糖转运蛋白的制作方法

专利名称：糖转运蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有糖转运活性的蛋白质及编码所说的蛋白质的DNA。
背景技术：
葡萄糖作为颅神经组织中的主要能源，虽具有低达180的分子量，但因其为极性分子而不能迅速通过细胞膜。因此，葡萄糖要通过葡萄糖转运蛋白，即以细胞膜的形式特异性存在的转运糖的蛋白质才能掺入细胞中。
目前，已知有两种类型的葡萄糖转运蛋白，即针对葡萄糖浓度梯度主动转运葡萄糖的能量依赖性Na+/葡萄糖同向转运型，和以只依赖于细胞内和细胞外葡萄糖浓度差异进行转运的易化扩散转运型。一般认为易化扩散转运型在颅神经组织中执行主要作用，已报导了存在于血内皮细胞中并参予血脑屏障中糖转运的GLUT1(生物化学杂志，263,15245(1998))，和被认为通过血脑屏障向神经细胞内转运葡萄糖的GLUT3(生物化学杂志，265,18035(1990))。
例如，有下列一些表明神经病变与葡萄糖转运蛋白的功能和表达异常之间关系的报导GLUT1部分缺乏引起惊厥和心理发生迟滞(N.Engl.J.Med.,325,703(1991))；帕金森氏病病例提示有GLUT3功能异常的可能性(Ann.Neurol.,32,S88(1992))；和肿瘤组织的血管内GLUT3的表达显著加速(癌症研究,52,3972(1992))。
发明的公开本发明人认真地研究了由已经在人脑组织中特异性表达的基因所编码的蛋白质，因而在分离新的蛋白质(以下称为HUCEP-8)和编码该蛋白质的基因(以下称为hucep-8)上获得了成功。本发明人发现，这种HUCEP-8可将单糖如葡萄糖转运到细胞中，从而完成了本发明。
即，本发明提供了(1)(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的新的蛋白质HUCEP-8，或(b)在具有经在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中缺失、取代或加入一个或多个氨基酸所形成的氨基酸序列，并具有糖转运活性的蛋白质；(2)编码(1)中所述任一蛋白质的基因；(3)(c)具有如SEQ ID NO:2所示之碱基序列的DNA，或(d)在严格条件下与SEQ ID NO:2的DNA杂交，并编码具有糖转运活性之蛋白质的DNA；(4)其特征在于使用(1)中所述的蛋白质筛选能够增强或抑制糖转运活性之化合物的方法；(5)其特征在于使用(2)或(3)中所述的基因筛选能够增强或抑制糖转运活性之化合物的方法；(6)筛选能够加速或抑制(2)或(3)中所述基因的转录之化合物的方法；(7)筛选能够加速或抑制(1)中所述任一蛋白质的转运之化合物的方法；(8)通过实施(4)、(5)、(6)或(7)中所述的筛选方法得到的化合物或其盐；以及(9)抗(1)中所述之蛋白质的抗体。
附图的简要说明

图1中，序列-1代表从大脑皮层cDNA库得到的重组体中有高出现率的DNA片段，并且序列-2至5各代表用于克隆涉及序列-1之DNA片段的寡核苷酸。图2显示涉及序列-1的DNA片段。图3和4显示含有基因hucep-8之DNA片段的碱基序列。图5显示重组载体pCRhucep-8的构建。图6显示重组载体pREhucep-8的构建。图7显示免疫印迹分析的结果。图8显示葡萄糖摄入试验的结果。
实施本发明的最佳方式可作为含有hucep-8基因的cDNA片段，从衍生于人大脑皮层的cDNA库中分离所说的基因。本发明人使用的cDNA库是使用购自Clontech公司的人大脑皮层mRNA制备的，但同样也可以使用购自Stratagene公司的人大层皮层mRNA制备cDNA。
可按照Okubo等人(Okubo等人，Nature Genet.,2,173(1992))所述的分析基因表达频率的方法，区分上述cDNA库中被认为在人脑组织内有可特异表达之基因的cDNA。具体地说，使用人大脑皮层mRNA作为模板，并使用将oligo(dT)结合到用适当的限制性酶开环的载体质粒的一端，然后再用限制性酶MboⅠ和Bam HⅠ切割而得到的引物，以合成cDNA。因为所说的载体是使用dam甲基化酶阳性大肠杆菌作为宿主制备的，所以载体的MboⅠ识别序列，即“GATC”的A残基已受到甲基化处理。因此，MboⅠ只切割新合成的cDNA部分。因为所说的载体只在已结合oligo(dT)之末端以外的末端附近有一个Bam HⅠ切割位点，所以该酶在这一个位点上切割所说的载体。如果新合成的cDNA部分中存在有Bam HⅠ识别序列，该位点上也将发生酶切割。因为Bam HⅠ和MboⅠ产生同样具有碱基序列“GATC”的粘性末端，所以可在用两种酶切割后，用DNA连接酶处理以使质粒闭环。
在本发明所采用的方法中，使用如此制备的质粒转化大肠杆菌以构建cDNA库。因此，该文库含有各mRNA均从3’末端的poly(A)位点延伸到5’末端上第一次出现碱基序列GATC之位点的区域。从所说的cDNA库中随机选择适当数目的重组体，从各重组体中提取cDNA并测定其完整碱基序列。所说的方法使之有可能通过计数具有按上述方法确定的特异性碱基序列的cDNA片段，将在随机选择的重组体中证实的器官特异性基因和高表达频率基因与其它基因区分开。在所说的方法中，可按照本领域技术人员已知的任何方法(例如MolecularCloning,2nd.ed.,Cold Spring Harbor Lb.Press,1989和为本领域技术人员介绍标准方法的其它手册中所述的方法，以下称为常规方法)，从重组体中提取cDNA并测定cDNA碱基序列。
