤。为了保持产品稳定，必须冷冻干燥一段合适时间并在即将使用前溶解。
IVIG的初始原料是已经证实在肌肉注射时对可能的病毒传播是安全的HNI。由此，认为IVIG也是安全的。然而临床应用几年后，一些制造商的IVIG令人吃惊的显示可导致丙型肝炎病毒感染的转移。为了阐明在HNI的生产过程中已消除了病毒而进行的研究显示用分级分离法从血浆中制备HNI时对病毒的消除是适度的。用于肌肉内的HNI的安全性似乎是因为它含有具保护性的免疫球蛋白。结合适度的注射体积和肌肉内给药方案，这些保护性免疫球蛋白能够中和并呈递未感染血浆中的普通病毒。尤其是免疫球蛋白大剂量静脉内给药时，如20世纪90年代早期所证实的可能会发生病毒感染。因此，在生产方法中应该包括一步或多步明确病毒失活/或已消除的步骤，这一点得到了认可。
以未切割和未修饰的有抗补体活性和高稳定性的免疫球蛋白分子为基础的第二代IVIG于80年代中期问世，但始终是冷冻干燥的产品形式。这代IVIG通过多步层析纯化。这种产品目前占IVIG市场的主流。这样第一代和第二代IVIG都是粉剂，在即将使用前溶解。
冷冻干燥的IVIG溶解很慢(一小瓶累计30分钟)。一个病人往往需要溶解几份。因此使用者有马上可使用的IVIG液体是十分首要的，液体产品已引入市场。更重要的是，为了获得一种纯度高、稳定性高，而临床效应又高，而副反应低的全天然IVIG，仍然需要改善生产方法。这样就需要对从粗制血浆或血浆蛋白组分中纯化IgG的方法进一步充实、改进，以获得不含病毒的液体产品。最后，该方法应该能够用于大规模生产。
本申请所述的纯化方法可以制备一种静脉内给药的液体免疫球蛋白产品，其特征为高纯度、纯天然、具有生物活性、两次病毒灭活、稳定的新一代IVIG，不含任何去污剂、聚乙二醇(PEG)或白蛋白等稳定剂。
发明概述本发明涉及一种改良的纯化方法和一种与其它药物一样能够静脉内给药的液体免疫球蛋白产品。
用本发明所述方法制备的免疫球蛋白可称为第三代IVIG。本方法按下述条件进行分离不用胃蛋白酶进行切割，通过沉淀去除聚集体和颗粒(已确认这一步骤可以有效清除病毒)，通过离子交换层析法达到进一步纯化，引进S/D处理作为病毒灭活步骤，并且制备的产品为液体。
与以前本领域的产品相比由于通过本发明的方法获得的免疫球蛋白产品纯度得到改善，不必添加诸如非离子去污剂，PEG或白蛋白的稳定剂来防止液体IVIG产品在储存过程中形成IgG的聚集体。本发明方法获得的产品比以前本领域的产品质量更高而且提供了改善的临床效用，而且实际上不存在不希望的副作用。
本发明的详细描述本发明涉及一种从粗制血浆或含免疫球蛋白的血浆组分中纯化免疫球蛋白，即IgG的方法，所述方法包括以下步骤(a)制备含免疫球蛋白的粗制血浆蛋白组分的水相悬浮液；(b)在上述步骤(a)的悬浮液中加入足够量的一种可溶于水的，而不使蛋白变性的沉淀剂，沉淀大部分非免疫球蛋白G的蛋白，免疫球蛋白聚集体和诸如病毒的具潜在感染性粒子的颗粒，而基本上不造成免疫球蛋白G单体的沉淀，这样形成了一种固体沉淀和液体上清的混合物；(c)从步骤(b)的混合物中回收澄清的含免疫球蛋白G的上清；(d)将步骤(c)澄清的含免疫球蛋白G的上清加至阴离子交换树脂，再加至阳离子交换树脂；(e)用pH和离子强度足以去除树脂中的蛋白杂质，而基本上不造成免疫球蛋白G洗脱的缓冲液洗去蛋白杂质和蛋白沉淀剂；(f)用pH和离子强度足以有效洗脱免疫球蛋白G的基本上非变性缓冲液洗脱免疫球蛋白G，从而回收含免疫球蛋白G的洗脱液；(g)将步骤(f)含免疫球蛋白G的洗脱液进行透滤/超滤以浓缩和/或透析洗脱液并任选地加入稳定剂；(h)在步骤(g)已透滤/超滤并任选地加入稳定剂的含免疫球蛋白G的组分中加入病毒致死剂量的病毒灭活剂形成基本上无病毒的含免疫球蛋白G的溶液；(i)将步骤(h)含免疫球蛋白G的溶液加至阴离子交换树脂纯化再接着加至阳离子交换树脂；
(j)用pH和离子强度足以从树脂中有效洗去蛋白杂质和病毒灭活剂而基本上不造成免疫球蛋白G的洗脱的缓冲液洗步骤(i)的阳离子交换树脂；(k)用pH和离子强度足以有效洗脱免疫球蛋白G的基本上非变性缓冲液从步骤(ｊ)的阳离子交换树脂洗脱免疫球蛋白G，由此回收含免疫球蛋白G的洗脱液；以及(l)透滤/超滤步骤(k)的含免疫球蛋白G的洗脱液以降低离子强度并浓缩免疫球蛋白G溶液，加入糖类物质调节重量摩尔渗透浓度。
本纯化方法的起始原料可以是粗制血浆，但是含免疫球蛋白的粗制血浆蛋白组分是更方便的。纯化方法的起始原料可以是正常人血浆或者可以来源于含有高滴度特定抗体的供体，例如超免疫血浆。在本说明书中，术语“含免疫球蛋白的血浆组分”包括所有本方法可用的起始原料，例如无冷沉淀物的血浆或各种血浆蛋白诸如因子Ⅸ和抗凝血酶已去除的无冷沉淀物血浆，不同的Cohn组分，和PEG沉淀法获得的组分(Polson等，(1964)，生物化学生物物理学报，82,463-475；Polson和Ruiz-Bravo,(1972)Vox Sang,23,107-118)或硫酸铵沉淀的组分。在一个优选的实施方案中，血浆蛋白组分是Cohn组分Ⅱ和Ⅲ，但是Cohn组分Ⅱ，或Conh组分Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ也可使用。优选用Kistler-Nitschmann改良的标准Cohn-分级分离法从血浆中制备不同的Cohn组分。除免疫球蛋白外，Cohn组分包括例如纤维蛋白原，α-珠蛋白和β-珠蛋白，包括各种脂蛋白，它们应该在后续纯化步骤中优选去除。根据用于获得Cohn组分的分离方法(例如离心或过滤)，可以使用助滤剂，也可以不使用。
本发明方法的第一步包括制备含免疫球蛋白的血浆蛋白组分的水相悬浮液，其中IgG在悬浮液中的浓度足够高，这样，在后续沉淀步骤中，大部分非IgG-蛋白，尤其是高分子量的成分，聚合免疫球蛋白和其它蛋白及具潜在感染性的颗粒沉淀，而单体免疫球蛋白基本上不沉淀。如果在加入沉淀剂前在这种有缓冲作用并经过滤的悬浮液中IgG浓度至少4g/l那么通常可以达到这一点。应该认识到沉淀悬浮液的蛋白浓度影响及pH和温度根据所选的沉淀剂而定。
血浆蛋白组分优选在基本上非变性温度和pH下重悬于水中和/或缓冲液中。术语“基本上非变性”是指术语所涉及的条件基本上不会造成IgG分子功能活性的不可逆丧失，例如丧失抗原结合活性和/或Fc的生物学功能(参见实施例2)。
用体积是血浆蛋白组分体积的6-9倍，优选7-8倍的由至少一种非变性缓冲系统酸化处理的水悬浮血浆蛋白组分是有利的。为了保证免疫球蛋白的最佳溶解性和后续PEG沉淀步骤的最佳效果，含免疫球蛋白的悬浮液的pH优选保持在pH6以下，比如在4,0-6.0的范围内，优选是5.1-5.7，最优选的pH是5.4。任何合适的酸性缓冲液都可使用，但缓冲系统优选包括至少一种下述缓冲液和酸磷酸钠，醋酸钠，醋酸，HCL。本领域熟练技术人员将会理解大量的其它缓冲液也可以使用。
尤其为了防止蛋白质变性和将蛋白酶的活性降至最低，免疫球蛋白缓冲液优选保持低温。免疫球蛋白悬浮液和水及所加的缓冲系统优选在0-12℃的范围内保持相同的温度，优选的温度是0-8℃，最优选的是1-4℃。
乙醇沉淀的糊状物的悬浮液含相对大量的聚集蛋白物质。任选地，过滤含免疫球蛋白的悬浮液以去除例如大的聚集体，如果存在的助滤剂，和残留的不溶糊状物。过滤优选使用厚滤纸，例如C150AF,AF2000或AF 1000(Schenk),30LA(Cuno)或相似的滤器。也可离心去除聚集体，如果存在的助滤剂，和残留的不溶性蛋白物质。
