专利名称：新的neuropilin/生长因子结合及其应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及Neuropilin(NP-1)受体和选自以下一组的生长因子的复合物，及用这种复合物诱导或拮抗由一或多种所述生长因子介导的细胞应答的方法，及分离的结合配偶体，如与一或多种生长因子和NP-1的复合物结合的抗体，所述生长因子的组为血管内皮生长因子-B167(VEGF-B167)血管内皮生长因子-C(VEGF-C)，血管内皮生长因子-D(VEGF-D)和加工形式的血管内皮生长因子-B186(加工的VEGF-B186)。
在胚胎发育中，初级血管网是在称为血管生成的过程中，通过中胚层细胞原位分化而建立的。据信包含胚胎新血管生成及成体新血管化的所有后继过程都受称为血管生成过程中预先存在的血管结构中新毛细管的萌生及分裂的影响。(Popper等，酶及蛋白质，199649138-162；Breier等，Dev.Dyn.1995204228-239；Risau，自然，1997386 671-674)。血管生成不仅参于胚胎发育和新组织生长，修复及再生中，也参于女性月经周期，妊娠期及参于伤口及创伤的修复中。血管生成除发生在正常机体之外，还包含于许多病理过程，特别是肿瘤生长及转移，及其它疾病如糖尿病视网膜病变，银屑病及关节病，其中血管增殖尤其微血管系统增殖是增加的。抑制血管生成可用于预防或减轻这些病理状况。
另一方面，启动血管生成在血管待建立或延伸之处是所需的，例如在组织或器官移植之后，或刺激梗塞组织或狭窄动脉中建立侧支循环如在冠心病及闭塞性脉管炎中。
血管生成是高度复杂的，包含保持细胞周期中的内皮细胞，胞外基质的降解，迁移并侵染周围组织，最后血管形成。复杂血管生成过程的分子机制基础远未明了。
由于血管生成在如此多的生理及病理进程中起关键作用，因此对参于调节血管生成中的因子已深入研究。许多生长因子已示出参于血管生成的调节当中，包括成纤维细胞生长因子(FGFs)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，转化生长因子α(TGFα)，及肝细胞生长因子(HGF)。例如参见Folkman等，生物化学杂志1992,267,10931-10934。
已提示内皮细胞特异性生长因子的一特定家族，血管内皮生长因子(VEGFs)及其相应受体主要负责内皮细胞生长和分化的刺激，及分化的细胞的某些功能。这些因子是PDGF家族成员，并呈现主要通过内皮受体酪氨酸激酶(RTKs)起作用。
在PDGF家族中已鉴别9种不同的蛋白质，二种是PDGFs(A和B)，一种是VEGF，其它六种是与VEGF密切相关的成员。此六种与VEGF密切相关的成员是VEGF-B，见于路德维格癌症研究所及赫尔辛基大学的国际专利申请PCT/US96/02957(WO96/26736)及美国专利5,840,693和5,607,918中所述；VEGF-C见于Joukov等，EMBO杂志，199615290-298及Lee等，美国科学院院报199693 1988-1992所述；VEGF-D，见于国际专利申请No.PCT/US97/14696(WO98/07832)及Achen等，美国科学院院报199895548-553所述；胎盘生长因子(PlGF)，见于Maglione等，美国科学院院报1991,889267-9271所述；VEGF2，见于人体基因组科学有限公司的国际专利申请No.PCT/US94/05291(WO95/24473)所述；和VEGF3，见于人体基因组科学有限公司的国际专利申请No.PCT/US95/07283(WO96/39421)所述。每个VEGF家族成员与VEGF氨基酸序列具有30％-45％的相同性。VEGF家族成员共享的VEGF同源结构域含有形成半胱氨酸结基序的6个半胱氨酸残基。VEGF家族的功能特点包括改变内皮细胞迁移程度，诱导血管通透性和血管生成及淋巴管生成性。
血管内皮生长因子(VEGF)是已从几种来源中分离出的同源二聚体糖蛋白。VEGF呈现对内皮细胞高特异性促有丝分裂活性。VEGF在胚胎血管生成期间新血管形成及成体生命期间血管生成中有重要调节功能(Carmeliet等，自然1996380435-439；Ferrara等，自然，1996380439-442；Ferrara和Davis-Smyth,Endocrine Rev.,1997 184-25)。VEGF所起的明显作用已研究证实，示出单一VEGF等位基因的失活会产生由于血管结构不能发育而导致的胚胎死亡(Carmeliet等，自然，1996 380 435-439；Ferrara等，自然，1996 380 439-442)。VEGF除具有强的朝向单核细胞的趋化活性之外，还能诱导内皮细胞中的纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂，并还能诱导血管通透性。由于其诱导微血管通透性，有时将其称为血管通透性因子(VPF)。VEGF的分离及性质参见Ferrara等，细胞生物化学杂志，1991 47 211-218，及Connolly，细胞生物化学杂志，1991 47 219-223。单一VEGF基因的可变mRNA剪切产生5个同种型VEGF。
VEGF-B与VEGF具有相似血管生成及其它性质，但在组织中分布与表达不同于VEGF。特别地，VEGF-B在心脏中强烈表达，在肺中只微弱表达，而VEGF正相反。由此推测VEGF与VEGF-B尽管在一些组织中共表达，但也存在功能差异。VEGF-B在体内和体外均能促进低浓度VEGF的促有丝分裂活性。
VEGF-B是用酵母共杂交相互作用阱筛选技术，通过筛选可与细胞类树脂酸结合蛋白I(CRABP-I)相互作用的细胞蛋白而分离的。VEGF-B的分离及特点见于PCT/JS96/02957及Olofsson等，美国科学院院报1996932576-2581所述。
VEGF-C分离自PC-3前列腺癌细胞系(CRL1435)的条件培养基，通过用转染而表达VEGFR-3的细胞筛选培养基产生内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)的酪氨酸磷酸化的能力。VEGF-C是用重组VEGFR-3经亲和层析纯化的，并克隆自PV-3DNA文库。VEGF-C的分离及特点见于Joukov等，EMBO杂志，199615290-298所述。
VEGF-D分离自购于Clontech的人乳腺cDNA文库，通过用得自称为“Soares Breast 3NbHBst”的人cDNA文库的表达的序列标记作杂交探针筛选而获得(Acher等，美国科学院院报，1998 95 548-553)。VEGF-D的分离及特点见于国际专利申请No.PCT/US97/146966(WO98/07832)所述。
VEGF-D基因在成年人中广泛表达，但不是遍在地表达。VEGF-D在心脏，肺及骨骼肌中强表达。VEGF-D在脾，卵巢，小肠及结肠中中度表达，在肾，胰腺，胸腺，前列腺和睾丸中低度表达。在来自脑，胎盘，肝或周围血白细胞的RNA中未检测到VEGF-DmRNA。
PlGF分离自胎盘cDNA文库。其分离与特点见于Maglione等，美国科学院院报，1991 88 9267-9271所述。目前其生物学功能还不十分清楚。
VEGF2分离自高度致瘤性不依赖于雌激素的人乳腺癌细胞系。尽管此分子据称与PDGF有22％同源性，与VEGF有30％同源性，但是编码VEGF2的基因的分离方法不清楚且还未公开对其生物学活性的鉴定。
VEGF3分离自衍生自结肠组织的cDNA文库。VEGF3与VEGF有大约36％相同性和66％相似性。分离编码VEGF3的基因的方法还不清楚，其生物活性特点也未揭示。
两个蛋白质间相似性通过对比氨基酸序列及一个蛋白质对另一个蛋白质序列的保守氨基酸取代而确定，而相同性的确定不包括保守氨基酸取代。
VEGF-B与VEGF呈大约40～50％的序列相同性，并与PlGF呈大约30％序列相同性。PlGF和VEGF-B mRNA的可变剪切分别产生二个同种型蛋白质PlGF-1和PlGF-2,VEGF-B167和VEGF-B168(Hauser等，生长因子9:259(1993))，所有这些蛋白质均与Flt-1结合。在这两种情况中，这些同种型蛋白之一PlGF-2和VEGF-B167具有与细胞表面肝素硫酸蛋白聚糖(HSPGs)结合的碱性C-末端，并可由肝素释放。此肝素结合区类似于由VEGF基因外显子7编码的氨基酸序列。
