细胞因子受体zalphall的制作方法

文档序号:3551698阅读:509来源:国知局
专利名称:细胞因子受体zalphall的制作方法
背景技术
多细胞有机体的细胞增殖和分化受激素和多肽生长因子的控制。这些可扩散分子使得细胞能够相互沟通,并协同作用形成细胞和器官,以及修复损伤组织。激素和生长因子的范例包括类固醇激素(如雌激素和睾酮)、甲状旁腺激素、促卵泡激素、白介素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素(EPO)和降钙素。
激素和生长因子通过结合受体而影响细胞代谢。受体可以是与细胞内信号途径(诸如第二信使系统)有关的膜整合蛋白质。受体的其它类型是可溶性分子,诸如转录因子。特别感兴趣的是细胞因子(即促进细胞增殖和/或分化的分子)的受体。细胞因子的范例包括刺激红血球发育的红细胞生成素(EPO);刺激巨核细胞谱系的细胞发育的血小板生成素(TPO);和刺激嗜中性细胞发育的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。这些细胞因子可以用于恢复患有贫血症、血小板减少症、和嗜中性细胞减少症或因癌症接受化疗的患者体内的正常血细胞水平。
这些细胞因子的经证实的体内活性说明了其它细胞因子、细胞因子激动剂、和细胞因子拮抗剂的巨大临床潜力和需求。本发明通过提供新的造血细胞因子受体及其相关组合物和方法满足了这些要求。
本发明提供了用于这些和本领域技术人员由此处教学而显而易见的其它用途的这类多肽。
发明概述在第一个方面,本发明提供了编码zalpha11多肽的分离多核苷酸,其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸残基序列(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ IDNO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列,其中氨基酸同一性百分比使用FASTA程序进行测定,其中ktup=1,缺口开放罚分=10,缺口延伸罚分=1,取代矩阵=BLOSUM62,其它参数为缺省值(default)。在一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸包含选自下组的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO4中第1位核苷酸至第1614位核苷酸所示多核苷酸序列;(b)SEQ ID NO1中第126位核苷酸至第779位核苷酸所示多核苷酸序列;(c)SEQ IDNO1中第126位核苷酸至第833位核苷酸所示多核苷酸序列;(d)SEQ IDNO1中第834位核苷酸至第1682位核苷酸所示多核苷酸序列;(e)SEQID NO1中第126位核苷酸至第1682位核苷酸所示多核苷酸序列;和(f)SEQ ID NO1中第69位核苷酸至第1682位核苷酸所示多核苷酸序列。在另一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸包含选自下组的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ IDNO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列。在另一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸由选自下组的氨基酸残基序列组成(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列。在另一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸还包含WSWSX结构域。在另一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸还包含跨膜结构域。在另一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸包含由SEQ ID NO2的第238位(Leu)至第255位(Leu)残基组成的跨膜结构域。在另一个实施方案中,上文公开的多核苷酸还包含胞内结构域。在另一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸包含由SEQ ID NO2的第256位(Lys)至第538位(Ser)残基组成的胞内结构域。在另一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸包含还具有BoxI和BoxII位点的胞内结构域。在另一个实施方案中,上文公开的分离多核苷酸包含胞内结构域,其中所述多肽还包含亲和标签。
在第二个方面,本发明提供了包含下列可操作连接在一起的元件的表达载体转录启动子;编码zalpha11多肽的DNA片段,其中所述多肽具有SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和转录终止子,其中启动子与DNA片段可操作连接,而DNA片段与转录终止子可操作连接。在一个实施方案中,上文公开的表达载体还包含与DNA片段可操作连接的分泌信号序列。
在第三个方面,本发明提供了包含上文公开的表达载体的培养细胞,其中细胞表达该DNA片段编码的多肽。
在第四个方面,本发明提供了包含下列元件的表达载体转录启动子;编码zalpha11多肽的DNA片段,其中该多肽具有SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;和转录终止子,其中启动子、DNA片段、和转录终止子是可操作连接的。在一个实施方案中,上文公开的表达载体还包含与DNA片段可操作连接的分泌信号序列。在另一个实施方案中,上文公开的表达载体还包含与DNA片段可操作连接的跨膜结构域。在另一个实施方案中,上文公开的表达载体还包含由SEQ ID NO2的第238位(Leu)至第255位(Leu)残基组成的跨膜结构域。在另一个实施方案中,上文公开的表达载体还包含与DNA片段可操作连接的胞内结构域。在另一个实施方案中,上文公开的表达载体还包含由SEQ ID NO2的第256位(Lys)至第538位(Ser)残基组成的胞内结构域。
在另一个方面,本发明提供了导入了权利要求15的表达载体的培养细胞,其中该细胞表达所述DNA片段编码的可溶性受体多肽。在一个实施方案中,上文公开的培养细胞的增殖依赖造血生长因子的外源供应。
在另一个方面,本发明提供了编码融合蛋白的DNA构建物,该DNA构建物包含编码具有选自下组的氨基酸残基序列的多肽的第一种DNA片段(a)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第19位氨基酸(Gly)的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)的氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)的氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第238位氨基酸(Leu)至第255位氨基酸(Leu)的氨基酸序列;(e)SEQ IDNO2中第238位氨基酸(Leu)至第538位氨基酸(Ser)的氨基酸序列;(f)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)的氨基酸序列;和(g)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)的氨基酸序列;和至少另一种编码其它多肽的DNA片段,其中第一种和其它DNA片段以同一读码框相连;且第一种和其它DNA片段编码融合蛋白。
在另一个方面,本发明提供了包含下列可操作连接在一起的元件的表达载体转录启动子;编码上文公开的融合蛋白的DNA构建物;和转录终止子,其中启动子与DNA构建物可操作连接,而DNA构建物与转录终止子可操作连接。
在另一个方面,本发明提供了包含上文公开的表达载体的培养细胞,其中所述细胞表达该DNA构建物编码的多肽。
在另一个方面,本发明提供了产生融合蛋白的方法,包括培养上文公开的细胞;并分离细胞产生的多肽。
在另一个方面,本发明提供了包含与选自下组的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸残基序列的分离多肽(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ IDNO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列,其中氨基酸同一性百分比使用FASTA程序进行测定,其中ktup=1,缺口开放罚分=10,缺口延伸罚分=1,取代矩阵=BLOSUM62,其它参数为缺省值。在一个实施方案中,上文公开的分离多肽包含选自下组的氨基酸残基序列(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列。在另一个实施方案中,上文公开的分离多肽由选自下组的氨基酸残基序列组成(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ IDNO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列。在另一个实施方案中,上文公开的分离多肽还包含WSXWS基元。在另一个实施方案中,上文公开的分离多肽还包含跨膜结构域。在另一个实施方案中,上文公开的分离多肽还包含跨膜结构域,其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO2的第238位(Leu)至第255位(Leu)残基组成。在另一个实施方案中,上文公开的分离多肽还包含胞内结构域。在另一个实施方案中,上文公开的分离多肽还包含胞内结构域,其中所述胞内结构域由SEQ ID NO2的第256位(Lys)至第538位(Ser)残基组成。在另一个实施方案中,上文公开的分离多肽还包含胞内结构域,其中所述胞内结构域还包含BoxI和BoxII位点。
在另一个方面,本发明提供了产生zalpha11多肽的方法,包括培养上文公开的细胞;并分离细胞产生的zalpha11多肽。
在另一个方面,本发明提供了包含选自下组的氨基酸序列的分离多肽(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;其中所述多肽基本上不含通常与造血受体相关的跨膜和胞内结构域。在另一个实施方案中,上文公开的分离多肽包含亲和标签。
在另一个方面,本发明提供了产生zalpha11多肽的方法,包括培养上文公开的细胞;并分离细胞产生的zalpha11多肽。
在另一个方面,本发明提供了产生针对zalpha11多肽的抗体的方法,包括用选自下组的多肽接种动物(a)由9至519个氨基酸组成的多肽,其中所述多肽包含SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)中的连续氨基酸序列;(b)包含SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)的氨基酸序列的多肽;(c)包含SEQ ID NO2中第101位氨基酸(Leu)至第122位氨基酸(Gly)的氨基酸序列的多肽;(d)包含SEQ ID NO2中第141位氨基酸(Asn)至第174位氨基酸(Ala)的氨基酸序列的多肽;(e)包含SEQ ID NO2中第193位氨基酸(Cys)至第261位氨基酸(Val)的氨基酸序列的多肽;(f)包含SEQ ID NO2中第51位氨基酸(Trp)至第61位氨基酸(Glu)的氨基酸序列的多肽;(g)包含SEQ ID NO2中第136位氨基酸(Ile)至第143位氨基酸(Glu)的氨基酸序列的多肽;(h)包含SEQID NO2中第187位氨基酸(Pro)至第195位氨基酸(Ser)的氨基酸序列的多肽;(i)包含SEQ ID NO2中第223位氨基酸(Phe)至第232位氨基酸(Glu)的氨基酸序列的多肽;和(j)包含SEQ ID NO2中第360位氨基酸(Glu)至第368位氨基酸(Asp)的氨基酸序列的多肽;其中所述多肽在动物体内引发免疫应答而产生抗体;并由动物分离抗体。