在区分高表达频率基因的方法中，随机选择的重组体总数一般为数十个至数千个，但必要时也可处理更大数目的重组体。本发明人通过实施上述方法确定了770个重组体中所有cDNA片段的序列，并从这些cDNA片段中选择出具有出现频率如具有2/770或更多同样碱基序列之cDNA的cDNA片段，以作为具有在人脑中特异性表达之基因的DNA片段的侯选片段。
如前所述，上述各个cDNA片段只含有mRNA之3’末端区域的一部分。因此，本发明人基于有关所说区域(下称3’片段)的碱基序列的信息得到了全长度cDNA。
使用购自Clontech公司的人大脑皮层cDNA库作为模板，并使用具有上述3’片段中之碱基序列的适当长度的合成寡核苷酸，和具有载体中的序列的实质上同样长度的合成寡核苷酸作为引物，采用PCR方法得到了全长度cDNA。结果，能扩增约1.9kb的DNA片段。在这种情况下，也可使用购自Stratagene公司的人大脑皮层cDNA库作为模板。也可使用购自Clontech或Stratagene公司的人大脑皮层mRNA作为模板，借助Clontech或Gibco公司的5’RACE试剂盒进行扩增。此外，也可使用上述3’片段，按照常规方法经集落杂交或噬斑杂交筛选上述人大脑皮层cDNA库，以进行扩增。
将按照上述方法扩增的各cDNA片段插入到得自Novagen的pT7Blue T-载体中，并用常规方法测定cDNA片段的整个碱基序列。在这种情况下，各cDNA片段独自得到了两个重组体DNA克隆，并测定了cDNA片段的碱基序列，从而进一步证实了碱基序列。
可用Northern杂交技术证实所说的cDNA序列的器官特异性出现的频率，从而证实被认为存在于按上述方法选择之任何cDNA片段中的基因在脑组织中的特异性表达。具体地说，用琼脂糖凝胶电泳法分级分离从各种人体器官中提取的和购自Clontech或Stratagene公司的各mRNA并转移到滤膜上，然后使用按上述方法选择的cDNA片段作为探针，以常规方法进行杂交。本发明人研究了所说的cDNA碱基序列出现的器官特异性。结果观察到，虽然所说的cDNA碱基序列在某种程度上也出现在脑以外的其它器官和细胞中，但证明与其它器官和细胞相比，所说的cDNA碱基序列在大脑皮层中的出现是特异的。
这一事实强有力地表明，所说的cDNA碱基序列中存在有人脑中特异性表达的，并且对于维持正常脑功能必不可少的所需基因。
按照一般所用的方法，包括使用计算机程序分析碱基序列，可证实碱基序列中蛋白质编码区域(ORF，开放读框)的存在。相信所说的cDNA碱基序列中存在所需的基因，本发明人利用计算机发现了所说碱基序列中的ORF，并将该基因定名为“基因hucep-8”(人大脑蛋白质的缩写)，将由所说的基因编码的蛋白质称为“HUCEP-8”。
基因hucep-8包括SEQ ID NO:2中所示的1560个碱基对(bp)。使用该基因hucep-8，可利用适当的宿主-载体系统，以常规基因重组技术制备重组基因。作为一种适用的载体，例如可使用衍生于大肠杆菌的质粒(如pBR322、pUC118等)、衍生于枯草杆菌的质粒(如pUB110、pC194等)、衍生于酵母的质粒(如pSH19等)、噬菌体及动物病毒(如逆转录病毒和痘病毒)。在重组中，可使用适当合成的DNA接头加入翻译起始密码子和翻译终止密码子。另外，可将适当的表达启动子连接到所说基因的上游，以表达该基因。可根据宿主的不同适当地选择所用的启动子。例如，当宿主是大肠杆菌时，可使用T7启动子、lac启动子、trp启动子、λPL启动子等。当宿主是杆菌属的细菌时，可使用SPO型启动子等。当宿主是酵母时，可使用PHO5启动子、GAP启动子、ADH启动子等。当宿主是动物细胞时，可使用衍生于SV40的启动子、逆转录病毒启动子等。
所说的基因可以表达为与另一种蛋白质(如谷胱甘肽S转移酶、蛋白A等)的融合蛋白质。可使用适当的蛋白酶(如凝血酶、肠激酶等)切掉如此由表达得到的融合的HUCEP-8。
作为可用于由表达得到HUCEP-8的宿主，可以利用各种大肠杆菌菌株、埃希杆菌属细菌、各种枯草杆菌菌株、芽孢杆菌属细菌、酵母如酿酒酵母的各种菌株，以及动物细胞如COS-7细胞、CHO细胞等。
作为使用上述重组载体转化宿主细胞的方法，可采用常规方法或针对不同的宿主细胞常规采用的相应方法。
另外，本发明人使用pREP10(可得自Invitrogen)作为表达载体，对基因hucep-8进行重组，以制备用于在培养的动物细胞中将所说的基因表达为HUCEP-8的载体pREhucep-8。借助Gibco公司的LIPOFECTAMINE试剂，使用pREhucep-8转化CHO细胞，以制备转化体CHO/pREhucep-8。根据所用载体中存在的选择性标志，或给出或删除的适当标志的存在与否来分离被转化的细胞。在本发明人所实施的用pREhucep-8转化CHO细胞的情况下，可利用抗潮霉素B抗性作为指示来区分并分离转化体。
可用下文实施例中所述的Northern杂交法证实所需基因在按上述方法得到的转化细胞中的表达。在与其中导入了pREP10的COS细胞相比，用pREhucep-8转化的COS细胞增加了葡萄糖摄入量。此外，证明在SK-N-SH细胞(培养的人成神经细胞瘤细胞)中，由于细胞死亡而使hucep-8的表达程度降低。