在含免疫球蛋白的经过滤的悬浮液中加入至少一种量足以造成免疫球蛋白聚集体中大部分高分子量蛋白，脂蛋白，聚集的蛋白沉淀的基本上不会引起变性的水溶性蛋白质沉淀剂。其它颗粒性物质，诸如感染性颗粒，如病毒颗粒，也会沉淀而不引起免疫球蛋白单体的沉淀。本文中的术语“感染性颗粒”包括如病毒颗粒(例如肝炎病毒，HIV1和HIV2)和细菌。
基本上不会引起变性的水溶性蛋白沉淀剂在蛋白纯化领域中是为人熟知的。这种沉淀剂用于蛋白分级分离，可从悬浮液中得到部分纯化的蛋白。本发明方法中使用的适合的蛋白沉淀剂包括PEG的各种分子量形式，辛酸，和硫酸铵。本领域的熟练技术人员会理解也可任选地使用其它几种不会导致变性的水溶性沉淀剂进行沉淀。术语“加入蛋白沉淀剂”和该术语的其它形式是指加入一种或多种类型的蛋白沉淀剂。
一种优选的沉淀剂是有机试剂PEG，尤其是分子量在3000-8000Da范围内的，如PEG3350,PEG4000,PEF5000，特别是PEG6000(这些数字代表PEG的平均分子量)。应用PEG的优点在于PEG不含离子且有稳定蛋白的特性，例如已知低浓度的PEG是IVIG的稳定剂。沉淀过程也有清除病毒的作用。PEG浓缩和沉淀各种种类、大小和表面包被的病毒。
向过滤的悬浮液中定量加入蛋白沉淀剂，可以使大量高分子量聚集的蛋白和颗粒沉淀，而不使IgG单体沉淀，形成澄清的上清溶液。加入的蛋白沉淀剂可以是固体粉末或浓缩溶液。
PEG作为沉淀剂时，蛋白质分子量越高，所使用PEG的浓度越低。PEG3350、PEG4000或是优选使用PEG6000为沉淀剂时，过滤的悬浮液中沉淀剂浓度优选在3-15％(重量)范围内，例如4-10％(例如约5％,6％,7％,8％,9％,10％)，其中6％是最优选的。在进行沉淀时，至少需在固相和液相间出现平衡后再进行沉淀，通常大约两个小时，例如2小时到12小时，优选时间大约4小时。在整个沉淀过程中悬浮液优选保持在低温(例如低于12℃，低于10℃，优选在2℃和8℃之间)。最适温度根据蛋白沉淀特性而定。
蛋白完全沉淀后，从固体沉淀和沉淀后的上清混合物中回收澄清的几乎全是单体形式的IgG的上清。可使用常规方法从固相中分离液相进行回收，如离心和/或过滤。优选使用1000-5000g离心力的极限沉降离心(例如Westfalia)。
任选地，回收的含IgG的澄清的上清经厚滤纸过滤去除较大的颗粒和聚集体。任选地随后使用常规灭菌滤器(如Millipore或Sartorius的0.22μm的滤器)进行无菌过滤，这样可从溶液中消除细菌。
澄清的和任选地过滤的含IgG的上清进行至少一步，如两步，也可选择进行多步阴离子和阳离子交换层析以去除残留的非IgG杂质，例如IgA，白蛋白和聚集体。在一个优选的实施方案中，将任选经过过滤的含IgG的澄清上清在两个适当直径的交换柱中经阴离子交换树脂层析后，再进行阳离子交换树脂层析。
在用离子交换层析纯化IgG时，优选的是，如pH和离子强度等条件的选自是使溶液中大部分杂质(诸如非IgG蛋白，例如IgA，铁转运蛋白，白蛋白和聚集体)结合于阴离子交换树脂上，而IgG分子基本上不吸附于阴离子树脂上。对于后续的阳离子交换层析，优选的条件是使溶液中几乎所有IgG单体结合于阳离子交换树脂上。没有结合于阴离子交换树脂上的蛋白杂质和沉淀剂，在阳离子树脂洗脱时被清除。
本方法的优选的实施方案中，阴离子交换树脂和阳离子交换树脂串联使用。本文中，术语“串联使用”用于离子交换树脂时，是指蛋白流经阴离子交换树脂后直接进入阳离子交换树脂而不改变缓冲液或其它条件。
一些原因可说明在一个步骤中用两个串联连接的层析柱而不是两个独立的层析步骤，例如使用不同的缓冲液进行阴离子交换和阳离子交换是有利的。使用两个串联连接的层析柱使操作更为可行，例如不需要在两个离子交换层析方法之间收集含IgG组分的中间步骤，因为在收集时有可能需要调节pH和离子强度。此外缓冲液的流速需要同时适用于两个柱子，并且两个柱子用同一种缓冲液平衡。然而，如果将层析过程换为两步也是可行的，即不要串联连接阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。但是如上所述两步层析与两个离子交换柱串联连接相比更费力。
目前认为本发明IVIG产品的高纯度、高IgG单体和二聚体含量和低IgA含量，部分是由于使用了串联连接的层析柱。
正如本领域熟练技术人员所熟知的，离子交换是以不同基质及结合不同带电基团的不同材料为基础的。例如，下述基质都可使用，所提到的材料可有不同程度的交联以琼脂糖为基础(诸如SepharoseCL-6B,SepharoseFast Flow和Sipharose High Performance)，以纤维素为基础(诸如DEAE Sephacel)，以右旋糖苷为基础(诸如Sephadex)，以二氧化硅和合成的聚合物为基础。对于阴离子交换树脂，共价结合于基质上的带电基团可以是如二乙氨乙基(DEAE)，季氨乙基(QAE)，和/或季铵(Q)。对于阳离子交换树脂，共价结合于基质上的带电基团可以是如羧甲基(CM)，丙磺基和/或甲磺基(S)。本发明方法的一个优选的实施方案中，阴离子交换树脂使用DEAE Sepharose Fast Flow，也可使用其它阴离子交换树脂。优选的阳离子交换树脂是CM Sepharose Fast Flow，也可使用其它的阳离子交换树脂。
填充进离子交换层析柱所用树脂的合适体积由柱的尺寸即柱的直径和树脂的高度反映，并根据例如上样溶液中的IgG量和所用树脂的结合能力而变化。
进行离子交换层析前，优选使用可结合缓冲液平衡离子的交换树脂。阴离子和阳离子交换树脂优选使用同一种缓冲液平衡，因为仅仅配制、使用一种缓冲液可以简化操作步骤。
例如，如果选用的阴离子交换树脂是DEAE Sepharose FF而阳离子交换树脂是CM Sepharose FF，且柱子串联相接，那么两个柱子都有利的是用与注入的IgG溶液有相同pH和离子强度的非变性酸性缓冲液平衡。多种缓冲液的任一种都适合于平衡离子交换柱，例如醋酸钠，磷酸钠，三羟甲基氨基甲烷。本领域的熟练技术人员清楚大量的其它缓冲液只要pH、电导与IgG溶液大致相同就可使用。平衡串联使用的阴离子交换柱和阳离子交换柱的优选缓冲液是浓度在5-25mM之间的醋酸钠缓冲液，例如在10-20mM的范围内，优选浓度是约15mM。平衡柱子的醋酸钠缓冲液的pH优选在5.0至6.0的范围内，诸如在5.4-5.9之间，优选的pH是约5.7。电导范围是1.0-1.4mS/cm，优选值是约1.2mS/cm。使用的醋酸盐缓冲液可用醋酸钠三水合物和冰醋酸制备。
在将澄清的经过滤的含IgG的上清上离子交换柱之前，如果有必要，其缓冲液浓度和pH值优选调节到与所用平衡缓冲液浓度和pH相同值。
将含IgG的上清加入串联的柱子后，为了保证含IgG的溶液完全从阴离子交换柱转入阳离子交换柱中，优选用一个柱体积的洗脱缓冲液洗柱(初始洗脱)。接着，阴离子交换柱和阳离子交换柱分开，优选用pH和离子强度足以洗脱阳离子树脂上的所有杂质而基本上不洗脱IgG的缓冲液洗阳离子交换柱去除蛋白质杂质。
即使可以使用其它相似浓度和pH值的缓冲液，在初始洗脱时，有利的是仍使用平衡缓冲液。优选使用醋酸盐缓冲液洗脱阳离子交换树脂上的杂质。缓冲液的pH可从5.0至6.0，例如在5.2-5.4的范围内，如约5.4。