在另一个方面,本发明提供了通过上文公开的方法产生的、可特异结合zalpha11多肽的抗体。在一个实施方案中,上文公开的抗体是单克隆抗体。
在另一个方面,本发明提供了可特异结合上文公开的多肽的抗体。
在另一个方面,本发明提供了检测待测样品中zalpha11蛋白质活性调节剂的存在的方法,包括培养导入了上文公开的表达载体的细胞,其中所述细胞在待测样品存在和不存在时表达DNA片段编码的zalpha11蛋白质;并通过生物学或生物化学实验比较在待测样品存在和不存在时zalpha11的活性水平;并由比较结果确定待测样品中zalpha11活性调节剂的存在情况。
在另一个方面,本发明提供了用于检测待测样品中zalpha11受体配基的方法,包括将待测样品与包含SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列的多肽接触;并检测样品中多肽与配基的结合。在一个实施方案中,上文公开的方法还包括包含跨膜和胞内结构域的多肽。在另一个实施方案中,上文公开的方法还包括在培养细胞中是膜结合型的多肽,而且检测步骤包括测量培养细胞中的生物学应答。在另一个实施方案中,上文公开的方法还包括在培养细胞中是膜结合型的多肽,而且检测步骤包括测量培养细胞中的生物学应答,其中生物学应答是细胞增殖或报导基因的转录激活。在另一个实施方案中,上文公开的方法还包括固定在固体支持物上的多肽。
本发明的这些和其它方面由下面的发明详述将变得显而易见。
图的简要描述

图1是人类zalpha11的Hopp/Woods亲水性图。
图2是人类zalpha11(zalpha)(SEQ ID NO2)和小鼠zalpha11(muzalp)(SEQ ID NO85)的比对。
发明详述在开始详细描述本发明之前,定义下列术语可能有助于理解术语“亲和标签”在此用于指能够结合到第二种多肽上、以利于第二种多肽的纯化或检测或者为第二种多肽与底物的结合提供位点的多肽片段。原则上,可获得抗体或其它特异结合剂的任何肽或蛋白质都可以作为亲和标签使用。亲和标签包括多聚组氨酸片段、蛋白A(Nilsson等人,欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)41075,1985;Nilsson等人,酶学方法(Methods Enzymol.)1983,1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson,基因(Gene)6731,1988)、谷氨酸-谷氨酸亲和标签(Grussenmeyer等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)827952-4,1985)、P物质、FlagTM肽(Hopp等人,生物技术(Biotechnology)61204-10,1988)、链霉亲和素结合肽、或者其它抗原性表位或结合结构域。通常参阅Ford等人,蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)295-107,1991。编码亲和标签的DNA可以由供应商处购买(如Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。
术语“等位变体”在此用于指占据相同染色体基因座的基因的两种或多种变换形式中的任一种。等位变异是通过突变自然发生的,而且可能导致种群内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(即编码的多肽没有变化),或者编码氨基酸序列改变了的多肽。术语“等位变体”在此也用于指由基因的等位变体编码的蛋白质。
术语“氨基末端”和“羧基末端”在此用于指多肽中的位置。在本文允许的范围内,这些术语用于指参照多肽特定序列或部分的接近度或相对位置。例如,位于多肽中参照序列羧基末端的序列即位于参照序列羧基末端附近,而不必在完整多肽的羧基末端。
术语“互补物/反互补物对”指在适当条件下形成非共价结合的稳定对的不同部分。例如,生物素和抗生物素蛋白(或链霉亲和素)是互补物/反互补物对的典型成员。其它例示性互补物/反互补物对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对、等等。在需要随后解离的互补物/反互补物对中,优选互补物/反互补物对的结合亲和力小于109M-1。
术语“多核苷酸分子的互补物”是具有与参照序列反向互补的碱基序列的多核苷酸分子。例如,序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT3′是互补的。
术语“毗连序列”指具有与另一多核苷酸相同或互补的邻接序列的多核苷酸。邻接序列与多核苷酸序列的完整给定部分或其部分“重叠”。例如,多核苷酸序列5′-ATGGCTTAGCTT-3′的代表性毗连序列是5′-TAGCTTgagtct-3′和3′-gtcgacTACCGA-5′。
术语“简并核苷酸序列”指包含一种或多种简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子包含不同的核苷酸三联体,但是编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体都编码Asp)。
术语“表达载体”用于指包含与用于其转录的附加片段可操作连接的、编码感兴趣多肽的片段的线性或环状DNA分子。这些附加片段包括启动子和终止子序列,还可以包括一种或多种复制起点、一种或多种选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号、等等。表达载体通常由质粒或病毒DNA衍生得到,或者可能包含二者的成分。
术语“分离的”当用于多核苷酸分子时,指多核苷酸分子已从其天然遗传环境中脱离,由此不含其它多余的或不想要的编码序列,并处于适用于基因工程化蛋白生产系统的形式。这样的分离分子是那些脱离其天然环境的分子,包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含通常相关的其它基因,但是可以包含天然存在的5′和3′非翻译区,诸如启动子和终止子。相关区域的鉴定对于本领域普通技术人员而言是显而易见的(例如参阅Dynan和Tijan,自然(Nature)316774-8,1985)。
“分离的”多肽或蛋白质是处于其天然环境之外的条件下的多肽或蛋白质,诸如脱离于血液和动物组织。在优选的形式中,分离多肽基本上不含其它多肽,尤其是动物来源的其它多肽。优选提供高纯度的多肽,即超过95%纯,更优选超过99%纯。应用于本文时,术语“分离的”不排除相同多肽以其它物理形式存在,如二聚体或者糖基化的或衍生的形式。
术语“可操作连接”在指DNA片段时,表示片段的比对使得其功能与目的一致,如转录起始于启动子并贯穿编码序列至终止子。
术语“定向进化同源物”(ortholog)指由一个物种获得的、是来自另一物种的多肽或蛋白质的功能对应物的多肽或蛋白质。定向进化同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
“平行进化同源物”(paralog)是由有机体产生的不同的但又结构相关的蛋白质。平行进化同源物被认为是通过基因重复产生的。例如α-珠蛋白、β-珠蛋白、和肌红蛋白互为平行进化同源物。
“多核苷酸”是由5’末端读至3’末端的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA,可以由天然来源分离得到、体外合成、或由天然和合成分子组合制备。多核苷酸的大小以碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)、或千碱基(“kb”)表述。只要本文允许,后两种术语可以描述单链或双链的多核苷酸。当该术语应用于双链分子时,指的是全长,而且应理解为等同于术语“碱基对”。本领域技术人员将认识到双链多核苷酸的两条链长度可以略有不同,而且其末端可能因酶切形成交错切口状;由此双链多核苷酸分子中的所有核苷酸不一定配对。
“多肽”是天然产生或合成的、以肽键连接的氨基酸残基的多聚体。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。
术语“启动子”在此用于其本领域公认的含义,指含有可结合RNA聚合酶并起始转录的DNA序列的基因部分。启动子序列通常(而非总是)位于基因的5’非编码区。
“蛋白质”是包含一条或多条多肽链的大分子。蛋白质还可以包含非肽成分,诸如糖基。糖和其它非肽取代基可以由产生蛋白质的细胞加到该蛋白质上,且随细胞类型而变化。蛋白质在此以其氨基酸主链结构定义;诸如糖基等取代基通常不特别指明,但仍可能存在。
术语“受体”在此用于指可结合生物活性分子(即配体)并介导配体对细胞的作用的细胞相关蛋白,或其多肽亚基。配体与受体的结合导致受体的构象变化(而且在某些情况中导致受体多聚体化,即相同或不同受体亚基的结合),从而引起效应子结构域与细胞中其它分子间的相互作用。由此这些相互作用导致细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用有关的代谢活动包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、细胞增殖、环腺苷酸产量的提高、细胞钙的转移、膜脂的移动、细胞粘附、肌醇脂的水解、和磷脂的水解。细胞表面细胞因子受体的特征是多结构域结构,下文有更详细的讨论。这些受体通过跨膜结构域锚定在细胞膜中,跨膜结构域的特征为疏水氨基酸序列,通常大约21-25个残基,而且通常侧翼为带正电的残基(Lys或Arg)。一般而言,受体可以是膜结合的、胞质的、或核的;单体的(如促甲状腺素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体的(如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体、和IL-6受体)。术语“受体多肽”用于指完整受体多肽链及其部分,包括分离的功能结构域(如配体结合结构域)。
术语“分泌信号序列”是编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列,该多肽作为更大多肽的组分,指导该更大多肽通过合成它的细胞的分泌途径。在通过分泌途径转运的过程中,该更大多肽通常被切割而除去分泌肽。
“可溶性受体”是不结合在细胞膜上的受体多肽。可溶性受体通常是缺少跨膜和胞内结构域的结合配体的受体多肽。可溶性受体可以包含其它氨基酸残基,诸如有助于多肽纯化或提供多肽与底物结合位点的亲和标签或免疫球蛋白恒定区序列。许多细胞表面受体具有通过蛋白水解产生的天然可溶性对应物。当可溶性受体多肽缺少足够部分的跨膜和胞内多肽片段以提供膜锚定或信号转导时,被称为基本上不含这些片段。
术语“剪接变体”在此用于指由基因转录得到的RNA的可互换形式。剪接变体一般通过利用转录RNA分子内(或较少情况下是分别转录的RNA分子之间)的可互换剪接位点而天然产生,并且可能导致由同一基因转录得到几种mRNA。剪接变体可能编码具有不同氨基酸序列的多肽。术语剪接变体在此还用于指由基因转录得到的mRNA的剪接变体编码的蛋白质。
通过不精确分析法(如凝胶电泳)测定的多聚体分子量和长度应理解为近似值。当这种值以“大约”X或“大致”X表述时,所述X值应理解为精确至±10%。
此处引用的所有参考文献均完整引用作为参考。
本发明部分根据编码具有I型细胞因子受体结构的蛋白质的新DNA序列的发现。其推导的氨基酸序列显示,编码的受体属于包括IL-2受体β-亚基和β-通用受体(即IL-3、IL-5、和GM-CSF受体β-亚基)的受体亚家族。对应于此新DNA的mRNA的组织分布分析显示在淋巴结、外周血白细胞(PBL)、脾、和胸腺中的表达。此外,mRNA在由Burkitt氏白瘤衍生的Raji细胞系(ATCC编号CCL-86)中含量丰富。此多肽已经命名为zalpha11。