本发明的新的蛋白质HUCEP-8是一种包括如SEQ ID NO:1中所示之520个氨基酸残基，分子量为55657道尔顿的蛋白质。发现存在于氨基酸序列上第118至134个残基Leu Gly Tyr Pro Ala Asp ArgPhe Gly Arg Arg Gly Ile Val Leu Leu Thr和第355至371个残基LeuGly Val Thr Val Asp Arg Phe Gly Arg Arg Gly Ile Leu Leu Leu Ser是典型存在于GLUT家族(Nature.325:641)中的氨基酸序列基元。
本发明不仅包括如SEQ ID NO:2所示的DNA碱基序列，而且还包括与所说的DNA杂交并编码具有糖转运活性之生理活性蛋白质的DNA。
也就是说，本发明包括下列一些DNA变体，无论它们与如SEQ IDNO:2所示的DNA碱基序列有什么不同，只要该DNA变体在严格条件下与基因hucep-8杂交，并且编码具有糖转运活性的生理活性蛋白质即可以诸如引入位点特异性突变、用诱变剂处理以造成随机诱变、用限制性酶切割以造成DNA片段的突变、缺失或连接等各种人工处理，引起基因hucep-8全长度碱基序列的部分DNA碱基序列改变所得到的DNA变体。
有这种可能性人染色体上可能存在其碱基序列稍微不同于如SEQ ID NO:2所示之DNA碱基序列的，不依赖基因hucep-8的基因。本发明也包括这样一个如上述人工变体的基因，条件是该基因所编码的蛋白质是具有糖转运活性的生理活性蛋白质。
只要所得到的变体与基因hucep-8的DNA碱基序列有90％或更高的同源性，上述DNA突变的程度都是允许的。与基因hucep-8杂交的程度可以是在例如下述常规条件下与基因hucep-8进行Southern杂交当使用DIG DNA标记试剂盒(批号为1175033，可购自Boehringer-Mannheim公司)标记探针时，于32℃在Dig Easy Hyb溶液(批号为1603558，可购自Boehringer-Mannheim公司)进行杂交，并于50℃在0.5xSSC溶液(含有0.1％[w/v]SDS)中洗膜(1xSSC溶液是含有0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠的缓冲溶液)。
本发明还包括由突变基因编码的并具有糖转运活性的生理活性蛋白质，其中所说的突变基因与上述基因hucep-8有高度同源性。
也就是说，本发明包括具有在新的蛋白质HUCEP-8之氨基酸序列中缺失、取代或加入一个或多个氨基酸所形成的氨基酸序列的变体，只要这些变体是具有糖转运活性的蛋白质即可。
构成蛋白质的氨基酸侧链在疏水性、带电性、大小等方面有所不同。从经验或物理化学测定结果已经知道，氨基酸间的几种相互关系能够令人满意地维持整个蛋白质的三维结构(也称为立体结构)，即在某种意义上这些关系对三维结构没有实质性影响。例如，就氨基酸残基的取代来说，可以包括下列组合甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)；Gly和丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)；亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)和苏氨酸(Thr)、Thr和丝氨酸(Ser)或Ala、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等。
因此可以说，本发明包括具有经在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的取代、插入或缺失等所形成之氨基酸序列的变体蛋白质，只要变异能令人满意地保留HUCEP-8蛋白质的三维结构，并且变体蛋白质具有如HUCEP-8的糖转运活性即可。只要所得到的变体与如SEQID NO:1所示的氨基酸序列有90％或更高的同源性，任何程度的变异都是允许的。
本发明还提供了筛选增强或抑制本发明的蛋白质之糖转运活性的化合物的方法，所说方法的特征在于使用本发明的蛋白质HUCEP-8。具体地说，所说的方法是一种筛选糖转运活性增强剂和糖转运活性抑制剂的方法，其包括将试验化合物与含有人糖转运蛋白HUCEP-8的细胞或其细胞膜部分接触时所达到的糖转运活性，与不发生这种接触时所达到的糖转运活性相比较。
可以使用能够用作本发明之蛋白质底物的任何一种底物。一般优选使用，例如放射性核素(如14C)标记的葡萄糖。试验化合物包括，例如肽、蛋白质、非肽化合物、合成的化合物及发酵产物。这样的化合物可以是新的化合物或者是众所周知的化合物。可以按照熟知的方法如Frost等人(生物化学杂志，260,2646(1985))所述的方法测定本发明之蛋白质的糖转运活性。
使用本发明的上述筛选方法得到的化合物或其盐是从上述试验化合物中筛选出来的化合物或其盐，并且这些化合物或其盐可以是新的化合物或已知的化合物。例如，与不接触试验化合物时所达到的糖转运活性相比，当这种活性增强30％或更高(优选50％或更高)时，即可选择该试验化合物作为能够增强本发明之蛋白质的糖转运活性的物质。另一方面，与不接触试验化合物时所达到的糖转运活性相比，当这种活性降低约30％或更低(优选50％或更低)时，即可选择该化合物作为能够抑制本发明蛋白质之糖转运活性的物质。