VEGF-C和VEGF-D不同于VEGF家族的其它成员，它们在VEGF-同源结构域两侧有N-和C-末端延伸，并且是蛋白酶解加工的(Joukov等，EMBO杂志16:3898(1997)；Acher等，美国科学院院报，95:548(1988))。另外，VEGF-C已知不与肝素结合，而VEGF-B167和一些VEGF(VEGF165,VEGF189和VEGF206)与肝素结合。成熟形式的VEGF-D缺失VEGF/PlGF特征性肝素结合结构域的多碱性区。
PDGF/VEGF家族成员通过与受体酪氨酸激酶结合而发挥作用。已鉴别5种内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶，称为VEGFR-1(Fit-1),VEGFR-2(KDR/Flk-1),VEGFR-3(Flt4),Tie和Tek/Tie-2。所有这些均有信号转导所必需的固有酪氨酸激酶活性。VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,Tie和Tek/Tie-2在脉管生成及血管生成中的必需性及特异性，已通过定向突变灭活鼠胚胎中的这些受体而证实。
已知与VEGFs结合的一受体酪氨酸激酶是Flt-1/VEGF-1(Shibuya等，Oncogene,5:519-524(1990)；Vries等，科学255:989-991(1992))；Flk-1/KDR/VEGFR-2(Matthews等，美国科学院院报88:9026-30(1991)；Terman等，生物化学生物物理学研究通讯187:1579-86(1992)；Millauer等，细胞72:835-46(1993))；和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2与VEGF高亲和性结合，且VEGFR-1还结合VEGF-B和PlGF。VEGF-C也示出是VEGFR-3的配体，且其还激活VEGFR-2(Joukov等，EMBO杂志，1996 15 290-298)。VEGF-D与VEGFR-2和VEGFR-3均结合。Tek/Tie-2的配体见于Regeneron Pharmaceuticals公司的国际专利申请No.PCT/JS95/12935(WO96/11269)所述。Tie的配体还未鉴别。
VEGFR-1,VEGFR-2和VEGFR-3通过不同内皮细胞表达。VEGFR-1和VEGFR-2均在血管内皮中表达(Oelrichs等，Oncogene,1992 8 11-18；Kaipainen等，J.Exp.Med.,1993 178 2077-2088；Dumont等.，Dev.Dyn.,1995 203 80-92；Fong等，Dev.Dyn.,1996 207 1-10),VEGFR-3大部分在成体组织的淋巴内皮中表达(Kaipainen等，美国科学院院报1995 9 3566-3570)。VEGFR-3还在肿瘤周围的血管中表达。
VEGFR基因的破坏导致脉管结构发育异常而在妊娠中期引起胚胎死亡。对携带完全失活的VEGFR-1基因的胚胎进行分析提示此受体是内皮的功能结构所需的(Fong等，自然，1995 376 66-70)。然而，VEGFR-1的胞内酪氨酸激酶区的缺失产生具有正常血管结构的存活小鼠(Hiratsuka等，美国科学院院报1998 95 9349-9354)。这些差异存在的原因尚待解释，但提示由酪氨酸激酶转导信号的受体不是VEGFR-1的合适功能所需的。对具有VEGFR-2的失活的等位基因的纯合小鼠进行分析提示此受体是内皮细胞增殖，血细胞生成及脉管生成所必需的(Shalaby等，自然，1995 376 62-66；Shalaby等，细胞，1997 89 981-990)。VEGFR-3的失活导致由于大血管的异常结构而导致的心血管疾病(Dumont等，科学，1998 282 946-949)。
尽管VEGFR-1主要在发育期间的内皮细胞中表达，其在胚胎发育的早期阶段也可见于造血前体细胞中(Fong等，自然，1995 37666-70)。在成体中，单核细胞和巨噬细胞也表达此受体(Barleon等，血液，1996 87 3336-3343)。在胚胎中，VEGFR-1由大多数(如果不是全部)血管表达(Breier等，Dev.Dyn.1995 204-228-239；Fong等，Dev.Dyn,1996 207 1-10)。
受体VEGFR-3在胚胎发育早期在内皮细胞上广泛表达，但随着胚胎发育逐渐限于静脉内皮，然后淋巴内皮(Kaipainen等，癌症研究，1994 92 3566-3570)。VEGFR-3在成体组织中的淋巴内皮细胞上表达。此受体是胎胚发育期间脉管发育所必需的。定向失活鼠VEGFR-3基因的二个拷贝导致特征在于具有缺陷管腔的异常结构的大血管的缺陷血管形成，在性交后9.5天引起心包腔内液体积聚和冠心病。基于这些发现已提出VEGFR-3是初级血管长成较大血管所必需的。然而，在这些鼠淋巴管的发育中VEGFR-3的作用未能研究，因为在淋巴系统形成之前胚胎死去。不过可设想VEGFR-3在胚胎发育和成体生存期间在淋巴内皮细胞中特异表达，从而在淋巴管发育及淋巴管生成中起作用。这可由发现VEGFR-3的配体VEGF-C在转基因鼠的皮肤中的异位表达，导致真皮中淋巴内皮细胞增殖及血管扩大而证实。进一步可推测VEGF-C可在淋巴内皮中具有主要功能，在血管生成及通透性调节方面呈现与VEGF共享的次要功能(Joukov等，EMBO杂志，1996 15 290-298)。
VEGF/VEGF受体系统的一些抑制剂已显示出通过抗血管生成机制而阻止肿瘤生长，见于Kim等，自然，1993 62 841-844和Saleh等，癌症研究，1996 56 393-401所述。
近年来，已经纯化并克隆一种新的130-135kDa VEGF同种型特异受体(Soker等，细胞，1998 735-735)。发现此VEGF受体与VEGF165同种型通过对肝素呈微弱亲和性的外显子7编码的序列而特异结合(Soker等，细胞，1998 92 735-745)。令人惊奇地，此受体呈现与人Neuropilin-1(NP-1)相同，NP-1是一种参与早期神经形态发生的受体。PlGF-2似乎也与NP-1相互作用(Migdal等，生物化学杂志，1998 273 22272-22278)。NP-1表达增强VEGF165与KDR的结合，并增强VEGF165的生物活性(Soker等，细胞，92:735-745(1998))。
NP-1已鉴别为是一受体，其介导脑衰蛋白/semaphorins(脑衰蛋白-1/SemaⅢ/Sema D)的化学排斥活性，脑衰蛋白/semaphorins是具有排斥锥体和轴突指导功能的跨膜及分泌糖蛋白的一个大家族(Kolodkin等，细胞，75:1389-1399(1993)；Zhigang等，细胞，90:739-751(1997)；Kolodkin等，细胞，90:753-762(1997))。SemaⅢ与NP-1结合的Kd为2-3×10-10M,VEGF165与NP-1结合的Kd为2-3×10-10M，二者相似(Zhigang等，细胞，90:739-751(1997)；Kolodkin等，细胞90:753-761；Soker等，细胞，92:735-745(1998))。由于两种具有明显不同生物活性(即VEGF刺激血管生成及SemaⅢ化学排斥神经细胞)的不同结构的配体与相同受体结合并具有相似亲和性，此发现是非常令人惊奇的。
发现NP-1在一些肿瘤细胞系中表达，并在VEGF-B是高表达的一些器官中较突出，如心脏，胰腺及骨骼肌。
发明概述本发明基于如下发现VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186均能与NP-1的胞外域结合，形成介导有效的细胞应答和/或拮抗非所需生物活性的生物活性复合物。
根据本发明已发现VEGF-B167通过负责肝素结合的区域中外显子6B编码的序列与NP-1受体结合。结合也可发生在NP-1与PlGF-2,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186之间。
由于可变剪接的结果，VEGF-B有各种同种型。VEGF-B167由外显子1～5加上外显子6B和外显子7组成，外显子7中有终止密码子。VEGF-B186由外显子1～5加上外显子6A组成，且其终止于外显子6B，但不同于VEGF-B167的外显子6B所用读框。外显子7在VEGF-B186中不翻译。如上所述，VEGF-B167与NP-1结合。仅表达外显子1-5的构建体的产物(鼠VEGF-BkEx1-5，如PCT/US97/23533所述，该文献引入本文作参考)不与NP-1结合这一事实表明结合位点不在外显子1-5中。相似地，加工的VEGF-B186不含有外显子7的表达产物，但仍结合NP-1的事实表明VEGF-B167的VEGF-B外显子6B编码的区域结合NP-1。