本发明的新的zalpha11多肽最初是通过检索EST数据库进行鉴定的。发现了一个EST,并对其相应cDNA进行了测序。此cDNA编码的新多肽显示与I型细胞因子受体具有同源性。zalpha11多核苷酸序列编码预测蛋白质的完整编码序列。zalpha11是可能涉及凋亡细胞途径、细胞-细胞信号分子、生长因子受体、或具有生长因子激素活性的胞外基质相关蛋白质等等的新的细胞因子受体。
由包含zalpha11多肽相应多核苷酸序列的单个克隆推导出了zalpha11多肽的序列。此克隆由脊髓文库获得。也可以为了这些序列搜索其它文库,包括PBL、胸腺、脾、淋巴结、人类红白血病细胞系(如TF-1)、Raji细胞、急性单核细胞白血病细胞系、其它淋巴样和造血细胞系、等等。
代表性zalpha11编码DNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO1(第69位至第1682位核苷酸),其推导的538个氨基酸序列显示于SEQ ID NO2。从整体看,zalpha11多肽(SEQ ID NO2)代表全长多肽片段(SEQID NO2的第1位残基(Met)至第538位残基(Ser))。zalpha11多肽的结构域和结构特征由下文进一步描述。
SEQ ID NO1的DNA序列编码的zalpha11多肽的分析揭示了,编码538个氨基酸(SEQ ID NO2)的开放阅读框架,包含19个氨基酸残基的预测分泌信号肽(SEQ ID NO2的第1位残基(Met)至第19位残基(Gly))和519个氨基酸的成熟多肽(SEQ ID NO2的第20位残基(Cys)至第538位残基(Ser))。除了对应于SEQ ID NO2的第214位至第218位残基的WSXWS基元(SEQ ID NO3),该受体还包含大致200个氨基酸残基的细胞因子结合结构域(SEQ ID NO2的第20位残基(Cys)至第237位残基(His));结构域接头(SEQ ID NO2的第120位(Pro)至第123位(Pro)残基);次末端链区(SEQ ID NO2的第192位(Lys)至第202位(Ala)残基);跨膜结构域(SEQ ID NO2的第238位(Leu)至第255位(Leu)残基);包含“BoxI”信号位点(SEQ ID NO2的第267位(Ile)至第273位(Pro)残基)和“BoxII”位点(SEQ ID NO2的第301位(Leu)至第304位(Gly)残基)的完整胞内信号结构域(SEQID NO2的第256位(Lys)至第538位(Ser)残基)。本领域技术人员将领会,这些结构域的边界是近似的,而且是根据与已知蛋白质的比对和蛋白质折叠的预测得出的。除了这些结构域,编码受体中的保守受体特征包括(如SEQ ID NO2所示)位于第138位的保守Trp残基,和位于第201位的保守Arg残基。编码上述zalpha11多肽区、结构域、基元、残基、和序列的相应多核苷酸显示于SEQ ID NO1。
跨膜区、以及保守和低变基元的存在通常确定了蛋白质中的重要结构区或与之有关。低变区(如疏水簇)通常存在于结构重要区中(P.Sheppard等人,见上文)。这些低变区常常包含少见或不常见的氨基酸,诸如色氨酸。位于这些保守且低变的基元侧翼或之间的区域可能更易变化,但是常常具有重要功能,因为它们可能确定了重要结构和活性或与之有关,诸如结合结构域、生物活性和酶活性、信号转导、细胞-细胞相互作用、组织定位结构域、等等。
上述zalpha11中的保守氨基酸残基区域可以作为工具,用于鉴别新的家族成员。例如,可以使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)由RNA(由各种组织来源或细胞系获得)扩增编码保守区的序列。具体而言,根据zalpha11序列设计的高度简并引物可以用于此目的。本领域技术人员可以容易的进行这些简并引物的设计和使用。
本发明提供了编码此处公开的zalpha11多肽的多核苷酸分子,包括DNA和RNA分子。本领域技术人员将领会,考虑到遗传密码的简并性,在这些多核苷酸分子中可能存在可观的序列变异。SEQ ID NO4是包含编码SEQ ID NO2的zalpha11多肽的所有DNA的简并DNA序列。本领域技术人员将领会,通过用U取代T,SEQ ID NO4的简并序列还提供了编码SEQ ID NO2的所有RNA序列。由此,本发明涵盖包含SEQ ID NO4的第1位核苷酸至第1614位核苷酸的zalpha11多肽编码多核苷酸及其RNA相当物。表1列出了SEQ ID NO4中用于表示简并核苷酸位置的单字母密码。“解析”指密码字母表示的核苷酸。“互补物”指互补核苷酸代码。例如,密码Y指C或T,其互补物R指A或G,A与T互补,G与C互补。表1核苷酸解析 互补物解析A A T TC C G GG G C CT T A AR A|G Y C|TY C|T R A|GM A|C K G|TK G|T M A|CS C|G S C|GW A|T W A|TH A|C|T D A|G|TB C|G|T V A|C|GV A|C|G B C|G|TD A|G|T H A|C|TN A|C|G|T N A|C|G|T
表2列出了SEQ ID NO4中使用的涵盖给定氨基酸的所有可能密码子的简并密码子。表2氨基酸 单字母密码 密码子简并密码子Cys C TGC TGT TGYSer S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSNThr T ACA ACC ACG ACT ACNPro P CCA CCC CCG CCT CCNAla A GCA GCC GCG GCT GCNGly G GGA GGC GGG GGT GGNAsn N AAC AAT AAYAsp D GAC GAT GAYGlu E GAA GAG GARGln Q CAA CAG CARHis H CAC CAT CAYArg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGNLys K AAA AAG AARMet M ATG ATGIle I ATA ATC ATT ATHLeu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTNVal V GTA GTC GTG GTT GTNPhe F TTC TTT TTYTyr Y TAC TAT TAYTrp W TGG TGGTer TAA TAG TGA TRRAsn|Asp B RAYGlu|Gln Z SARAny X NNN
本领域普通技术人员将领会,在确定代表编码每种氨基酸的所有可能密码子的简并密码子时引入了模糊用法。例如,丝氨酸的简并密码子(WSN)有时编码精氨酸(AGR),而编码精氨酸的简并密码子(MGN)有时编码丝氨酸(AGY)。编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间也存在相似的相互关系。由此,简并序列涵盖的一些多核苷酸可能编码氨基酸序列变体,但本领域普通技术人员参照SEQ ID NO2的氨基酸序列能够容易的鉴定这些变体序列。可以容易的检验变体序列有无此处所述功能。
本领域普通技术人员还将领会,不同物种可能展示“偏爱密码子用法”。通常参阅Grantham等人,核酸研究(Nuc.Acids Res.)81893-1912,1980;Haas等人,现代生物学(Curr.Biol.)6315-324,1996;Wain-Hobson等人,基因(Gene)13355-364,1981;Grosjean和Fiers,基因(Gene)18199-209,1982;Holm,核酸研究(Nuc.Acids Res.)143075-3087,1986;Ikemura,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)158573-597,1982。如此处所用,术语“偏爱密码子用法”或“偏爱密码子”是专业术语,指在特定物种的细胞中最常用的蛋白质翻译密码子,由此偏爱使用编码每种氨基酸的可能密码子(见表2)中代表性的一种或几种。例如,苏氨酸可以由ACA、AAC、ACG、或ACT编码,但是在哺乳动物细胞中ACC是最常用的密码子;在其它物种(例如昆虫细胞、酵母、病毒、或细菌)中,可能偏爱不同的苏氨酸密码子。通过本领域已知的多种方法可以将特定物种的偏爱密码子导入本发明的多核苷酸。将偏爱密码子序列导入重组体DNA,可以例如通过使特定细胞类型或物种中的蛋白质翻译效率更高而增加蛋白质的产量。因此,SEQ ID NO4中公开的简并密码子序列可以作为模板,用于优化多核苷酸在本领域常用的和此处公开的多种细胞类型和物种中的表达。可以检验并优化包含偏爱密码子的序列在各物种中的表达,并检验此处公开的功能。
在本发明的优选实施方案中,分离多核苷酸在严谨条件下可与SEQID NO1的相似大小区域或其互补序列发生杂交。选择的严谨条件一般比特定序列在定义的离子强度和pH的热解链温度(Tm)低大约5℃。Tm是(在定义的离子强度和pH下)50%靶序列与完全配对的探针发生杂交的温度。本领域已知大量的用于计算Tm的公式,而且对于DNA、RNA、DNA-RNA杂合体、和不同长度的多核苷酸探针序列是特异的(参阅例如Sambrook等人,《分子克隆实验室手册(Molecular CloningALaboratory Manual)》,第2版,冷泉港出版社,1989;Ausubel等人(编),《分子生物学现行方案(Current Protocols in MolecularBiology)》,John Wiley and Sons公司,1987;Berger和Kimmel(编),《分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)》,Academic Press公司,1987;和Wetmur,生物化学和分子生物学评论和回顾(Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.)26227,1990)。序列分析软件,诸如OLIGO 6.0(LSR;Long Lake,MN)和Primer Premier4.0(Premier Biosoft Internatioal;Palo Alto,CA),以及因特网站点,是可获得的用于分析给定序列并根据用户定义的标准计算Tm的工具。这些程序还可以在定义的条件下分析给定序列并鉴定合适的探针序列。通常,较长多核苷酸序列(如大于50碱基对)的杂交在比计算的Tm低大约20-25℃的温度进行。对于较小探针(如小于50碱基对)的杂交,通常在Tm或低于Tm5-10℃进行。这产生DNA-DNA和DNA-RNA杂合体的最大杂交速率。通过加入甲酰胺可以实现于较低温度下的更高严谨度,缓冲液中每含1%的甲酰胺,杂合体的Tm就降低大约1℃。适当的严谨杂交条件相当于在包含下列成分的溶液中于大约42℃温育大约5小时至过夜大约40-50%甲酰胺、高达大约6X SSC、大约5X Denhardt氏溶液、0-大约10%硫酸葡聚糖、和大约10-20μg/ml变性的商品化载体DNA。这些严谨条件通常包括20-70℃的温度和含高达6X SSC和0-50%甲酰胺的杂交缓冲液;杂交后将滤膜在高达大约2XSSC中清洗。例如,适当的清洗严谨度相当于0.1X-2X SSC、0.1%SDS,于55-65℃进行。在杂交和清洗过程中可以使用不同的严谨度以实现与靶序列的最大特异性的结合。杂交后的清洗通常于递增的严谨度进行从而由杂交复合物除去未杂交的多核苷酸探针。严谨的杂交和清洗条件取决于探针的长度(反映在Tm上)、使用的杂交液和清洗液,而且本领域技术人员凭经验可以常规确定。