工业实用性根据HUCEP-8具有糖转运活性这一事实推测，基因hucep-8的异常表达或HUCEP-8的功能异常可严重妨碍脑神经功能的维持。
因此，可利用HUCEP-8来开发，例如，能够增强或抑制糖转运活性的化合物，并且这种化合物可望成为新的脑神经疾病治疗剂。
以下借助实施例详细解释本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1基因hucep-8的克隆1)对维持大脑正常功能必要的基因之部分碱基序列的测定使用大脑皮层mRNA(Clontech)作为模板，按照Okubo等人(Okubo等人Nature Genet.,2,173(1992))所述的方法制备大脑皮层cDNA库。
然后从所说的库中随机选择770个重组体，按照常规方法(Molecular Cloning,2nd.ed.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989；下同)提取重组体DNA并测定在各重组体DNA之cDNA部分的3’侧的碱基序列。使用PE Applied Biosystems公司制造的DNA序列仪(ABIPRISM377)和可从该公司获得的反应试剂盒进行测序。
分析770个重组体中各DNA片段的出现频率，发现具有图1中所示碱基序列(碱基序列-1)的基因的出现频率为2/770。
2)含有碱基序列-1的cDNA片段的扩增首先，使用PE Applied Biosystems公司生产的DNA合成仪(ABI380B)合成具有互补于碱基序列-1之一部分的碱基序列的寡核苷酸(图1；碱基序列-2)。然后按上述同样方法合成具有如接近λ噬菌体克隆载体(λDR2)之cDNA插入位点的同样碱基序列的寡核苷酸(碱基序列-3)。使用以λDR2作为克隆载体制得的人大脑皮层5’-STRETCH cDNA库(可得自Clontech Laboratories)作为模板，并使用具有碱基序列-2的寡核苷酸和具有碱基序列-3的寡核苷酸作为引物，进行PCR反应。在该反应中，使用了得自TAKARA SHUZO有限公司的试剂盒(TAKARA LA PCR试剂盒Ver.2)和TAKARASHUZO有限公司生产的PCR热循环仪MP。
液体反应组合物cDNA库(108pfu/ml) 5μl10x PCR缓冲溶液5μl2.5mM dNTP 1μl10μM寡核苷酸(碱基序列-2) 2μl10μM寡核苷酸(碱基序列-3) 2μl
水 34.5μlLA DNA聚合酶0.5μl总计50μl反应条件液体反应组合物于95℃保持2分钟，95℃反应20秒，以-1℃/2秒的速率冷却至58℃，并于58℃保持1分钟，然后于72℃保持4分钟。该循环重复35次，以扩增所需的碱基序列。
按上述方法(图2)特异地扩增具有部分碱基序列-1的DNA片段(约1.9kb)。
3)亚克隆到载体中以进行碱基序列测定按照常规方法进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度1％)以分级分离步骤2)中扩散的DNA。用溴乙锭染凝胶并用紫外光照射，切下含有所需条带的部分凝胶。
从这部分琼脂糖凝胶中提取DNA片段，并使用GenecleanⅡ试剂盒(购自Bio101)纯化之。
按下述方法将纯化的DNA片段亚克隆到用于碱基序列测定的载体pT7 BlueT-载体(得自Novagen)中。使用购自TAKARA SHUZO有限公司的试剂盒(TAKARA DNA连接试剂盒Ver.2)，使连接溶液于16℃反应1.5小时。
使用上述反应溶液，按照常规方法转化大肠杆菌K12菌株DH5。
将转化体接种到含有50μg/ml氨苄青霉素(Amp)、40μg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)和100μM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB琼脂培养板上，并于37℃培养过夜。
将所得到的白色菌落接种到10ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，并于37℃培养过夜，然后离心收集细胞并使用QIAprepSpin Plasmid Miniprep试剂盒(得自Qiagen)纯化重组DNA。如此构建的重组DNA称为pThucep-8。
4)DNA片段碱基序列的测定使用PE Applied Biosystems生产的DNA序列仪以二脱氧链终止法测定碱基序列。基于所测知的碱基序列，合成寡核苷酸，并用引物行走方法确定整个碱基序列。测定两股DNA的碱基序列。所说克隆之cDNA的碱基序列如图3和图4中所示。根据所说的碱基序列含有互补于碱基序列-2之碱基序列的上游部分这一事实，证实已克隆了所需的基因(人大脑蛋白质-8,hucep-8)。
所说的cDNA含有编码包括520个氨基酸残基之蛋白质(HUCEP-8)的翻译区(开放读框，ORF)。
实施例2hucep-8基因在CHO细胞中的表达及其功能分析1)表达载体pREhucep-8的构建基于图3和图4中所示的碱基序列，使用DNA合成仪(ABI 380B,PE Applied Biosystems公司制造)分别合成了具有碱基序列-4和碱基序列-5的寡核苷酸。
使用上述重组DNA pThucep-8作为模板，并以具有碱基序列-4和碱基序列-5的寡核苷酸作为引物，于下述反应条件下进行了PCR反应。在该反应中，使用了购自Stratagene公司的Pfu DNA聚合酶和TAKARA SHUZO有限公司生产的PCR热循环仪MP。
