专利名称：干扰素－β融合蛋白及用途的制作方法
技术领域：
本发明背景现在多肽和蛋白质用于特殊疾病的全身治疗的用途在医学实践中是被普遍接受的。这些物质在治疗中所起的作用是如此重要，以至于很多研究热点都针对通过重组DNA技术的大量合成。这些多肽中很多是在激发它们的生物学作用中非常有潜力和特异性的内源分子。
限制这些蛋白质类物质在它们趋向的应用中的用途的主要因素在于，当是亲本带来的时，它们在很短的时间内消失。这作为通过蛋白酶或者通过使用用于蛋白质消除的正常途径例如通过肾过滤的清除的代谢的结果而发生。与蛋白质给药的这些途径相关的问题在制药工业中是公知的，并且在努力中使用各种各样的方法来解决这些问题。
是大多数临床工作焦点并且努力改进其给药和生物同化作用的肽家族是干扰素。对于多种临床疾病状态试验过干扰素。最好地确定了该家族的一个成员人干扰素-β在治疗多发性硬化中的用途。最近欧洲和美国许可了用于治疗该疾病的两种形式的重组干扰素-β。一种形式是干扰素-β-1a(已注册商标，以AVONEX出售，Biogen，Inc.，Cambridge，MA)，并且下文互换使用“干扰素-beta-1a”或“IFN-beta-1a”或“IFN-β-1a”或“干扰素-β-1a”。另一种形式是干扰素-β-1b(以AVONEX注册商标并出售，Berlex，Richmond CA)，下文称之为“干扰素-β-1b”。使用自然人基因序列在哺乳动物细胞中制备干扰素-β-1a并且是糖基化，而使用修饰的在氨基酸位置17处包含基因工程半胱氨酸-对-丝氨酸取代的人基因序列在大肠杆菌细菌中产生干扰素-β-1b，并且是非糖基化的。
先前，我们中的几个人在功能测定中直接比较了干扰素-β-1a和干扰素-β-1b的相对体外效力并且证明干扰素-β-1a的比活比干扰素-β-1b的比活高大约10倍(Runkel等，1998，药物研究(Pharm.Res.)15641-649)。从设计用来鉴定这些活性差异的结构基础的研究，我们鉴定了糖基化作用，这是影响特异活性的产物之间的已知结构差异的唯一一种。碳水化合物的影响主要通过其对结构的稳定作用而证明。在热变性实验和SEC分析中证实了碳水化合物的稳定作用。聚集作用的增加和对热变性的提高的敏感性也与糖基化作用的缺失相关。使用导致去糖基化产物的过量沉积的PNG酶F从干扰素-β-1a酶去除碳水化合物。
这些研究表明，尽管干扰素-β-1a和干扰素-β-1b之间序列有保守性，但是它们有截然不同的生物化学本质，因此对于干扰素-β-1b所知的许多不能适用于干扰素-β-1a，反之亦然。
发明概述我们利用相对于非糖基化形式的糖基化干扰素-β的优点。特别地，我们开发出一种具有相对于干扰素-β-1b的提高的活性的干扰素-β-1a组合物，并且其一般也具有融合蛋白的有益性质，与不是融合蛋白的干扰素-β-1a形式相比没有活性的有效损失。因此，如果以一定方法进行修饰，使得产物(干扰素-β-1a融合蛋白)保留它们的全部或大部分生物活性，则可以获得下面的性质改变药物代谢动力学和药物动力学导致提高的半寿期和组织分布的改变(例如在脉管系统中停留更长时间的能力)。这样一种制剂是制药和医药学领域的一个实质性进步并且将对其中干扰素具有某些用途的各种疾病的治疗作出显著的贡献所述疾病是例如多发性硬化，纤维变性，和其它炎症或自身免疫疾病，癌症，肝炎和其它病毒疾病和特征在于新血管形成的疾病。特别地，在脉管系统中保持更长时间的能力使得要使用的干扰素-β-1a抑制血管生成并且有跨越血-脑屏障的可能。
特别地，本发明涉及具有氨基酸序列X-Y-Z的分离的多肽，其中X是具有由干扰素-β的氨基酸序列组成的氨基酸序列或者其部分的多肽；Y是任选的连接基团部分；和Z是包括不是干扰素-β的多肽的至少一部分的多肽。任选的部分Y和必须的部分Z可以与干扰素-β(X)的N-或C-末端连接。优选地，X是人干扰素-β-1a。在优选的实施方案中，Z是免疫球蛋白的恒定区的至少一部分并且可以从选自IgM，IgG，IgD，IgA和IgE的类的免疫球蛋白衍生。如果是IgG类，则其选自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4之一。人IgM和IgE的恒定区包含4个恒定区(CH1，(铰链)，CH2，CH3和CH4，其中人IgG，IgA和IgD的恒定区包含3个恒定区(CH1，(铰链)，CH2和CH3)。在本发明大多数优选的融合蛋白中，恒定区包含至少铰链，CH2和CH3区。在另一个实施方案中，Z部分是包含免疫球蛋白样区的多肽的至少一部分。这样的其它多肽的实例包括CD1，CD2，CD4和I类和II类主要组织相容性抗原成员。
本发明另一个实施方案是具有由干扰素-β的氨基酸序列或者其部分组成的氨基末端区和包括不是干扰素-β的蛋白质的至少一部分的羧基末端区的融合蛋白。羧基部分优选是从选自IgM，IgG，IgD，IgA和IgE的类的免疫球蛋白衍生的免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。在最优选的融合蛋白中，恒定区至少包含铰链，CH2和CH3区。
本发明的另一个实施方案是一种融合蛋白，其干扰素-β部分(如上式中的X)被诱变以提供相对于非突变形式的干扰素-β-1a具有选择性增强的抗病毒和/或抗增殖活性或者其它有利性质的突变蛋白。
本发明的另一个实施方案是编码上述融合蛋白的分离的DNA。本发明还涉及包括编码上述融合蛋白的分离的DNA和一个表达调控序列的重组DNA，其中所述表达调控序列与所述DNA可操作地连接。本发明的范围也包括用本发明的重组DNA序列转化的宿主细胞。
本发明进一步涉及制备重组多肽的方法，包括提供根据本发明的宿主细胞种群；在表达重组DNA编码的多肽的条件下培养所述细胞种群；和分离表达的多肽。
本发明的另一方面是基本纯化形式的包括干扰素-β-1a和天然不相关的另外的多肽的干扰素-β-1a融合蛋白，该融合蛋白具有和没有该另外的多肽的干扰素-β-1a的抗病毒活性大约相同的抗病毒活性。
本发明的另一方面是包括治疗有效量的干扰素-β-1a融合蛋白的药物组合物。
本发明的另一方面是使用本发明的多肽抑制血管生成和新血管生成的方法。
附图的简要说明
图1组氨酸标记的干扰素-β融合(也称之为“hisIFN-β”或“His6-标记的”)的cDNA和推导的氨基酸序列。给出了该his干扰素-β-1a的全长DNA和蛋白质序列。裂解的VCAM-1信号序列离开组氨酸标记物(His6，位置4-9)的上游3个氨基末端残基(SerGlyGly)。肠激酶连接体序列(AspAspAspAspLys)通过间隔区(位置10-12，SerSerGly)与组氨酸标记物分开。天然干扰素-β-1a蛋白质序列跨越位置(Met18-Asn183)。图2干扰素-β-1a/Fc融合的cDNA和推导的氨基酸序列。给出了人干扰素-β-1a/鼠Fc的全长DNA和蛋白质序列。人干扰素-β-1a蛋白质序列跨越氨基酸残基1-166(DNA序列1-498)。肠激酶连接体序列跨越氨基酸残基167-171(DNA序列499-513)。鼠IgG2a重链蛋白质序列跨越残基172-399(DNA序列514-437)。图3丙氨酸取代的干扰素-β突变体与由I型干扰素受体链的胞外区组成的二聚体融合蛋白的结合，IFNAR2/Fc。如实施例1所述(D小节)测定了丙氨酸取代的IFN突变体(A1-E)对于IFNAR2受体链的结合亲和性。在该测定中直方图代表它们在此检测中相对于野生型his-IFN-β的结合亲和性(％w.t.)。根据(野生型his-IFN-β的亲和性)/(突变体IFN-β的亲和性)×100计算％w.t.值。给出了多次测定(n＝3)的％w.t.(x)和该实验系列的平均％w.t.(x)。突变体A2，AB1，AB2和E在比w.t.his-IFN-βEC50(*)高500倍的浓度下不结合IFNAR2/Fc。图4丙氨酸取代的干扰素-β突变体与Daudi Burkitt’s淋巴瘤细胞上表达的I型干扰素细胞表面受体复合物(“IFNAR1/2复合物”)的结合。使用如实施例1所述(D小节)的FACS为基础的细胞表面受体结合测定测定了丙氨酸取代的突变体(A1-E)的受体结合性质。直方图代表它们在该测定中相对于野生型his-IFN-β的受体结合亲和性(％w.t.)。根据(w.t.his-IFN-β的亲和性)/(突变体IFN-β的亲和性)×100计算每一种突变体的％w.t.。直方图下给出了多次测定的％w.t.值(o)和该实验系列的％w.t.的平均值(x)。图5丙氨酸取代的干扰素-β突变体的抗病毒活性如实施例1(E小节)所述，在用EMC病毒攻击的人A549细胞上测定丙氨酸取代的突变体(A1-E)的抗病毒活性。在该测定中直方图代表它们相对于野生型his-IFN-β的活性(％w.t.)。根据突变体IFN-β(50％cpe)的浓度/w.t.his-IFN-β(50％cpe)的浓度的倒数×100计算％w.t.。给出了多次测定的％w.t.值(o)和该实验数据系列的平均值(x)。图6丙氨酸取代的干扰素-β突变体的抗增殖活性如实施例1(E小节)所述，在Daudi Burkitt’s淋巴瘤细胞上测定丙氨酸取代的突变体(A1-E)的抗增殖活性。直方图代表它们在该测定中相对于野生型his-IFN-β的活性(％w.t.)。根据(w.t.％his-IFN-β浓度(50％生长抑制)/突变体IFN-β浓度(50％生长抑制)×100计算％w.t.。给出了多次测定的％w.t.值(o)和该实验数据系列的平均值(x)。图7丙氨酸取代的干扰素-β突变体的相对抗病毒和抗增殖活性。比较了抗病毒(x轴)和抗增殖(y轴)测定中丙氨酸取代的突变体(A1-E)的相对活性。对于该比较使用了图5和6中给出的平均百分比野生型his-IFN-β(％w.t.(x))。活性协调降低/提高的那些突变体将落在或者非常接近垂直线。抗病毒和抗增殖活性不均衡降低/提高的那些突变体将明显落于对角线之外(DE1，D，C1)。考虑使用的平均％w.t.值中固有的平均偏差确定意义。图8IFN-β-1a/Ig融合的抗病毒活性在使用用EMC病毒攻击的人肺癌细胞(A549)的抗病毒测定中评价在x轴指定的浓度下的IFN-β-1a(用作AVONEX)或者IFN-β-1a/鼠Ig2a融合蛋白的活性。用病毒培养2天后，活细胞用MTT染色，在450nm下读板，在y轴上给出反映细胞成活度的吸光度。误差栏给出标准偏差。给出(50％最大OD450)和因此50％病毒杀死(“50％致细胞病变作用”)的IFN-β-1a(用作AVONEX大量中间体)的浓度是大约0.4pM，而干扰素-β-1a融合蛋白的50％致细胞病变作用的是大约0.15pM。图9用IFN-β-1a/Fc融合蛋白或IFN-β-1a处理的小鼠血浆中IFN-β抗病毒活性的测定。
使用50000单位的IFN-β-1a(用作AVONEX大量中间体)或50000单位的IFN-β-1a/Fc融合蛋白对小鼠静脉内注射。以x轴指示的注射干扰素之后的不同时间通过眶后放血从这些小鼠获得血液。每个时间点至少对3只小鼠放血，制备血浆并且冷冻，直到在使用用脑心肌炎病毒攻击的人肺癌细胞(A549)的抗病毒测定中评价IFN-β活性的时候。成活细胞用MTT的溶液染色，在450nm下读板，测定反映细胞成活度和IFN-β活性的吸光度。使用作为AVONEX的干扰素-β-1a对于每一个平板产生标准曲线并且用来测定每一个样品中IFN-β活性的量。给出从各个动物得到的数据。图10人IFN-β和人IgG1Fc的直接融合物(ZL5107)的可读框的全长DNA和蛋白质序列图11由人IFN-β/G4S连接体/人IgG1Fc组成的融合蛋白(ZL6206)的可读框的全长DNA和蛋白质序列。
详细说明除非另有说明，详细说明中引用的所有参考文献在这里引作参考。这里使用下面的术语I.定义干扰素-“干扰素”(也称之为“IFN”)是哺乳动物细胞响应暴露给各种各样的诱导物例如病毒，多肽，促细胞分裂原等产生的小的物种特异性单链多肽。本发明中使用的最优选的干扰素是在残基80(Asn80)处糖基化的并且优选通过重组DNA技术衍生的糖基化的人干扰素-β。该优选的糖基化干扰素-β称之为“干扰素-beta-1a”(或“IFN-beta-1a”或“IFN-β-1a”或“干扰素beta 1a”或“干扰素-beta-1a”或“干扰素-β-1a”，所有这些都互换使用)。术语“干扰素-β-1a”也意指包括所有的突变体形式(即实施例1)，前提是所述突变体在Asn80残基处也是糖基化的。
制备蛋白质包括干扰素的重组DNA方法是已知的。参见，例如，美国专利4399216，5149636，5179017(Axel等)和4470461(Kaufman)。
可以在本发明的方法中使用的优选的干扰素-β-1a多核苷酸衍生自各种脊椎动物，优选哺乳动物的野生型干扰素-β基因序列，并且使用对本领域技术人员来说是公知的方法获得，例如描述于下面的美国专利的方法美国专利5641656(1997年6月24日颁发编码鸟I型干扰素蛋白质原(proprotein)和成熟鸟I型干扰素的DNA)，美国专利5605688(1997年2月25日-重组狗和马I型干扰素)；美国专利5231176(1993年7月27日，编码人白细胞干扰素的DNA分子)；美国专利5071761(1991年12月10日，编码人类淋巴母细胞干扰素LyIFN-α-2和LyIFN-α-3的亚序列的DNA序列)；美国专利4970161(1990年11月13日，编码人γ-干扰素的DNA序列)；美国专利4738931(1988年4月19日，包含人干扰素-β基因的DNA)；美国专利4695543(1987年9月22日，人干扰素-β基因Gx-1基因)和美国专利4456748(1984年6月26日，编码不同的天然存在的白细胞干扰素的亚序列的DNA)。
根据本发明可以使用干扰素-β-1a的突变体。使用本领域技术人员公知的定向诱变的常规方法进行诱变。此外，本发明提供编码功能等价的干扰素-β-1a多肽的功能等价的干扰素-β-1a多核苷酸。
编码干扰素-β-1a的第一种多核苷酸与编码干扰素-β-1a的第二种多核苷酸相比如果满足下面条件的至少一个，则是“功能等价的”(a)“功能等价物”是在标准杂交条件下与第二种多核苷酸杂交的第一种多核苷酸和/或与第一种多核苷酸序列简并的。最优选地，其编码具有干扰素-β-1a[治疗]活性的突变干扰素；(b)“功能等价物”是表达时编码第二种多核苷酸编码的氨基酸序列的第一种多核苷酸。