如上所述,本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。制备DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。RNA通常由产生大量zalpha11 RNA的组织或细胞分离得到。这样的组织和细胞可通过Northern印迹进行鉴定(Thomas,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)775201,1980),而且包括PBL、脾、胸腺、和淋巴组织、Raji细胞、人类红白血病细胞系(如TF-1)、急性单核细胞白血病细胞系、其它淋巴样和造血细胞系、等等。总RNA可以使用异硫氰酸胍提取、随后通过CsCl梯度离心分离而制备(Chirgwin等人,生物化学(Biochemistry)1852-94,1979)。poly(A)+RNA使用Aviv和Leder的方法(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)691408-1412,1972)由总RNA制备。互补DNA(cDNA)使用已知方法由poly(A)+RNA制备。在另一方法中,可以分离得到基因组DNA。然后通过例如杂交或聚合酶链式反应(PCR)(Mullis,美国专利,4,683,202)鉴定并分离编码zalpha11多肽的多核苷酸。
编码zalpha11的全长克隆可以通过常规克隆步骤获得。优选互补DNA(cDNA)克隆,但是对于某些应用(如转基因动物表达),可能优选使用基因组克隆,或者对cDNA克隆进行修饰,使之包含至少一个基因组内含子。制备cDNA和基因组克隆的方法在本领域是众所周知的,且在普通技术人员的水平之内,包括使用此处公开的序列或其部分作为文库的探针或引物。表达文库可以用针对zalpha11的抗体、受体片段、或其它特异性结合配偶体进行探查。
本发明的多核苷酸还可以使用DNA合成仪进行合成。目前的首选方法是亚磷酰胺法。如果诸如合成基因或基因片段这样的应用需要化学合成的双链DNA,那么将分别合成每条互补链。短多核苷酸(60-80bp)的合成采用的是直接合成技术,而且可以通过合成互补链、然后使之退火而完成。但是合成较长的多核苷酸(大于300bp)通常采用特殊策略,因为DNA化学合成过程中的每个循环的偶联效率一般达不到100%。为了解决这个问题,合成基因(双链)由长度为20-100个核苷酸的单链片段以模块形式装配而成。
构建合成基因的方法之一需要先产生一套重叠的互补寡核苷酸,它们每个的长度都在20-60个核苷酸之间。基因的每个内在部分都具有为与邻近部分准确碱基配对而设计的互补3’和5’末端延伸片段。由此,基因装配后,通过用T4 DNA连接酶沿着两条链的主链封闭缺口完成加工。除了蛋白质编码序列,合成基因还可以设计成包含有利于插入克隆载体的限制性内切酶位点的末端序列。此外,还可以加入包含适于转录和翻译起始与终止信号的其它序列。
制备全长基因的另一种方法是合成一套特定的重叠寡核苷酸(40-100个核苷酸)。当3’和5’短重叠互补区(6-10个核苷酸)退火后,仍留下较大缺口,但是短碱基配对区的长度和稳定性都足以维持结构的完整性。通过E.coliDNA聚合酶I的酶促DNA合成作用填补缺口,从而得到完整的DNA双链体。酶促合成完成后,用T4 DNA连接酶封闭切口。随后将双链构建物依次连接,形成完整基因序列,通过DNA序列分析进行检验。参见Glick和Pasternak,《重组体DNA的分子生物技术、原理和应用(Molecular Biotechnology,Principles & Applications ofRecombinant DNA)》,ASM出版社,Washington特区,1994;Itakura等人,生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem.)53323-56,1984;和Climie等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87633-7,1990。
本发明还提供了来自其它物种的对应多肽和多核苷酸(定向进化同源物)。这些物种包括(但不限于)哺乳动物、鸟类、两栖类、爬行动物、鱼类、昆虫、和其它脊椎动物和无脊椎动物。特别感兴趣的是来自其它哺乳动物的zalpha11多肽,包括鼠、猪、羊、牛、犬、猫、马、及其它灵长类动物的多肽。人类zalpha11的定向进化同源物可以结合使用本发明提供的信息和组合物以及常规克隆技术而克隆得到。例如,可以使用由此处公开的表达zalpha11的组织或细胞类型获得的mRNA克隆得到cDNA。可以通过使用根据此处公开的序列设计的探针探查Northern印迹从而鉴定mRNA的合适来源。然后由阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。然后可以通过多种方法分离编码zalpha11的cDNA,诸如通过使用完整或部分人类cDNA或基于公开序列的一套或多套简并探针的探查。还可以使用PCR克隆cDNA(Mullis,见上文),所用引物根据此处公开的代表性人类zalpha11序列设计。在另一种方法中,cDNA文库可以用于转化或转染宿主细胞,而感兴趣cDNA的表达可以用针对zalpha11多肽的抗体进行检测。类似的技术也可以用于分离基因组克隆。
细胞因子受体亚基的特征为包含胞外结构域、将多肽锚定在细胞膜中的跨膜结构域、和胞内结构域的多结构域结构。胞外结构域可以是配体结合结构域,胞内结构域可以是涉及信号转导的效应物结构域,但是配体结合和效应物功能可以属于多聚体受体的不同亚基。配体结合结构域自身可以是多结构域结构。多聚体受体包括同型二聚体(如PDGF受体αα和ββ同工型、红细胞生成素受体、MPL、和G-CSF受体)、每个都具有配体结合和效应物结构域的异型二聚体(如PDGF受体αβ同工型)、和具有不同功能的亚基组成的多聚体(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、和GM-CSF受体)。有些受体亚基是多种受体公用的。例如,自身不能结合配体但是包含胞内信号转导结构域的AIC2B亚基是IL-3和GM-CSF受体的组分。基于结构和功能,许多细胞因子受体可以属于四种相关家族之一。例如造血受体的特征为存在包含保守半胱氨酸残基和WSXWS基元的结构域(SEQ ID NO3)。关于细胞因子受体结构的综述见Urdal,医学化学年度报告(Ann.Reports Med.Chem.)26221-228,1991和Cosman,细胞因子(Cytokine)595-106,1993。在施加于有机体以获得新的生物学功能的选择压力下,有可能由现有受体基因的复制得到新的受体家族成员,导致多基因家族出现。由此家族成员包含祖先基因的遗迹,而且这些特征性特点可以应用于其它家族成员的分离和纯化。由此,细胞因子受体超家族细分成几个家族,例如免疫球蛋白家族(包括CSF-1、MGF、IL-1、和PDGF受体);造血家族(包括IL-2受体β-亚基、GM-CSF受体α-亚基、GM-CSF受体β-亚基;和G-CSF、EPO、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、和IL-9受体);TNF受体家族(包括TNF(p80)TNF(p60)受体、CD27、CD30、CD40、Fas、和NGF受体)。
zalpha11的序列分析暗示它与IL-2受体β-亚基、IL-3、IL-4、和IL-6受体属于同一受体亚家族。此亚家族中的某些受体(如G-CSF)结合形成转导信号的同型二聚体。此亚家族的其它成员(如IL-6、IL-11、和LIF受体)与第二种亚基(称为β-亚基)联合以结合配体并转导信号。特定的β-亚基结合多种特定细胞因子受体亚基。例如,β-亚基gp130(Hibi等人,细胞(Cell)631149-1157,1990)结合IL-6、IL-11、和LIF特异的受体亚基(Gearing等人,欧洲分子生物学杂志(EMBO.J.)102839-2848,1991;Gearing等人,美国专利号5,284,755)。制瘤素M结合LIF受体和gp130的异型二聚体。CNTF结合包含CNTF受体、LIF受体、和gp130亚基的三聚受体。
人类zalpha11的小鼠定向进化同源物的多核苷酸序列已经鉴定并显示于SEQ ID NO84,而对应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO85。SEQ ID NO84的DNA序列编码的小鼠zalpha11多肽的分析揭示了编码529个氨基酸(SEQ ID NO85)的开放阅读框架,其包含19个氨基酸残基的预测分泌信号肽(SEQ ID NO85的第1位残基(Met)至第19位残基(Ser))和510个氨基酸的成熟多肽(SEQ ID NO2的第20位残基(Cys)至第529位残基(Ser))。除了对应于SEQ ID NO85的第214位至第218位残基的WSXWS基元(SEQ ID NO3),受体还包含大致200个氨基酸残基的细胞因子结合结构域(SEQ ID NO85的第20位残基(Cys)至第237位残基(His));结构域接头(SEQ ID NO85的第120位(Pro)至第123位(Pro)残基);次末端链区(SEQ ID NO85的第192位(Lys)至第202位(Ala)残基);跨膜结构域(SEQ ID NO85的第238位(Met)至第254位(Leu)残基);包含“BoxI”信号位点(SEQ ID NO85的第266位(Ile)至第273位(Pro)残基)和“BoxII”位点(SEQ ID NO85的第301位(Ile)至第304位(Val)残基)的完整胞内信号结构域(SEQ ID NO85的第255位(Lys)至第529位(Ser)残基)。人类和小鼠氨基酸序列的比较揭示了人类多肽和定向进化同源物多肽都包含上述对应结构特征(见图2)。小鼠zalpha11的成熟序列起始于Cys20(如SEQ ID NO85所示),对应于人类序列的Cys20(如SEQID NO2所示)。小鼠和人类序列的完整氨基酸序列(对应于SEQ ID NO2和SEQ ID NO85)之间存在大约63%的同一性。小鼠和人类zalpha11序列的胞外细胞因子结合结构域(对应于SEQ ID NO2的第20位(Cys)至第237位(His)残基和SEQ ID NO85的第20位(Cys)至第237位(His)残基)之间存在大约69%的同一性。小鼠和人类zalpha11序列的胞内信号结构域(对应于SEQ ID NO2的第256位(Lys)至第538位(Ser)残基和SEQ ID NO85的第255位(Lys)至第529位(Ser)残基)之间存在大约60%的同一性。上述同一性百分比是使用FASTA程序进行测定的,其中ktup=1,缺口开放罚分=12,缺口延伸罚分=2,取代矩阵=BLOSUM62,其它参数为缺省值。编码小鼠zalpha11多肽区、结构域、基元、残基、和序列的对应多核苷酸显示于SEQ ID NO84。
本领域技术人员将领会,SEQ ID NO1中公开的序列代表了人类zalpha11的单一等位基因,而且等位基因变异和其它剪接也在预料之中。该序列的等位基因变体可以通过根据标准步骤探查来自不同个体的cDNA或基因组文库进行克隆。SEQ ID NO1所示DNA序列的等位基因变体(包括包含沉默的和导致氨基酸序列变化的变异的那些变体)都属于本发明范围之内,SEQ ID NO2的等位基因变体蛋白质也一样。由其它剪接的mRNA产生的、保留了zalpha11多肽的特性的cDNA包括在本发明范围之内,这些cDNA和mRNA编码的多肽也一样。这些序列的等位基因变体和剪接变体可以通过根据本领域已知的标准步骤探查来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库进行克隆。
本发明还提供了与SEQ ID NO2的多肽及其定向进化同源物基本相似的分离zalpha11多肽。术语“基本相似”在此用于指与SEQ ID NO2所示序列或其定向进化同源物具有至少70%、更优选至少80%的序列同一性的多肽。这些多肽更优选与SEQ ID NO2或其定向进化同源物至少90%、更优选至少95%或更多相同。序列同一性百分比通过常规方法进行确定。参阅如Altschul等人,数学生物学公告(Bull.Math.Bio.)48603-616,1986和Henikoff和Henikoff,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910915-10919,1992。简而言之,使用缺口开放罚分为10,缺口延伸罚分为1,和表3(氨基酸由标准单字母密码表示)所示的Henikoff和Henikoff(同上)的“blosum 62”评分矩阵对此两氨基酸序列进行比对,使比对得分最优化。然后如下计算同一性百分比 表3A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R -1 5N -2 0 6D -2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q -1 1 0 0 -3 5E -1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