液体反应组合物pThucep-8(1μg/ml) 1μl10x PCR缓冲溶液 5μl2.5mM dNTP 8μl10μM寡核苷酸(碱基序列-4)2μl10μM寡核苷酸(碱基序列-5)2μl水 31μlPfu DNA聚合酶1μl总计 50μl反应条件液体反应组合物于94℃保持1分钟，以-1℃/2秒的速率冷却至53℃，并于53℃保持1分钟，然后于72℃保持3分钟。该循环重复30次，然后将反应溶液于72℃保持10分钟，以扩增所需的碱基序列。
以琼脂糖凝胶电泳法分级分离按上述方法扩增的DNA片段，以纯化1.56kb DNA片段(片段1)。将各片段1与已开环的载体peR-Blunt(购自Invitrogen)混合，并于实施例1中步骤3)所述的条件下进行了连接和大肠杆菌K12菌株DH5的转化。然后，培养转化体并离心收集其细胞，此后从细胞中纯化重组DNA。如此构建的重组DNA中，有些已插入了片段1，从而使HUCEP-8的起始密码子可能定位于pCR-Blunt的XhoⅠ切割位点侧，并且终止密码子可能定位于HindⅢ切割位点侧，为此将此重组DNA定名为pCRhucep-8(图5)。
用限制性酶HindⅢ和XhoⅠ(均购自TAKARA SHUZO有限公司)切割重组DNA pCRhucep-8，然后以琼脂糖凝胶电泳法分级分离裂解产物，以纯化约1.6kb的DNA片段(片段2)。用限制性酶HindⅢ和XhoⅠ(均购自TAKARA SHUZO有限公司)切割衍生于动物细胞的表达载体pREP10(可得自Invitrogen公司)，并纯化如此得到的开环载体(片段3)。
将片段2与片段3混合并在实施例1中所述的条件下进行连接和大肠杆菌K12菌株DH5的转化。培养转化体并离心收集其细胞，然后从细胞中纯化重组DNA。将如此构建的重组DNA定名为pREhucep-8(图6)。
2)导入CHO细胞并制备稳定的转化体在直径60mm的塑料培养皿中培养CHO细胞。使用含有10％胎牛血清、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM(可购自Gibco公司，以下称为生长培养基)作为培养基，在5％CO2存在下于37℃进行培养。
在细胞上铺敷LIPOFECTAMINE试剂(可购自Gibco)并培养3小时。然后换成生长培养基并继续培养24小时。将细胞分散于胰蛋白酶溶液中，然后将细胞悬液分成两等份，分别倒入两个直径100mm的培养皿中，继续培养24小时。
除去培养基后，换成含有潮霉素B(可购自Calbiochem；终浓度为400μg/ml)的生长培养基。每隔3天用新鲜培养基替换含潮霉素B的生长培养基，共培养2周。当肉眼确实看到细胞集落时，使用不锈钢杯分离出5个集落。使用5个按上述方法只在CHO细胞中导入pREP10后分离的稳定转化体作为参比转化体。
3)基因表达的确认使用直径为100mm的塑料平皿，在含有潮霉素B(终浓度为400μg/ml)的生长培养基中培养分离的各转化体。当细胞密度相当于80％连片生长时，除去培养基，然后加入PBS并用细胞刮棒回收细胞。离心沉降细胞后，除去上清液并使用mRNA提取试剂盒(可购自Pharmacia Biotec)从细胞中纯化mRNA。按照常规方法，经琼脂糖凝胶电泳分级分离2μg mRNA并转印迹到滤膜(Hybond-N+,Amersham公司生产)上，进行Northern杂交。使用相当于hucep-8并已用DIG(洋地黄毒苷)标记的cDNA片段作为探针。接着按照试剂盒使用手册中所述的方法使用DIG寡核苷酸加尾试剂盒(可购自Boehringer-Mannheim)进行标记。在具有下列组成的溶液中于51℃杂交5小时(给出的浓度均为终浓度)5x SSC1％封闭缓冲液0.1％N-月桂酰肌氨酸钠0.02％SDS50μg/ml polyA1pmol/ml DIG-标记的合成DNA杂交完成后，于51℃相继用2x SSC,0.1％SDS,0.5x SSC和0.1％SDS洗膜。
洗涤后，按照试剂盒使用手册中所述的方法，使用DIG发光检测试剂盒处理膜。使用HyperfilmTM-ECL(购自Amersham)胶片检测信号。
结果发现，hucep-8基因在其中已导入了pREhucep-8的CHO细胞中的表达水平，比在其中导入了pREP10的CHO细胞中的表达水平高。
实施例3:hucep-8基因在COS细胞中的表达及其功能分析1)将pREhucep8导入COS细胞并制备稳定的转化体将COS细胞培养在直径60mm的塑料培养皿中。使用含有10％胎牛血清、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM培养基(可购自Gibco；以下称为生长培养基)，于5％CO2存在下37℃进行培养。
当细胞密度达到50％时，在细胞上铺敷含有实施例2的1)中构建的pREhucep-8的LIPOFECTAMINE试剂(可购自Gibco)，并培养24小时。然后，更换成生长培养基并继续培养24小时。将细胞分散于胰蛋白酶溶液中之后，将细胞悬液分成两等份，分别倒入两个直径100mm的培养皿中，继续培养24小时。
除去培养基后，换成含有潮霉素B(可购自Calbiochem公司；终浓度400μg/ml)的生长培养基。每隔3天换一次新鲜培养基连续培养2周。当肉眼可看到细胞集落时；使用不锈钢杯分离5个集落。使用在COS细胞中按同样方法只导入pREP10作为载体后分离的5个稳定的转化体作为参比转化体。