加工形式的VEGF-B186也能结合NP-1，且也不含有外显子6B。尽管还未知产生不同于全长形式的加工形式的VEGF-B186的切割位点的位置，但此加工形式的VEGF-B186包含外显子1～5和至少部分外显子6A。因此，在部分外显子6A中也许有第二个结合位点，其在加工的VEGF-B186中表达。
根据本发明，发现VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D和其它配体是模块结构，因为各结构域在可以分别表达且互相分离。在细胞表面，VEGF-B167的一个结构域结合Flt-1，另一个结构域结合Neuropilin和肝素硫酸盐。此独立的模块性及可分离性可例如通过连接共受体结合结构域而利用。
还发现VEGF-C与VEGFR-2和VEGFR-3及Neuropilin受体结合。VEGF-C△N△C不与NP-1结合而全长VEGF-C与之结合。
人VEGF-B的氨基酸序列参见Eriksson等的PCT申请公开No.WO96/26736(Gen Bank数据库登记号No.U52819)所述。NP-1的氨基酸或核苷酸序列参见Soker等，细胞，92:735-745(1998)(EMBL数据库登记号No.AF016050)所述。分析内皮细胞增殖的一有效方法如Olofsson等，美国科学院院报93:2576-81(1996)所述。
含有受体蛋白的样品例如可以是在正常表达受体的细胞的条件培养基中自然产生的可溶的NP-1受体。通过蛋白酶解从细胞中天然脱落的组织样品或组织液也可以用作受体样品。
类似物或功能类似物指相应多肽的修饰的形式，其中至少有一个氨基酸取代，这样的类似物在体内和/或体外基本保留与未修饰的多肽相同的生物活性。另外，本发明鉴别的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的类似物可以是小分子，例如蛋白质或肽或非蛋白质化合物。类似物也可包括用毒素或药物或放射性同位素标记的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D，加工的VEGF-B186或其衍生物(包括但非限于单体或二聚体的片段)，这些标记可靶向在肿瘤内皮细胞上表达及正调节的NP-1。这种分子可用于拮抗或抑制由生长因子的VEGF-家族成员诱导的不需要的细胞应答，如肿瘤诱导的血管生成或牛皮癣或视网膜病变，可通过类似于Kim等所述方法(自然，362:1480-87(1994))进行。
废除NP-1与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186之间的相互作用可减轻在癌症中的生物学活性。也可能的是VEGF-B167不经Flt-1而经NP-1通过仍未知机制在细胞中转导信号。这种信号转导可存在于表达NP-1的正常或癌细胞中。抑制此信号转导的处理可用于治疗和/或调节正常或病理血管形成。
分离NP-1与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的复合物的步骤包括使用NP-1受体，优选NP-1的胞外域与免疫球蛋白G(IgG)的融合蛋白，随后经琼脂糖凝胶A结合而进行。或者不使用琼脂糖凝胶A而使用离子交换层析，凝胶过滤或亲和层析。含有受体/IgG融合蛋白的条件培养基与用编码各个生长因子配体或其类似物的DNA转染的细胞，或天然表达配体的细胞的条件培养基相互作用，或与含有候选配体类似物的溶液相互作用。表达NP-1-IgG融合蛋白的细胞的条件培养基可经过琼脂糖凝胶A层析柱或基质以固定受体，或者融合蛋白在ELISA测定中可固定在纤维素圆盘中或吸附在塑料圆盘上。含有表达配体的细胞的条件培养基的第二种溶液然后经过固定的受体。如果需要。此配体可放射标记以易于通过放射分析测定结合的配体数量。
这种分析可用于筛选包含NP-1受体过表达的情况，即通过检测与对照组相比较结合放射性的提高而筛选。此方法也可用于筛选与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和/或加工的VEGF-B186相竞争的类似物的存在与否，即通过检测与对照组相比较结合放射性的降低，而指示用于测试中的放射标记的配体与非放射性的推定类似物之间的竞争。
对VEGF家族成员的可检测细胞应答例如包括内皮细胞增殖，血管生成，受体的酪氨酸磷酸化，及细胞迁移。同种型特异诱导可实现。特例包括尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)诱导，内皮细胞迁移和一些内皮细胞类型的生长刺激。管形成也是可能的。
表达受体蛋白或其一部分的细胞可以是天然表达此受体的细胞，或者可以是其中导入编码此受体或其一部分的核酸的细胞，这样此受体蛋白或其一部分被表达。可转染或转导编码Neuropilin的核酸，以提高在体外和在体内细胞中的表达。在不表达Neuropilin的细胞中的表达(如造血细胞，见Soker等，细胞，92:735-745(1998))应使它们对诱导更易应答。应通过VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186诱导，但不应通过未加工的(即全长的)VEGF-B186诱导。同样，通过与那些表达特定RTK的细胞毗邻的细胞对NP-1或其一部分的表达也可调节RTK的有效浓度和/或由RTK进行的信号转导。
当本文涉及导入编码NP-1，其胞外域，结合配体的片段或其类似物，或与VEGF-B167或VEGF-C有结合亲和性并由在严格条件下与编码结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链的核苷酸序列时，其可以经用质粒载体转化，或用病毒载体(如腺病毒，痘病毒或逆转录病毒)体外或体内转染，或用细菌载体(如BCG)体外或体内转染，或注射裸DNA进行。
肝素通过那些结合肝素的生长因子可调节NP-1结合，且一碱性肝素结合肽可不依赖于直接NP-1相互作用而调节NP-1结合。VEGF-C不结合肝素，因此VEGF-C不能进行肝素调节。
或者，前述分析通过固定VEGF-B167配体或候选类似物，并将固定的配体与表达受体或其一部分的细胞的条件培养基接触而进行，受体的一部分如是胞外域或结合配体的片段。
检测蛋白质/受体结合的方法可包括检测VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或它们的类似物与NP-1受体蛋白或其一部分的特异结合的方法，或检测由VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186诱导的细胞应答，如uPA和PAI-1诱导，及受体磷酸化。
本发明的另一方面涉及一种含有两种分子的分离的配体一受体复合物，所述分子之一为所述配体，并含有VEGF-B167，加工的VEGF-B186,VEGF-C和VEGF-D的NP-1结合序列(例如，VEGF-B167的外显子6B编码的序列)，第二种所述分子为所述受体，其选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的结构域的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合VEGF-C、结合VEGF-D或结合加工的VEGF-B186的NP-1的受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、VEGF-C、VEGF-D或加工的VEGF-B186有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。优选的受体是NP-1受体，且配体包括VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1结合序列(例如，VEGF-B167的外显子6B编码的NP-1结合序列)。
配体或复合物的分离与纯化可通过常规方法进行，如根据Harlow等，抗体实验手册，冷泉港实验室出版(1988)和/或Marshak等，蛋白质纯化及定性方案，冷泉港实验室出版(1996)所述方法，用单克隆抗体进行免疫亲和性纯化。各个配体或复合物的适当抗体可通过常规方法产生。
一种无细胞复合物可体内或体外使用以竞争VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186与受体的结合，或防止在配体结合后细胞结合的受体二聚体化。这种无细胞复合物包含至少一个受体分子例如可溶的NP-1(sNP-1)，和一个二聚体分子。sNP-1是一种非膜结合蛋白及受体的一部分，如NP-1的胞外域或结合配体的片段。二聚体分子可以是VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或它们的类似物的同源二聚体或混合的二聚体。二聚体的一个分子可与复合物中的受体分子结合，另一个分子具有能与细胞表面受体结合的游离结合位点。