阳离子交换树脂上的IgG的洗脱优选用pH和离子强度足以使IgG有效洗脱的基本上非变性缓冲液，然后回收含IgG的洗脱液。本文中，有效洗脱是指上样于串联的阴离子交换树脂和阳离子交换树脂的IgG蛋白含量至少75％，如至少80％，至少85％，从阳离子交换树脂上洗脱下来。有利的是按照梯度洗脱的步骤洗脱。本发明方法中，优选使用pH在5.0-6.0之间，如5.2-5.8，优选值是5.4，浓度在5-40mM范围内，如10-25mM，优选值是15mM的醋酸钠缓冲液。
优选的洗脱缓冲液盐浓度高至足以从树脂上置换下IgG。但也认为升高pH和降低盐浓度可从树脂上洗脱IgG。本方法的一个优选的实施方案中，用浓度在50-500mM范围内的氯化钠溶液进行连续盐梯度洗脱，优选氯化钠浓度是约125mM至约350mM。
也可进行逐步梯度洗脱。认为也可以进行恒定盐洗脱，其中所用的阳离子交换柱洗脱缓冲液与梯度洗脱相反只有一种盐浓度。如果进行恒定盐洗脱，有利的是使用的氯化钠盐浓度范围在约350mM至约500mM。与恒定盐洗脱相比梯度洗脱的优点是用盐梯度洗脱更有效，而另一个优点是洗脱液的盐离子强度低，因为高盐离子强度对IgG的稳定性至关重要，因此低盐离子强度是优选的。洗脱缓冲液可进一步含有如下文所述蛋白稳定剂。正如本领域熟练技术人员所知道的，也可用其它适当的缓冲系统洗脱IgG。
洗脱时或洗脱后优选直接在IgG组分中至少加入一种蛋白稳定剂。蛋白稳定剂是本领域熟练技术人员所熟知的，包括如不同的糖醇和糖类(诸如山梨醇，甘露糖，葡萄糖，海藻糖，麦芽糖)。蛋白(诸如白蛋白)，氨基酸(诸如赖氨酸，甘氨酸)和有机试剂(诸如PEG)。有利的是选用的中间稳定剂能在后续步骤中从含IgG的溶液中去除。
IgG的溶液中蛋白稳定剂的合适浓度根据所使用的试剂而定。一个优选的实施方案中，稳定剂是苏糖醇，优选的最终浓度是2-15％(w/v)的苏糖醇，如约2.5％。
阳离子交换柱洗脱后，洗脱液优选脱盐(如透析)并有利的是浓缩。结合使用透滤/超滤方法改变IgG的缓冲液和浓度。术语“透滤/超滤”是指透析和浓缩各通过透滤和超滤在一步进行。透滤和超滤也可以按照两步进行。但为了防止产品不必要的损失，目前优选用透滤和超滤法同一步进行透析和浓缩。
有利的是使用的透滤/超滤膜标称透过分子量范围是10,000-100,000Da。本方法优选的膜类型是标称透过分子量是30,000Da的聚砜膜，来自Millipore。也可使用有相当材料和多孔性的其它超滤膜。
浓缩的程度可有相应的变化。浓缩溶液从约10g/l至100g/l IgG,优选的是10g/l到50g/l。浓缩后，IgG浓缩液有利的是对低盐离子强度的缓冲液透析。不仅去除盐离子，此步还可从溶液中去除低分子量杂质并提供了为下步纯化改变缓冲液的方法。透滤缓冲液优选含2.5％(w/v)山梨醇的15mM醋酸钠。直到超滤的溶液的电导值降至1.5mS/cm以下，优选小于1.3mS/cm时停止改变缓冲液。在透滤/超滤过程中，pH优选保持在4.0-6.0范围内，优选5.1-5.7，最优选的值是约5.4。
透滤/超滤后，如果有必要有利的是将溶液中的蛋白稳定剂的浓度调节至所用特定蛋白稳定剂特有的最适终浓度。如果使用了山梨醇，其浓度优选调至约10％(重量)。
优选用孔直径在0.2-1.0μm范围内的滤膜过滤稳定的溶液，优选的直径是0.45μm左右，以便在下一步骤之前去除聚集体。在这一步骤中，作为高纯度、低离子强度、酸性pH、相对高浓度的IgG和添加的稳定剂最终形成的溶液看起来是澄清的。
在IVIG的生产过程中，目前已明确证实至少有两种清除病毒和灭活病毒的方法，在清除病毒的过程中，优选加入PEG，而针对有脂类包膜病毒应先用S/D处理。除了对起始原料的病毒安全性有严格的要求外，根据国际准则以及众所周知的多步纯化可降低病毒的作用，综合使用两个独立的降低病毒的步骤对有包膜病毒和无包膜病毒都是有效的，本发明的药物基本上是无病毒毒性的。
优选在本方法的此步骤中，向IgG的溶液中加入病毒致死剂量的病毒灭活剂，灭活IgG的溶液中的可能具感染性的脂类包膜病毒。病毒灭活剂的“病毒致死剂量”意来用来说明在溶液中加入的剂量，使得溶液中的病毒颗粒基本上无感染能力，并由此形成本领域所定义的含IgG的无病毒毒性溶液。这样的“致死剂量”根据使用的病毒灭活剂及诸如培养时间、pH、温度、脂类含量和蛋白浓度确定。
术语“病毒灭活剂”意在说明一种能够灭活有脂类包膜病毒和无脂类包膜病毒的试剂或方法。术语“病毒灭活剂”在适当情况下应理解为包括这些试剂和/或方法的结合使用，及这些试剂或方法的一种。
优选的病毒灭活剂是去污剂和/或溶剂，最优选的是去污剂-溶剂混合物。可以理解病毒灭活剂可以是一种或多种去污剂和一种或多种溶剂的混合物。溶剂/去污剂(S/D)处理是广泛使用的灭活血液产品中脂类包膜病毒(例如HIV1和HIV2，丙型肝炎病毒和非A-B-C(甲、乙、丙)型肝炎病毒，HTLV1和2型，疱疹病毒家族，包括CMV和埃-巴(EB)病毒)的步骤。多种去污剂和溶剂可以灭活病毒。可从含非离子和离子的去污剂中进行挑选，并且选取不导致变性的去污剂。由于非离子去污剂可以简化IgG制备中清除去污剂的后续步骤，所以优选非离子去污剂。合适的去污剂，如Shanbrom等，US专利4,314,997中，和US专利4,315,919所述。优选的去污剂是市场所售的Triton X-100和吐温-80。可以灭活病毒的试剂，如Neurath和Horowitz，在US专利4,764,369中所述的二-或三烷基磷酸酯。优选溶剂是三(正丁基)磷酸酯(TNBP)。本发明优选使用的一种病毒灭活剂是TNBP和吐温80的混合物，也可选择使用其它混合物。优选加入的混合物，使TNBP在IgG的溶液中的浓度在0.2-0.6％(重量)之间，优选浓度是约0.3％。吐温80在含IgG的溶液中的重量浓度在0.8-1.5％之间，优选重量浓度是约1％。
在灭活有包膜的病毒后，可以得到基本上无病毒毒性的含IgG溶液，通常这些条件包括温度为4-30℃，诸如19-28℃,23-27℃，优选约25℃，及证实性研究发现的培养时间。通常培养1-24小时是足够的，优选为4-12小时，诸如约6小时，以保证病毒充分灭活。然而，适当的培养条件(温度和培养时间)根据所用的病毒灭活剂，pH，和溶液中蛋白浓度及脂类含量而定。
预期也可使用其它的方法去除或灭活病毒制备无病毒毒性的产品，诸如加入亚甲基蓝再进行紫外光照射或纳米过滤。
溶剂/去污剂处理后，有利的是用缓冲液稀释溶液。或者，过滤基本上无病毒毒性的含IgG的溶液，优选用先前所述的本发明方法的上一步骤中的厚滤纸或无菌滤器。
病毒灭活后，优选进行过滤，离子交换层析去除病毒灭活剂和蛋白杂质。优选按照所述的本发明方法中先前的离子交换层析步骤进行，不同之处是阴离子交换树脂的体积大约是阳离子交换树脂的一半，且IgG洗脱之前用大量缓冲液洗柱，至少用六个柱体积的缓冲液。另外，本发明的优选的实施方案中平衡缓冲液是浓度在5-25mM之间的醋酸钠，优选浓度是15mM,pH范围在5.0-5.8之间，优选5.4。如前所述，优选将醋酸钠的含量和含IgG溶液的pH调节至与平衡缓冲液相同的浓度和pH。此外，本发明的一个优选的实施方案中，加入到回收的洗脱液中的稳定剂，优选麦芽糖，终浓度在1-5％(重量)之间，优选为2.5％。
优选的消除病毒灭活剂的方法是离子交换层析。但是，其它方法，诸如油抽提和其它的层析方法，预期是有效的。适当的方法根据所用的病毒灭活剂而定。溶剂/去污剂的清除，可通过先使IgG结合于树脂上，接着再用缓冲液完全洗去灭活剂。阳离子交换层析是一种有用的方法。在本发明的优选的实施方案中，除阳离子交换层析外也可进行阴离子交换层析以提高本发明方法最终产品的质量和总体纯度。