2)与hucep-8基因产物有特异反应性的抗体，抗-HUCEP-8的制备合成相当于hucep-8基因产物C末端侧上14个残基的寡核苷酸，然后按照常规方法使之交联结合到KLH上，并用如此得到的产物免疫兔。在42天内反复免疫4次后，于第52天从所说的兔体内制备血清，并用蛋白A柱层析法纯化IgG组分。然后，使用带有固相化寡肽(如用作抗原的同样寡肽)的树脂，以亲合柱层析法从所说的IgG组分中纯化与所说的寡肽有特异反应性的抗体，并定名为抗-HUCEP-8。上述所有操作均按常规方法进行。
3)基因表达的确认在直径100mm的塑料培养皿中，使用含有潮霉素B(终浓度400μg/ml)的生长培养基培养各个分离的转化体。当细胞密度相当于80％连片生长时，除去培养基并加入PBS，然后用细胞刮棒回收细胞。离心沉降细胞后，弃去上清液。向残留物中加入匀浆缓冲液(5mMHEPES缓冲液(pH8)，0.32M蔗糖)并反复吹吸使细胞分散。用超声细胞破碎仪(Taitec公司生产)破碎细胞，然后离心除去未破碎的细胞。
除去未破碎的细胞后，将上清液(超声溶胞产物部分)于4℃下以100,000xg离心1小时，以分级分离成上清液(胞浆部分)和沉淀物。将沉淀物部分悬浮于匀浆缓冲液中并经超声处理分散之(膜部分)。使用BCA蛋白质测定试剂(可购自Pierce)测定各部分中的蛋白质含量。
以常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分级分离各部分中的各50μg蛋白质，并转印迹到PVDF膜(可购自Bio-Rad)上。于4℃下用Blockace(可购自Dai Nippon药物公司)将膜封闭过夜，然后于室温下与抗-HUCEP-8抗体(用10％Blockace/PBS稀释1,000倍)温育2小时。用TPBS(含有0.1％Tween 20的PBS)洗膜5次，每次5分钟，然后在室温下与连接有过氧化物酶的驴抗兔IgG(购自Amersham)一起温育1小时。用TPBS洗如此处理的膜共5次，每次5分钟，然后再用ECL检测试剂(购自Amersham)处理。使用HyperfilmTM-ECL(购自Amersham)胶片检测信号。
结果，可在其中导入了pREhucep-8之COS细胞的膜部分中检测到与抗-HUCEP-8反应的带。在其中导入了pREP10之COS细胞的超声溶胞产物、胞浆部分及膜部分中均不能检测到这样的带。该带的分子量约为50kDa，其不同于根据hucep-8基因产物的氨基酸序列(图7)估算的分子量(55.7kDa)。但如众所周知，糖转运蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中有较高的迁移率，以致其表观分子量低于其真实分子量(生物化学杂志，267,467(1992))。
4)葡萄糖摄入能力的证实将其中已导入了pREhucep-8的和其中已导入了载体pREP10的两组COS细胞各自悬浮于含有2％胎牛血清、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM(购自Gibco；葡萄糖浓度1g/l)中，以每孔2×104个细胞的密度接种于96孔CytostarT(Amersham制造)中，然后于5％CO2存在下37℃培养过夜。除去培养基后，各孔内加入50μl含有5％BSA但不含葡萄糖和酚红的DMEM，然后37℃培养3小时。以0.1μCi/50μl/孔的量加入14C标记的2-脱氧葡萄糖(购自Daiichi PureChemical有限公司)，于37℃温育20分钟，然后以100μl/孔的量加入1mM非放射标记的葡萄糖以终止放射标记的2-脱氧葡萄糖的摄入，并用Micro Beta液体闪烁计数器(Wallac生产)测量细胞的葡萄糖摄入能力。
结果可见，其中已导入了pREhucep-8的COS细胞比其中已导入了载体pREP10的COS细胞有明显较高的葡萄糖摄入能力(图8)。
序列表<110>TAISHO药物有限公司<129>糖转运蛋白<139>P485<150>JP 10-187235<151>1998-07-02<160>2<210>1<211>520<212>PRT<213>Homo sapience<400>1Met Ala Ser Asp Pro Ile Phe Thr Leu Ala Pro Pro Leu His Cys5 10 15His Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Asn Ala Ser Gly Trp Glu Gln Pro20 25 30Pro Asn Ala Ser Gly Val Ser Val Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ala35 40 45Ser Ala Ala Ser Arg Val Ala Thr Ser Thr Asp Pro Ser Cys Ser50 55 60Gly Phe Ala Pro Pro Asp Phe Asn His Cys Leu Lys Asp Trp Asp65 70 75Tyr Asn Gly Leu Pro Val Leu Thr Thr Asn Ala Ile Gly Gln Trp80 