本发明另一方面提供了一种与配体一受体复合物上的表位有特异结合亲和性的分离的结合配偶体，所述复合物包含VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186蛋白或其类似物，所述蛋白与选自如下一组的一种受体的结合配体的结构域有特异结合相互作用，所述的组为包含NP-1的氨基酸序列，NP-1的胞外域或结合配体的结构域的氨基酸序列，与NP-1的结合配体的结构域有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、VEGF-C、VEGF-D或加工的VEGF-B186的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，或与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码NP-1结合配体的结构域的核酸杂交的核酸编码的多肽链；其中该结合配偶体基本上与未复合的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其类似物无结合亲和性。严格杂交条件例如如下所述在42℃在5×SSC,20mM NaPO4,pH 6.8,50％甲酰胺中杂交；并在42℃在0.2×SSC中冲洗。本领域技术人员明白基于被杂交序列的长度及GC核苷酸基本含量可改变这些条件，还了解存在确定这种变化的公式。例如参见Sambrook等“分子克隆实验手册”，第二版，P9.47-9.51，冷泉港，纽约冷泉港实验室(1989)。优选地此结合配偶体也基本上与任何未复合的受体蛋白或其受体类似物无结合亲和性。此结合配偶体可以是与这种生长因子/受体复合物反应或识别其的抗体。可使用多克隆或单克隆抗体，但优选单克隆抗体。这种抗体可通过标准方法生产，筛选出那些分别结合受体或配体的抗体。
如本申请所用，序列相同性百分率是通过用Lasergene程序包的“MEGALIGN”序列对比工具(DNASTAR,Ltd.Abacus House,ManorRoad,West Ealing,London W130AS United Kingdom)并利用其预设条件进行测定的。此序列对比然后手工校正，并在适于对比的区域内估算相同性数目。
本发明另一方面涉及VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的根据上述方法获得的拮抗剂的如下应用，(ⅰ)拮抗VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186与细胞表面受体的结合，或(ⅱ)拮抗由VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186诱导的细胞应答。
一优选的拮抗剂包括一种抗体，该抗体与以下结构有结合特异性(ⅰ)一蛋白质的配体结合结构域，该蛋白质具有包含NP-1的氨基酸序列，结合VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186并与NP-1的配体结合结构域具有至少90％氨基酸相同性的其类似物的氨基酸序列的多肽链，或者具有与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186有结合亲和性并由在严格条件下与编码NP-1的配体结合结构域的核酸杂交的核酸编码的多肽链；或(ⅱ)与NP-1受体有结合亲和性并包含VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1结合序列的受体结合结构域(例如，VEGF-B167的外显子6B编码的NP-1结合序列)。
与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186有结合亲和性的蛋白质的配体结合结构域与NP-1的配体结合结构域呈现至少90％，优选至少95％的氨基酸相同性并且特别优选与其相应。VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186类似物的受体结合结构域与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1结合序列(例如VEGF-B167的外显子6B编码的NP-1结合序列)呈现至少90％，优选至少95％的序列相同性且特别优选与其相应。
本发明另一方面涉及一种受体蛋白的应用，该受体蛋白选自包含NP-1的氨基酸序列，NP-1的胞外域的氨基酸序列，配体结合结构域的氨基酸序列，或其结合VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186并与NP-1的配体结合结构域具有至少90％氨基酸相同性的类似物的氨基酸序列的多肽链，或者与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186有结合亲和性并由在严格条件下与编码NP-1的配体结合结构域的核酸杂交的核酸编码的多肽链；所述应用为用在一种方法中以拮抗(a)VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186与蛋白质如细胞表面受体的结合，或(b)诱导由VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186诱导的细胞应答。
多肽链与各个生长因子的细胞表面受体相竞争，并占据可用的生长因子，从而防止生长因子与细胞表面受体的有效相互作用，并防止诱导由该生长因子正常介导的细胞应答。一适当的肽链可以是可溶形式的受体(sNP-1)，如Soker等，细胞，92:735-745(1998)所述。
本发明另一方面提供了一种识别VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186与细胞表面受体结合的方法，该方法包括提供与NP-1的氨基酸序列或其结合VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的受体的序列变体有结合特异性的蛋白质，其中此蛋白质与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1结合序列有至少90％，优选至少95％的氨基酸序列相同性，这样此蛋白质当提供给表达细胞表面受体的细胞时，能与受体特异作用，从而基本上抑制VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186与受体的结合。该蛋白质可以是根据上述一种方法的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的类似物，优选是不诱导由VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186介导的细胞活性的类似物。
Neuropilin中的相互作用结构域，或VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C或VEGF-D的分离的可溶的NP结合结构域或肽，可用作任何VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C或VEGF-D的全效可溶抑制剂。VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C或VEGF-D衍生的结构域或肽也可通过各种方法贴附于细胞表面，如表达载体转化，或与其它细胞表面分子有亲和性的连接的结构域。
本发明另一方面提供了包含这种生长因子/受体复合物的药物制备物。
本发明另一方面提供了治疗特征在于NP-1细胞表面受体过表达的疾病的方法，所述方法包括对患有所述疾病的患者施用有效结合或拮抗NP-1受体的量的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或根据上述方法之一获得的类似物。
对NP-1的剔除及过表达研究已显示在脉管系统尤其心脏中的令人感兴趣的效应，其中VEGF-B167很可能是重要因素。VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其衍生物也能调节NP-1的其它配体即脑衰蛋白-1/semaphorin Ⅲ/D,semaphorin E及semaphorin Ⅳ的结合，且以此方式，VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186和/或其衍生物可影响中枢神经系统。