总之，术语“干扰素”包括但不限于上面列出的活性剂以及它们的功能等价物。如这里所使用的，术语“功能等价物”因此指具有和认为是功能等价物的干扰素一样的或改进的对哺乳动物受体的有益效果的干扰素-β-1a蛋白或编码干扰素-β-1a蛋白的多核苷酸。正如本领域技术人员所理解的，可以通过重组技术，例如通过表达“功能等价DNA”来制备功能等价蛋白质。因此，本发明包括天然存在的DNA以及编码和天然存在的DNA编码的蛋白质相同的蛋白质的非天然存在的DNA编码的干扰素-β-1a蛋白。由于核苷酸编码序列的简并性，其它多核苷酸可以用来编码干扰素-β-1a。这些包括通过在序列中编码相同氨基酸序列的不同密码子的取代因此产生一种沉默改变而改变的上述序列的全部或部分。这样被改变的序列认为是这些序列的等价物。例如，Phe(F)由两个密码子编码，TTC或TTT，Tyr(Y)由TAC或TAT编码和His(H)由CAC或CAT编码。另一方面，Trp(W)由单一密码子TGG编码。因此，要理解对于给定的编码特定干扰素的DNA序列，将会有编码它的很多DNA简并序列。这些简并DNA序列认为在本发明范围内。
“融合物”-指两种或多种蛋白质或者其片段通过其各自的肽骨架，最优选地通过编码这些蛋白质的多核苷酸分子的基因表达而共线性共价连接的产物。优选蛋白质或者其片段来自不同的来源。因此，优选的融合蛋白包括与不是干扰素的第二部分共价连接的干扰素-β-1a蛋白或片段。具体地说，“干扰素-β/Ig融合物”是一种蛋白质，包括本发明干扰素-β分子(即干扰素-β-1a)或者其片段，其N-末端或C-末端连接其中免疫球蛋白链的N-末端的一部分被干扰素-β取代的免疫球蛋白链的N-末端。一种干扰素-β/Ig融合物是“干扰素-β/Fc融合物”，其是包括与免疫球蛋白的恒定区的至少一部分连接的本发明的干扰素-β分子(即干扰素-β-1a)的蛋白质。优选的Fc融合物包括与包含重免疫球蛋白链的C-末端区的抗体的片段连接的本发明的干扰素-β分子。
术语“融合蛋白”也指通过单-或杂-功能分子与不是干扰素-β蛋白的第二部分化学连接的干扰素-β蛋白，其如下所述从纯化的蛋白质从头制备。
“重组体”，如这里所使用的，指从重组的哺乳动物表达系统衍生的蛋白质。在大多数细菌培养物例如大肠杆菌中表达的蛋白质会没有聚糖，因此这些表达系统不是优选的。在酵母中表达的蛋白质可以具有寡糖结构，这不同于在哺乳动物细胞中表达的产物。
说明书中作为干扰素-β-1a的特征使用的“生物学活性”指特殊分子具有与本发明的实施方案足够的氨基酸序列同源性从而具有在这里公开的如下所述实施例1中所示类型体外抗病毒测定中测定的能具有抗病毒活性。
这里所使用的“治疗组合物”定义为包括本发明的蛋白质和其它生理相容成分的组合物。所述治疗组合物可以含有赋形剂，例如水，矿物质和载体，例如蛋白质。
“氨基酸”-肽，多肽或蛋白质的单体单位。自然界存在的肽，多肽或蛋白质中发现二十种氨基酸，它们都是L-异构体。该术语也包括氨基酸的类似物和蛋白质氨基酸的D-异构体及其类似物。
“衍生的”氨基酸是一种天然或非天然氨基酸，其中通过化学反应修饰正常存在的侧链或末端基团(或者干扰素-β-1a情况下的糖部分)。这样的修饰作用包括，例如γ-羧基化作用，β-羧基化作用，pegylation，硫酸盐化作用，磺化作用，磷酸化作用，酰胺化作用，酯化作用，N-酰化作用，羰苄基化作用，甲苯磺酰化作用，和本领域公知的其它修饰。“衍生化的多肽”是包含一个或多个衍生化的氨基酸和/或如果该多肽是糖基化的，则包含一个或多个衍生化的糖的多肽。
“蛋白质”-基本上由任何二十种氨基酸组成的任何聚合物。尽管“多肽”经常指相对大的多肽，并且“肽”经常指小的多肽，但是本领域中这些术语的使用有重叠且有不同。除非另有说明，这里使用的术语“蛋白质”指肽，蛋白质和多肽。
氨基酸残基的“功能等价物”是具有和功能等价物取代的氨基酸残基类似的物理化学性质的氨基酸。
“突变体”-有机体遗传材料中的任何改变，特别是野生型多核苷酸序列中的任何变化(即缺失，取代，加入或改变)或者野生型蛋白质中的任何改变。术语“突变蛋白”与“突变体”互换使用。
“野生型”-分别和其在体内正常存在一样的蛋白质或者其部分或者蛋白质序列或者其部分的外显子的天然存在的多核苷酸序列。
“标准杂交条件”-与杂交和洗涤的0.5×SSC至大约5×SSC和65℃基本上等价的盐和温度条件。这里使用的术语“标准杂交条件”因此是一种操作定义并且包括杂交条件的范围。严格性较强的条件例如可以包括用噬斑筛选缓冲液(0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％Ficoll400；0.2％牛血清白蛋白，50mM Tris-HCl(pH7.5)；1MNaCl；0.1％焦磷酸钠；1％SDS)；10％硫酸葡聚糖，和100微克/毫升变性的超声处理过的鲑精DNA在65℃下杂交12-20小时，并且在65℃下用75mM NaCl/7.5mM柠檬酸钠(0.5×SSC)/1％SDS洗涤。严格性较低的条件例如可以包括用噬斑筛选缓冲液，10％硫酸葡聚糖，和110微克/毫升变性的超声处理过的鲑精DNA在55℃下杂交12-20小时，并且在55℃下用300mM NaCl/30mM柠檬酸钠(2.0×SSC)/1％SDS洗涤。也参见分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，JohnWiley & Sons，Inc，纽约，6.3.1-6.3.6部分(1989)。
“表达调控序列”-当与那些基因可操作地连接时，控制和调节基因表达的多核苷酸序列。
“可操作地连接”-当表达调控序列控制和调节所述多核苷酸序列的转录和翻译时，多核苷酸序列(DNA，RNA)与表达调控序列可操作地连接。术语“可操作地连接”包括在要表达的多核苷酸序列前有合适的起始信号(例如ATG)并且保持正确的读框以允许该多核苷酸序列在表达调控序列的调控下表达并且产生该多核苷酸序列编码的期望的多肽。
“表达载体”-当表达载体被引入宿主细胞时，使得至少一个基因表达的多核苷酸，例如DNA质粒或噬菌体(在其它一般实例中)。载体可以是或者可以不是在细胞中能复制的。
“分离的”(与“基本上纯的”互换使用)-当用于编码多肽的核酸，即多核苷酸序列时，指RNA或DNA多核苷酸，基因组多核苷酸的部分，cDNA或合成的多核苷酸，它们由于其来源或操作(i)不与其天然相关的所有多核苷酸相关(例如在宿主细胞中作为表达载体存在，或者其部分)；或者(ii)与除了其天然连接的部分之外的核酸或其它化学部分连接；或者(iii)天然不存在。“分离的”另外指一种多核苷酸序列，其(i)例如通过聚合酶链反应(PCR)体外扩增的；(ii)化学合成的；(iii)通过克隆重组产生；或者(iv)如通过切割和凝胶分离纯化的。
因此，“基本上纯的核酸”是与从中衍生该核酸的自然存在的有机体基因组中正常邻接的一个或两个编码序列不直接邻接的核酸。基本上纯的DNA也包括是编码另外的序列的杂交基因的一部分的重组DNA。
“分离的”(与“基本上纯的”互换使用)-当用于多肽时，指一种多肽或者其部分，它们由于其来源或操作(i)在宿主细胞中作为表达载体的部分的表达产物存在；或者(ii)与除了其天然连接的部分之外的蛋白质或其它化学部分连接；或者(iii)自然界中不存在。“分离的”另外指一种蛋白质，其(i)是化学合成的；或者(ii)在宿主细胞中表达并且与相关的蛋白质纯化分离开。该术语一般指与天然存在的其它蛋白质和核酸分离的多肽。优选地，多肽也从用来纯化它们的例如抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)的物质分离。
“异源启动子”-如这里使用的，是与一个基因或一个纯化的核酸天然不相关的启动子。
“同源性”-如这里使用的，与术语“相同性”是同义词，并且指两个多肽，分子之间或者两个核酸之间的序列相似性。当两个比较的序列的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单位占据时(例如两个DNA分子的每一个中的一个位置都是腺嘌呤，或者两个多肽的每一个中的一个位置都是赖氨酸)，则在该位置上各分子是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置的数目除以比较的位置的数目X100的函数。例如，两个序列中10个位置中有6个是匹配的或者是同源的，则两个序列是60％同源性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％同源性(总共6个位置中有3个是匹配的)。一般情况下，当将两个序列对比时进行比较以给出最大同源性。使用例如计算机程序例如序列比较程序(DNAstar，Inc.)方便完成的Needleman等，分子生物学杂志(J，Mol Biol.)48443-453(1970)的方法可以提供这样的序列比较。同源序列共有相同的或相似的氨基酸残基，其中相似残基对序列比较参照的序列的相应的氨基酸残基是保守取代或“允许的点突变”。关于这一点，参照序列中残基的“保守取代”是与相应的参照残基物理或功能相似，例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等等的那些取代。特别优选的保守取代是满足Dayhoff等对于“可接受的点突变”的严格定义的那些，5蛋白质序列和结构的图表集(Atlas of Protein Sequence andStructure)，5增刊3，22章354-352，国家生物医学研究基金，华盛顿D.C.(1978)。
术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在这里也互换使用。
术语“新血管生成”和“血管生成”广义上指新血管的补充。特别地，“血管生成”也指肿瘤病灶处新血管的补充。
“IFNAR2”，“IFNAR1”，“IFNAR1/2”指已知构成I型细胞表面干扰素受体的蛋白质。单独的IFNAR2的胞外部分(胞外结构域)部分可以结合α或β干扰素。
除非另有说明，实施本发明将使用细胞生物学，细胞培养，分子生物学，微生物学，重组DNA，蛋白质化学和免疫学的常规技术，这些在本领域范围内。这样的技术在文献中有描述。参见，例如，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，(Sambrook，Fritsch和Maniatis编著)，冷泉港实验室出版社，1989；DNA克隆(DNA Cloning)，第I和II卷(D.N.Glover编著)，1985；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，(M.J.Gait编著)，1984；美国专利4683195(Mullis等)；核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)(B.D.Hames和S.J.Higgins编著)，1984；转录和翻译(Transcription and Translation)(B.D.Hames和S.J.Higgins编著)，1984；动物细胞的培养(Culture of Animal Cells)(R.I.Freshney编著)，Alan R.Liss，Inc.，1987；固定化的细胞和酶(Immobilized Cell and Enzymes)，IRL出版社.1986；分子克隆实施指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)(B.Perbal)，1984；酶学方法(Method in Enzymology)，第154和155卷(Wu等编著)，科学出版社，纽约；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene TransferVectors for Mammalian Cell)(J.H.Miller和M.P.Calos编著)，1987，冷泉港实验室；细胞和分子生物学中的免疫化学方法(ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology)(Mayer和Walker编著)，科学出版社，伦敦，1987；实验免疫学手册(Handbook of ExperimentImmunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著)，1986；处理小鼠胚胎(Manipulating the Mouse Embryo)，冷泉港实验室出版社，1986。II.融合蛋白的制备和表达本发明涉及用于产生干扰素-β-1a融合蛋白的系统。特别地，本发明涉及这些蛋白质以及在它们的制备中使用的重组DNA分子。
通过本领域公知的多种方法可以实现本发明多肽的制备。例如，通过公知的使用cDNA的重组DNA技术可以制备全长干扰素-β-1a或截短形式的干扰素-β-1a(见下文)。
可以以期望的多肽的氨基酸序列为基础设计编码期望的干扰素-β-1a多肽的基因。然后可以使用标准方法来合成基因。例如，可以使用氨基酸序列来构建反向翻译的基因。可以在单一步骤中制备包含能编码干扰素-β-1a的核苷酸序列的DNA寡聚物。或者，可以合成编码期望的干扰素-β-1a的部分的几个较小的寡核苷酸然后连接在一起。优选地，编码干扰素-β-1a部分的DNA序列将作为几个分开的接着能连接在一起的寡核苷酸来制备(见实施例2)。各寡核苷酸一般包含用于互补组装的5’或3’突出端。
一旦组装，优选的基因将特征在于被限制性内切核酸酶识别的序列(包括用于直接组装到克隆或表达载体中的单一的限制位点)，考虑要使用的宿主表达系统(优选哺乳动物细胞)的优选的密码子，和当转录时产生稳定的有效翻译的RNA的序列。通过核苷酸测序，限制酶作图，和生物活性多肽在合适的宿主中的表达可以证实正确的组装。
通过使用合适的人干扰素-βDNA序列作为通过交叉物种杂交筛选特定哺乳动物细胞cDNA文库的探针可以分离哺乳动物干扰素-βcDNA。在本发明中使用的哺乳动物干扰素-β包括例如灵长类，人，鼠，犬，猫，牛，马和猪干扰素-β。通过交叉物种杂交，使用从人干扰素-βDNA序列衍生的单链cDNA作为从哺乳动物cDNA文库分离干扰素-βcDNA的杂交探针，可以获得哺乳动物干扰素-β。可以用于分离和克隆干扰素基因序列的方法是上面总结的美国专利中公开的那些方法。但是特别相关的是描述包含人干扰素-β基因的DNA的美国专利4738931(1988年4月19日)的教导。