使用上述比率通过相似方法测定多核苷酸分子的序列同一性。
本领域技术人员将领会,已经建立了许多种算法,可以用于比对两种氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是用于检验此处公开的氨基酸序列与假定变体zsig57氨基酸序列的同一性水平的合适蛋白质比对方法。Pearson和Lipman,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444,1988和Pearson,酶学方法(Meth.Enzymol.)18363,1990描述了FASTA算法。
简而言之,FASTA首先通过鉴定检索序列(如SEQ ID NO2)与具有最高同一性密度(如果ktup变量是1)或同一性配对(如果ktup=2)的待测序列的共享区而描绘序列相似性,而不考虑保守氨基酸取代、插入、或删除。然后使用氨基酸取代矩阵,通过比较所有配对氨基酸的相似性,对具有最高同一性密度的10个区域重新进行评分,并修剪”各区域末端使之只包含有助于最高得分的那些残基。如果几个区域的得分超过“临界”值(由根据序列长度和ktup值预先确定的公式计算),则检验经修剪的最初区域,以确定这些区域是否可以连接形成包含缺口的大致比对。最后,使用经修正的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48444,1970;Sellers,SIAM应用数学杂志(SIAM J.Appl.Math)26787,1974)比对两种氨基酸序列的最高得分区,其中允许氨基酸插入和删除。用于FASTA分析的优选参数是ktup=1,缺口开放罚分=10,缺口延伸罚分=1,取代矩阵=BLOSUM62,其它参数为缺省值。如Pearson,酶学方法(Meth.Enzymol.)18363,1990的附录2解释的,可以通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)将这些参数导入FASTA程序。
FASTA还可以使用上述比率测定核酸分子的序列同一性。对于核苷酸序列比较,ktup值的范围为1-6,优选3-6,最优选3,其它参数为缺省值。
BLOSUM62表(表3)是由代表超过500组相关蛋白质的高度保守区的蛋白质序列片段的大约2,000种局部多重比对衍生得到的氨基酸取代矩阵(Henikoff和Henikoff,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910915,1992)。相应的,BLOSUM62取代频率可以用于定义可以导入本发明氨基酸序列中的保守氨基酸取代。虽然可能仅仅根据化学特性设计氨基酸取代(如下文讨论的),术语“保守氨基酸取代”优选指BLOSUM62值大于-1表示的取代。例如,如果氨基酸取代的特征是BLOSUM62值为0、1、2、或3,则此取代是保守的。根据该系统,优选的保守氨基酸取代的特征为BLOSUM62值至少是1(如1、2、或3),而最优选的保守氨基酸取代的特征为BLOSUM62值至少是2(如2或3)。
zalpha11多肽变体或基本同源的zalpha11多肽的特征为具有一个或多个氨基酸的取代、删除、或加入。这些变化优选是微小性质的变化,即是保守氨基酸取代(见表4)和其它不会严重影响多肽折叠或活性的取代;小的删除,一般为1-大约30个氨基酸的缺失;和小的氨基或羧基末端延伸,诸如氨基末端甲硫氨酸残基,多达大约20-25个残基的小接头肽,或亲和标签。本发明由此包括大约489-大约568个氨基酸残基的、包含与SEQ ID NO2的相应区域至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、或更多相同的序列的多肽。含亲和标签的多肽还可以在zalpha11多肽和亲和标签之间包含蛋白水解切割位点。合适的位点包括凝血酶切割位点和Xa因子切割位点。表4保守氨基酸取代碱性氨基酸精氨酸赖氨酸组氨酸酸性氨基酸谷氨酸天冬氨酸极性氨基酸谷氨酰胺天冬酰胺疏水氨基酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸芳香族氨基酸 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小氨基酸 甘氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸本发明还提供了多种其它多肽融合体和包含一种或多种多肽融合体的相关多聚体蛋白质。例如,可以如美国专利号5,155,027和5,567,584公开的制备zalpha11多肽与二聚化蛋白质的融合体。这方面的优选二聚化蛋白质包括免疫球蛋白恒定区结构域。免疫球蛋白-zalpha11多肽融合体可以在基因工程化细胞中表达,以产生多种多聚体zalpha11类似物。可以将辅助结构域与zalpha11多肽进行融合,以将它们靶向于特异细胞、组织、或大分子(如胶原)。可以将zalpha11多肽与两个或多个部分融合,诸如用于纯化的亲和标签和靶向结构域。多肽融合体还可包含一个或多个切割位点,尤其是在结构域之间包含切割位点。参阅Tuan等人,结缔组织研究(Connective TissueResearch)341-9,1996。
本发明的蛋白质还可以包含非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括(但不限于)反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲撑脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型谷氨酰胺、六氢吡啶羧酸、四氢噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3,3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸,和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然氨基酸残基掺入蛋白质的方法。例如,可以采用体外系统,其中使用化学氨酰化抑制子tRNA抑制无义突变。本领域已知合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法。可以在包含E.coli S30提取物和商品化酶和其它试剂的无细胞体系中进行包含无义突变的质粒的转录和翻译。通过层析法纯化蛋白质。参阅例如Robertson等人,美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1132722,1991;Ellman等人,酶学方法(Methods Enzymol.)202301,1991;Chung等人,科学(Science)259806-809,1993;和Chung等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9010145-9,1993)。在第二种方法中,通过显微注射突变mRNA和化学氨酰化抑制子tRNA,在非洲爪蟾卵母细胞内进行翻译(Turcatti等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27119991-8,1996)。在第三种方法中,在缺乏将取代的天然氨基酸(如苯丙氨酸)而存在所需的非天然存在氨基酸(如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)的条件下培养E.coli细胞。将非天然存在的氨基酸掺入蛋白质以代替其天然对应物。参阅Koide等人,生化(Biochem.)337470-6,1994。通过体外化学修饰法可以将天然存在的氨基酸残基转变成非天然存在的种类。可以将化学修饰法与定点诱变相结合,以进一步拓宽取代范围(Wynn和Richards,蛋白质科学(Protein Sci.)2395-403,1993)。
可以用有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸、和非天然氨基酸取代zalpha11氨基酸残基。
可以根据本领域已知步骤,诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,科学(Science)2441081-5,1989;Bass等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)884498-502,1991),鉴定本发明多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中,在分子内每一残基处引入单个丙氨酸突变,并如下所述检验所得突变分子的生物学活性(如配基结合和信号转导)以鉴定对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可以参阅Hilton等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2714699-4708,1996。配体-受体、蛋白质-蛋白质、或其它生物学相互作用的位点也可以通过对结构的物理分析(通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射、或光亲和标记等技术测定),结合推断的接触位点氨基酸的突变进行确定。参阅例如de Vos等人,科学(Science)255306-12,1992;Smith等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224899-904,1992;Wlodaver等人,FEBS通讯(FEBSLett.)30959-64,1992。还可以由与相关受体的同源性分析推断必需氨基酸的位置。
可以确定位于对维持结构完整性比较重要的区域或结构域内的氨基酸残基。在这些区域内,可以确定能够或多或少承受变化并维持分子的完整三维结构的特定残基。分析序列结构的方法包括(但不限于)具有高氨基酸或核苷酸同一性的多重序列比对及使用可获得软件(如InsightII中的viewer和homology建模工具,MSI,San Diego,CA)的计算机分析、二级结构倾向、二元模式、互补堆积和埋藏的极性相互作用(Barton,结构生物学的现行观点(Current Opin.Struct.Biol.)5372-376,1995和Cordes等人,结构生物学的现行观点(Current Opin.Struct.Biol.)63-10,1996)。在设计对分子的修饰或鉴定特定片段时,结构的测定通常通过评价经修饰分子的活性实现。
在zalpha11多肽中产生的氨基酸序列变化应使得对生物学活性重要的较高级结构的影响最小。例如,当zalpha11多肽包含一个或多个螺旋时,产生的氨基酸残基变化应使得不影响螺旋几何学和分子的其它组分,其中所述组分的构象变化会减弱一些重要功能,例如分子与其结合配偶体的结合。可以通过上文公开的计算机建模预测,或者通过晶体结构测定氨基酸序列变化的后果(参阅如Lapthorn等人,自然结构生物学(Nat.Struct.Biol.)2266-268,1995)。本领域众所周知的其它技术可以比较蛋白质变体与标准分子(如天然蛋白质)的折叠。例如,可以进行变体和标准蛋白质中半胱氨酸模式的比较。使用还原法和烷基化的质谱和化学修饰提供了确定与二硫键有关或无关的半胱氨酸残基的方法(Bean等人,生化分析(Anal.Biochem.)201216-226,1992;Gray,蛋白质科学(Protein Sci.)21732-1748,1993;和Patterson等人,化学分析(Anal.Chem.)663727-3732,1994)。通常认为如果经修饰分子不具有与标准分子相同的二硫键模式,则折叠将受到影响。另一种众所周知且可接受的测量折叠的方法是圆二色性法(CD)。由经修饰分子和标准分子产生的CD光谱的测量和比较是常规的(Johnson,蛋白质(Proteins)7205-214,1990)。结晶学是另一种众所周知的分析折叠和结构的方法。核磁共振(NMR)、消化肽作图、和表位作图也是众所周知的分析蛋白质和多肽间折叠和结构相似性的方法(Schaanan等人,科学(Science)257961-964,1992)。