当受体蛋白包含非NP-1残基的多肽链，但仍显示与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186有结合亲和性时，其应与NP-1的配体结合结构域呈至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，尤其优选至少95％的氨基酸相同性。相似地，VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的有用类似物应分别与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1结合结构域呈现至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，尤为优选至少95％的序列相同性。
附图简述本发明参考举例论证的试验将得以进一步阐述，结果如图示
图1示出转染的293T细胞的pIg和NP-1-Ig的SDS-PAGE图。
图2示出用特异抗体对转染的细胞的条件培养基中代谢标记的生长因子的亲和沉淀。
图3示出用受体/免疫球蛋白融合蛋白对转染的细胞的条件培养基中代谢标记的生长因子的亲和沉淀。
图4示出用Flt-1-Ig或Flt-4-Ig融合蛋白作为阴性对照，对转染的细胞的条件培养基中代谢标记的生长因子的亲和沉淀。
图5示出VEGF-B167和VEGF-B186与抗体(IP),NP-1-Ig,Flt1-Ig和Flt4-Ig的结合。
图6示出mVEGF-BkEx1-5和VEGF165与抗体(IP),NP-1-Ig,Flt1-Ig和Flt4-Ig的结合。
图7示出VEGF-C和VEGF-C△N△C与抗体(IP),NP-1-Ig,Flt1-Ig和Flt4-Ig的结合。
图8示出VEGF-D和VEGF-D△N△C与抗体(IP),NP-1-Ig,Flt1-Ig和Flt4-Ig的结合。
图9示出GST-VEGF-B167的亲和层析。
图10示出用图9中洗脱的物质进行的银染SDS-PAGE图。
图11是示出GST-mVEGF-B167(外显子6B)对VEGF与PAE-NP-1细胞结合的竞争结合测试结果的条形图。
图12示出NP-1-Ig和NP-1-myc抗体与VEGF的结合试验结果。
图13(a),(b)和(c)分别示出VEGF,VEGF-B167和VEGF-B186与NP-1-Ig和NP-1-myc抗体的结合试验结果。
图14示出VEGF-B167和NP-1-Ig直接结合测试结果。
实施例详述本发明参考以下举例示出的实施例将得以进一步阐述。
实施例1克隆可溶的Neuropilin-1-Ig融合构建体将鼠NP-1的胞外域(鼠NeuropilincDNA的248-2914bp，登记号D50086)克隆入pIgplus(Ingenius)中。此胞外域的3’部分(2738-2914bp)首先作为EcoRV-BamHⅠ片段连接于pIgplus中，5’部分(248-2738bp)然后作为EcoRV片段(5’EcoRV位点衍生自pBluescript KSⅡ载体)连接进该载体。胞外域的序列因此克隆入具有编码人IgG Fc部分的pIgplus载体序列的框架中，以产生融合蛋白，该融合蛋白可通过蛋白质A琼脂糖凝胶从转染的293T细胞的培养基中沉淀出，随后进行SDS-PAGE及银染。结果示于图1。将NP-pIgplus或pIgplus转染入细胞中，并在转染后24-32小时之间收集无血清的条件培养基。通过银染检测蛋白质。如图1所示，检测到一个大约135kDa的条带，而在只用pIgplus载体转染的细胞培养基中未见到这种条带。在53-76kD之间迁移的多肽代表血清白蛋白。大约为30kD的低分子量条带据信代表部分蛋白酶解的Fc尾部。
实施例2转染，免疫沉淀及可溶受体结合通过磷酸钙沉淀法用编码可溶受体Ig-融合蛋白VEGFR-1-Ig(Olofsson等，美国科学院院报95:11716(1998)),VEGFR-3-Ig或得自实施例1的NP-1-Ig的质粒转染293-T细胞。VEGFR-3通过扩增R3的7个Ig环，加上将人Ig的Fc部分置于载体pREP7中而构建。
293-T细胞在转染后培养24小时，用含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)冲洗，并饥饿24-32小时。收集培养基并经离心澄清，用蛋白质A琼脂糖凝胶沉淀融合蛋白。
用编码hVEGF165,mVEGF-B167,mVEGF-B186,hVEGF-C,hVEGF-D,PlGF-1或PlGF-2的质粒相似地转染293-T或293EBNA细胞，并在转染后24小时用100μCi/ml Pro-mix TML-35S(Amersham)将转染的细胞代谢标记6～7小时。向标记培养基中加入10μg/ml肝素以促进结合硫酸肝素的生长因子从细胞表面及细胞周围基质中释出，除用于VEGF转染的培养基之外，代谢标记的培养基用VEGF抗体免疫沉淀2小时以免疫耗竭内源性VEGF。然后将相似量的含有代谢标记的生长因子的培养基用于免疫沉淀或用于受体结合分析。生长因子在室温用含有受体-Igs的结合缓冲液(磷酸缓冲盐水(PBS),0.5％BSA,0.2％Tween20)保温3小时。然后将琼脂糖凝胶珠用冰冷的结合缓冲液洗一次，用PBS洗3次，进行15％SDS-PAGE分析。
用抗VEGF165,VEGF-B167,VEGF-B186,VEGF-C,VEGF-D的特异抗体和蛋白质A琼脂糖胶进行免疫沉淀。结果示于图2。还用与蛋白质A琼脂糖凝胶偶联的可溶的NP-1-Ig蛋白进行蛋白质A琼脂糖凝胶沉淀，以从转染的细胞的条件培养基中沉淀代谢标记的VEGF165,VEGF-B167,VEGF186,VEGF-C,VEGF-D,PlGF-1和PlGF-2。结果示于图3。如图2，图3对比所示，通过可溶的NP-1-Ig和通过特异抗体沉淀的hVEGF165,mVEGF-B167,mVEGF-B186(加工形式)，hVEGF-C和PlGF-2的量几乎相同。相反，在NP-1-Ig与hVEGF-D或PlGF-1之间检测到无明显结合。然而，下述图8的结果表明尽管相互作用较弱，但hVEGF-D仍能结合NP-1-Ig。
作为阴性对照，用Flt-1-Ig或Flt-4-Ig从表达VEGF165,VEGF-B167,VEGF-B186,VEGF-C,VEGF-D,PlGF-1和PlGF-2的转染的细胞的条件培养基中亲和沉淀代谢标记的生长因子。结果如图4所示，所示配体与所示受体的结合的丧失是期望的。
实施例3:VEGF家族成员与特异抗体，NP-1,Flt-1和Flt-4的结合用分别表达VEGF-B167,VEGF-B186,mVEGF-BkEx1-5(通过表达含有鼠VEGF-B的外显子1-5的构建体而产生)，VEGF165,VEGF-C,VEGF-C△N△C(由如Joukov等，EMBO杂志，16:3898-911(1997)所述构建的VEGF-C的102-225位氨基酸组成的构建体)，VEGF-D，和VEGF-D△N△C(由如Achen等，美国科学院院报95:548-53(1998)所述构建的VEGF-D的93-201位氨基酸组成的构建体)的细胞的条件培养基重复进行实施例2的一般步骤。结果示于图5～8。
图5示出配体VEGF-B167和VEGF-B186与NP-1-Ig,Flt-1-Ig和Flt-4-Ig的结合分析，图6示出配体mVEGF-BkEx1-5和VEGF165与NP-1-Ig,Flt-1-Ig和Flt-4-Ig的结合分析。在图中，IP是指用抗体沉淀配体的免疫沉淀，并作为阳性对照。VEGF-B186的抗体是WO96/26736中所述VEGF-B的N末端肽的多克隆抗体。此抗体还识别VEGF-B167和mVEGF-BkEx1-5。抗VEGF165抗体购自R&D系统公司。在图6中，可以观察到mVEGF-BkEx1-5与NP-1不结合。图5示出加工的VEGF-B186(下部条带)与可溶的NP-1结合，但全长VEGF-B186(上部条带)未与之结合。由于mVEGF-BkEx1-5未与NP-1结合，因此相互作用位点很可能在加工的VEGF-B186的C末端区域，其最可能位于VEGF-B186的外显子6A内，并在全长形式中被封闭而在加工的形式中暴露。