本发明还涉及包含上述DNA序列的重组DNA分子。本发明重组DNA分子能在用其转化的宿主中指导本发明多肽的表达。编码本发明的融合多肽的DNA序列必须可操作地连接用于该表达的表达调控序列。为了提供本发明重组构建体的足够的转录，可以优选向重组载体中引入合适的启动子/增强子序列，前提是该启动子/表达调控序列能驱动编码糖基化干扰素-β的核酸序列的转录。可以用来调控以免疫球蛋白为基础的融合蛋白的表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Benoist和Chambon，1981，自然290304-310)，Rous肉瘤病毒的3’长末端重复单元中包含的启动子(Yamamoto等，1980，细胞22787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，美国国家科学院院刊78144-1445)，金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982，自然29639-42)；包括胭脂氨酸合酶启动子区的植物表达载体(Herrera-Estrella等，自然303209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等，1981，核酸研究(Nucl.Acids Res.)92871)，和用于光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等，1984，自然310115-120)；来自酵母或其它真菌的启动子元件例如Gal4启动子，ADC(醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子，和下面的动物转录调控区，它们表现出组织特异性并且在转基因动物中使用在胰细胞中是有活性的弹性蛋白酶I基因调控区(Swift等，1984，细胞38639-646；Ornitz等，1986，冷泉港Symp.Quant.Biol.50399-409)；MacDonald，1987，肝脏病学(Hepatology)7425-515)；在β-胰细胞中是有活性的胰岛素基因增强子或启动子(Hanahan，1985，自然315115-122)；在淋巴样细胞中是有活性的免疫球蛋白基因增强子或启动子(Grosschedl等，1984，细胞38647-658；Adames等，1985，自然318533-538；Alexander等，1987，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)71436-1444)；巨细胞病毒早期启动子和增强子区(Boshart等，1985，细胞41521-530)；在睾丸，乳腺，淋巴样和肥大细胞中是有活性的小鼠乳肿瘤病毒调控区(Leder等，1986，细胞45485-495)；在肝中有活性的白蛋白基因调控区(Pinkert等，1987，基因和进展(Genes and Devel.)1268-276)；在肝中有活性的α-胎蛋白基因调控区(Krumlauf等，1985，分子细胞生物学51639-1648；Hammer等，1987，科学23553-58)；在肝中有活性的α-1-抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey等，1987，基因和进展(Genesand Devel.)1161-171)；在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因调控区(Mogram等，1985，自然315338-340；Kollias等，1986，细胞4689-94)；在脑的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因调控区(Readhead等，1987，细胞48703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区(Sani，1985，自然314283-286)；和在下丘脑中有活性的促性腺素释放基因调控区(Mason等，1986，科学2341372-1378)。由于表达的干扰素-β不会是糖基化的，所以原核生物表达系统例如LAC，或者β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院院刊3727-3731)在本发明中不是优选的。尽管如此，将使得干扰素-β在原核或真核宿主中糖基化的原核生物表达系统包括在本发明的范围内。
可以使用的表达载体包括但不限于下面的载体或者它们的衍生物人或动物病毒，例如牛痘病毒，腺病毒或逆转录病毒为基础的载体；昆虫病毒，例如杆状病毒；酵母病毒；噬菌体载体(例如λ)，和质粒和粘粒DNA载体，等等。具体地说，用于优选的真核宿主的有用表达载体包括包括来自SV40，牛乳头瘤病毒，巨细胞病毒的表达调控序列的载体。此外，在各具体的表达载体中，对于这些DNA序列的插入可以选择各种各样的位点。这些位点通常由切割它们的限制性内切核酸酶设计。本领域技术人员对这些是公知的。要理解在本发明中使用的给定的表达载体不必须具有用于插入选择的DNA片段的限制性酶切位点。相反，所述载体可以通过另外的方法连接片段。
通过各种各样的因素确定表达载体和选择用来插入选择的DNA片段并且与表达调控序列可操作地连接的位点对于特定的限制酶敏感的位点的数目，多肽的大小，多肽蛋白水解降解的容易程度等等。通过平衡这些因素确定对于给定DNA的载体和插入位点的选择。
本发明的重组构建体可以使用本领域公知的方法引入到能表达所述融合蛋白的宿主细胞中，包括转化(例如，使用DEAE-葡聚糖或磷酸钙技术)，转染，微注射，感染，细胞枪和电穿孔。可以使用任何宿主细胞类型，前提是融合蛋白重组核酸序列在该细胞类型中被足够地转录地mRNA，并且该细胞可以将该蛋白质糖基化。另外，本发明的重组核酸构建体可以用来产生能产生免疫球蛋白基的融合蛋白的非人转基因动物。在本发明优选的实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如COS或GHO细胞。
通过三种一般的方法可以鉴定这些多核苷酸构建体进入给定表达载体中的成功插入(a)DNA-DNA杂交，(b)存在或不存在“标记”基因功能，和(c)插入的序列的表达。在第一种方法中，通过使用包括与插入的融合蛋白同源的序列的探针的DNA-DNA杂交可以检测表达载体中插入的干扰素-β-1a的存在。在第二种方法中，以存在或不存在由载体中外来基因的插入引起的某些“标记”基因功能(例如胸苷激酶活性，对抗生素例如G418的抗性，转化表型，杆状病毒中形成的包函体)为基础可以鉴定和选择重组载体/宿主系统。宿主系统。例如，如果插入多核苷酸使得间断载体的标记基因序列，则通过不存在标记基因功能可以鉴定包含该插入的重组体。在第三种方法中，通过测定重组载体表达的外来基因产物可以鉴定重组表达载体。这样的测定可以以例如生物测定系统中基因产物的物理或功能性质为基础。
要明白不是所有的宿主/表达载体组合在编码本发明多肽的DNA序列中具有等效的功能。但是，本领域技术人员在考虑这里提出的原理之后可以作出宿主表达的载体组合的具体选择而不超出本发明范围。
本发明的优选方案包括融合蛋白和编码它们的DNA序列。这些融合蛋白具有特征在于干扰素-β-1a的氨基酸序列的氨基末端区和包括非干扰素-β-1a的蛋白质的区的羧基-末端区。这样一种蛋白质的优选的通式是具有一级(primary)氨基酸序列X-Y-Z的蛋白质，其中，X是具有由人干扰素-β的氨基酸序列组成的氨基酸序列，或者其部分的多肽；Y是任选的连接体部分；和Z是包括除了人干扰素-β之外的多肽的至少一部分的多肽。在一个实施方案中，Z部分可以是包含免疫球蛋白样区的多肽的一部分。这样的其他多肽的例子包括CD1，CD2，CD4和I类和II类主要组织相容性抗原的成员。这样的多肽的实例参见美国专利5565335(Capon等)。
Z部分可以包括例如多个组氨酸残基，或者优选地，免疫球蛋白的Fc区，这里定义的“Fc”是包含免疫球蛋白重链的C末端区的抗体的片段。
在最优选的融合蛋白中，干扰素-β-1a多肽通过其C-末端与至少一部分的免疫球蛋白的Fc区融合。所述干扰素-β-1a形成氨基末端部分，Fc区形成羧基末端部分。在这些融合蛋白中，Fc区优选限于恒定结构域铰链区和CH2和CH3结构域。这些融合物中的Fc区也可以限于铰链区的一部分，能够形成分子间二硫桥的部分，CH2和CH3结构域，或者它们的功能等价物。这些恒定区可以从任何哺乳动物来源(优选人)衍生并且可以衍生自任何合适的类和/或同种型，包括IgA，IgD，IgM，IgE和IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
编码Ig融合物的重组核酸分子可以通过本领域公知的任何方法获得(Maniatis等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)或者从公众可获得的克隆获得。例如Robinson，R.等，PCT申请，公开号WO87-02671教导了制备编码免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的基因的制备方法。编码干扰素分子或片段的cDNA序列可以直接连接编码重链Ig恒定区的cDNA或者可以通过连接体序列连接。在本发明的另一个实施方案中，可以产生重组载体系统来接纳编码干扰素-β的序列在具有合成的铰链区的正确的阅读框中。此外，作为重组载体系统的部分，可以期望包括相应于包括RNA裂解/聚腺苷酸化位点和下游序列的免疫球蛋白基因的3’侧翼区的核酸。此外，可以期望基因工程处理免疫球蛋白融合蛋白编码序列的上游信号序列以有利于从用重组载体转化的细胞分泌融合的分子。
本发明提供了包括融合蛋白的二聚体融合分子以及单体或多聚体分子，这样的多聚体可以通过使用通常是多价的Ig分子例如IgM五聚体或IgA二聚体的Ig分子的那些Fc区或者其部分来产生。要明白J链多肽对于形成和稳定IgM五聚体和IgA二聚体是需要的。或者，使用具有对Ig分子的Fc区的亲和性的蛋白质，例如A蛋白，可以形成多聚体的干扰素-β-1a融合蛋白。例如，多种干扰素-β-1a/免疫球蛋白融合蛋白可以结合A蛋白-琼脂糖小球。
这些多价形式上有用的，因为它们具有多个干扰素-β受体结合位点。例如，二价可溶性干扰素-β-1a可以由连接体区(Y部分)分开的两个串联重复的SEQ ID NO2的氨基酸1-166(或者SEQ ID NO2的核酸1-498编码的那些)(通式中的X部分)组成，该重复与免疫球蛋白恒定区(Z部分)的至少一部分结合。也可以构建另外的多价形式，例如，通过使用常规的偶联技术，将干扰素-β-1a/Ig融合物化学偶联于任何临床可接受的载体分子，选自Ficoll，聚乙二醇或葡聚糖的聚合物。或者，可以使干扰素-β-1a化学偶联于生物素和然后使生物素-干扰素-βFc缀合物结合抗生物素蛋白，得到四价抗生物素蛋白/生物素/干扰素-β分子。干扰素-β-1a/Ig融合物也可以共价偶联于二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)和得到的用抗-DNP或抗-TNP-IgM沉淀的缀合物，形成对于干扰素-β受体位点具有10价的十聚体缀合物。
根据常规方法，例如萃取，沉淀，色谱，亲和层析，电泳等，可以分离和纯化本发明的干扰素-β-1a蛋白，片段和融合蛋白。例如，通过将其溶液通过其上固定有干扰素受体的柱子可以纯化干扰素蛋白和片段(美国专利4725669)。然后通过用离液序列高的盐处理或者通过用乙酸水溶液洗脱可以洗脱结合的干扰素分子。通过使含有融合蛋白的溶液通过含有选择性结合该融合蛋白的Fc部分的固定化A蛋白或蛋白质G的柱子，可以纯化免疫球蛋白融合蛋白。参见，例如，Reis，K.J.，等，免疫学杂志，1323098-3102(1984)；PCT申请，申请号WO87/00329。然后通过用离液序列高的盐处理或者通过用乙酸水溶液洗脱可以洗脱嵌合的抗体。
或者可以在抗干扰素抗体柱上，或者在抗免疫球蛋白抗体柱上，可以纯化干扰素蛋白和免疫球蛋白-融合分子，得到基本上纯的蛋白质。术语“基本上纯的”意指没有天然与之相关的杂质的蛋白质。通过电泳单一泳带可以证实基本上纯。
本发明有用的干扰素-β-1a/Ig融合蛋白的实施例是SEQ ID NO2，其通过包含表达质粒pCMG261的真核生物细胞分泌到细胞培养物中(见实施例2)。该蛋白质由与鼠Ig的铰链区和CH2和CH3恒定区融合的成熟人干扰素-β-1a组成。这包括Fc结合蛋白，A蛋白识别的鼠免疫球蛋白的足够部分。
引入人干扰素-β-1a的本发明的其他融合蛋白如下(a)SEQ ID NO3和4分别是组氨酸标记的干扰素-β-1a融合物的cDNA和推导的氨基酸序列(也参见图1)和；(b)SEQ ID NO1是编码SEQ ID NO2的干扰素-β-1a/Ig融合蛋白的cDNA(也参见图2)。
本发明优选的干扰素-β-1a蛋白质包括新的“连接(junction)”DNA序列SEQ ID NO5和氨基酸SEQ ID NO6。SEQ ID NO5代表人干扰素-βDNA和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA之间的连接的任一侧上的11个三联体密码(见实施例5SEQ ID NO41和42)。具体地，在SEQ ID NO5中，编码人干扰素-β-1a的DNA在核苷酸三联体568-570(AAC)处终止，和编码人IgG1恒定区的DNA在SEQ ID NO41的574位核苷酸起始的三联体(GAC)处开始。SEQ ID NO6给出了相应的推导的氨基酸“连接”序列并且以SEQ ID NO42为基础。另一个独特的“连接”序列确定为包括在最终DNA构建体中的连接体(linker)序列(见实施例5SEQ ID NO43和44)。该“连接”DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO7和8中给出，其示出干扰素-β-1a序列的末端(SEQ ID NO43的570位核苷酸)和连接体序列(SEQ IDNO43的571-585位核苷酸；SEQ ID NO8中的GGGGS)之间直接连接的任一侧上的11个三联体密码。
DNA“连接”序列可以用作DNA探针并且是在对于编码任何干扰素-β-1a/Ig融合蛋白的任何DNA序列的标准条件下的杂交所需的最少DNA。尽管如此，只要整个探针与所述连接的两侧和参与杂交的干扰素-β/恒定区连接的两侧都杂交，则可以存在较小的序列。此外，本领域技术人员会明白比SEQ ID NO5或7更大的DNA序列将同样适合杂交。本领域技术人员可以通过用使用多核苷酸激酶适当标记的ATP磷酸标记单链有义寡核苷酸或单链反义寡核苷酸的5’末端试验一个具体的探针例如SEQ ID NO5或7是否能在连接的两侧上杂交。本发明的序列一定杂交，因此通过两个寡核苷酸探针标记。进一步明白本发明包括编码连接SEQ ID NO5或7的充份简并的序列。