可以产生SEQ ID NO2所示zalpha11蛋白质序列的Hopp/Woods亲水性图谱(Hopp等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)783824-3828,1981;Hopp,免疫方法杂志(J.Immun.Meth.)881-18,1986;和Triquier等人,蛋白质工程(Protein Engineering)11153-169,1998)。见图1。图谱是根据移动6残基框绘制的。忽略了埋藏的G、S、和T残基和暴露的H、Y、和W残基。例如,在zalpha11中亲水区包括SEQ ID NO2的第55位至第60位氨基酸残基、SEQ ID NO2的第56位至第61位氨基酸残基、SEQ ID NO2的第139位至第144位氨基酸残基、SEQ ID NO2的第227位至第232位氨基酸残基、和SEQ ID NO2的第364位至第369位氨基酸残基。
本领域技术人员将领会到,在设计zalpha11多肽氨基酸序列中的修饰时,需要考虑亲水性和疏水性,使得不影响完整结构和生物学特性。特别感兴趣的替代是选自下组Val、Leu、和Ile,或选自下组Met、Gly、Ser、Ala、Tyr、和Trp的疏水性残基。例如耐受取代的残基可以包括诸如SEQ ID NO2中所示残基。然而,半胱氨酸残基相对不耐受取代。
还可以由zalpha11与I型细胞因子受体家族成员之间的序列相似性分析推断出重要氨基酸的位置。使用诸如上述“FASTA”分析等方法,可鉴定蛋白质家族内的高相似性区域,并用于分析氨基酸序列中的保守区。根据结构鉴定zalpha11多核苷酸变体的另一种方法是测定编码潜在的zalpha11多核苷酸变体的核酸分子能否与具有上述SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子发生杂交。
鉴定本发明多肽中重要氨基酸的其它方法是本领域已知的步骤,诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,科学(Science)2441081,1989;Bass等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)884498,1991;Coombs和Corey,“定点诱变和蛋白质工程”,在《蛋白质分析和设计》一书中,Angeletti(编),第259-311页,Academic Press公司,1998)。在后一种技术中,在分子中每个残基处引入单个丙氨酸突变,并如下所述检验所得突变分子的生物学活性,以鉴定对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可以参阅Hilton等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2714699-4708,1996。
本发明还提供了zalpha11多肽的功能性片段及编码这些功能性片段的核酸分子。此处定义的“功能性”zalpha11或其片段的特征为具有增殖或分化活性、诱导或抑制特化细胞功能的能力、或者特异结合抗zalpha11抗体或zalpha11配体(可溶性的或固定化的)的能力。如上所述,zalpha11的特征为I型细胞因子受体结构。由此,本发明还提供了包含下列各项的融合蛋白(a)包含此处所述胞外或胞内结构域的多肽分子;和(b)包含一个或多个这些结构域的功能性片段。融合蛋白的其它多肽部分可以由其它I型细胞因子受体提供,例如IL-2受体β-亚基和β-通用受体(即IL3、IL5、和GM-CSF受体β-亚基),或是有助于融合蛋白分泌的非天然和/或无关分泌信号肽。
可以进行核酸分子的常规删除分析,从而获得编码zalpha11多肽的核酸分子的功能性片段。作为例示,具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA分子或其片段可以用Bal3核酸酶进行消化,从而获得一系列嵌套删除。然后将这些DNA片段以正确的阅读框架插入表达载体,并分离表达的多肽,测试其zalpha11活性或者结合抗zalpha11抗体或zalpha11配体的能力。外切核酸酶消化的另一种方法是使用寡核苷酸介导的诱变导入删除或终止密码子,从而特异产生期望的zalpha11片段。或者,可以使用聚合酶链式反应合成zalpha11多核苷酸的特殊片段。
鉴定功能性结构域的常规方法对于本领域技术人员是众所周知的。例如,Horisberger和Di Marco,药物治疗(Pharmac.Ther.)66507,1995总结了在干扰素的两个末端或其中之一进行截短的研究。此外,例如Treuter等人,分子与普通遗传学(Molec.Gen.Genet.)240113,1993;Content等人,“42kDa 2-5A合成酶通过人类干扰素诱导的表达和初步删除分析”,在《生物学干扰素系统,关于干扰素系统的ISIR-TNO会议的进展》一书中,Cantell(编),第65-72页,Nijhoff,1987;Herschman,“EGF受体”,在《动物细胞增殖的控制》一书中,1,Boynton等人(编),第169-199页,Academic Press,1985;Coumailleau等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27029270,1995;Fukunaga等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27025291,1995;Yamaguchi等人,生化药物学(Biochem.Pharmacol.)501295,1995;和Meisel等人,植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)301,1996描述了用于蛋白质功能性分析的常规方法。
使用已知的诱变和筛选方法,诸如Reidhaar-Olson和Sauer(科学(Science)24153-7,1988或Bowie和Sauer,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)862152-2156,1989)公开的方法,可以产生并检验多氨基酸取代。简而言之,这些作者公开了使多肽中两个或多个位置同时随机化,选择功能性多肽,然后对诱变多肽进行测序以确定每个位置可允许取代的范围的方法。其它可以使用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等人,生化(Biochem.)3010832-10837,1991;Ladner等人,美国专利号5,223,409;Huse,WIPO出版物WO 92/062045)和定区诱变(Derbyshire等人,基因(Gene)46145,1986;Ner等人,DNA 7127,1988)。
通过如Stemmer,自然(Nature)370389-91,1994;Stemmer,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9110747-51,1994;和WIPO出版物WO 97/20078公开的DNA重排(DNA Shuffling),可以产生公开的zalpha11 DNA和多肽序列的变体。简而言之,通过亲代DNA的随机片段化,随后使用PCR重新装配,由体外同源重组产生随机引入点突变的变体DNA。可以通过使用亲代DNA家族,诸如等位基因变体或来自不同物种的DNA而改进该技术,从而在此过程中引入更多的变异性。选择或筛选期望活性,再反复进行诱变和检测,即可通过选择期望突变并同时抛弃有害基因变化而使序列快速进化”。
此处公开的诱变方法可以与高通量的自动化筛选方法结合,以检测宿主细胞中克隆的诱变zalpha11受体多肽的活性。在这方面优选的实验包括下文描述的细胞增殖实验和基于生物传感器的配体结合实验。编码活性受体或其部分(如配体结合片段、信号结构域、等等)的诱变DNA分子可以由宿主细胞回收,并使用现代化设备迅速进行测序。这些方法能够快速测定感兴趣多肽中单个氨基酸残基的重要性,并且可以应用于未知结构的多肽。
另外,本发明蛋白质(或其多肽片段)可以与其它生物活性分子(尤其是其它细胞因子)连接,以提供多功能分子。例如,来自zalpha11的一个或多个螺旋可以与其它细胞因子连接,以增强它们的生物学特性或生产效率。
本发明由此提供了一系列新的杂合分子,其中包含一个或多个zalpha11的螺旋的片段与另一种多肽融合。融合优选通过DNA水平的剪接进行,使得嵌合分子能够在重组生产系统中表达。然后检测产生的分子的诸如改进的可溶性、改进的稳定性、延长的清除半衰期、改进的表达和分泌水平、和药效动力学等特性。这些杂合分子还可以在蛋白质或多肽组分间包含其它氨基酸残基(如多肽接头)。
本领域普通技术人员使用此处公开的方法,可以鉴定和/或制备多种保留信号转导或配体结合活性的SEQ ID NO2的多肽片段或变体。例如,可以通过制备与细胞因子结合结构域(SEQ ID NO2的第20位(Cys)至第237位(His)残基或其等位基因变体或物种定向进化同源物)基本同源并保留野生型zalpha11蛋白质的配体结合活性的多种多肽,产生zalpha11的“可溶性受体”。这些多肽可以包含来自例如部分或完整跨膜和胞内结构域的其它氨基酸。这些多肽还可以包含此处一般性公开的其它多肽片段,诸如标记物、亲和标签、等等。
对于任何zalpha11多肽,包括变体、可溶性受体、和融合多肽或蛋白质,本领域普通技术人员可以使用上述表1和表2列出的资料容易的得到编码该变体的完全简并性多核苷酸序列。
根据常规技术,可以在基因工程化宿主细胞中生产本发明的zalpha11多肽,包括全长多肽、生物活性片段、和融合多肽。合适的宿主细胞是能够用外源DNA转化或转染且能够在培养中生长的那些细胞类型,包括细菌、真菌细胞、和培养的高等真核细胞。优选真核细胞,尤其是多细胞有机体的培养细胞。操作克隆DNA分子和将外源DNA导入各种宿主细胞的技术公开于Sambrook等人,分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual),第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989;和Ausubel等编辑,分子生物学现行方案(Current Protocols in Molecular Biology),John Wileyand Sons公司,纽约,1987。
通常,在表达载体内,编码zalpha11多肽的DNA序列与其表达所需的其它基因元件(通常包括转录启动子和终止子)可操作连接。载体通常还包含一种或多种选择标记和一种或多种复制起点,尽管本领域技术人员将领会,在某些系统中选择标记可以由其它载体提供,而外源DNA可以通过整合到宿主细胞基因组中而得到复制。启动子、终止子、选择标记、载体和其它元件的选择是本领域普通技术水平内的常规设计事务。许多这样的元件描述于文献中,并且可以由供应商处获得。
为了引导zalpha11多肽进入宿主细胞的分泌途径,可在表达载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列、或前序列)。分泌信号序列可以是zalpha11多肽自身的,或者可以来自另一种分泌蛋白质(如t-PA),或重新合成。分泌信号序列与zalpha11的DNA序列可操作连接,即这两种序列以正确的阅读框架连接,其所处位置使得能够引导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码感兴趣多肽的DNA序列的5’端,但是某些信号序列可以位于感兴趣DNA序列中的其它位置(参阅如Welch等人,美国专利号5,037,743;Holland等人,美国专利号5,143,830)。