图7和图8分别示出VEGF-C和VEGF-C△N△C，及VEGF-D和VEGF-D△N△C与NP-1-Ig,Flt-1-Ig和Flt-4-Ig的结合。两种全长VEGF-C和VEGF-D与Neuropilin-1(NP-1)的结合被检测到。然而，相当于这些生长因子成熟形式的截短的△N△C形式的VEGF-C和VEGF-D未示出任何与NP-1的结合。
在每张附图中，各个生长因子通过特异抗体免疫沉淀的阳性对照称为IP。
实施例4生产及纯化VEGF-B167GST融合蛋白及VEGF-B186GST融合蛋白将覆盖mVEGF-B167的117-161位氨基酸的外显子6B，用5’-ACGTAGATCTAGCCCCAGGATCCTC-3’(SEQ ID NO:1)和5’-ACGTGAATTCTCACCTACAGGTTGCTGG-3’(SEQ ID NO:2)作引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增。扩增的片段用适当的酶消化并连于质粒pGEX-2T(Pharmacia Biotech)的BamHⅠ和EcoRⅠ位点。经测序检定此构建体。用此构建体转化大肠杆菌(E.coli)BL-21并根据厂商指导纯化。将蛋白质在PBS中透析过夜。
相似地生产掺入VEGF-B186的外显子6A和部分外显子6B(116～163位氨基酸)的多肽表达产物的GST融合蛋白用于稍后的试验中。
实施例5生产和纯化VEGF GST融合蛋白VEGF的外显子7用5’-ATCGGGATCCCCCTGTGGGCCTTGC-3’(SEQ ID NO:3)和5’ACGTGAATTCTTAACATCTGCAAGTACGTT-3’(SEQ IDNO:4)作引物，通过PCR扩增。扩增的片段用适当的酶消化并连于pGEX-2T(Pharmacia Biotech)的BamHⅠ和EcoRⅠ位点。经测序检定此构建体。用此构建体转化E.coli BL-21并根据厂商指导纯化。将蛋白质在PBS中透析过夜。
实施例6用GST-VEGF-B167外显子6B亲和层析将谷胱甘肽琼脂糖纯化的GST-VEGF-B167外显子6B应用于Hi-阱肝素琼脂糖凝胶素和层析柱(5ml)，并充分洗涤，然后以在20mM磷酸钠缓冲液pH7.2中的0.15-1.5M NaCl的线性盐梯度从层析柱中洗脱。结果示于图9。此亲和层析示出VEGF-B167的外显子6B编码的序列(GST-VEGF-B167)与肝素相互作用，且多数蛋白质用0.8M NaCl可被洗脱。图10示出洗脱物的银染SDS-PAGE。
实施例7结合可溶受体并与GST融合蛋白竞争用编码可溶的Ig-融合受体VEGFR-1和NP-1的质粒转染293-T细胞。然后从转染后在含有0.2％BSA的DMEM中饥饿24小时的转染的细胞中收集培养基。用蛋白质A琼脂糖凝胶沉淀融合蛋白。通过用hVEGF165pSG5,mVEGF-B167pSG5,mVEGF-B186pSG5和mVEGF-BkEx1-5pSG5(Olofsson等，美国科学院院报95:11716(1998))转染293-T细胞生产配体，且此细胞在10mg/ml肝素存在下用100μCi/ml Pro-mix TML-35S(Amersham)代谢标记6-7小时。除用于hVEGF165转染的培养基之外，代谢标记的培养基用VEGF抗体免疫耗竭内源性VEGF以及可能的VEGF异源二聚体，免疫耗竭进行2小时。将生长因子与等量模拟转染的细胞的培养基与可溶的受体-Ig融合蛋白在4℃结合3小时，并用含有1％Triton-X100的PBS洗3次，用PBS洗一次，并在还原条件下经15％SDS-PAGE分析。为了竞争，实施例4和5中制备的25mg每种GST融合蛋白，以及GST单独在受体取出之前，与代谢培养基保温30分钟，如上述进行分析。
实施例8在细胞结合的受体上，GST-VEGF-B167和GST-VEGF-B186对125-hVEGF165与NP-1结合的竞争将人重组VEGF165用125I试剂放射标记至比活性为2.5×105cpm/ng。将种植于24孔平板中的铺满的猪动脉内皮(PAE)细胞，PAE-NP-1细胞和PAE-NP-1-VEGFR-1细胞用冰冷的结合缓冲液(F12,0.5mg/ml BSA,20mM Hepes pH7.4)洗一次，并将具有或不具有增加量的rhVEGF165,rhVEGF121(R&D系统)，GST,GST-VEGF(见实施例5),GST-VEGF-B167(见实施例4)和GST-VEGF-B186(类似产生的)的1ng/ml标记的VEGF加入结合缓冲液中。表达NP-1的PAE-NP-1细胞得自Soker等，细胞92:735-45(1998)。然后将此PAE-NP-1细胞用在pcDNA3.1载体中含有全长人VEGF受体1的构建体转染，并用zeocin选择所得转染物以获得PAE-NP-1-VEGFR-1细胞。在4℃结合2小时之后，用含有5μg/ml肝素的冰冷的结合缓冲液(F12,0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)；20mM Hepes pH7.4)将此细胞洗4次，用冰冷的PBS洗1次。然后在0.5M NaOH中裂解。用γ计数仪计数细胞裂解物的放射活性。
GST-VEGF-B167(外显子6B)对125I-hVEGF165与NP-1结合的竞争结果示于图11。使用1ng/ml125I-hVEGF165和20μg/ml GST融合蛋白。如图11所示，GST-VEGF-B167亲和性较低，完成大约50％竞争。阴性对照组使用的是GST和VEGF121，两者均无竞争。阳性对照组使用的是mVEGF164，其确实竞争。
实施例9:GST-VEGF167和GST-VEGF-B186与表达NP-1的细胞的交联如上述放射标记GST融合蛋白和VEGF-B167和VEGF-B186，并如Cao等，生物化学杂志，271:3154(1996)所述，用10ng标记的蛋白质和二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)交联剂(Pierce)交联于种植于6孔平板中的表达NP-1及共表达NP-1和VEGFR-1(实施例8)的转染的细胞。交联的蛋白质在还原条件下通过6％SDS-PAGE解析。加入过量(1μg)的rhVEGF165作竞争剂。
实施例10:VEGFR-1和NP-1之间的直接作用可溶的myc标记的NP-1和PAE-Flt1细胞或NIH-VEGFR-1细胞(Sawano等，细胞生长与分化，7:213-21(1996))用于测试VEGFR-1和NP-1之间的相互作用。myc标记的NP-1通过将myc标记附着于NP-1胞外域上而产生。可溶的NP-1(sNP-1)在有或无配体的情况下与细胞交联，并将交联物用单克隆抗myc抗体免疫沉淀。此抗myc抗体得自Berkeley抗体公司(Babco)。将此复合物通过6％SDS-PAGE解析，移至硝基纤维素上并用Flt1抗体(SantaCruz)探查。
结果示于图12和13。图12示出等量的NP-1-Ig和NP-1-myc用于结合试验。图13(a),(b)，和(c)示出VEGF,VEGF-B167和VEGF-B186的结合结果。二聚体的NP-1-Ig和单体的NP-1-myc以相似强度至少结合VEGF和VEGF-B167。VEGF-B186的结合较弱。
实施例11测试NP-1和/或NP-1模拟分子过量的可溶NP-1(sNP-1)以类似于sFlt1的方式(Goldman等，1998)，通过阻止与内皮细胞上及表达受体的细胞上的RTK相互作用，而阻断VEGF,VEGF-B,VEGF-C和VEGF-D信号转导。通过在存在过量NP-1的情况下用测试配体刺激受体进行体外测试。通过测定体外激酶分析或抗磷酸酪氨酸Western印迹分析中的自磷酸化对结果进行定量。
实施例12配体对不同细胞类型的定向结合NP-1受体的VEGF家族的配体，通过用含有NP-1 DNA的病毒载体体内转化细胞，由此该细胞表达NP-1受体，从而定向于不同类型的细胞。
实施例13与NP-1和NP-2在低严格条件下杂交寻找组织特异性同源物NP-1受体的同源物通过在如上述低严格条件下筛选结合测试而被测试与VEGF家族和成纤维细胞生长因子家族成员的配体的结合。
实施例14可溶NP-1与VEGF-B167的直接结合为进一步确定NP-1与VEGF-B167间的相互作用。测试VEGF-B167直接结合可溶NP-1-Ig融合蛋白的能力。纯化的GST或GST-VEGF-B167在室温在ELISA平板上包被90分钟。除去蛋白质溶液并用含有5％BSA的PBS将包被的孔封闭30分钟。用含有0.5mg/ml BSA的PBS将平板洗3次，并与可溶NP-1-Ig在1μg/ml浓度保温，在室温下结合2小时。在加入与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人Ig之前，如上述洗平板3次，将抗人Ig抗体置于孔中40分钟，之后如上所述洗涤平板，另加一次用PBS洗涤，然后根据供应商指示(DAKO)加入100μl底物1,2-邻苯二胺二氢氯化物(ODP)。加入100μl0.5MH2SO4终止反应。在450nm读取吸光度。结果示于图14。Flt4-Ig用作阴性对照，其不与GST或GST-VEGF-B167结合(结果未示出)。