III.干扰素融合多肽的其它变体本发明的蛋白质的衍生物也包括保留生物活性的一级蛋白质的各种结构形式。由于存在可离子化的氨基和羧基，例如干扰素-β融合蛋白可以是酸性或碱性盐的形式，或者可以是中性形式。也可以通过氧化或还原来修饰各氨基酸残基。此外，通过与其他化学部分，例如糖基基团，聚亚烷基二醇聚合物，例如聚乙二醇(PEG参见共同申请未决的和普通转让的申请系列号60/104491和60/720237)，脂质，磷酸酯，酰基等等形成共价或聚集缀合物，或者通过产生氨基酸序列突变体，可以修饰(“衍生物化”)干扰素-β-1a的一级氨基酸结构(包括N-和/或C-末端)或者聚糖。
干扰素-β/Ig的其他衍生物包括例如通过在重组培养物中合成为另外的N-末端或C-末端的干扰素-β或者其片段与其他蛋白质或多肽的共价或聚集缀合物。例如，缀合的肽可以是翻译同时或翻译后指导该蛋白质自其合成位点向细胞膜或细胞壁内或外其功能位点转移的蛋白质的N-末端区的信号(或前导)多肽序列(例如酵母α-因子前导序列)。干扰素-β受体蛋白可以包括加入以有利于干扰素-β的纯化或鉴定的肽(例如组氨酸/干扰素-β-1a融合物)。干扰素-β的氨基酸序列也可以连接肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(Hopp等，生物/技术(Bio/Technology)61204，1988)。后一序列是高度抗原性的并且提供特异性单克隆抗体可逆性结合的表位，使得可能进行表达的重组蛋白的快速测定和有利于纯化。在紧接着Asp-Tyr对之后的残基处牛粘膜肠激酶也特异性裂解该序列。
其他类似物包括干扰素-β融合Fc蛋白或者其生物活性片段，它们的干扰素-β序列与SEQ ID NO2，4，6或8中所示的那些的不同之处在于不破坏分离的蛋白质生物活性的一个或多个保守氨基酸取代或一个或多个非保守氨基酸取代，或者在于缺失或插入。保守取代一般包括用相似性质的一个氨基酸取代另一个氨基酸，例如下组内的取代颉氨酸，丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸和异亮氨酸，颉氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本领域技术人员容易得知其他保守取代。例如，对于丙氨酸，保守取代可以选自D-丙氨酸，甘氨酸，β-丙氨酸，L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的任一个。对于赖氨酸，取代可以是D-赖氨酸，精氨酸，D-精氨酸，高-精氨酸，蛋氨酸，D-蛋氨酸，鸟氨酸或D-鸟氨酸的任一种。一般情况下，预期引起分离的多肽的功能性质变化的取代是那些，其中(i)极性残基取代疏水性残基，例如亮氨酸和异亮氨酸，苯丙氨酸或丙氨酸，(或被疏水性残基取代)；(ii)半胱氨酸残基取代任何其他残基(或被任何其他残基取代)；(iii)带有正电性侧链的残基，例如赖氨酸，精氨酸或组氨酸，取代带有负电性侧链的残基，例如谷氨酸或天冬氨酸(或被带有负电性侧链的残基，例如谷氨酸或天冬氨酸取代)或者(iv)具有大侧链的残基，例如苯丙氨酸，取代不具有这样一个侧链的氨基酸例如甘氨酸(或被不具有这样一个侧链的氨基酸例如甘氨酸取代)。本发明包括分离的分子，它们是等位变体，天然突变体，诱变的突变体，在严格性高或低的条件下与编码例如SEQ ID NO2，4，6或8多肽的核酸杂交的DNA编码的蛋白质。
我们研究出干扰素-β-1a突变体，其是本发明干扰素-β-1a部分的进一步的变体。这些干扰素-β-1a部分可能特别有用，因为它们表现出野生型干扰素-β-1a没有发现的新的性质(参见实施例1)。简要地说，我们带着定位活性和受体结合需要的残基的目的对人干扰素-β-1a进行了诱变分析。可获得人干扰素-β-1a的三维晶体结构(参见Karpusas等，1997，美国国家科学院院刊9411813-11818)，使得我们鉴定了丙氨酸(或丝氨酸)取代，对于干扰素-β受体相互作用可获得的暴露给溶剂的残基，和保留分子内键涉及的氨基酸。我们设计了一组15个丙氨酸扫描突变，其置换沿着干扰素-β-1a的各螺旋(A，B，C，D，E)和环(AB1，AB2，AB3，CD1，CD2，DE1，DE2)的不同区的2和8残基之间。参见实施例1。
哺乳动物细胞表达的突变体(SEQ ID NO2图1)的亲和纯化包括氨基-末端组氨酸标记(“his”标记)。在抗病毒和抗增殖测定中评价这些突变体的功能性结果。研究出非放射性结合测定来分析这些突变体对干扰素-β表面细胞受体(IFNAR1/2细胞表面受体)的结合。另外，应用使用结合干扰素的IFNAR2-胞外域/Fc融合蛋白的以ELISA为基础的测定来对干扰素-β-1a和IFNAR2之间的表面的相互作用制图(参见实施例1)。这些突变分析证明干扰素-β分子的一部分中的N-或C-末端对于受体结合或生物功能是不重要的。
我们鉴定了定向诱变引起的三种类型效果。这些效果在某些情况下对于干扰素药物开发可能是有利的。三种类型的效果如下(a)具有比his-野生型干扰素-β-1a更高的抗病毒活性的突变体(如突变体C1)；(b)在抗病毒和抗增殖测定中都表现出活性，但是与his-野生型干扰素-β-1a相比，抗增殖活性相对抗病毒活性不成正比地低的突变体(例如突变体C1，D和DE1)；和(c)功能拮抗剂(例如A1，B2，CD2和DE1)，与his-野生型干扰素-β-1a相比，相对于受体结合，其表现出抗病毒和抗增殖活性不成正比地低。
此外，只要免疫球蛋白和干扰素-β-1a保持它们各自的活性，通过将这两种分子结合在一起的任何化学反应也可以进行干扰素-β-1a部分(X)和第二非干扰素-β-1a部分Z(例如免疫球蛋白的Fc区)之间的偶联。所述化学键可以包括很多化学机理，例如共价键结合，亲和性结合，嵌入，配位结合和络合作用。在干扰素-β-1a和免疫球蛋白部分之间形成共价结合的有代表性的偶联剂(即通式中的连接体“Y”)可以包括有机化合物，例如硫酯类，碳化二亚酰胺，琥珀酰亚胺酯类，二异氰酸酯，例如甲苯-2，6-二异氰酸酯，谷二醛(gluteraldehydes)，重氮苯和六亚甲基二胺类，例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺，亚氨酸酯类的二功能化衍生物，例如己二酰亚胺酸二甲酯，和双活性氟化合物，例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。所列出的不是穷尽本领域公知的各种种类的化学偶联剂。这些中的很多是可购得的，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸(SPDP)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)；4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(SMPTPierce Chem.Co.，Cat.#21558G)。IV.本发明的应用本发明的融合蛋白可以在称之为干扰素-β治疗的治疗组合物中使用。这些分子具有与融合蛋白，特别是Ig融合物相关的一般的优点；也就是说改变药物代谢动力学和药物动力学导致提高的半寿期和在脉管系统中停留更长时间。此外，尽管结构与干扰素-β-1b相似，但是特别优选的糖基化干扰素-β-1a蛋白质生物活性比非糖基化干扰素-β-1b高很多倍，参见Runkel等，1998，药学研究(Pharm.Res.)15641-649。
发现本发明的产物在保持治疗干扰素-β-1a的半寿期中是有用的，并且可以例如溶解于水或可接受液体介质来制备以用于治疗性给药。给药通过非经肠，气溶胶或口服途径。可以制备细胶体悬浮液用于非经肠给药或者通过口服途径产生贮存效果，同时气溶胶制剂可以是液体或自然干粉剂。在干燥，冻干或溶液制剂中，本发明的干扰素-β-1a应该具有好的贮存稳定性。
本发明的治疗蛋白质可以用于干扰素-β-1a成分对其有效的任何症状或疾病的预防或治疗。另外，本发明的融合蛋白可以在生物系统或样品中成分，症状或疾病状态的诊断中使用，以及用于非生理系统中的诊断目的。
在治疗应用中，本发明涉及治疗患有或者潜在易患有这样的症状或疾病和需要这样的治疗的动物受试者的方法，包括对这样的动物施用有效量的对所述症状或疾病有治疗效果的本发明的融合蛋白。要用本发明的融合物治疗的受试者包括哺乳动物受者并且最优选人受试者。根据要治疗的具体的症状或疾病，可以以任何合适的治疗有效和安全的剂量对动物受试者施用本发明的干扰素-β-1a融合蛋白，这一点本领域技术人员容易确定，不需要进行试验。由于I型干扰素的物种屏障，需要制备如本文所述与来自合适的物种的干扰素的干扰素-融合物蛋白。
干扰素-β-1a的抗细胞增殖活性是公知的。特别地，这里描述的一些干扰素-β-1a融合物对于治疗肿瘤和癌症例如成骨癌，淋巴癌，急性淋巴细胞白血病，乳腺癌，黑色素瘤和鼻腔癌，以及自身免疫疾病例如纤维变性，狼疮和多发性硬化是有用的。此外预期这里描述的融合蛋白特别是一些干扰素-β-1a突变体蛋白表现出的抗病毒活性可以用于治疗病毒疾病，例如ECM感染，流感和其它呼吸道感染，狂犬病和肝炎。也预期这里描述的蛋白质表现出的干扰素-β-1a的免疫调控活性可以用于治疗自身免疫疾病和炎症，例如纤维变性，多发性硬化。干扰素抑制新血管形成(血管生成或新血管生成)的能力是的本发明的蛋白质用来治疗血管原疾病，例如糖尿病性视网膜病，视网膜早熟，macular降解，角膜移植排异，新血管青光眼，晶状体后纤维组织形成，潮红和Osler-Webber综合症。此外，干扰素的抗内皮活性已公知了一段时间并且内皮细胞活性通过抑制肿瘤细胞产生的血管原因子的产生或效果来干扰干扰素作用的一个潜在的机理。一些血管肿瘤，例如血管瘤对于用干扰素治疗特别敏感。用α-干扰素的治疗只报道过治疗这种疾病。希望使用本发明的干扰素-β-1a融合蛋白治疗将在药物代谢动力学和药物动力学方面提供实质性的药学利益，因为该缀合物预期比非缀合的干扰素在血管中保留更长时间，这样导致用作抗血管生成剂的更有效和有效的治疗，参见实施例9。
本发明的聚合物-干扰素-β-1a融合蛋白可以以本身施用以及以药学可接受的酯，盐和其它其生理功能衍生物的形式施用。在这样的药学和药物制剂中，干扰素-β-1a优选与一种或多种药学可接受载体和任选地任何其它治疗成分一起使用。所述载体必须是与制剂的其它成分相容并且对其接受者没有危害意义上的药学可接受。以实现期望的如上所述的药学效果有效量和适合实现期望的日剂量的量提供干扰素-β-1a。
所述制剂包括适合非经肠和经肠给药的那些制剂，具体的给药方式包括口服，直肠，口腔含化，局部，鼻，眼，皮下，肌内，静脉内，经皮，鞘内，关节腔内，动脉内，蛛网膜下，支气管，淋巴管，阴道和子宫内给药。优选适合口服，鼻和非经肠给药的制剂。
当在包括液体溶液的制剂中使用干扰素-β-1a时，所述制剂可以有利地口服或非经肠给药。当在液体悬浮液制剂中或者作为生物相容载体制剂中的粉末剂使用时，所述制剂可以有利地口服，直肠或支气管给药。
当直接以粉末固体形式使用干扰素-β-1a时，干扰素-β-1a可以有利地口服。或者，通过喷雾载体气体中的粉末，形成患者从包括合适的喷雾装置的呼吸循环器吸入的粉末的气体状分散物，鼻或支气管给药。
包括本发明蛋白质的制剂可以方便地以单位剂量存在，并且可以通过制药领域公知的任何方法制备。这样的方法一般包括将活性成分与包括一种或多种辅助成分的载体一起加入的步骤。一般情况下，均匀而密切地将活性成分加入到液体载体，细密分散的固体载体，或者两者中，并且，然后，如果需要，将产品压制成型为期望的制剂的剂量形式。
适合口服给药的本发明制剂可以以离散单位存在，例如胶囊，扁囊剂，片剂或锭剂，它们各自含有预定量的粉末或颗粒状的活性成分；或者在含水液体或非含水液体中的悬浮液，例如糖浆，也西剂，乳化液或饮剂。
片剂可以任选地与一种或多种辅助成分一起压制或模制。通过在合适的机器中压制，活性化合物处于自由流动形式例如粉末或颗粒，其任选地与粘合剂，崩解剂，润滑剂，惰性稀释剂，表面活性剂或排出剂混合。模制的由与合适的载体结合的粉末化聚合物的混合物组成的片剂可以通过在合适的机器中成型来制备。
通过将活性化合物加入到糖例如蔗糖的浓水溶液中，向其中也可以加入任何辅助成分，可以制备糖浆。这样的辅助成分可以包括调味剂，合适的保鲜剂，延迟糖结晶的试剂，和提高任何其它成分的溶解度的试剂，例如多羟基醇，例如甘油或山梨糖醇。
适合非经肠给药的制剂一般包括活性结合物的灭菌含水制剂，其优选与受试者的血液是等张的(例如生理盐水)。这样的制剂也可以包括悬浮剂或增稠剂或者设计将该化合物定向送给血液成分或一个或多个器官的其它微颗粒系统。所述制剂可以以单位剂量或多剂量形式存在。
鼻喷雾制剂包括活性结合物与保鲜剂和等张剂的纯化的水溶液。这样的制剂优选调至与鼻粘膜相容的pH和等张状态。
用于直肠给药的制剂可以以使用合适的载体例如可可脂，氢化脂肪或氢化脂肪羧酸的栓剂存在。
眼用制剂例如滴眼液通过与鼻喷雾剂类似的方法制备，除了优选pH和等张因素以匹配眼的应用。
局部制剂包括溶解或悬浮于一种或多种基质例如矿物油，石油，多羟基醇或用于局部药物制剂的其它基质的本发明结合物。
除上述成分外，本发明的制剂可以另外包括一种或多种辅助成分，选自稀释剂，缓冲剂，调味剂，崩解剂，表面活性剂，增稠剂，润滑剂，保鲜剂(包括抗氧化剂)等等。
因此，本发明涉及提供用于体外稳定溶液中的干扰素-β-1a的合适的融合蛋白，这是非治疗应用的优选的例举说明的应用。本发明融合蛋白可以用于例如提高干扰素-β-1a的对酶降解的抗性，并且提供改进货架寿命，室温稳定性和研究试剂和试剂盒的经久耐用的方法。
提供下面的实施例详细说明本发明，但是不应该认为是本发明的限制。特别地，要明白可以变化这里描述的体内动物实验，这样基础方法的其它修饰和变化是可能的。例如，在实施例7中，本领域技术人员可以使用其它新喋呤测定或者可以改变使用的灵长类的数目和种类。这些对实施例的修饰和改变认为在本发明的精神和范围内。实施例1使用丙氨酸/丝氨酸取代突变的人干扰素-β-1a的结构/活性研究受体结合位点和功能域的分析概述以定位活性和受体结合需要的残基为目的对人干扰素-β-1a(IFN-β-1a)进行大量突变分析。可获得人IFN-β的三维晶体结构(Karpusas，M.等，1997，美国国家科学院院刊9411813-11818)，允许我们鉴定对受体相互作用可得的暴露给溶剂的残基的丙氨酸(或丝氨酸)的取代作用，和保留分子内键中涉及的氨基酸。设计一组15个丙氨酸取代突变，其置换沿着各螺旋(A，B，C，D，E)和环(AB，CD，DE)的不同区的2和8残基之间。对于亲和纯化包括由6个组氨酸残基组成的氨基-末端标记，以及去除氨基-末端延伸的肠激酶连接体序列位点。得到的干扰素称之为“his标记的-干扰素(IFN)-β”或“his6-干扰素-β”等，两者互换使用。