85 90Asp Leu Val Cys Asp Leu Gly Trp Gln Val Ile Leu Glu Gln Ile95 100 105Leu Phe Ile Leu Gly Phe Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Leu Gly Tyr110 115 120Pro Ala Asp Arg Phe Gly Arg Arg Gly Ile Val Leu Leu Thr Leu125 130 135Gly Leu Val Gly Pro Cys Gly Val Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ser140 145 150Ser Thr Gly Val Met Ala Leu Arg Phe Leu Leu Gly Phe Leu Leu155 160 165Ala Gly Val Asp Leu Gly Val Tyr Leu Met Arg Leu Glu Leu Cys170 175 180Asp Pro Thr Gln Arg Leu Arg Val Ala Leu Ala Gly Glu Leu Val185 190 195Gly Val Gly Gly His Phe Leu Phe Leu Gly Leu Ala Leu Val Ser200 205 210Lys Asp Trp Arg Phe Leu Gln Arg Met Ile Thr Ala Pro Cys Ile215 220 225Leu Phe Leu Phe Tyr Gly Trp Pro Gly Leu Phe Leu Glu Ser Ala230 235 240Arg Trp Leu Ile Val Lys Arg Gln Ile Glu Glu Ala Gln Ser Val245 250 255Leu Arg Ile Leu Ala Glu Arg Asn Arg Pro His Gly Gln Met Leu260 265 270Gly Glu Glu Ala Gln Glu Ala Leu Gln Asp Leu Glu Asn Thr Cys275 280 285Pro Leu Pro Ala Thr Ser Ser Phe Ser Phe Ala Ser Leu Leu Asn290 295 300Tyr Arg Asn Ile Trp Lys Asn Leu Leu Ile Leu Gly Phe Thr Asn305 310 315Phe Ile Ala His Ala Ile Arg His Cys Tyr Gln Pro Val Gly Gly320 325 330Gly Gly Ser Pro Ser Asp Phe Tyr Leu Cys Ser Leu Leu Ala Ser335 340 345Gly Thr Ala Ala Leu Ala Cys Val Phe Leu Gly Val Thr Val Asp350 355 360Arg Phe Gly Arg Arg Gly Ile Leu Leu Leu Ser Met Thr Leu Thr365 370 375Gly Ile Ala Ser Leu Val Leu Leu Gly Leu Trp Asp Tyr Leu Asn380 385 390Glu Ala Ala Ile Thr Thr Phe Ser Val Leu Gly Leu Phe Ser Ser395 400 405Gln Ala Ala Ala Ile Leu Ser Thr Leu Leu Ala Ala Glu Val Ile410 415 420Pro Thr Thr Val Arg Gly Arg Gly Leu Gly Leu Ile Met Ala Leu425 430 435Gly Ala Leu Gly Gly Leu Ser Gly Pro Ala Gln Arg Leu His Met440 445 450Gly His Gly Ala Phe Leu Gln His Val Val Leu Ala Ala Cys Ala455 460 465Leu Leu Cys Ile Leu Ser Ile Met Leu Leu Pro Glu Thr Lys Arg470 475 480Lys Leu Leu Pro Glu Val Leu Arg Asp Gly Glu Leu Cys Arg Arg485 490 495Pro Ser Leu Leu Arg Gln Pro Pro Pro Thr Arg Cys Asp His Val500 505 510Pro Leu Leu Ala Thr Pro Asn Pro Aha Leu515 520<210>2<211>1560<212>DNA<213>Homo sapience<400>2atggcctcgg accccatctt cacgctggcg cccccgctgc attgccacta cggggccttc60ccccctaatg cctctggttg ggagcagcct cccaatgcca gcggcgtcag cgtcgccagc 120gctgccctag cagccagcgc cgccagccgt gtcgccacca gtaccgaccc