离子交换层析步骤之后，优选透析和浓缩含IgG的洗脱液；这样残余的小蛋白组分的含量也被有效的降低。如前所述可有利地进行透滤/超滤完成透析和浓缩。超滤用的缓冲液是醋酸钠，优选浓度大约从4至10mM，优选7.5mM,pH在4.0至6.0，优选约5.1-5.7，诸如大约5.4。或者，也可用诸如磷酸钠或酸等缓冲液进行超滤。电导小于或等于1mS/cm时停止超滤。或者，进一步无菌过滤含IgG的溶液。
如果需要，将基本上无病毒灭活剂的含纯化的IgG的溶液进行进一步处理，达到可用于如静脉内、皮下、或肌肉内应用的液体产品的目的。
从实用的角度讲，免疫球蛋白的液体产品含量在储存和使用时是一样的。产品中IgG的终浓度优选在0.25-20％(重量)的范围内(相当于2.5-200g的IgG/L)，诸如大约1-20％(重量)，即2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,12％,14％,16％,18％。
众所周知高蛋白浓度可得到更高的IgG稳定性。另一方面，IgG的高浓度意味着病人在静脉给药时，由于本产品的渗透压很高，为了避免在输注时发生事故，所以最大输注率必须维持在很低水平。本文推荐European Pharmacopoeia(Ph.Eur.)的静脉内给药浓度是5％(w/v)。另一方面，高度浓缩的产品(例如10％或上文所述)适合用于静脉或皮下注射。
即使不是优选的，显而易见通过本发明的多个方法步骤获得的产品也能够用作如冻干品而不作为液体产品，尽管它与即时可用的免疫球蛋白产品液体成品形式的使用相比略显不足。下文将会详细叙述后一实施方案。
在离子强度显著低于血浆时液体免疫球蛋白产品最稳定，例如电导优选低于1.0mS/cm，优选约0.8mS/cm。
PH对IgG稳定性和输注速度有影响。液体免疫球蛋白产品在酸性条件下最稳定，例如低于IgG的等电点，pH6.4-8.5。pH值与生理pH值越接近(7.1-7.3)，使用的输注速度越高。由于稳定性的需要，本发明免疫球蛋白产品的pH优选在5.7-5.1之间，诸如5.2和5.6之间，如约5.4。
而且，免疫球蛋白产品可包含如前所述的蛋白稳定剂。除了糖醇和糖类(诸如山梨醇，甘露糖，海藻糖，麦芽糖)，还有蛋白(诸如白蛋白)，氨基酸(诸如赖氨酸，甘氨酸)和有机试剂(诸如PEG和吐温80)也可用作稳定剂。含IgG的溶液中稳定剂的适当浓度如前所述根据所用的特定试剂确定。
如果需要可以调整纯化的IgG溶液以获得稳定的等渗溶液。术语“等渗”意在说明与血浆中渗透压相等的溶液。如上文所述，本发明免疫球蛋白产品液体成品的离子强度显著低于血浆。因为这个原因优选使用单糖或双糖提高溶液的重量摩尔透滤压浓度而并不影响离子强度。本发明一个优选的实施方案中，加入的甘露糖浓度保证溶液是等渗的，而且甘露糖发挥了免疫球蛋白稳定剂的功能。这步操作优选加入的甘露糖终浓度在约5％到15％(w/v)范围内，优选10％(w/v)；也可选择使用其它糖类，诸如甘露糖和葡萄糖。
优选的免疫球蛋白产品最终条件既需保证蛋白的稳定性又要考虑如pH，离子强度和涨度等生理上可接受的条件。而且，免疫球蛋白产品必须符合如Monograph No.918,Ph.Eur.,1997中所指定的质量管理测试。
本发明方法获得的产品的主要优点是，如是液体产品，该产品是液体的即时可用的化合物，它而且很稳定，高度纯化，有大量的正常IgG亚类分布，极低的IgA含量和低IgM含量，且保留了抗体活性和如Fc功能所示的生物活性。
而且，它基本上不含免疫球蛋白聚集体和/或可检测到的其它高于二聚体的聚合物血浆蛋白并具有低抗补体活性，并且有很高含量的IgG单体和二聚体。单体IgG含量至少有90％，这一点很理想。由于它的高稳定性可以避免添加其它稳定剂，诸如白蛋白，甘氨酸，去污剂，或PEG。最后，由于方法中有明确的经验证的旨在消除和/或灭活脂类包膜和无脂类包膜病毒的降低病毒步骤，所以产品是无病毒毒性的。
验证一个生产步骤是降低病毒步骤旨在提供证明生产方法可以有效灭活/消除已知的污染初始原料的病毒或是可能造成污染的病毒的证据。验证性研究包括在待验证的生产步骤前有意加入病毒再在此生产步骤或几步后检测消除病毒/灭活病毒的程度。GMP抑制防止了有意在生产设备中引入病毒。因此，应该在为生产步骤按比例缩减形式的病毒学研究独立装备的实验室进行验证性研究且研究人员应有专门的病毒学技术并有有关工程师配合。在待验证的生产步骤前加入的病毒的量应尽可能的高以确定该生产步骤充分灭活/消除病毒的能力。但是，应加入病毒刺突使得生产原料的组成不会发生显著性改变。优选的病毒刺突的最大体积小于等于10％。
应根据GLP原则进行定量感染性分析并且可涉及噬斑形成，检测其它诸如合胞体或转化灶形成的致细胞病变作用，终点滴定(如，TCID50分析)，检测病毒抗原合成或其它方法。方法必须足够敏感重复性能好且有充分的重复试验和对照进行检测以保证结果有充分的统计学准确性。
典型的，用6logs病毒检测一个方法步骤，如果降低了大约4logs或更多病毒，提示对研究中的特定的测试病毒有明显的效果。相同的，降低了大约4.5logs,5logs，或甚至5.5logs，说明对研究中特定的测试病毒有明显的效果，且此步骤是已验证的病毒降低步骤。
使用最有可能污染该产品的病毒进行病毒验证性研究，然后提供尽可能多的物理化学特性，以检测该体系总的清除病毒能力。
进行病毒的验证性研究应按照病毒验证性研究指南的注意事项研究的设计、结果和解释，以证实病毒的失活和清除(CPMP/BWP/268/95)，以及血浆类的医药产品指南的注意事项(CPMP/BWP/268/95)进行以下工作。
本方法的验证性研究见实施例5。
本发明产品的纯度大于95％，甚至大于98％。本发明之所以能够获得纯度如此之高的产品是由于该产品是通过至少一种，最好是两种任选地串联的阴-阳离子交换层析步骤而获得的。尽管可以使用许多种方法获得高产量，但是使用本文所提及的方法所获得的产量显著的高，每公斤的新鲜冰冻血浆中至少可以获得3.5克IgG蛋白。
已进行的比较研究(见实施例2)表明，使用本发明的方法所获得的免疫球蛋白产品具有理想的功能特性，如显著的抗原结合特性和很高的Fc功能。由本发明人制备的优选药物是5％(重量)免疫球蛋白的溶液。稳定性检测表明，该产品在4℃下可以存放一年以上，也就是说免疫球蛋白产品IgG不聚结成团块或者降解为片段、不丧失必需的生物活性、或者不产生不必需的活性，如体外检测抗补体活性、激肽释放酶原活性。
根据本发明的方法，可获得纯度达95％以上的IgG产品，如至少是96％，或至少97％，例如至少98％，优选至少99％，更优选纯度在99.5％。IgG产品中IgA的含量应小于6mg/L，如IgA小于4mg/L，优选小于3mg/L者，IgA低于2mg/L更优选。
需要强调的是其它产品含有不同形式的稳定剂，如去污剂、PEG或白蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的产品不含上述任何稳定剂，而是选择耐受性非常好的糖类作为稳定剂。
本发明产品的一个特征是聚合物和聚集体的浓度非常低。在一个优选方案中，本发明产品中含有少于1.5％的聚合物和聚集体，如低于1％，低于0.5％或低于0.25％。IgG单体和二聚体的含量至少为95％，或至少97％，如至少为98％，优选为至少98.5％或99％。本产品中IgG单体含量至少为90％。