使用野生型IFN-β基因构建体作为诱变的模板构建各种突变体his标记的-IFN-β表达质粒。诱变方法包括首先在野生型his标记的-IFN-β基因中导入独特的限制性酶切位点，然后在用合成的寡核苷酸双螺旋取代选择的限制性酶切位点之间的不同的DNA序列，其编码丙氨酸(或丝氨酸)取代突变。最后，将突变体IFN基因亚克隆到指导哺乳动物细胞在人293肾细胞系中表达的质粒中。
在抗病毒和抗增殖测定中评价这些突变体的功能结果。采用非放射性IFN结合测定来分析在与人Daudi Burkitt’s淋巴瘤细胞的表面受体(“IFNAR1/2复合物”)的结合中的这些突变体。另外，进行定位对his-IFN-β突变体和IFNAR2之间的相互作用表面的分析，其中使用由与人IgG1的铰链区，CH2和CH3区融合的IFN受体蛋白IFNAR2胞外域组成的IFNAR2/Fc融合蛋白。1.产生作为诱变模板的干扰素-β基因我们产生IFN-β丙氨酸(或丝氨酸)取代的突变体的方法是首先产生修饰的IFN-β基因，其编码野生型蛋白质，但是载有散布在基因中的独特的限制性酶切位点。使用独特的位点来交换野生型序列成合成寡核苷酸双螺旋，其编码突变的密码子。为了获得适合产生突变基因的人IFN-β-1a表达盒，通过PCR扩增IFN-βcDNA(GenBank登记号#E00029)。IFN-β基因开始克隆到质粒pMJB107中，为了在没有将通过诱变产生的特异性限制性酶切位点的质粒中完成该基因的定点诱变，需要pACYC184的衍生物(参见Rose等，1988，核酸研究16(1)355)。
用来亚克隆人IFN-β基因的编码序列的PCR引物也让我们在IFN-β基因上游和符合其读框地引入肠激酶连接体序列(5’PCR引物5’TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3’(SEQ ID NO9“BET-021”，和3’PCR引物5’-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3’(SEQ ID NO10“BET-022”)和用于克隆到质粒pMJB107位点中的侧翼限制性酶切位点(BspEI和XhoI)。得到的DNA称之为PCR片段A。
向从pDSW247(片段B)产生的第二DNA片段的最后的构建体引入来自人血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)信号序列和6个组氨酸标记的有效信号序列。质粒pDSW247是pCEP4的衍生物(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其中缺失了EBNA-1基因，并且携带6个组氨酸标记上游并符合其读框地融合的VCAM-1信号序列(VCAMss)。用来产生VCAMss-1/组氨酸标记盒部分的PCR引物是插入了使切割B片段DNA的侧翼限制性酶切位点(NotI和BspEI)的KID-369(5’PCR引物5’-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3’SEQ ID NO11)和KID-421(3’PCR引物5’-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3’SEQ ID NO12)为了产生携带VCAM-1信号序列，his标记和干扰素-β基因的质粒载体，我们进行三路连接，使用来自质粒载体pMJB107(NotI和XhoI裂解的)凝胶纯化的DNA片段，PCR片段A(BspEI和XhoI裂解的)和片段B(NotI和BspEI裂解的)。使用连接的质粒来转化JA221或XL1-Blue大肠杆菌细胞，挑出氨苄青霉素抗性菌落并且通过限制性酶切图谱分析测定插入物。制备最大制备的DNA并且通过DNA测序证实该插入物的序列。得到的构建物称之为pCMG260。2.在pCMG260中创建人干扰素-β的丙氨酸取代的突变体使用质粒pCMG260作为多轮诱变的模板(U.S.E.定点诱变试剂盒(Boehringer-Mannheim))，其将独特的限制性酶切位点引入到沿着IFN-β蛋白质编码序列的位置但是不改变得到的蛋白质的序列。使用诱变的质粒来转化大肠杆菌的JA221或XL1-Blue菌株，并且挑选重组菌落分析氯霉素抗性。通过DNA限制性图谱分析对氯霉素抗性菌落进一步测定期望的独特的限制性酶切位点的存在。证实了得到的IFN-β质粒，pCMG275.8，包含全套的独特的限制性酶切位点和该基因的DNA序列。图1中给出了修饰的his标记的干扰素-β基因的全长DNA序列和野生型蛋白质编码序列。
表1给出了全套丙氨酸取代突变物(下一页)。突变体的名称详细说明了其中引入突变的结构域(螺旋和环状结构)。全套丙氨酸(丝氨酸)取代导致人IFN-β的165个氨基酸的65个氨基酸突变。
通过用合成的寡核苷酸双螺旋置换独特的限制性酶切位点之间的DNA的片段，从pCMG275.8产生一组突变体，其携带表2给出的基因编码信息(见下文)。为了产生各种丙氨酸取代突变物质粒，将凝胶纯化的pCMG275.8载体(用如下面对于每一个IFN-β结构区指出的合适的限制性酶裂解)和寡核苷酸双螺旋(表2中所示编码链序列)连接在一起。使用连接混合物来转化大肠杆菌的JA221菌株，并且挑选重组菌落分析氨苄青霉素抗性。通过筛选合适的限制性酶切位点对氨苄青霉素抗性菌落进一步测定突变的插入的存在。对于两个突变体(A2和CD2)，使用合成的寡核苷酸(如表2所示)的两个双螺旋实施克隆策略，所述合成的寡核苷酸带有互补突出末端使得它们相互连接，并且以三路连接与载体IFN-β骨架连接。下面例举列出了用来克隆表2的突变的寡核苷酸的位点。克隆方案(B小节)给出干扰素-β基因上这些独特的位点的位置。
A螺旋BspEI至MunI或BgIII至PstIAB环状结构 MunI至PstI或MunI至BsaHIB螺旋BspHI至BsaI或BsaHI至BsaIC螺旋BsaI至XbaICD环状结构 XbaI至BspHI或XbaI至DraIIID螺旋BspHI至DraIIIDE环状结构 BspHI至PvuIE螺旋PvuI至BstEII表1HUIFN-β的丙氨酸取代突变的位置 指定IFN-β的线表示野生型人IFN-β序列。对于每一个突变体给出了IFN-β残基的丙氨酸或丝氨酸取代，相关区下的虚线代表野生型序列。螺旋和环状结构表示为突变体下的实线。DE环跨越D和E螺旋向的间隙产生两个另外的丙氨酸取代突变体(H93A，H97A和H121A)，并且在抗病毒分析中分析来评价突变这些组氨酸的效果，其在结晶(crustal)结构二聚体中与锌螯合。这两个突变体在抗病毒测定中保持完全的野生型活性，提示锌介导的二聚体形成对于IFN-β活性不是重要的。
表2A1 SEQ ID CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAAGNO13 CTTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGCBET-053A2 SEQ ID GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGGCNO14 TTGAATACTBET-039SEQ IDNO15 GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCABET-041AB1SEQ ID AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGACATNO16 CCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCABET-080AB2SEQ ID AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCTATNO17 CCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCABET-082AB3SEQ ID AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACANO18BET-084SEQ ID TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGANO19BET-086B1 SEQ ID CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCAGANO20 CAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAABET-110B2 SEQ ID CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCGCTNO21 GCAGCTTCATCTAGCACTGGCTGGAABET-112C1 SEQ ID GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGATAAANO22 CCATCTGAAGACAGTTCTAGBET-114C2 SEQ ID GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATAGC
NO23 ACATCTGGCTGCAGTTCTAGBET-092CD1SEQ ID CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACTNO24BET-094CD2SEQ ID CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGAGCGNO25 CGCTGCACCTGAAAAGABET-096SEQ ID TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACACTGTNO26BET-106D1 SEQ ID CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATACCTNO27 GGCAGCCAAGGAGTACTCACACTGTBET-108DE1SEQ ID CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTNO28 GAAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGATBET-116DE2SEQ ID CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGNO29 AAGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGATBET-118E1 SEQ ID CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAGNO30BET-104B.EBNA293表达质粒的构建凝胶纯化与VCAM-1信号序列，his标记和肠激酶连接体序列融合的野生型和突变体IFN-β基因，得到761个碱基对NotI和BamHI限制性酶切片段。纯化过的基因亚克隆到NotI和BamHI裂解的载体pDSW247中，其是pCEP4的衍生物(Invitrogen，Carlsbad，CA)。质粒pDSW247是用于在人EBNA293肾细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中瞬时表达蛋白质的表达载体。其包含巨细胞病毒早期基因启动子和在该系统中高水平基因表达所需要的EBV调控元件，以及用于大肠杆菌(氨苄青霉素抗性)和EBNA293细胞(潮酶素抗性)的选择性标记物。使用连接的质粒转化JA221或XL1Blue大肠杆菌细胞，并且挑出氨苄青霉素抗性菌落，并且通过限制性酶切图谱分析测定插入物。制备MaxprepDNA，并且通过DNA测序证实插入物的序列。使用表现出期望的诱变序列的阳性菌落转染人EBNA293肾细胞。图12给出了全部克隆和表达方法。C.IFN-β-1a丙氨酸取代突变体的表达和定量测定在补充有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺和250μg/ml遗传霉素(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)的Dulbecco改进的Eagle培养基中保持人EBNA293细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，Chittenden，T(1989)病毒学杂志633016-3025)为分会合培养。使用脂质转染胺方法(Gibco/BRL，LifeTechnologies)将Pdsw247表达质粒瞬时转染到EBNA293细胞中。转染后3-4天收集条件培养基，离心去除细胞碎片，通过ELISA定量测定his-IFN-β浓度。