或者,本发明多肽所含的分泌信号序列可以用于引导其它多肽进入分泌途径。本发明提供了这些融合多肽。可以制备信号融合多肽,其中使用本领域已知的和此处公开的方法,将来自SEQ ID NO2的第1位氨基酸(Met)至第19位氨基酸(Gly)的分泌信号序列与另一种多肽可操作连接。本发明融合多肽所含的分泌信号序列优选与附加肽在氨基末端融合以指导该附加肽进入分泌途径。已知这种构建物在本领域中有许多应用。例如,这些新的分泌信号序列融合构建物能够引导通常为非分泌型蛋白质的活性组分进行分泌。这些融合体可以在体内或体外用于引导肽通过分泌途径。
在本发明中,培养的哺乳动物细胞是合适的宿主。将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等人,细胞(Cell)14725,1978;Corsaro和Pearson,体细胞遗传学(SomaticCell Genetics)7603,1981;Graham和Van der Eb,病毒学(Virology)52456,1973)、电穿孔(Neumann等,欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)1841-845,1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等人,同上)、脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等人,焦点(Focus)1573,1993;Ciccarone等人,焦点(Focus)1580,1993)、和病毒载体(Miller和Rosman,生物技术(BioTechniques)7980-90,1989;Wang和Finer,自然医学(Nature Med.)2714-16,1996)。在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽的方法公开于例如Levinson等人,美国专利号4,713,339;Hagen等人,美国专利号4,784,950;Palmiter等人,美国专利号4,579,821;和Ringold,美国专利号4,656,134。合适的培养哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573;Graham等人,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)3659-72,1977)、和中国仓鼠卵巢细胞系(如CHO-Kl;ATCCNo.CCL 61)。其它合适的细胞系在本领域中是已知的,并且可以由诸如美国典型培养物保藏中心(Rockyille,Maryland)等公共保藏机构获得。通常,优选强转录启动子,诸如来自SV40或巨细胞病毒的启动子。参阅如美国专利号4,956,288。其它合适的启动子包括来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利号4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。
药物选择常用于选择插入了外源DNA的培养哺乳动物细胞。这些细胞通常称为“转染子”。在选择剂存在下培养并能将感兴趣基因传给后代的细胞称为“稳定转染子”。优选的选择标记是编码新霉素抗性的基因。在新霉素型药物,诸如G-418等存在时进行选择。选择系统还可以用于提高感兴趣基因的表达水平,此过程称为“扩增”。如下进行扩增在低水平选择剂存在时培养转染子,然后提高选择剂用量,以选择高水平生产导入基因产物的细胞。优选的可扩增选择标记是赋予氨甲喋呤抗性的二氢叶酸还原酶。还可以使用其它药物抗性基因(如潮霉素抗性、多药抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。诱导表型改变的其它标记,诸如绿色荧光蛋白,或诸如CD4、CD8、I型MHC等细胞表面蛋白,胎盘碱性磷酸酶,均可用于通过诸如FACS分拣术或磁珠分离技术等方式从未转染细胞中挑出转染细胞。
其它高等真核细胞也可以作为宿主使用,包括植物细胞、昆虫细胞、和禽类细胞。Sinkar等人(生物科学杂志(J.Biosci.)(Bangalore)1147-58,1987)回顾了将发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为植物细胞中表达基因的载体的使用。Guarino等人美国专利号5,162,222和WIPO出版物WO 94/06463公开了昆虫细胞的转化及其中外源多肽的生成。可以用通常来自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。参阅L.A.King和R.D.Possee,杆状病毒表达系统实验室指南(The Baculovirus Expression SystemA Laboratory Guide),伦敦,Chapman&Hall;D.R.O’Reilly等人,杆状病毒表达载体实验室手册(The Baculovirus Expression SystemA Laboratory Manual),纽约,牛津大学出版社,1994;和C.D.Richardson编,杆状病毒表达方案,分子生物学方法(BaculovirusExpression Protocols.Methods in Molecular Biology),Totowa,NJ,Humana Press,1995。制备重组zalpha11杆状病毒的另一种方法是利用Luckow描述的基于转座子的系统(V.A.Luckow等人,病毒学杂志(J.Virol.)674566-79,1993)。这一利用转移载体的系统在Bac-to-BacTM试剂盒(Life Technologies,Rockville,MD)中有售。该系统利用转移载体,即含Tn7转座子的pFastBaclTM(LifeTechnologies),将编码zalpha11多肽的DNA转移到杆状病毒基因组(作为大质粒保持在E.coli中,称为“杆粒”)中。参阅M.S.Hill-Perkins和R.D.Possee,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)71971-6,1990;B.C.Bonning等人,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)751551-6,1994;和G.D.Chazenbalk和B.Rapoport,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2701543-9,1995。另外,转移载体可以包含与编码位于表达的zalpha11多肽C或N末端的表位标签(例如Glu-Glu表位标签)的DNA的框架内融合体(T.Grussenmeyer等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)827952-4,1985)。使用本领域已知技术,用包含zalpha11的转移载体转化E.coli,并筛选含有指示重组杆状病毒的中断LacZ基因的杆粒。使用常规技术分离包含重组杆状病毒基因组的杆粒DNA,并用于转染草地夜蛾(Spodoptera fruggiperda)细胞,如Sf9细胞。随后产生表达zalpha11的重组病毒。使用本领域常用方法制备重组病毒原种。
重组病毒可以用于感染宿主细胞,一般为来自秋粘虫,即草地夜蛾的细胞系。大体上参阅Glick和Pasternak,分子生物技术学重组DNA的原理和应用(Molecular BiotechnologyPrinciples andApplications of Recombinant DNA),ASM Press,Washington特区,1994。另一种合适的细胞系是来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的HighFiveOTM细胞系(Invitrogen)(美国专利号5,300,435)。可以使用市售无血清培养基培养和维持这些细胞。用于Sf9细胞的合适培养基是Sf900 IITM(Life Technologies)或ESF 921TM(Expression System);用于粉纹夜蛾细胞的合适培养基是Ex-Cell O405TM(JRH Biosciences,Lenexa,KS)或Express FiveOTM(Life Technologies)。所用步骤大体描述于可获得的实验室手册(L.A.King和R.D.Possee,同上;D.R.O’Reilly等人,同上;C.D.Richardson,同上)。使用此处所述方法可以完成zalpha11多肽由上清液中的后续纯化。
真菌细胞,包括酵母细胞,也可以在本发明中使用。在此方面特别感兴趣的酵母种类包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、和甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)。用外源DNA转化酿酒酵母细胞并由此产生重组多肽的方法公开于例如Kawasaki,美国专利号4,599,311;Kawasaki等人,美国专利号4,931,373;Brake,美国专利号4,870,008;Welch等人,美国专利号5,037,743;和Murray等人,美国专利号4,845,075号。通过用选择标记确定的表型,通常是药物抗性或在缺乏特殊营养成分(如亮氨酸)时生长的能力,选择转化细胞。用于酿酒酵母的载体系统优选Kawasaki等人公开的POT1载体系统(美国专利号4,931,373号),其通过在含葡萄糖培养基中的生长来选择转化细胞。用于酵母的合适启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(参阅如Kawasaki,美国专利号4,599,311;Kingsman等人,美国专利号4,615,974号;和Bitter,美国专利号4,977,092)和乙醇脱氢酶基因的那些启动子和终止子。还可以参阅美国专利号4,990,446;5,063,154;5,139,936和4,661,454。本领域已知用于其它酵母的转化系统,包括多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromycse lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)、和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)。参阅例如Gleeson等人,普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)1323459-65,1986和Cregg,美国专利号4,882,279。根据McKnight等人的美国专利号4,935,349的方法可以利用曲霉属细胞。转化产黄枝顶孢(4cremoniumchrysogenum)的方法公开于Sumino等人的美国专利号5,162,228。转化脉孢菌属细胞的方法公开于Lambowitz的美国专利号4,486,533。