临床试验表明，本发明产品的临床效应与注册使用的IVIG产品具有可比性。患者对该产品具有很好的耐受性，该免疫球蛋白在血循环中的滞留时间为4周。本发明试验表明，IVIG,SSI的免疫调节作用是可信的(见实施例3中的数据)。
IVIG的适应症有原发性低γ球蛋白血症或原发性γ球蛋白缺乏症，包括常见的多种免疫缺陷性疾病、Wiskott-Aldrich综合征和重症联合免疫缺陷症(SCID)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和多发性骨髓瘤患者所引起的继发性低γ球蛋白血症或γ球蛋白缺乏症、AIDS和细菌感染的儿童、急性和慢性原发性血小板减少性紫癜(ITP)、异原性骨髓移植(BMT)、Kawasaki病和格林-巴利(Guillan-Barre)综合征。
神经病学慢性炎性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)、多灶性运动神经病变、多发性硬化、Myasthenia Gravis病、Eaton-Lambert综合征、视神经炎、癫痫病。
妇科学习惯性流产、原发性抗磷脂综合征。
风湿病学类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、脉管炎、Wegner肉芽肿、Sjogren综合征、青少年类风湿性关节炎。
血液病学自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、自身免疫性溶血性贫血、嗜中性粒细胞减少症。
胃肠道疾病Crohn病、结肠性溃疡、腹部疾病。
其它哮喘、败血症性休克、慢性疲劳综合征、银屑病、中毒性休克综合征、糖尿病、副鼻窦炎、扩张性心肌病、心内膜炎、动脉粥样硬化、成年感染AIDS和细菌感染。
除了上述所提及的可以用IVIG产品治疗的适应症外，还有一些重症的自身免疫性疾病也可以用本发明产品进行治疗，这些疾病通常用皮质类固醇类激素和免疫抑制剂进行治疗。这些疾病中包括几种神经性疾病，如多发性神经根炎，以及一些免疫介导的外周多发性神经根炎，但是还有一些慢性炎性风湿性疾病和血管性疾病，如全身性脉管炎包括小血管，多发性肌炎和其它疾病。
本发明产品不同的作用方式可以清除慢性感染的感染性抗原和提高IgG的代谢。
本发明通过以下实施例作进一步阐明(不局限于这些例子)。
实施例实施例1免疫球蛋白的纯化方法步骤(除实施例5外，其它均在5±3℃的条件下进行操作)步骤1Cohn组分Ⅱ+Ⅲ糊状物的制备通过经Kristler-Nitschmann(Kristler P和Nitschmann HS,1952,Vox Sang,7,414-424)改进的标准Cohn分级分离法(Cohn E，等，1946，美国化学学会杂志，459-475)，从人血浆中分离制备Cohn组分Ⅱ+Ⅲ的糊状物。在除去冷沉淀物后，并且如果需要将某些血浆蛋白(如因子Ⅸ和抗凝血酶)吸附在诸如一种离子交换材料和/或一种称为Heparin Sepharose(肝素琼脂糖)基质上之后，用乙醇进行沉淀。
制备组分Ⅱ-Ⅲ糊状物所需合适的条件(pH、乙醇浓度、温度、蛋白质浓度)，请参见Hams主编的《血液分离和血浆成分》一书，Wiley-Liss，纽约，1991。在过滤前添加一种助滤剂，在压力滤器上分离该糊状物。
步骤2从Cohn组分Ⅱ+Ⅲ糊状物中提取免疫球蛋白提取是向140公斤组分Ⅱ和Ⅲ糊状物(含有30公斤的助滤剂，Schenk，德国)(相应于1150公斤血浆起始体积)中先添加525公斤的pH为4.0，浓度为2.33mM的磷酸钠/醋酸钠缓冲液，缓慢搅拌1.5小时，接着连续两次添加350公斤注射用水(WFI)，每次加水后均搅拌1.5小时。最后，大约添加280公斤浓度为21.5mM磷酸钠/醋酸钠，pH为7.0，悬浮，调节pH值为5.4。
悬浮液用厚滤纸进行过滤(C-150AF,Schenk，德国)。滤液中含有免疫球蛋白和其他蛋白质。
步骤3用PEG6000沉淀蛋白质的聚集体以及除去病毒将PEG6000(德国默克公司)加入到步骤2中所制备的过滤液中，最终浓度为6％(重量)。沉淀4小时，用极限沉降离心机(WestfaliaBKA28，德国)离心上述PEG悬液，使之澄清，然后再进行过滤(50LA,Cuno，法国)，接着用0.22微米的过滤器过滤除菌(Durapore,Millipore，美国)。用缓冲液调节滤后PEG上清的pH值，方法是一份pH为0.45M的醋酸钠与29份上清混合，pH值为5.7。
步骤4通过系列阴离子和阳离子交换层析法进行纯化(Ⅰ)两根层析柱分别填充56升的DEAE-Sepharose FF(PharmaciaBiotech，瑞典)和56升的CM-Sepharose FF(Pharmacia Biotech，瑞典)。两根柱子串联相连，液体先流经DEAE-Sepharose树脂，接着再通过CM-Sepharose树脂。柱子中的树脂用pH值为5.7的15mM的醋酸钠缓冲液平衡。然后，步骤3中的溶液通过串联的两根柱子。
在进行离子交换层析时，溶液中的大多数蛋白质结合在DEAE-Sepharose树脂上。在溶液流经柱子时，IgG不与DEAE-Sepharose树脂结合，直接穿过柱子，但与CM-Sepharose树脂结合。在溶液流经柱子后，并用相当于一个柱体积的平衡缓冲液冲洗后，将DEAE柱与CM柱断开。然后CM柱用3倍柱体积的pH值为5.4的15mM的醋酸钠缓冲液冲洗，再用一种pH值为5.4,NaCl浓度为125mM至350mM，醋酸钠为15mM的梯度液进行洗脱。将洗脱下来的IgG收集在山梨醇中，最终浓度为2.5％(重量)。
步骤5溶剂/去污剂(S/D)处理IgG组分洗脱的IgG组分用超滤/透滤法进行浓缩和除盐，至每升大约含有50克的IgG的浓度。所使用的膜为一种聚砜膜，最大透过分子量为30kD(Millipore)。对pH值为5.4，含2.5％的山梨醇的15mM醋酸钠的缓冲液进行透滤，直到溶液的电导率小于1.4mS/cm为止。溶液中IgG的含量用分光光度法进行测量，波长为280nm(纳米)(A280)。将山梨醇的浓度调整到10％(重量)，溶液用孔径为0.45微米的滤膜过滤(Pall公司，英国)。然后加入Tween-80和TNBP，最终浓度分别为1％和0.3％(均是重量)，进行S/D处理。25℃下，S/D处理至少6小时。
步骤6离子交换层析法去除S/D(Ⅱ)两根分别填充DEAE28升和CM56升Sepharose FF层析柱串联连接，并用pH值为5.4,15mM醋酸钠进行平衡。在步骤5中经S/D处理的IgG用5份pH值为5.4，浓度为15mM醋酸钠缓冲液稀释，然后用厚滤纸(Cuno90 LA)进行过滤，接着进行过滤除菌(Sartobran,Sartonius)，再用两根串联相连的柱子进行层析。除CM柱用6倍于柱体积的缓冲液进行冲洗，以除去来自S/D处理所带来的杂质一步外，离子交换层析和随后从CM柱上洗脱IgG方法均按步骤4所述的方法进行操作。洗脱下的IgG收集在终浓度为2.5％的麦芽糖(默克，德国)溶液中。
步骤7用于静脉内应用的免疫球蛋白终浓度和配方对步骤6所洗脱下来的IgG进行超滤，并用透滤法进行除盐，透滤液为含2.5％麦芽糖的7.5mM的醋酸钠溶液，pH值为5.4，直到最终溶液的电导率小于1mS/cm为止。使用的膜为聚砜膜，最大透过分子量为100kD，也就说大于100KD的蛋白质不能透过膜，只允许小于100KD的分子透过，从而被清除。将IgG的最终浓度调整为50克/升，而麦芽糖的最终浓度调整为10％(W/V)。最终经麦芽糖调节的制备液通过灭菌的滤器(Sartopure GF2,Sartorius)进行过滤除菌。