使用多克隆兔抗体(A蛋白纯化的IgG，产生的用来纯化人IFN-β-1a的抗体)包被96-孔ELISA板，并且使用相同的多克隆兔Ig的生物素化形式作为第二试剂来进行使用链霉抗生物素蛋白连接的辣根过氧化物(HRPJackson ImmunoResearch，W.Grove，PA)进行干扰素检测，来进行ELISA测定。使用一系列IFN-β-1a稀释液(为Biogen，Inc出售的AVONEX)产生标准浓度曲线。在ELISA测定中，将含有来自EBNA转化物的条件培养基的his-IFN-β稀释，获得具有10ng/ml至0.3ng/ml范围浓度的样品。为了证实通过ELISA测定的培养基中的IFN-β的浓度，进行蛋白质印迹分析。在10-20％梯度凝胶上使减少的培养上清液和IFN-β-1a标准物进行SDS-PAGE(NOVEX，San Diego，CA)并且在PDVF膜上印迹。用兔多克隆抗-IFN-β-1a抗血清(#447，BIOGEN，Inc.，产生来抗IFN-β-1a的第二抗血清)来检测免疫反应带，接着用HRP连接的驴抗-兔IgG(Jackson ImmunoResearch，W.Grove，PA)处理。D.评价IFN-β-1a突变体的受体结合使用两种不同的结合测定评价C中描述的IFN-β-1a突变体的受体结合性质。一种测试测定IFN-β突变体对融合蛋白，IFNAR2/Fc的结合，该融合蛋白包括与人IgG的恒定区的部分融合的人IFNAR2受体链的胞外域。在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达IFNAR2-Fc并且通过A蛋白琼脂糖亲和层析纯化，参照生产商的说明(PierceChem.Co.，Rockford，IL，catalog#20334)。在ELISA数控编程测定中测定IFN-β突变体对IFNAR2-Fc的结合。4℃下用50μl/孔的包被缓冲液(50Mm碳酸氢钠，0.2mM氯化镁，0.2mM氯化钙，pH9.6)中10μg/ml的小鼠抗人IgG1单克隆抗体(CDGS-AA9，Biogen，Inc.)包被平底96孔板，来制备ELISA板。用含有0.05％Tween-20的PBS冲洗平板两次，室温下用0.5％脱脂奶粉的PBS溶液封闭1小时。冲洗两次后，向各孔中加入含有0.05％Tween-20的0.5％脱脂奶粉的PBS溶液中的1μg/ml的IFNAR2-Fc 50μl，并且在室温下保温1小时，然后再冲洗平板两次。通过在条件培养基中加入50μl/孔的IFN-β突变体，在补充有10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中系列稀释，并且在4℃下保温2小时，来测定IFN-β突变体与IFNAR2-Fc的结合。IFN-β突变体的稀释液一般在大约1μM至10pM的范围。冲洗后，与平板结合的干扰素-β如下测定加入由1∶1000稀释的兔多克隆抗干扰素抗体(#447，Biogen，Inc.)加辣根过氧化物(HRP)-标记的驴抗-兔IgG(Jackson ImmunoResearch)的混合物50μl/孔，并且在4℃下保温15分钟。冲洗两次后，加入HRP底物，在ELISA平板读数器上在450nm吸光度处读数之前，该平板在4℃下保温。吸光度数据对IFN-β突变体的浓度数据作图通过将数据与简单的双曲线结合等线图相比较，测定IFN-β突变体与IFNAR2-Fc的结合亲和性。图3给出了这些分析的结果，其中以三次实验测定的各突变体的结合亲和性表示为对His6野生型IFN-β-1a测定的亲和性的百分比。
使用第二受体结合测定来测定与表达一起包括IFN-β的受体的两个受体链IFNAR1和IFNAR2的Daudi细胞结合的IFN-β突变体的亲和性。该以FACS为基础的测定使用了定向抗IFNAR1，EA12(Biogen，Inc.，)的胞外域的封闭单克隆抗体，来区别未占据的(自由的)受体和结合了IFN-β的受体。将Daudi细胞(20μl，2.5×107细胞/毫升)置于96孔V-底ELISA平板中，并且与各种浓度的IFN-β突变体(20μl FACS缓冲液；5％FBS，0.1％NaN3的PBS溶液)在4℃下保温1小时。IFN-β突变体期望的系列稀释液范围是0.5μM至0.5pM。向每一个孔加入100ng生物素化的鼠抗IFNAR1单克隆抗体EA12(10μl)，平板在室温下又保温2分钟，然后用FACS缓冲液冲洗两次(4℃)。然后在4℃下细胞和50μl/孔的1∶200稀释的R-藻红蛋白-结合的链霉抗生物素蛋白(HRPJackson ImmunoResearch，W.Grove，PA)保温30分钟，用FACS缓冲液冲洗两次，重新悬浮于300μl的含有0.5％低聚甲醛的FACS缓冲液中，并且转移到12×75mm的聚苯乙烯管中(Falcom2052)。然后通过在FACScan(Becton Dickinson)上通过流式细胞计分析样品。以平均通道荧光强度(MFCI)对IFN-β突变体的浓度将数据作图；结合亲和性定义为给出染色抗体50％抑制作用的IFN-β突变体的浓度。对每一个突变体多次测定。图4表示通过该方法测定的每一种IFN-β突变体的受体结合亲和性，以各项实验中对His6野生型IFN-β-1a测定的亲和性的百分比表示。E.评价IFN-β突变体的功能使用用于IFN-β的抗病毒活性和对抑制细胞增殖的能力的体外测定对IFN-β突变体测定功能活性。对每一个突变体最少进行三次抗病毒测定，每一次有三次重复的数据点。在每次实验中用His6野生型IFN-β-1a作为参照。用两倍稀释的浓度范围在全抗病毒保护和没有病毒细胞杀伤保护浓度之间的范围内的IFN-β突变体处理A549人肺癌细胞(ATCC CCL185)过夜来进行抗病毒测定。第二天，在导致不存在干扰素情况下完全杀伤细胞的稀释度下用脑心肌炎病毒(ECMV)攻击细胞两天。然后用代谢染料MTT(2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基-苯基]-2H-四唑鎓-5-羧酰苯胺)(M-5655，Sigma，St.Louis，MO)处理平板。在PBS中制备5mg/ml MTT的贮存液并且灭菌过滤，将该溶液50μl稀释到细胞培养基中(每孔100μl)。室温下培养30-60分钟后，去除MTT/培养基溶液，用100μl PBS清洗细胞，最后将代谢染料溶解于100μl的90％异丙醇中的1.2N盐酸中。在450nm吸光度下定量测定活细胞(这一点由染料的存在证实)。将吸光度对IFN-β突变体的浓度作图分析，各突变体的活性定义为50％的细胞被杀死的浓度。图5给出各项实验中以对His标记的-野生型IFN-β-1a测定的活性的百分比表示的每一个突变体的活性。
也在抗增殖测定中对IFN-β突变体测定了功能。以2×105细胞/毫升在补充有10％确定的胎牛血清(Hyclone，Logan Utah)和2mM L谷氨酰胺的RPMI1620中接种人Daudi Burkitt’s淋巴瘤细胞(ATCC#CCL213)。每个孔中也含有给定浓度的IFN-β突变体，每孔中培养基的最终体积为100μl；选择使用的IFN-β浓度，分布于Daudi细胞增殖最大抑制至没有抑制作用(即全增殖)。对于试验的每一个IFN-β突变体浓度使用两次试验点，所有的实验中包括两套未处理的细胞。在5％CO2保温箱中在37℃下将细胞保温2天，然后向各孔加入50μl培养基中的氚化胸苷((甲基-3H)胸苷，AmershamTRK758)1μCi/孔，并且又保温4小时。使用LKB平板收集器收集细胞，使用LKBβ平板读数器测定氚化胸苷的插入。平均两次实验值并且测定标准偏差。将每分钟平均数量对IFN-β突变体的浓度作图分析，各突变体的活性定义为给出最大生长抑制的50％的需要的浓度。对每一个突变体进行多次实验。图6给出各项实验中以对His标记的-野生型IFN-β-1a测定的活性的百分比表示的结果。F.IFN-β突变体的性质发现His标记的-野生型IFN-β-1a在抗病毒和抗增殖测定中的活性比对于未标记的野生型IFN-β-1a发现的相应活性都低大约3倍。由于所有的IFN-β突变体A1-E都在他们的N-末端包含相同的his标记序列，因此通过在抗病毒，抗增殖和结合测定中将这些突变体的活性与His标记的-野生型IFN-β-1a的活性相比较来测定突变对分子性质的影响。在这样做的过程中，我们假设，与His标记的-野生型IFN-β-1a相比，突变体A1-E的活性变化大约和不存在N-末端his标记的这些相同的突变体的效果在定性和定量上相同。丙氨酸扫描诱变技术的操作者对其它可溶性细胞因子标记的或融合构建体的等价假设一般认同，特别是在标记的或融合构建体的体外功能活性接近野生型细胞因子的情况下，本申请就是如此。参见，例如，Pearce K.H.Jr等，生物化学杂志27220595-20602(1997)和JonesJ.T.等，生物化学杂志27311667-11674(1998)。
图3-6所示数据表明定向诱变引起三种类型的效果。在某些情况下这些效果对于干扰素药物开发是有利的。这三种类型的效果如下(a)抗病毒活性比野生型IFN-β-1a高的突变体(例如突变体C1)；(b)在抗病毒测定和抗增殖测定中都表现出活性，但是与野生型IFN-β-1a相比，抗增殖活性相对于抗病毒活性不相称地降低(例如突变体C1，D和DE1)；和(c)功能拮抗剂(例如A1，B2，CD2和DE1)，与野生型IFN-β-1a相比，其表现出就受体结合来说抗病毒和抗增殖活性不相称地降低。可以看到一些突变体落在一类以上中。下面总结了这些类。我们参照列出的那些实施例鉴定了这些类的突变体，但是应该明白这些区的其它突变体可以导致对活性的相似的甚至是增强的效果a)突变体C1具有比野生型his标记的IFN-β-1a高大约6倍的抗病毒活性。预计该突变体和该类型的其它突变体在减少实现给定水平的抗病毒效果中必须施用的IFN-β的量中是有用的。减低施用的蛋白质的量预期会降低该蛋白质的免疫原性并且也可以减少来自不是以机械为基础的毒性的副作用。该类中的突变体预计在其中其抗病毒效果产生施用IFN-β的治疗利益和其中抗增殖效果带来毒性或不期望的副作用的情况下是有益的。b)在图7中比较了抗病毒和抗增殖测定中丙氨酸取代突变体的相对活性(％野生型)。在大多数突变体(对角线上的那些)中见到协调变化的活性(即与来自野生型his标记的IFN-β-1a的活性的以相同倍数不同的抗病毒和抗增殖活性)。但是，与野生型his标记的IFN-β-1a相比，相对于其它的；一个测定中，几个突变体表现出活性更大的变化，这一点通过从从对角线移位证实。下面表中给出了三种这样的突变体。突变体C1表现出比野生型his标记的IFN-β-1a高大约6倍的抗病毒活性，但是在抗增殖测定中，其活性类似于野生型。因此突变体C1相对于野生型his标记的IFN-β-1a具有比其抗增殖活性增强5.2倍的抗病毒活性。类似地，突变体D在抗病毒测定中表现出野生型活性的65％，但是在抗增殖测定中只表现出野生型活性的20％，因此与野生型相比，具有比其抗增殖活性增强3.4倍的抗病毒活性。突变体DE1在抗病毒测定中表现出野生型活性的26％，但是在抗增殖测定中只表现出野生型活性的8.5％，因此与野生型his标记的IFN-β-1a相比，具有比其抗增殖活性增强3.0倍的抗病毒活性。当以足以实现期望水平抗病毒活性的浓度下施用时，这些突变蛋白表现出比野生型蛋白大大降低的抗增殖活性。在这类中，突变体和(a)类一样，预计在其中其抗病毒效果产生施用IFN-β的治疗利益和其中抗增殖效果带来毒性或不期望的副作用的情况下是有益的。
(c)与野生型his标记的IFN-β-1a相比，具有相对于受体结合低的抗病毒和抗增殖活性的突变体(见下面的表)。突变体A1表现出比野生型his标记的IFN-β-1a观察到的活性高2.0倍和1.8倍的抗病毒和抗增殖活性，但是结合Daudi细胞上相关受体的亲和性比野生型高29倍。因此，与该蛋白质的抗病毒和抗增殖活性相比，该突变体与IFN-β受体结合增强大约15倍。类似地，突变体B2，CD2和DE1表现出分别超过抗病毒活性4.6-，4.6-和18倍，和超过抗增殖活性3.5-，15-和54倍的结合增强效果。预计这些蛋白质作为内源IFN-β和可能地，其他内源I型干扰素的活性的功能拮抗剂是有用的，因为它们具有结合和占据该受体的能力，从而在靶细胞中只产生小部分的用野生型IFN-β所见的功能反应。
G.突变蛋白与干扰素三维结构的相关性公开的非糖基化形式的鼠IFN-β的晶体结构(T.Senda，S Saitoh和Y.Mitsui，2.15埃分辨率下确定的重组鼠干扰素-β的晶体结构，分子生物学253187-207(1995))和人α--2b干扰素的晶体结构(R.Radhakrishnan，L.J.Walter，A.Hruza，P.Reichert，P.Ptrotta，T.L.Nagabhushan和M.R.Walter，通过X射线结晶学揭示人α--2b干扰素的锌介导的二聚体)为人IFN-β的多肽骨架提供了模型，我们最近研究出糖基化状态的干扰素-β-1a的结构(M.Karpusas，M.Nolte，C.B.Benton，W.Meier，W.N.Lipscomb和S.Egoelz，2.2埃分辨率下人IFN-β的晶体结构，美国国家科学院院刊9411813-11818(1997))。
关于干扰素-β-1a的三维结构可以总结出我们突变研究的结果(这里没有给出)。一些突变残基产生活性降低(降低2至大于5倍)。突变区相应于表1和2给出的取代。
其效果对功能最明显的突变体导致活性和细胞表面受体结合的大的降低。该区(A2螺旋，AB和AB2环状结构和E螺旋)中的突变相应于IFNAR2结合位点中的突变，因为我们的测定中这些突变体没有一个结合IFNAR/Fc。
尽管对于IFNAR2结合重要的那些突变体也影响细胞结合，但是细胞表面结合性质也受分子的其他区(B1螺旋，C2螺旋)中的残基的影响。在描述丙氨酸取代的效果的三维模型(没有给出)中可以看到干扰素-β-1a分子的N-末端，C-末端和糖基化C螺旋区不在受体结合位点内。这些区中的突变不降低生物活性或降低细胞表面受体结合。实施例2用于表达干扰素-β-1a融合(IFN-β/Fc)蛋白的质粒的构建应用PCR技术产生编码与鼠IgG2a重链分子Fc部分融合的人IFN-βDNA序列的表达质粒。该质粒载体pDSW247(见实施例1)是其中缺失EBNA-1基因的pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)的一种衍生物。使用该质粒构建用于在EBNA293人肾细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA.，Shen.E.S.，等，1995，Gene156，235-239)中的瞬时蛋白质表达的表达载体的构建。将其设计为包含符合干扰素-β序列的读框和在其上游的人血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)，和在干扰素-β和Ig序列的连接处的肠激酶连接体序列。
从几个DNA片段组装该融合蛋白表达盒。为了获得编码人IFN-β基因的DNA片段，使用人IFN-β的cDNA亚克隆(GenBank登记号#E00029)作为PCR的模板，使用引物(5’GGTGGTCTCACATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC(SEQ IDNO31“BET-025”)和5’-GCCCTCGAGTCGACCTTGTCATCATCGTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG(SEQID NO32“BET-026”)其也在IFN-β的第一密码子上游插入一个限制性酶切位点(BsaI)。用于IFN-β基因的3’PCR引物(SEQ ID NO32BET-026)消除了IFN-β终止密码子，并且插入了符合读框的肠激酶连接体序列(DDDDK)和终止限制性酶切位点(XhoI)，用于亚克隆到表达载体中。IFN-β编码序列上游引入BsaI位点使我们将VCAM-1信号序列连接到IFN-β编码序列上游并符合其读框。该VCAM-1信号序列也通过PCR产生，使用引物对5’-CAAGCTTGCTAGCGGCCGCGG-3’(SEQ ID NO33“BET-023”和5’-GGTGGTCTCACATGGCTTGAGAAGCTGC-3’(SEQ ID NO34“BET-024”)其包含5’限制性酶切位点(NotI，用于连接到pDSW247 NotI克隆位点上)和3’限制性酶切位点(BsaI，用于连接到IFN-β-1a5’PCR片段上)。PCR的模板是是人血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)cDNA(GenBank登记号X53051)。