用途生长因子的VEGF家族成员如VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186与Neuropilin-1受体之间的相互作用，可用于通过用例如携带NP-1DNA的病毒载体转化需增强生长因子活性的细胞由此该细胞表达过量的NP-1受体而增强配体的作用。
NP-1受体与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其类似物之间复合物的形成，可用于治疗患有特征在于NP-1受体过表达的疾病的患者，这可通过给予这种患者有效结合或拮抗NP-1受体的量的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其类似物。NP-1和VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其类似物之间复合物的形成还可用于治疗特征在于NP-1受体低表达的状态。这种状态可包括正常成人内皮或需要提高血管形成的状态。在给定情况下所施用的数量取决于患者的特点及疾病的性质且能被本领域技术人员通过常规试验测定而定。
VEGF-B的某些同种型可参于促进内皮细胞生长迁移及刺激及管形成中。通过转染或转导提高体外或体内细胞中Neuropilin的表达，可使此细胞对同种型更易应答。通过毗邻表达特定RTK的细胞的细胞表达Neuropilin也可以调节由RTK有效浓度和信号转导。
可转染或转导编码Neuropilin的核酸以提高其在体外或体内细胞中的表达。在不表达Neuropilin的细胞(如造血细胞，见Soker等，细胞，92:735-745(1998))中的表达应使它们更加应答VEGF-B167而非未加工的(即全长的)VEGF-B186。
肝素也应调节Neuropilin结合，且VEGF-B167的一碱性肝素结合肽可不依赖于直接NP-1相互作用而调节。VEGF-C不结合肝素，因此VEGF-C不能被调节。
Neuropilin中的相互作用结构域，或VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的分离的可溶NP结合结构域或肽，可用作VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的全效可溶抑制剂。VEGF-B167,VEGF165,VEGF-C,VEGF-D,PlGF-2或加工的VEGF-B186衍生的结构域或肽也可通过各种方法锚着于细胞表面，如表达载体转化，或与其它细胞表面分子具有亲和性的连接的结构域。
NP-1可与肿瘤细胞相关。废除VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D,PlGF-2和/或加工的VEGF-B186与NP-1之间的相互作用可减轻癌症中的生物学活性。也可能的是通过仍未知的机制，一或多个这些生长因子不经Flt-1而信号转导，且此机制在肿瘤细胞中发生。废除相互作用将调节此信号机制。
对NP-1的剔除及过表达研究已显示对心血管系统，尤其在VEGF-B167可能很重要的心脏的令人感兴趣的效力。VEGF-B167还能调节NP-1的其它配体的结合，这些配体称为脑衰蛋白-1/semaphorin Ⅲ/D,semaphorin E和semaphorin Ⅳ，从而影响中枢神经系统。
VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其类似物可适当地静脉内施用，或通过类似于目前用于定向输送VEGF或FGF的系统的定向输送系统而施用。这种系统例如包括使用质粒形式的DNA(Isner等，Lancet,348:370(1996))，或使用重组腺病毒(Giordano等，自然医学，2:534-39(1996))。VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186还可通过类似于所述提供VEGF的方法(Bauters等，美国生理学会，ppH 1263-271(1994)；Asahara等，循环，91:2793(1995))以蛋白质形式提供，或通过使用缺陷疱疹病毒(Mesri等，循环研究，76:161(1995))而提供。VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的小分子类似物可口服。也可使用其它标准输送模式如皮下，皮内，肌内，腹膜内，或静脉内注射。
NP-1受体或其部分与VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186蛋白的复合物也可用于产生抗体。此抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。通常地，可用常规生产抗体的技术生产抗NP-1/生长因子复合物的抗体。例如，特异的单克隆抗体可通过免疫接种由重组DNA表达而获得的融合蛋白而产生。抗VEGF-B167/受体复合物的嵌合的及人化的抗体和抗体片段均包括在本发明范围内。标记的单克隆抗体，尤其用于筛选特征在于NP-1受体过表达或低表达的疾病。这种疾病例如包括血管及淋巴管的内皮细胞肿瘤。
在诊断/预防装置中，上述抗体，生长因子或受体是标记的，且所剩未标记的二者之一是结合底物的，由此在抗体与生长因子/受体复合物之间结合后，通过测定附着于底物的标记数量，可确定抗体一生长因子/受体复合物。常规的ELISA试剂盒例如是这种诊断/预防装置。
标记可以是直接或间接的，共价或非共价的。抗体，生长因子或受体可以共价或非共价地偶联于适当的超磁性，顺磁性，电子致密的，生态的(ecogenic)或放射性试剂以显像。在诊断分析中，可使用放射性或非放射性标记。放射性标记例如是放射性原子或基团，如125I或32P。非放射性标记例如是酶，如辣根过氧化物酶，或荧光标记如异硫氰酸荧光素(FITC)。
论断/预防试剂盒还可包括使用PCR以确定NP-1和/或各个生长因子的表达。
前面的阐述及实施例只是举例说明本发明，而非有限制目的，本领域技术人员在本发明精神及原理的范围内，可对本发明的实施方案加以改动。所有改变均包括在本发明权利要求范围内。
序列表<110>路德维格癌症研究所赫尔辛基大学许可贸易公司<120>新的NEUROPILIN/生长因子结合及其应用<130>路德维格研究所-卡里·阿利塔洛等<140><141><150>60/104,723<151>1998-10-19<150>60/112,991<151>1998-12-18<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1acgtagatct agccccagga tcctc<210>2<211>28<212>DNA<213>Hongia koreensis<400>2acgtgaattc tcacctacag gttgctgg<210>3<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3atcgggatcc ccctgtgggc cttgc<210>4<211>30<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4acgtgaattc ttaacatctg caagtacgtt
权利要求书按照条约第19条的修改1、一种含有两种分子的分离的配体一受体复合物，所述分子之一为所述配体，其包含由VEGF-B167的外显子6B编码的氨基酸序列或其与VEGF-B167具有90％氨基酸序列相同性的结合受体的类似物，第二种所述分子为所述受体，其选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
2、一种含有两种分子的分离的配体一受体复合物，所述分子之一为所述配体，其选自由VEGF-B167，加工的VEGF-B186,VEGF-C和VEGF-D组成的一组，第二种所述分子为所述受体，其选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
3、如权利要求2所述的复合物，其中所述配体选自VEGF-B167，加工的VEGF186和VEGF-C。