实施例2本方法方法所获得的产品与其他IVIG产品比较分析结果Gammonativ Octagam Gammagard IVIG,SSI冻干 液体 冻干 液体纯度 45.4％199.1％ 94.6％199.8％白蛋白 50mg/ml2少量 3mg/ml2未检出单体和二聚体含量 98.3％396.8％ 97.6％399.4％聚合物和聚集体 0.8％31.6％＜0.1％3＜0.1％ACA26％ 30％ 34％ 32％PKA＜8.5IE/ml ＜8.5IE/ml ＜8.5IE/ml ＜8.5IE/ml血凝素，3％溶液抗-A＞1∶2 阴性 阴性 阴性 阴性抗-B＞1∶2 阴性 阴性 阴性 阴性Fc功能 169％ 121％132％ 178％亚类分布IgG1 60.0％ 61.9％ 67.7％ 56.6％IgG2 35.8％ 33.1％ 27.2％ 39.4％IgG3 3.5％ 3.6％4.4％ 2.6％IgG4 0.7％ 1.4％0.6％ 1.5％IgA2.96mg/l 54.7mg/l 0.85mg/l 1.36mg/lIgM0.28mg/l 39.1mg/l 0.99mg/l 0.16mg/lTween80＜20ppm＜20ppm 未确定 ＜20ppmTNBP 2.0ppm 1.5ppm 1.5ppm 1.5ppmPEG0.01mg/ml 0.01mg/ml1.6mg/ml40.02mg/mlPH 6.75.7 6.75.6总蛋白浓度 97g/l 45g/l50g/l 51g/l麦芽糖或葡萄糖 20mg/ml92mg/ml 15mg/ml88mg/ml1没有对HSA校正；2制造商声明；3经HSA峰值的校正；4用作为稳定剂纯度(蛋白质组成)药典纯度要求IVIG制备物的IgG至少为95％，也就是说含有的非IgG成分不超过5％。有多种理由说明纯度是非常重要的。从理性上看，只应含有具所需功能的蛋白质，而其它杂质蛋白质可能有潜在危害性，如引起不必要的副反应和/或影响产品的稳定性。
纯度可以借助Ph Eur,1997，第964-965页所述的电泳技术进行分析，蛋白质可以用醋酸纤维素凝胶进行分离。但是为了实际目的，用琼脂糖凝胶进行分离。电泳后，分别进行凝胶的固定、干燥和染色。最后对蛋白质带进行扫描检测。由上表显示，本发明产品是非常纯的(99.3％)。
白蛋白白蛋白的含量可通过C.B Laurell(分析生物化学，1965,10,358-361)所介绍的方法应用免疫电泳技术进行分析。取5微升的产品用抗人白蛋白抗体(DAKO A/S，丹麦，No A0001(1/100))分析。由于纯度高，所以本发明产品没有检测出白蛋白。
IgG单体和二聚体的含量IgG的单体和二聚体可用凝胶渗透层析法进行分析，通过积分单体和二聚体峰值面积从层析谱监控，参见Ph.Eur。不同的分析结果均列入上述表中，发现单体和二聚体的量占该产品在整个层析谱面积的99.3％(其中IgG单体占92％)。
聚合物和聚集体的含量产品中所含的聚合物和聚集体是造成一系列的副反应的原因，如流感样症状。由于制备方法非常温和，所以产品的纯度非常高，由本发明所制备的免疫球蛋白产品基本不含有聚合物和聚集体。
聚合物可以通过凝胶渗透层析法进行分析，任何比二聚体IgG的滞留时间短的蛋白质峰值均认为是聚合物，这正如Ph.Eur所述的那样。
按照Ph.Eur和其他指南，蛋白质聚集体的含量最好低于3％。由本方法所制备的产品测不出聚集体，因此认为所含的聚合物和多聚物的含量小于0.1％。
抗补体活性(ACA)和激肽释放酶原激活剂活性(PKA)ACA和PKA的测量方法参见Ph.Eur。
ACA应尽可能的低。根据Ph.Eur，补体消耗应低于或等于50％。对本发明产品的样本进行补体消耗的测量发现为30％，也就是与其他所测量分析样本具有可比性。值得注意的是白蛋白可以抑制补体的消耗(本发明人观察发现)。
如果本产品中PKA含量达到一定水平，可以引起血压降低的副反应。因此，免疫球蛋白产品中PKA应尽可能的低。根据Ph.Eur，PKA应小于35IU/ml这一由Ph.Eur所规定的标准，本产品与所分析的其他产品一样，均小于该法所规定的量，如低于8.5IU/ml。
血凝素血浆免疫球蛋白的IgM组分包括血凝素，它是A型和B型抗原的抗体。在这些抗体存在时，可以引起副作用，可能由于使用者的血型为A型和/或B型，从而导致溶血反应。
按照药典的要求，免疫球蛋白产品中血凝素的含量必须低于经过1∶64的稀释后可以造成A/B型红细胞凝集时的含量。所有产品均符合这一要求。
Fc功能保留的结合抗原的活性对IVIG的生物学功能是非常重要的。对免疫调理作用活性也同样重要。另一方面，保留的Fc功能对IVIG作用于各种吞噬细胞以及补体的激活均非常重要。Fc功能通过许多技术方法可以证实，但是Ph.Eur中所述的方法已被认可，通过该方法可以测量在制备抗风疹抗体的过程中抗体激活补体的潜能。该活性可以与设定为100％的一种推荐的免疫球蛋白生物学制备物(BRP,Ph.Eur)进行比较。如果相对活性大于60％的参考制备标准的话，该产品就可以进行一系列的检测。已表明，本产品Fc功能的稳定性非常高，尤其是与其他液态产品进行比较分析时更是如此，最可能的原因是纯化方法较温和。
亚类的分布IgG亚类的分布通过A Ingild(斯堪的纳维亚免疫学杂志，1983,17,41)所介绍的标准Mancini免疫扩散法进行测定。浓度用WHO的参考血清(67/97)进行判定。亚类的分布必须在正常人的血浆范围之内，即中位浓度为3.7-10.2克IgG1/升血清，1.1-5.9克IgG2/升血清，0.15-1.3克IgG4/升血清和0.06-1.9克IgG4/升血清(R Djurup等，斯堪的纳维亚临床实验室调查杂志，48,77-83)。因此，所有产品的亚类的分布是可以接受的。
IgA含量据认为IgA的存在具有潜在的使IgA缺乏的受体致敏。如果IgA缺乏的患者使用了含有IgA的免疫球蛋白的制剂，IgA就会被认为是外来抗原，结果患者体内就会产生IgA的抗体。该患者下次再用含有IgA的制剂时，就会激发过敏性反应。因此，免疫球蛋白中应尽量不含有IgA是非常重要的。在IVIG产品中含有的IgA可以用ELISA法进行检测，如使用一种多克隆抗IgA的抗体与IgA结合，一种标记的抗IgA用来检测结合的IgA。标准品通过含有已知含量的IgA的校正器(No X908,DAKO A/S，丹麦)稀释来构建。
用实施例1中所描述的方法制备的产品中IgA的含量小于2mg/L，其中IgA的含量远远低于其他液态产品中的含量。由于IgG与IgA之间的物理化学特性非常相似，所以在纯化时很难将它们区分开。但是，本发明方法中的两步阴离子/阳离子交换层析，可以使IgA的含量降低到非常低的水平。
IgM含量
Ig(免疫球蛋白)中IgM可以用ELISA法进行检测，如使用一种多克隆抗IgM的抗体与IgM结合，一种标记的抗IgM用来检测。标准品通过含有已知含量的IgM的校正器(No X908,DAKO A/S，丹麦)稀释来构建。从上表可以看出，该产品中IgM的含量非常低，并显著低于在其他液态产品中含量。
Tween80、TNBP和PEGTween80、TNBP和PEG通过标准法进行测量。总的来说，这些添加物的含量越低越好。