为了产生干扰素-β-1a/Fc融合基因进行下面的程序。通过SalI＋BamHI消化DNA片段凝胶纯化而从pEAG293去除鼠IgG2a片段。质粒pEAG293是鼠IgG2a的铰链区，CH2和CH3区的BluescriptIISK＋(Stratagene，LaJolla CA，catalogue#212205)亚克隆(GenBank登记号V00798)。PCR引物对5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCW-3’(SEQ ID NO35)，其中S＝C或G，M＝A或C，R＝A或G，W＝A或T，和5’-CTGAGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTT-3’(SEQ ID NO36)分别在该盒的5’和3’末端产生侧翼SalI和NotI位点。鼠IgG2a Fc区盒与GenBank序列不同之处在于单一碱基(V369密码子)，产生一个沉默突变。因此，从该IgG2a Fc区盒表达野生型Fc蛋白。
通过NotI至BamHI消化从pCMG258切割包含与携带C-末端肠激酶连接体序列的人IFN-β基因融合的VCAM-1信号序列的DNA片段并且凝胶纯化。SalI位点存在于原始pDSW247质粒上，并且紧接着位于IFN-β基因编码序列的下游和并符合其读框。质粒载体pDSW247制备为凝胶纯化的NotI＋BamHI片段(见实施例1)。使用上述片段进行三路连接，组装最后的表达干扰素-β-1a/IgG2a融合物的表达载体。该表达质粒称之为pCMG261并且在携带成熟人IFN-β基因的融合物中包含VCAM-1信号序列，肠激酶连接体序列和鼠IgG2a Fc区。图2给出该融合蛋白的全长DNA(SEQ ID NO1)和蛋白质序列(SEQ ID NO2)。实施例3在哺乳动物细胞中产生干扰素-β-1a融合蛋白将重组IFN-β/Fc表达载体，pCMG261，瞬时转染到人EBNA293肾细胞中实现本发明干扰素-β-1a融合蛋白的表达。根据生产商的方法(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD，Hawley-Nelson，P.，Ciccarone，V.，Gebeyehu，G.Jesse，J.，Felgner，P.L.(1993)Focus15.73)，对于100mmEBNA293细胞培养皿使用1-3毫克质粒DNA，在EBNA283人肾细胞中，通过脂质转染胺方法(catalogue#18324-020，Life Technologies)转染该重组表达质粒。在细胞脂质转染转染后第二天，用培养基(Dulbecco改进的Eagle培养基，10％胎牛血清，4mM谷氨酰胺，250μg/ml的遗传霉素(Life Technologies，Gaithersburg，MD))代替原培养基。3-4天后收获条件培养基并且如下所述测定IFN-β-1a-Fc的浓度。
通过将融合蛋白的蛋白编码区转移到用于这些系统的合适的表达载体中也可以进行在其他哺乳动物细胞和原核生物表达系统中制备IFN-β/Fc融合蛋白。可选择的表达系统包括哺乳动物细胞表达系统，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Barsoum，J.(1995，分子生物学方法48，18章，225-237)和NS-O鼠细胞(Rossman，C.等，1996，蛋白质表达和纯化7，335-342)，和COS7绿猴肾细胞(Ettinger，R.等，1996，美国国家科学院院刊9323，13102-13107)。可以使用的其他真核生物表达系统是酵母巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(Eldin，P.E.等，1997，免疫学方法杂志201，67-75)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Horwitz，A.H.，1988，美国国家科学院院刊85，8678-8682)。
使用A蛋白纯化的兔抗-IFN-β-1a多克隆抗体的IgG级份(抗原是纯化的IFN-β-1a，Biogen，Inc.)包被96孔板，通过ELISA进行在来自转染的EBNA293细胞的培养上清液中IFN-β-1a-Fc蛋白表达水平的定量测定。该抗体检测IFN-β-1a标准物和浓度范围在10ng/ml和0.3ng/ml之间的干扰素中培养上清液。使用生物素化兔多克隆抗IFN-β-1a(和上面一样的抗体)和链霉抗生物素蛋白辣根过氧化物来检测结合的干扰素。为了证实ELISA值，进行蛋白质印迹分析，其中在5-20％Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)上进行还原的培养上清液和IFN-β-1a标准物的分析，转移到PVDF膜(Amersham LifeScience，Inc.，Cleveland，OH)并且用不同的兔多克隆血清(来抗IFN-β-1a)检测，接着用辣根过氧化物连接的驴抗-兔IgG(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)抗体检测。实施例4IFN-β-1a/鼠IgG2a融合蛋白的抗病毒活性在用脑心肌炎病毒(EMCV)攻击之前用IFN-β-1a或鼠IFN-βIgG2a(61，41，27，18，12，8.2，5.5，3.7，2.5，1.6pg/ml)预处理人肺癌细胞(A549)24小时。与病毒保温2天后，以XTTPMS溶液(分别在磷酸缓冲盐水中以333μg/ml和2ng/ml，的2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鎓-5-羧酰苯胺内盐Phenazine methosulfate)并且通过光谱学在450nM处检测。对于每一个IFN浓度使用三次重复数据点进行分析。
图8在误差框中给出了标准偏差。测定IFN-β-1a的50％致细胞病变效应大约是0.4pM。对IFN-β-鼠IgG2a的50％致细胞病变效应是0.15pM。实施例5人IFN-β-1a/人IgG1 Fc融合蛋白的构建和制备A.人IFN-β-1a/人IgG1 Fc融合蛋白的构建应用PCR技术产生编码与人IgG1重链分子Fc部分(铰链区，CH2和CH3区)融合的人IFN-β DNA序列的表达质粒。
EBNA构建物该质粒载体pCH269是其中缺失EBNA-1基因的pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)的一种衍生物。使用该质粒构建用于在EBNA293人肾细胞中的瞬时蛋白质表达的表达载体的构建(Invitrogen，Carlsbad，CA.，Shen.E.S.，等，1995，Gene156，235-239)。
从三个DNA片段组装该融合蛋白表达盒符合读框并且与编码人IFN-β的序列融合的编码VCAM-1信号序列NotI/SalI片段，编码人IgG1的铰链区，CH2和CH3区的SalI/NotI片段，和EBNA表达载体pCH269的NotI片段。
通过PCR技术制备符合读框中并且与人IFN-β基因融合的两种不同的编码成熟VCAM-1信号序列的NotI/SalI片段。PCR的模板是质粒pCMG258(见上面实施例2)，其编码符合读框并且与人IFN-β基因融合的成熟VCAM-1信号序列，其本身符合读框内并且与肠激酶连接体序列融合。使用两套PCR引物。一套是引物(5’-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3’(SEQ ID NO37)，和5’-ATACGCGTCGACGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3’(SEQ ID NO38))其在位置162引入氨基酸变化，由G变为C。该片段称之为人IFN-β-C162。
第二套引物是(5’-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3’(SEQID NO39)，和5’-TACACGTCGACGCTGCCACCACCGCCGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3’SEQ ID NO40))其也引入G162至C162氨基酸取代，并且将肠激酶连接体序列(DDDDK)改变为GGGGS接头序列，其符合读框并且在3’端融合到人IFN-β基因。该片段称之为人IFN-β-C162/G4S。两套引物都包含使连接到pCH269中的5’NotI位点和使与人IgG1的SalI/NotI片段连接的3’SalI裂解位点。
通过将质粒SAB144(如美国专利5547853所述)的衍生物质粒pEAG409限制性酶(SalI/NotI)消化来制备编码人IgG1的铰链区，CH2和CH3区的人IgG1片段。将该片段切割并凝胶纯化。用NotI消化EBNA表达载体质粒pCH269并且凝胶纯化。
通过两个三路连接产生两个人IFN-β-人IgG1 Fc融合构建体。一个构建体称之为ZL6206，包含G4S连接体；另一个构建体称之为ZL5107，是直接的融合物。SEQ ID NO41和SEQ ID NO42分别给出了直接融合物的开放读框的全长DNA和蛋白质序列(见图10)。SEQ ID NO43和SEQ ID NO44分别给出了连接体融合物的开放读框的全长DNA和蛋白质序列(见图11)。CHO构建体制备人IFN-β-人IgG1 Fc融合CHO稳定表达构建体，其由直接连接人IgG1 Fc的人IFN-β组成。用NotI从质粒ZL5107切割人IFN-β-人IgG1 Fc片段并且凝胶纯化；其连接到pEAG347的NotI位点(一种包含串联SV40早期和腺病毒主要晚期启动子的表达载体[从pAD2β质粒衍生]，一种独特的NotI克隆位点，接着是SV40晚期转录终止和polyA信号[从pCMVβ质粒衍生]。pEAG347包含pUC19-衍生的质粒骨架和pSV2dhfr-衍生的dhfr，用于MTX选择和在转染的CHO细胞中扩增)。B.在哺乳动物细胞中产生人IFN-β-1a/人IgG1 Fc融合蛋白将人IFN-β融合构建体瞬时转染到EBNA293细胞中将上述重组IFN-β/人IgG1 Fc表达载体瞬时转染到人EBNA293肾细胞中实现本发明IFN-β-1a融合蛋白的表达。根据上面实施例3描述的方法通过脂质转染胺方法(catalogue#18324-020，LifeTechnologies)将这些重组表达质粒在EBNA293人肾细胞中转染。人IFN-β-1a/人IgG1 Fc融合构建体(没有连接体)稳定转染到dhfr-CHO细胞中将包含上述表达载体的重组IFN-β/人IgG1 Fc(没有连接体)dhfr稳定转染到dhfr-CHO细胞中实现本发明IFN-β-1a融合蛋白的表达。通过电穿孔转染该重组表达质粒并且根据下面方法完成对阳性克隆的选择用BglII消化的质粒DNA(20mcg)被沉淀，重新悬浮于800mc1HEPES缓冲液中并且加入到10×107CHO细胞/毫升。电穿孔后，在DMEM完全培养基中培养细胞2天。然后用完全DMEM/透析的10％FBS将细胞分裂到20-40个10cm培养皿中并且培养5天，然后用递增(50-200ng/ml)浓度的MTX的DMEM溶液将细胞移至选择培养基中培养2星期。2星期后，选择细胞的单一菌落并且扩展。在抗病毒测定中测试来自22个CHO克隆的上清液。
活性如实施例4所述在CPE测定中测定所述融合蛋白的抗病毒活性。以测试中使用的IFN-β-1a标准物的60MU/mg比活性为基础，瞬时(EBNA)表达的带有连接体的人IFN-β-1a/人IgG1 Fc融合蛋白的活性是900U/ml，没有连接体的活性是440U/ml。 CHO表达的人IFN-β-1a/人IgG1 Fc融合蛋白活性是50U/ml。实施例6测定用IFN-β-1a和IFN-β-1a/鼠IgG2a融合蛋白处理的小鼠血浆中IFN-β-1a抗病毒活性用50000单位的IFN-β-1a(大量)或5000单位的IFN-β-1a-鼠IgG2a融合蛋白通过尾静脉对小鼠(C57/B16)静脉内注射。使用等体积磷酸缓冲液作为对照。
注射IFN-β后，在不同时间点(立刻，0.25，1，4，24和48小时)眶后取血取样。每个时间点至少有3只小鼠。在含有抗凝剂的试管中收集全血，去除细胞，并且在测定之前冷冻得到的血浆。在没有血清的测定培养基中将血浆样品稀释1∶10倍并且通过0.2μm针式过滤器。
然后将稀释的样品滴定到指定的含有A549细胞的96孔组织培养板的孔中在每一个平板上加入标准IFN-β-1a(10，6.7，4.4，2.9，1.3，0.9和0.6U/ml的AVONEX)和4个样品。在用EMC病毒攻击之前用样品预处理细胞24小时。与病毒培养2天后成活细胞用MTT溶液染色(5mg/ml磷酸缓冲液)1小时，用磷酸缓冲液洗涤，用1.2N HCl异丙醇溶液增溶。在450nm处对各孔读数。对于每一个平板产生标准曲线，并且用来测定各样品中IFN-β-1a活性的量。图9中，对时间点将来自不同小鼠的样品的活性作图。
作为时间函数的来自循环的IFN-β-1a融合物的较慢减少表明融合蛋白样品的半寿期比没有修饰的IFN-β-1a对照物长得多。这些研究的第二个非常显著的发现是在分布期几乎没有融合蛋白减少，15和60分钟时间点的相似高活性水平证实这一点。数据表明，和对照IFN-β-1a不一样，IFN-β-1a融合蛋白的分布大部分局限于血管系统。实施例7在灵长类中比较药物代谢动力学和药物动力学使用IFN-β-1a融合物和天然IFN-β-1a(作为100mM磷酸钠，200mM氯化钠，pH7.2中的没配制的大量中间体AVONEXIFN-β-1a)进行比较研究，来测定它们在灵长类中的相对稳定性和活性。在这些研究中，在灵长类中将IFN-β-1a融合物的药物代谢动力学和药物动力学与天然IFN-β-1a的相比较，合理的推论可以扩展到人类。动物和方法研究设计这是平行组，重复剂量研究，来评价IFN-β-1a融合蛋白和非融合IFN-β-1a的比较药物代谢动力学和药物动力学。