ctcgtgcagc 180ggcttcgccc cgccggactt caaccattgc ctcaaggatt gggactataa tggccttcct 240gtgctcacca ccaacgccat cggccagtgg gatctggtgt gtgacctggg ctggcaggtg 300atcctggagc agatcctctt catcttgggc tttgcctccg gctacctgtt cctgggttac 360cccgcagaca gatttggccg tcgcgggatt gtgctgctga ccttggggct ggtgggcccc 420tgtggagtag gaggggctgc tgcaggctcc tccacaggcg tcatggccct ccgattcctc 480ttgggctttc tgcttgccgg tgttgacctg ggtgtctacc tgatgcgcct ggagctgtgc 540gacccaaccc agaggcttcg ggtggccctg gcaggggagt tggtgggggt gggagggcac 600ttcctgttcc tgggcctggc ccttgtctct aaggattggc gattcctaca gcgaatgatc 660accgctccct gcatcctctt cctgttttat ggctggcctg gtttgttcct ggagtccgca 720cggtggctga tagtgaagcg gcagattgag gaggctcagt ctgtgctgag gatcctggct 780gagcgaaacc ggccccatgg gcagatgctg ggggaggagg cccaggaggc cctgcaggac 840ctggagaata cctgccctct ccctgcaaca tcctcctttt cctttgcttc cctcctcaac 900taccgcaaca tctggaaaaa tctgcttatc ctgggcttca ccaacttcat tgcccatgcc 960attcgccact gctaccagcc tgtgggagga ggagggagcc catcggactt ctacctgtgc 1020tctctgctgg ccagcggcac cgcagccctg gcctgtgtct tcctgggggt caccgtggac 1080cgatttggcc gccggggcat ccttcttctc tccatgaccc ttaccggcat tgcttccctg 1140gtcctgctgg gcctgtggga ttatctgaac gaggctgcca tcaccacttt ctctgtcctt 1200gggctcttct cctcccaagc tgccgccatc ctcagcaccc tccttgctgc tgaggtcatc 1260cccaccactg tccggggccg tggcctgggc ctgatcatgg ctctaggggc gcttggagga 1320ctgagcggcc cggcccagcg cctccacatg ggccatggag ccttcctgca gcacgtggtg 1380ctggcggcct gcgccctcct ctgcattctc agcattatgc tgctgccgga gaccaagcgc 1440aagctcctgc ccgaggtgct ccgggacggg gagctgtgtc gccggccttc cctgctgcgg 1500cagccacccc ctacccgctg tgaccacgtc ccgctgcttg ccacccccaa ccctgccctc 1560
权利要求
1．下列(a)或(b)项的蛋白质(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质；(b)具有在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中缺失、取代或加入一个或多个氨基酸所形成的氨基酸序列，并具有糖转运活性的蛋白质。
2．编码根据权利要求1的蛋白质(a)或(b)的基因。
3．包括下述(c)或(d)的基因(c)具有如SEQ ID NO:2所示碱基序列的DNA；(d)在严格条件下与SEQ ID NO:2的DNA杂交，并编码具有糖转运活性之蛋白质的DNA。
4．筛选能够增强或抑制糖转运活性的化合物或其盐的方法，其特征在于使用根据权利要求1的蛋白质。
5．筛选能够提高或抑制糖转运活性的化合物或其盐的方法，其特征在于使用根据权利要求2或3的基因。
6．筛选能够加速或抑制根据权利要求2或3的基因的转录之化合物的方法。
7．筛选能够加速或抑制根据权利要求1的蛋白质的转运之化合物的方法。
8．通过实施权利要求4至7中任一项的筛选方法得到的化合物或其盐。
9．抗根据权利要求1的蛋白质的抗体。
全文摘要
可通过从衍生于人大脑皮层的cDNA库中克隆得到编码具有糖转运活性之新的蛋白质HUCEP－8的基因hucep－8。
文档编号C07K14/435GK1313865SQ9980995
公开日2001年9月19日 申请日期1999年7月2日 优先权日1998年7月2日
发明者吉本真, 矢崎圆, 松本佳代, 高山喜好, 钓谷克树 申请人:大正制药株式会社