pH值所分析的液态产品的pH值呈酸性，pH为5.6-5.7，而冻干产品在溶解后呈中性，pH为6.7。
总蛋白质浓度根据Ph Eur，蛋白质的浓度至少应为50g/L±10％；所有产品均符合这一要求。蛋白质浓度用Kjeldahl法进行测量。
麦芽糖和葡萄糖稳定剂糖类常常用作免疫球蛋白的稳定剂，它们具有很好的稳定性，并很快被清除。麦芽糖、蔗糖和葡萄糖用商品化的试剂盒进行检测(宝灵曼，德国)，麦芽糖作为参照。
结果显示两种分别用单独用白蛋白和白蛋白加PEG进行稳定处理的冻干产品，还含有一种糖类稳定剂，其浓度在15mg/ml至20mg/ml。本发明的产品和其他液态产品的稳定性几乎相同，即约9％，麦芽糖的浓度分别为88mg/ml和92mg/ml。如果将聚合物和多聚物的含量作为衡量稳定性的一个参数，本发明产品与其他液态产品次相比，稳定性更高，尽管它们的结构组成非常相似。
实施例3临床试验结果按照ICH和CPMP/388/95指南，对本发明产品进行临床研究，本发明产品也称为IVIG，SSI。
已经进行了药物动力学、药效和安全性试验。临床试验已经包括4组患者原发性免疫缺陷综合征(15例)，继发性免疫缺陷综合征(6例)，特发性血小板减少性紫癜(15例)和慢性炎性脱髓鞘多发性神经病(5例)。
原发性免疫缺陷综合征或继发性免疫缺陷综合征患者所使用的剂量为0.2-0.4g/kg，间隔2-5周。特发性血小板减少性紫癜患者使用的剂量每天为400mg/kg体重，连用5天，或者每天1000mg/kg体重，连用两天。
安全性为检测所有患者的血清转氨酶、血清肌苷和病毒标记物。对5例特发性血小板减少性紫癜患者进行总共24周的检测病毒、肾脏和肝脏安全性标记的检测。
药物动力学该产品的半衰期(T1/2)为30.5天(中位值)。这与其他IVIG药物结果一致。
效果对具有以下症状的患者原发性免疫缺陷综合征或继发性免疫缺陷综合征、呕吐不止、住院治疗、连续使用抗生素和各种肺炎等患者，在患者已经使用其它注册的IVIG药物治疗时，均登记进行6个月的回顾性研究。随后的6个月，患者用免疫球蛋白SSI、液体进行治疗，获得相同的参数。
结果液体免疫球蛋白SSI，与其他IVIG成分具有相同的效应，用于预防/防止原发性和继发性免疫缺陷综合征患者的感染。
在80％的特发性血小板减少性紫癜患者中，血小板数再用液体的免疫球蛋白SSI治疗前的＜30X109/L升到治疗后的大于等于50X109/L。个别患者的血小板计数的升高和症状消失的时程延长的程度与使用相同剂量的其他IVIG药物治疗相比，效果相同。一位首次接受IVIG治疗的患者用该药治疗无效。这种情况不经常对IVIG来说不经常发生，因此不必对此大惊小怪。血小板的升高和症状消退时间延长的详细机制还正在研究之中。
结果液体免疫球蛋白SSI在治疗慢性特发性血小板减少性紫癜患者的血小板降低时，与其他IVIG药物具有相同疗效。
临床医生认为，IVIG,SSI对慢性炎性脱髓鞘多发性神经病患者而言，与以前进行的IVIG试验具有相同的功效。患者对IVIG,SSI的耐受性与其他IVIG产品相同。
安全性除一例严重的副反应外，在切除脾脏后就不再发生如此严重的副反应，仅仅有轻微的副反应。这些副反应主要包括头痛、发热和呕吐。迄今为止，在输入IVIG,SSI时，还未见有严重危及生命的事件报道。也未见有病毒血清转化事件的报道。也未见有肾脏和肝脏受或过敏性休克的报道。
临床研究表明免疫球蛋白SSI(液体)有很好的耐受性。副反应发生的频率、程度和类型与其他类型的IVIG药物没有差别。
实施例4液体的IVIG的稳定性研究结果为了检测液体IVIG产品是否长期保持稳定，进行一种称为“实时”和“实情”的稳定性研究。总共取4种连续的IVIG产品批号(每种取250ml样本)进行研究，在2℃-8℃时，保存至少12个月。4个批号的样本分别在0个月、存放6个月和存放12个月时进行分析。研究结果见下述。存放0个月 存放6个月 存放12个月外观 轻微乳白色轻微乳白色 轻微乳白色和无色和无色 和无色单体和二聚体含量 100％ 99.6％ 99.5％聚合物和聚集体 ＜0.1％ ＜0.1％＜0.1％ACA 39.7％38.2％ 37.3％PKA ＜8.5IE/ml＜8.5IE/ml ＜8.5IE/mlFc功能 107％ 113％ 111％亚类分布IgG1 59.2％57.7％ 57.1％IgG2 36.4％38.1％ 38.6％IgG3 2.7％ 2.6％ 2.5％IgG4 1.8％ 1.6％ 1.7％PH 5.5 5.55.5蛋白组成(％IgG) 99.8％99.7％ 99.1％总蛋白浓度 48.8g/l 48.3g/l49.2g/l渗透性 348mOsm/kg347mOsm/kg 350mOsm/kg上述所提到的检测均按Ph.Eur.和实施例2中所述的方法进行。
观察发现单体和二聚体含量经过12个月也保持稳定，提示样本中未有聚合物形成。已知免疫球蛋白聚合物是导致严重副反应的原因，常表现为流感样症状。由于使用本发明的方法制备的免疫球蛋白产品稳定性非常高，所以即使经过长时间的保存也不会形成聚合物和聚集体。
经过长时间观测，该产品中ACA的含量也未见升高，尽管有意使这些批次的产品含有很高浓度的ACA。如果发现ACA的含量升高，这可能提示在储存过程中形成了聚集体。因此，ACA长时间保持稳定提示没有聚集体的形成。
上述结果进一步提示该产品在储存过程中没有激肽释放酶原激活剂活性，因为PKA的活性没有升高。但是需要注意的是所测量的数值低于规定水平值。
测量Fc功能提示完整的有功能的IgG的存在在储存中保持稳定。因此，在该样本中没有发现存在蛋白酶，因为蛋白酶可以降解蛋白质，因此降低Fc的功能。IgG分子没有发生变性，否则就会降低其结合抗原的活性。
本领域技术人员已知IgG不同亚类的稳定性可能存在差异。从本实验结果可以看出，所有亚类在储存过程中保持稳定，提示该产品是稳定的。还可以通过样本在经过长时间的储存后，IgG的含量在总蛋白质中基本保持恒定这一事实中进一步证实上述观点，提示IgG基本没降解，也就是说本发明产品是稳定的，在2-8℃下至少可以储存12个月，其特性不发生显著改变，并仍表现出相应的疗效和安全性。
实施例5本发明制备IVIG方法中经验证的降低病毒的步骤通过分离步骤除去病毒应用聚乙二醇(PEG)沉淀免疫球蛋白溶液中的病毒。
使用两种无包膜小病毒进行病毒的验证性研究，可以获得下述病毒降低结果清除6.3log10甲型肝炎病毒(HAV)清除7.2log10脊髓灰质炎病毒应用两种有包膜病毒进行病毒验证性研究，可以获得下述的降低病毒水平的结果清除7.6log10人获得性免疫缺陷病毒(HIV)清除7.5log10BVDV。
通过S/D处理步骤使病毒失活用1％的Tween80和0.3％TNBP处理免疫球蛋白溶液，温度为25℃，处理至少6小时。
使用4种有包膜病毒进行病毒验证性研究，可以获得下述的病毒减少程度使7.4log10HIV失活使5.3log10Sindbis病毒失活使4.1log10BVDV失活使5.1log10PRV失活共对本发明方法中的两种不同步骤进行8项验证性研究。PEG沉淀一步证实可以用于四种不同病毒的清除，两种为无包膜小病毒HAV和脊髓灰质炎病毒，两种为有包膜病毒HIV和BVDV，可以作为丙型肝炎的模型。这些研究表明所有四种病毒通过PEG处理，均可以被有效地清除。因此，PEG沉淀被证实可以有效地清除病毒。S/D处理已证实可用于四种不同的有包膜病毒。从验证性实验的数据可以看出，S/D处理可以有效地失活全部四种病毒。因此，S/D处理被证实可以作为有效地灭活病毒的步骤。IVIG方法中用PEG沉淀清除病毒和用S/D处理使病毒失活等步骤，已经证实每种方法均可有效清除和失活四种不同病毒。本发明方法中HIV和BVDV累加性降低倍数分别为15和11.6。本发明方法所制备的产品不含病毒。