这项研究使用健康的灵长类动物(优选猕猴)。在给药之前，在试验物质给药之前，在14天内以2个时刻由实验动物兽医评价所有动物的疾病健康的状况；一次评价必须在第一次试验物质给药之前24小时。只有健康动物接受试验物质。评价包括一般身体检查和预先量抽出血液用于基础临床病理学和对IFN-β-1a基础抗体水平的测定。对所有的动物称重并且在试验关节给药之前24小时内记录体温。
收12个受试者并分成三组，接受1MU/kg的融合的或没有融合的IFN-β-1a，然而在别的方面却接受相同的IFN-β-1a。皮下(SC)或静脉内(IV)途径给药。6只雄性动物通过IV途径接受试验物质给药(3/处理)，另外的6只雄性动物通过IV途径接受试验物质给药(3/处理)。所有的动物必须是首次用IFN-β-1a处理。每一只动物两次给药；给药间隔4星期。剂量体积是1.0ml/kg。
在每一次注射之后0，0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24，48，72和96小时抽血测定药物动力学。在给予研究药物之后0，24，48，72，96，168，336，504，小时后抽取血样用于干扰素诱导的生物反应标记物的测定。
研究期间的评价包括临床观察给药后30分钟和1小时的毒性反应。进行全天候观察，并且记录一般表现，毒性症状，不舒服和行为变化。在给药后21天内以一定时间间隔记录体重和体温。测定方法应用致细胞病变效应(CPE)生物测定定量测定血清中干扰素-β水平。CPE测试测定干扰素介导的抗病毒活性的水平。样品中抗病毒活性水平反映在抽血的那个时间样品中含有的活性干扰素的分子的数目。该方法是评价干扰素-β药物动力学的标准方法。常规研究中使用的CPE测试测定干扰素-β保护人肺癌细胞(A549，#CCL-185，ATCC，Rockville，MD)免受脑心肌炎(EMC)病毒带来的细胞毒性。细胞与血清样品预培养15-20小时，使得诱导和合成干扰素可诱导的蛋白质，其然后引发抗病毒反应。然后加入EMC病毒并且再培养30小时，然后使用结晶紫染色评价细胞毒性。用每一个测试平板上的样品同时测定干扰素-β内标和干扰素-β-Ig内标。将该标准值用天然人成纤维细胞干扰素参照标准物(WHO干扰素第二国际标准物，人成纤维细胞，Gb-23-902-53)校正。每一个测试平板也包括既不含有任何类型的干扰素-β也不合EMC的细胞生长对照孔，含有细胞和EMC但是不含干扰素-β的病毒对照孔。也制备了含有标准物和样品的对照平板来测定，如果有的话，样品对细胞生长的影响。将这些平板染色，而没有加入病毒。
在两份重复的测试平板的每一个上双份测试样品和标准物，对于每一个样品得到4个数据。报道4次重复的几何平均浓度。该项测试中，测定极限是10单位(U)/ml。
应用商业上可得的测试以临床药理学单位测定新蝶呤的血清浓度。药物动力学和统计学方法使用RstripTM软件(MicroMath，Inc.，Salt Lake City，UT)在药物动力学模型上拟合数据。对于每一组以几何平均浓度对时间作图。因为测定结果以稀释度表示，所以认为几何平均值比算术平均值更合适。对于基础值调节血清干扰素水平，并且将非可检测浓度血清浓度设置为5U/ml，其代表检测下限的一半。
对于静脉内输液数据，应用两室静脉内输注模型检测每一个受试者的血清浓度，并且用两室注射模型处理SC数据。
计算下面的药物动力学参数(i)观察到的峰浓度，Cmax(U/ml)；(ii)0-48小时的曲线下的面积，使用梯形规则的AUC；(iii)消除半寿期；和，来自静脉内输注的数据(如果使用静脉内)(iv)分布半寿期(h)；(v)清除率(ml/h)；(vi)分布的表观容积，Vd(L)。
使用WinNonlin(1.0版本，Scientific Consulting Inc.，Apex，NC)软件计算SC和IM注射后消除半寿期。
对于新蝶呤，对于每一组给出了时间算术平均值。计算Emax，自基础线的最大变化。对Cmax，AUC和Emax进行单向方差分析，来比较给药组。在分析之前，对Cmax和AUC进行对数转换；报道几何平均值。实施例8干扰素-β-1a融合物的抗-血管生成作用体外评价干扰素-β-1a融合物抑制内皮细胞增殖的能力使用CS-C Medium试剂盒(Cell Systems，Cat.#4Z0-500)在培养基中保持人静脉内皮细胞(Cell Systems，Cat.#2VO-P75)和人皮肤微血管内皮细胞(Cell Systems，Cat.#2M1-C25)。实验之前24小时，将细胞胰酶消化，并且重新悬浮于测试培养基，90％M199和10％胎牛血清(FBS)中，并且调节到期望的细胞密度。然后将细胞放置于凝胶包被的24孔或96孔平板上，分别是12500细胞/孔或2000细胞/孔。
过夜培养之后，用含有20ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(Becton Dickinson，Cat#40060)和各种浓度的融合的或非融合的干扰素-β-1a蛋白质或正对照(endostatin可以用作正对照，可以是抗bFGF的抗体)的新鲜培养基置换测试培养基。在24孔平板中将最终浓度调节到0.5ml，或在96孔平板中将最终浓度调节到0.2ml。
22小时后，将细胞胰酶消化，用Coulter计数，冷冻用于CyQuant荧光读数，或者用[3H]胸苷标记。
该项体外测试试验了本发明的人干扰素-β-1a分子对内皮细胞增殖的影响，其可能是体内抗血管生成效果的指征。参见O’Reilly，M.S.，T.Boehm，Y.Shing，N.Fukal，G.Vasios，W.Lane，E.Flynn，J.Birkhead，B.Olsen，和J.Folkman，(1997)，血管生成和肿瘤生长的内源抑制剂，细胞(cell)88，277-285。实施例9测定干扰素-β-la/Ig融合物的抗-血管生成和新血管生成效果的体内模型开发出了各种各样的模型来测定本文描述的分子的抗-血管生成和新血管生成效果。这些模型中的一些描述于美国专利5733876(1998年3月31日“抑制血管生成的方法”)和5135919(1992年8月4日“抑制血管生成的方法和药物组合物”)。其他测试包括S.Taylor和J.Folkman自然，297，307(1982)和R.Crum，S.Szabo和J.Folkman科学，230，1375(1985)的无壳尿囊绒膜(CAM)测试；Folkman.J等；实验药物杂志(J Exp.Med.)，133，275(1971)的小鼠背侧气囊方法和Gimbrone，M.A.Jr.等，J.Natl.Cancer Inst，52，413(1974)的大鼠角膜微囊测试，其中通过在各角膜中移植浸渗在EVA(乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)小球中的500ng的碱性的FGF(牛，R&D Systems，Inc.)在Sprague-Dawley品系(Charles River，日本)雄性成年大鼠中诱导角膜血管生成。
测试干扰素-β-1a/Ig融合物在动物模型中抗血管生成效果的其他方法包括(但不限于)在下面文献中描述的筛选新的潜在的抗癌药物的方法最初的癌症化疗报告，第3部分，第3卷，No.2，1972年9月和体内癌症模型增刊，1976-1982，NIH，公开号84-2635，1984年2月。因为I型干扰素的物种屏障，为了评价啮齿类动物模型中干扰素-β融合物的抗血管生成活性，制备啮齿类动物干扰素-β/Ig融合物制剂。通过测定鼠干扰素-β/Ig融合物对皮下移植的Lewis肺癌的抗血管生成效果的方法举例说明这样的筛选方法。肿瘤系来源1951年自发产生的C57BL/6小鼠中肺癌。试验方法概述将肿瘤块皮下移植到B6D2F1小鼠的腋区。肿瘤移植后许多天以不同的剂量皮下(SC)或腹膜内(IP)施用试验物质(即本发明的融合蛋白)。测定的参数是存活时间中值。结果表示为对照存活时间的百分比。动物繁殖C57BL/6小鼠。试验B6D2F1小鼠。体重小鼠应该在3gm重量范围内，雄性最轻体重为18gm，雌性最轻体重为17gm。性别在一个实验中对所有的试验和对照动物使用一种性别。来源如果适宜，在一个实验中使用一个来源。实验规模每个实验小组有10个动物。肿瘤转移增殖块制备2-4mm s.c.供者肿瘤块。时间13-15天位点在腋区皮下移植该切片，在腹股沟区穿刺。试验块制备2-4mm s.c.供者肿瘤块。时间13-15天位点在腋区皮下移植该切片，在腹股沟区穿刺。试验方案第0天移植肿瘤，进行细菌培养。在每一个奇数编号的实验中试验正对照化合物。制备材料。每天记录死亡情况。第1天检查培养物。如果污染则放弃实验。使动物随机化。根据指示处理(在第1天和下面几天)。第2天再检查培养物。如果污染则放弃实验。第5天称重日2和最初评价试验物质毒性的一天。第14天对照物早期死亡的一天。第48天不再存在对照物的一天。第60天结束并评价实验。粗略对肺检查肿瘤情况。质量控制在每一个奇数编号的实验中，试验正对照化合物(NSC26271(环磷酰胺，剂量为100mg/kg/注射))，给药方案是只是在第一天腹膜内给药。正对照的试验/对照下限是140％。可接受的未处理的对照存活时间的中值是19-35.6天。评价测定的参数是存活时间中值，第1天和第5天计算的平均动物体重，对所有的试验小组使用计算试验/对照比。计算进行期每一天和最后评价的那一天平均动物体重。对第5天存活者多于65％的所有的试验小组计算试验/对照比。试验/对照比值小于86％指示有毒性。在评价毒性中也可以使用体重变化过度差异的动物(试验减去对照)。
活性标准认为大于或等于140％的初始的试验/对照比对于证明中等活性是必需的。可重复获得的大于或等于150％的试验/对照比值认为有明显活性。
权利要求
1.一种具有氨基酸序列X-Y-Z的分离的多肽，其中X是具有包括糖基化干扰素-β的氨基酸序列的氨基酸序列，或者其部分的多肽；Y是任选的连接体部分；和Z是包括除了糖基化干扰素-β之外的多肽的至少一部分的多肽。
2.权利要求1的分离的多肽，其中X是干扰素-β-1a。
3.权利要求1的分离的多肽，其中X是具有至少一种下面性质的突变体(a)该突变体具有比野生型干扰素-β-1a高的抗病毒活性，其中通过病毒诱导的细胞裂解来测定抗病毒活性；(b)相对于野生型干扰素-β-1a，该突变体具有比抗增殖活性更大的抗病毒活性；(c)该突变体结合干扰素受体，但是当与野生型干扰素-β-1a相比时，相对于其受体结合活性，具有减低的抗病毒活性和减低的抗增殖活性。
4.权利要求2的分离的多肽，其中干扰素-β-1a是衍生化的。
5.权利要求4的分离的多肽，其中衍生物是聚烷基二醇聚合物。
6.权利要求1的分离的多肽，其中Z是免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
7.权利要求6的分离的多肽，其中所述恒定区的至少一部分衍生自选自IgM，IgG，IgD，IgA和IgE类的免疫球蛋白。
8.权利要求7的分离的多肽，其中所述类是IgG。
9.权利要求6的分离的多肽，其中所述恒定区的至少一部分至少包括铰链，CH2和CH3区。
10.具有由糖基化干扰素-β的氨基酸序列或其部分组成的氨基末端区并且具有包括除了糖基化干扰素-β之外的蛋白质的至少一部分的羧基末端区的融合蛋白。
11.权利要求10的分离的蛋白质，其中X是干扰素-β-1a。
12.权利要求10的分离的蛋白质，其中X是具有至少一种下面性质的突变体(a)该突变体具有比野生型干扰素-β-1a高的抗病毒活性，其中通过病毒诱导的细胞裂解来测定抗病毒活性；(b)相对于野生型干扰素-β-1a，该突变体具有比抗增殖活性更大的抗病毒活性；(c)该突变体结合干扰素受体，但当与野生型干扰素-β-1a相比时，相对于其受体结合活性具有减低的抗病毒活性和减低的抗增殖活性。
13.权利要求11的分离的蛋白质，其中干扰素-β-1a是衍生化的。
14.权利要求13的分离的蛋白质，其中衍生物是聚烷基二醇聚合物。
15.权利要求10的分离的蛋白质，其中除了干扰素-β之外的蛋白质的至少一部分是免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
16.权利要求15的分离的蛋白质，其中所述恒定区的至少一部分衍生自选自IgM，IgG，IgD，IgA和IgE类的免疫球蛋白。
17.权利要求16的分离的蛋白质，其中所述类是IgG。
18.权利要求15的分离的蛋白质，其中所述恒定区的至少一部分至少包括铰链，CH2和CH3区。
19.编码权利要求1和10的蛋白质的分离的DNA序列。
20.包括权利要求19的DNA序列和一个表达控制序列的重组DNA，其中所述表达调控序列与所述DNA可操作地连接。
21.用权利要求20的重组DNA序列转化的宿主细胞。
22.产生重组多肽的方法，包括(a)提供权利要求21的宿主细胞种群；(b)在表达重组DNA编码的多肽的条件下生长所述细胞种群；和(c)分离表达的多肽。
23.干扰素-β融合蛋白，包括糖基化干扰素-β和另外的其不与之天然相关的多肽，其是基本上纯化形式的。
24.权利要求23的融合蛋白，其中所述干扰素-β是人干扰素-β-1a。
25.权利要求24的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有选自下面的抗病毒活性(a)比野生型干扰素-β-1a高的抗病毒活性，其中通过病毒诱导的细胞裂解来测定抗病毒活性；(b)相对于野生型干扰素-β-1a，比抗增殖活性更大的抗病毒活性；(c)包括受体结合活性的活性，但是当与野生型干扰素-β-1a相比时，相对于其受体结合活性的减低的抗病毒活性和减低的抗增殖活性。
26.含有治疗有效量的权利要求1，10和23的干扰素-β融合蛋白的药物组合物。
27.一种抑制患者血管生成的方法，包括对患者施用有效量的权利要求26的组合物。
28.权利要求3的分离的多肽，其中突变体是衍生化的。
29.权利要求27的分离的多肽，其中衍生物是聚烷基二醇聚合物。
30.权利要求12的分离的蛋白质，其中突变体是衍生化的。
31.权利要求27的分离的蛋白质，其中衍生物是聚烷基二醇聚合物。
全文摘要
描述了一种包括糖基化干扰素－β(X)的氨基酸序列的具有氨基酸序列X－Y－Z的融合多肽或者其部分;Y是任选的连接体部分;和Z是包括除了糖基化干扰素－β以外的一种多肽的至少一部分的多肽。优选X是人干扰素－β－1a。也描述了干扰素－β－1a的突变体。
文档编号C07K17/08GK1333785SQ99812213
公开日2002年1月30日 申请日期1999年10月15日 优先权日1998年10月16日
发明者A·惠蒂, L·朗克尔, M·布里克梅尔, P·霍克曼 申请人:拜奥根有限公司