4、一种可溶的融合蛋白质，包含一种免疫球蛋白和一种受体，所述受体选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
5、一种模块组合，其包含至少第一个蛋白质结构域和第二个蛋白质结构域，所述第一个结构域包含由VEGF-B167的外显子6B编码的氨基酸序列，所述第二个结构域选自VEGF165,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186。
6、一种调节与表达或过表达VEGF-B、VEGF-C和/或VEGF-D的活细胞相关的生长因子的结合和生物活性的方法，所述生长因子选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括向所述细胞中导入一载体，该载体包括编码一种受体序列的核苷酸序列，该受体序列选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
7、一种抑制与活细胞相关的生长因子的生物活性的方法，所述生长因子选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括用一种包含由VEGF-B167的外显子6B编码的氨基酸序列的多肽或包含由VEGF-B186的外显子6A编码的NP-1结合序列的多肽处理所述细胞。
8、一种抑制与活细胞相关的生长因子的生物活性的方法，所述生长因子选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括用一种包含由VEGF-B167的外显子6B编码的NP-1结合表位的多肽或包含由VEGF-B186的外显子6A编码的NP-1结合序列的多肽处理所述细胞。
9、一种调节细胞对脑衰蛋白/semaphorin糖蛋白的应答性的方法，所述方法包括用选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186的物质处理该细胞。
权利要求
1.一种含有两种分子的分离的配体一受体复合物，所述分子之一为所述配体，其包含由VEGF-B167的外显子6B编码的氨基酸序列或其结合受体的类似物，第二种所述分子为所述受体，其选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
2.一种含有两种分子的分离的配体一受体复合物，所述分子之一为所述配体，其选自由VEGF-B167，加工的VEGF-B186，VEGF-C和VEGF-D组成的一组，第二种所述分子为所述受体，其选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
3.如权利要求2所述的复合物，其中所述配体选自VEGF-B167，加工的VEGF186和VEGF-C。
4.一种可溶的融合蛋白质，包含一种免疫球蛋白和一种受体，所述受体选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
5.一种模块组合，其包含至少第一个蛋白质结构域和第二个蛋白质结构域，所述第一个结构域包含由VEGF-B167的外显子6B编码的氨基酸序列，所述第二个结构域选自VEGF165,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186。
6.一种调节与活细胞相关的生长因子的结合和生物活性的方法，所述生长因子选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括向所述细胞中导入一载体，该载体包括编码一种受体序列的核苷酸序列，该受体序列选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
7.一种抑制与活细胞相关的生长因子的生物活性的方法，所述生长因子选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括用一种包含由VEGF-B167的外显子6B编码的氨基酸序列的多肽或包含由VEGF-B186的外显子6A编码的NP-1结合序列的多肽处理所述细胞。
8.一种抑制与活细胞相关的生长因子的生物活性的方法，所述生长因子选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括用一种包含由VEGF-B167的外显子6B编码的NP-1结合表位的多肽或包含由VEGF-B186的外显子6A编码的NP-1结合序列的多肽处理所述细胞。
9.一种调节细胞对脑衰蛋白/semaphorin糖蛋白的应答性的方法，所述方法包括用选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186的物质处理该细胞。
10.一种调节细胞对脑衰蛋白/semaphorin糖蛋白的应答性的方法，所述方法包括用一种包含由VEGF-B167的外显子6B编码的NP-1结合表位的多肽或包含由VEGF-B186的外显子6A编码的NP-1结合序列的多肽处理所述细胞。
11.如权利要求10的方法，其中所述多肽包含由VEGF-B167的外显子6B编码的氨基酸序列。
12.如权利要求10的方法，其中所述多肽包含由加工的VEGF-B186的外显子6A编码的NP-1结合序列。
13.一种调节与活细胞相关的一种蛋白质的结合和生物活性的方法，所述蛋白质选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括向所述细胞中导入一载体，该载体包括编码一种受体序列的核苷酸序列，由此所述细胞能表达所述受体序列，该受体序列选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链。
14.一种抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法，包括用以下物质处理所述细胞的步骤，所述物质为(a)一种可溶的蛋白质，其选自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物的氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链；或(b)一种多肽，其包含由VEGF-B167的外显子6B编码的NP-1结合表位或由加工的VEGF-B186的外显子6A编码的NP-1结合表位。
15.如权利要求14的方法，其中所述肿瘤细胞用可溶的NP-1处理。
16.如权利要求14的方法，其中所述肿瘤细胞用包含由VEGF-B167的外显子6B编码的氨基酸序列的多肽处理。
17.如权利要求14的方法，其中所述多肽包含由加工的VEGF-B167的外显子6A编码的NP-1结合序列。
18.与一种配体一受体复合物上的一表位有特异结合亲和性的一种分离的结合配偶体，所述复合物包含一种选自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186及其类似物的蛋白质，该蛋白质与选自如下一组的一种蛋白质的结合配体的结构域有特异结合相互作用，所述的组为包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其结合配体的片段的氨基酸序列，与所述结合配体的片段有至少90％氨基酸相同性的结合VEGF-B167、结合加工的VEGF-B186或结合VEGF-C的其受体类似物氨基酸序列的多肽链，以及与VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有结合亲和性的并由在严格条件下与编码所述结合配体的片段的核酸杂交的核酸编码的多肽链；所述结合配偶体与未复合的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D，加工的VEGF-B186或其类似物基本上无结合亲和性。
19.如权利要求18的分离的结合配偶体，其中所述结合配偶体与未复合形式的所述蛋白质或其类似物基本上无结合亲和性。
20.如权利要求18的结合配偶体，其中所述结合配偶体是抗体。
21.如权利要求20的结合配偶体，其中所述结合配偶体是单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了选自VEGF－B
文档编号C07K19/00GK1324242SQ99812335
公开日2001年11月28日 申请日期1999年10月19日 优先权日1998年10月19日
发明者卡里·阿利塔洛, 乌尔夫·埃里克松, 布里吉塔·奥洛夫松, 泰贾·马基嫩 申请人:路德维格癌症研究所, 莱森希亚有限公司