权利要求
1.从含免疫球蛋白的粗制血浆蛋白组分中纯化免疫球蛋白即免疫球蛋白G(IgG)的方法，包括以下步骤(a)制备含免疫球蛋白的粗制血浆蛋白组分的水相悬浮液；(b)在上述步骤(a)的悬浮液中加入足够量的一种可溶于水的不使蛋白变性的沉淀剂，沉淀大部分非免疫球蛋白G的蛋白、免疫球蛋白聚集体和诸如病毒颗粒的潜在感染性颗粒的颗粒，而基本上不造成免疫球蛋白G单体的沉淀，这样形成了一种固体沉淀和液体上清的混合物；(c)从步骤(b)的混合物中回收澄清的含免疫球蛋白G的上清；(d)将步骤(c)澄清的含免疫球蛋白G的上清加至阴离子交换树脂，再加至阳离子交换树脂；(e)用pH和离子强度足以去除树脂中的蛋白杂质，而基本上不造成免疫球蛋白G洗脱的的缓冲液洗去蛋白杂质和蛋白沉淀剂；(f)用pH和离子强度足以有效洗脱免疫球蛋白G的基本上非变性缓冲液洗脱免疫球蛋白G，从而回收含免疫球蛋白G的洗脱液；(g)将步骤(f)含免疫球蛋白G的洗脱液进行透滤/超滤以浓缩和/或透析洗脱液并任选地加入稳定剂；(h)在步骤(g)已透滤/超滤并任选地加入稳定剂的含免疫球蛋白G的组分中加入病毒致死剂量的病毒灭活剂形成基本上无病毒的含免疫球蛋白G的溶液；(i)将步骤(h)含免疫球蛋白G的溶液加至阴离子交换树脂纯化再接着加至阳离子交换树脂；(j)用pH和离子强度足以从树脂中有效洗去蛋白杂质和病毒灭活剂而基本上不造成免疫球蛋白G的洗脱的缓冲液洗步骤(i)的阳离子交换树脂；(k)用pH和离子强度足以有效洗脱免疫球蛋白G的基本上非变性缓冲液从步骤(ｊ)的阳离子交换树脂洗脱免疫球蛋白G，由此回收含免疫球蛋白G的洗脱液；以及(l)透滤/超滤步骤(k)的含免疫球蛋白G的洗脱液以降低离子强度并浓缩免疫球蛋白G溶液，加入糖类物质调节重量摩尔渗透浓度。
2.根据权利要求1的方法，其中含有免疫球蛋白的血浆蛋白组分选自Cohn组分Ⅱ；Cohn组分Ⅱ和Ⅲ；以及Cohn组分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(a)中的悬浮液维持在0℃到12℃，步骤(a)中的悬浮液的pH值保持在6以下。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤(b)中蛋白质的沉淀剂选自聚乙二醇(PEG)、辛酸和硫酸铵。
5.根据权利要求4的方法，其中蛋白质的沉淀剂选自分子量为3000-8000Da的PEG，如PEG3350、PEG4000、PEG5000和PEG6000。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中在步骤(d)和/或步骤(i)中阴离子交换树脂柱和阳离子交换树脂柱串联连接。
7.根据权利要求6的方法，其中用于阴离子交换层析和阳离子交换层析的缓冲液相同，缓冲液的pH值也相同，均低于6.0。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤(d)和/或步骤(i)中的阴离子交换树脂含有二乙氨乙基基团，和/或步骤(d)和/或步骤(i)中的阳离子交换树脂含有羧甲基基团，树脂优选是DEAESepharose FF和CM Sepharose FF。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中从步骤(b)到(l)中所使用的缓冲液是醋酸盐缓冲液，如pH为5.0-6.0的醋酸盐缓冲液，浓度为5-25mM。
10.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤(h)中的病毒灭活剂为至少含一种非离子或离子去污剂和至少一种溶剂的混合物。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤(h)中的病毒灭活剂为至少一种基本上非变性的去污剂和至少一种三(低级烷基)磷酸酯溶剂的混合物。
12.通过权利要求1-11任一项的方法获得的免疫球蛋白产品。
13.通过权利要求6-8任一项的方法获得的免疫球蛋白产品。
14.一种免疫球蛋白产品，具有下列特征a)纯度大于98％，b)IgG单体和二聚体的含量大于98.5％，c)IgA的含量小于4mg/L，和d)含有IgG1,IgG2,IgG3和IgG4。
15.根据权利要求14的免疫球蛋白产品，其不含作为稳定剂的去污剂，PEG或白蛋白。
16.根据权利要求14或15的免疫球蛋白产品，其中IgA的含量小于3mg/L。
17.根据权利要求14-16任一项的免疫球蛋白产品，其所含的IgG1为55％-65％,IgG2为30％-40％,IgG3为2％-5％,IgG4为1％-4％之间。
18.根据权利要求14-17任一项的免疫球蛋白产品，其中聚合物和聚集体的含量小于0.5％。
19.根据权利要求14-18任一项的液体免疫球蛋白产品。
20．根据权利要求14-19任一项的液体免疫球蛋白产品，可直接静脉应用。
21．根据权利要求14-20任一项的免疫球蛋白产品作为药物的应用。
22．根据权利要求14-21任一项的免疫球蛋白产品在制备治疗患下列疾病的哺乳动物及感染AIDS和细菌感染的成年患者的药物中的应用，所述疾病为PID(原发性免疫缺陷症)，SID(继发性免疫缺陷症)，ITP(特发性血小板减少性紫癜)，多神经根炎，外周多发性神经病变，川崎病，多发性肌炎，重症慢性自身免疫性疾病，慢性感染性脱髓鞘多发性神经病变(CIPD)，多灶性运动神经病变，多发性硬化，Myasthenia Gravis,Eaton-Lambert综合征，Opticus神经炎，癫痫病，习惯性流产，原发性抗磷脂综合征，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，系统性硬皮病，脉管炎，Wegner肉芽肿，Sjogren综合征，青少年类风湿性关节炎，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，自身免疫性溶血性贫血，嗜中性粒细胞减少症，Crohn病，结肠性溃疡，腹部疾病，哮喘，败血症性休克综合征，慢性疲劳综合征，银屑病，中毒性休克综合征，糖尿病，副鼻窦炎，扩张性心肌病，心内膜炎，动脉粥样硬化。
23．根据权利要求22的应用，其中哺乳动物是人。
全文摘要
本发明涉及一种从含免疫球蛋白的粗制血浆蛋白组分中纯化免疫球蛋白G的方法。所述的方法包括一系列步骤,其中优选依次结合使用阴离子交换柱和阳离子交换柱。在整个纯化方法中优选使用一种pH5.0－6.0摩尔浓度约5－25mM的醋酸盐缓冲液。本发明进一步包括通过本发明方法获得的免疫球蛋白产品。本发明还涉及一种纯度超过98%、IgG单体和二聚体含量大于98.5%、IgA含量少于4mg/L并含有少于0.5%的聚合物和聚集体的免疫球蛋白产品。所述产品不包含作为稳定剂的去污剂,PEG或白蛋白。所述产品稳定、无病毒、呈液体,可直接用于静脉给药。
文档编号C07K16/06GK1311797SQ9980928
公开日2001年9月5日 申请日期1999年6月9日 优先权日1998年6月9日
发明者因加·劳森, 伯厄·泰斯纳 申请人:斯塔滕斯血清研究所