WIPO出版物WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536、和WO98/02565中公开了使用甲醇毕赤酵母作为宿主生产重组蛋白的方法。用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子通常制备成双链环状质粒,转化前优选进行线性化。为了在甲醇毕赤酵母中生产多肽,优选质粒中的启动子和终止子是甲醇毕赤酵母基因的,诸如甲醇毕赤酵母的醇利用基因(AUG1或AUG2)。其它有用的启动子包括二羟丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了便于DNA整合到宿主染色体中,优选质粒的整个表达片段两侧为宿主DNA序列。可用于甲醇毕赤酵母的优选选择标记是甲醇毕赤酵母ADE2基因,它编码使ade2宿主细胞在缺乏腺嘌呤时仍可生长的磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC;EC4.1.1.21)。进行大规模工业生产时,希望最低限度地使用甲醇,因此优选使用甲醇利用基因(AUG1和AUG2)均被删除的宿主细胞。生产分泌蛋白时,优选液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主细胞。电穿孔法有助于将包含编码感兴趣多肽的DNA的质粒导入甲醇毕赤酵母细胞。优选通过电穿孔使用指数衰减的脉冲电场转化甲醇毕赤酵母细胞,场强为2.5-4.5kV/cm,优选约3.75kV/cm,时间常数(t)为1-40毫秒,最优选约20毫秒。
包括大肠杆菌、芽孢杆菌、和其它属菌株在内的原核宿主细胞也可以在本发明中作为宿主细胞使用。转化这些宿主并表达克隆于其中的外源DNA序列的技术在本领域是众所周知的(参阅如Sambrook等人,同上)。在诸如E.coli等细菌中表达zalpha11多肽时,多肽可能保留在细胞质中(通常为不溶性颗粒),或者可能由细菌分泌序列引导到周质空间。在前一种情况中,裂解细胞,回收颗粒,并使用例如异硫氰酸胍或尿素进行变性。然后通过稀释变性剂,诸如通过在尿素和还原型与氧化型谷胱甘肽溶液中透析,随后在缓冲盐溶液中透析,可以使变性多肽重折迭并二聚体化。在后一种情况中,通过破裂细胞(通过例如超声处理或渗透压休克)释放周质空间内容物并回收蛋白质的方法,可以将多肽以可溶且有功能形式由周质空间回收,由此不需要变性和重新折迭。
根据传统步骤,在含所选宿主细胞生长必需的养分和其它组分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。本领域已知包括合成培养基和复合培养基在内的各种合适的培养基,通常包含碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、和矿物质。必要时,培养基中还包含诸如生长因子或血清等组分。生长培养基通常可以通过例如药物选择或必需养分(由表达载体携带的或共转染进入宿主细胞的选择标记弥补)的缺乏选出包含外源导入DNA的细胞。甲醇毕赤酵母细胞在含有适当碳源、氮源和微量营养物的培养基中进行培养,温度约为25℃-35℃。通过传统方法,诸如小烧瓶振荡或发酵罐喷气,为液体培养物提供充足的通气。甲醇毕赤酵母的培养基优选YEPD(2%D-葡萄糖、2%BactoTM蛋白胨(Difco Laboratories,Detroit,MI)、1%BactoTM酵母提取物(DifcoLaboratories)、0.004%腺嘌呤、和0.006%L-亮氨酸)。
在本发明的一方面,通过培养细胞产生zalpha11细胞因子受体(包含跨膜和胞内结构域),并将该细胞用于筛选该受体的配基,包括天然配基,以及天然配基的激动剂和拮抗剂。为了概括该方法,将编码受体的cDNA或基因与其表达所需其它基因元件(如转录启动子)联合,并将产生的表达载体插入宿主细胞。选择表达DNA并产生功能性受体的细胞,并用于多种筛选系统。
适合用于表达本发明的新受体并转导受体介导的信号的哺乳动物细胞包括表达β-亚基(诸如gp130)的细胞和共表达gp130和LIF受体(Gearing等人,欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)102839-2848,1991;Gearing等人,美国专利号5,284,755)的细胞。在这方面,通常优选采用应答结合该亚家族受体的其它细胞因子(诸如IL-6或LIF)的细胞,因为这些细胞包含必要信号转导途径。这类优选的细胞包括人类TF-1细胞系(ATCC No.CRL-2003)和DA-1细胞系(Branch等人,血液(Blood)691782,1987;Broudy等人,血液(Blood)751622-1626,1900)。或者,合适的宿主细胞可以经改造以产生β-亚基或期望的细胞应答所需的其它细胞组分。例如,鼠细胞系BaF3(Palacios和Steinmetz,细胞(Cell)41727-734,1985;Mathey-Prevot等人,分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)64133-4135,1986)幼仓鼠肾(BHK)细胞系或CTLL-2细胞系(ATCC TIB-214)可以经转染在zalpha11之外还表达小鼠gp130亚基,或者小鼠gp130和LIF受体。通常优选使用来自相同物种的宿主细胞和受体,然而该方法使得细胞系可以经改造而表达来自任何物种的多受体亚基,由此克服由物种特异性引起的潜在限制。或者,可以克隆人类受体cDNA的物种同系物,并用于来自相同物种的细胞系,诸如BaF3细胞系中使用小鼠cDNA。依赖一种造血生长因子(诸如IL-3)的细胞系可以由此经改造而变成依赖zalpha11配基。
将表达功能性zalpha11的细胞用于筛选实验。本领域已知多种合适的实验。这些实验是建立在检测靶细胞中生物学应答的基础之上的。细胞增殖实验就是这样的一种实验。将细胞在存在或不存在待测化合物的条件下培养,并通过例如测量氚标记的胸苷的掺入或通过基于Alymer BlueTM(AccuMed,Chicago,IL)或3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)的代谢性降解的比色法检测细胞增殖(Mosman,免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)6555-63,1983)。另一种实验使用经进一步改造使之表达报导基因的细胞。报导基因与可应答受体连接途径的启动子元件连接,而该实验检测报导基因转录的激活。这方面优选的启动子元件是血清应答元件(SRE;参阅例如Shaw等人,细胞(Cell)56563-572,1989)。优选的这样一种报导基因是荧光素酶基因(de Wet等人,分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)7725,1987)。使用本领域已知的方法通过发光检测荧光素酶基因的表达(如Baumgartner等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26919094-29101,1994;Schenborn和Goiffin,Promega Notes4111,1993)。荧光素酶实验试剂盒可以由例如Promega公司(Madison,WI)购买。这类靶细胞系可以用于筛选化学药品库、细胞条件培养基、真菌肉汤、土壤样品、水样品、等等。例如,可以在靶细胞上检验细胞或组织条件培养基样品库,以鉴定产生配基的细胞。然后将阳性细胞用于产生哺乳动物细胞表达载体中的cDNA文库,分组,转染宿主细胞,并表达。然后检验来自经转染细胞的培养基样品,随后分组、重新转染、传代培养、并重新检验阳性细胞,以分离表达配基的克隆细胞系。肾、肝、脾、胸腺、其它淋巴组织、或T细胞的条件培养基样品是用于筛选步骤的配基的优选来源。
zalpha11的天然配基还可以通过诱变表达zalpha11的依赖细胞因子的细胞系并在选择自分泌生长的条件下培养从而进行鉴定。参阅WIPO出版物WO 95/21930。在典型步骤中,诸如用EMS对表达zalpha11的细胞进行诱变。然后在存在所需细胞因子的条件下回收细胞,并转移到不含该细胞因子的培养基中。诸如通过向培养基中加入可溶性(结合配基的)受体多肽,或者通过在野生型细胞和表达zalpha11的经转染细胞上检验条件培养基,对存活细胞筛选zalpha11配基的产生。在这种方法中使用的优选细胞系包括经转染表达gp130或联合表达gp130和LIF受体的细胞。优选的这些宿主细胞系包括经转染的CTLL-2细胞(Gillis和Smith,自然(Nature)268154-156,1977)和经转染的BaF3细胞。
此外,采用zalpha11可溶性受体多肽的分泌捕获方法可以用于分离zalpha11配基(Aldrich等人,细胞(Cell)871161-1169,1996)。用由已知或猜想的配基来源制备的cDNA表达文库感染COS-7细胞。cDNA文库载体通常具有用于在COS-7细胞中扩增的SV40复制起点和用于高水平表达的CMV启动子。将经转染的COS-7细胞单层培养,然后固定并透化处理。然后使此处所述的经标签或生物素标记的zalpha11可溶性受体接触细胞层,使之结合单层中表达抗互补分子(即zalpha11配基)的细胞。由此表达配基的细胞将结合受体分子。将与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗标签抗体(Ig融合体用抗Ig,FLAG标签融合体用M2或抗FLAG,链霉亲和素,等等)用于将经标签或生物素标记的zalpha11可溶性受体结合的这些细胞可视化。HRP催化tyramide试剂的沉积,例如tyramide-FITC。这种检测可以使用商业性试剂盒,例如Renaissance TSA-DirectTMKit(NEN Life Science Products,Boston,MA)。在荧光显微镜下鉴定并挑取表达zalpha11受体配基的细胞(绿色细胞),随后使用Aldrich等人(同上)所述用于质粒回收的步骤进行配基克隆,经几轮分泌捕获实验,直至鉴定出单克隆。
作为受体,zalpha11多肽的活性可以用硅基生物传感器微型生理机能测量仪测量,该仪器测量与受体结合和随后的生理学细胞应答有关的细胞外酸化速率或质子排出。例示性装置是Molecular Devices(Sunnyvale,CA)制造的CytosensorTMMicrophysiometer。使用这种方法可以测量多种细胞应答,诸如细胞增殖、离子转运、能量产生、炎症应答、调控和受体结合、等等。参阅例如H.M.McConnell等人,科学(Science)2571906-1912,1992;S.Pitchford等人,酶学方法(Meth.Enzymol.)22884-108,1997;S.Arimilli等人,免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)21249-59,1998;I.VanLiefde等人,欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)34687-95,1998)。微型生理机能测量仪可以用于检验真核、原核、粘附或非粘附细胞。微型生理机能测量仪通过测量细胞培养中胞外酸化作用随时间的变化,可直接测量针对各种刺激,包括zalpha11多肽的激动剂、配基、或拮抗剂的细胞应答。优选用微型生理机能测量仪测量表达zalpha11的真核细胞的应答,并与不表达zalpha11多肽的真核细胞对照比较。表达zalpha11多肽的真核细胞包括用此处所述zalpha11转染而产生的可对zalpha11调控的刺激产生应答的细胞;或天然表达zalpha11的细胞,诸如由淋巴、脾、胸腺组织、或PBL衍生的表达zalpha11的细胞。响应表达zalpha11的细胞而产生的胞外酸化上升或下降相对于对照细胞的差异,是对zalpha11调节的细胞应答的直接测量。此外,这些zalpha11调节的应答可以在各种刺激下进行检验。同样的,使用微型生理机能测量仪,可以提供鉴定zalpha11多肽激动剂和拮抗剂的方法,包括提供表达zalpha11多肽的细胞,在不含待测化合物时培养第一份细胞,在含有待测化合物时培养第二份细胞,检测第二份细胞相对于第一份细胞的细胞应答的上升或下降。使用这种方法可以快速鉴定zalpha11的拮抗剂和激动剂,包括天然配基。
本发明提供的其它实验包括使用杂合受体多肽。这些杂合多肽主要分为两类。在第一类中,包含SEQ ID NO2的大约第256位(Lys)至第528位(Ser)残基的zalpha11胞内结构域,与第二种受体的配基结合结构域相连。优选第二种受体是造血细胞因子受体,例如mpl受体(Souyri等人,细胞(Cell)631137-1147,1990)。杂合受体还包含可能由任一受体衍生的跨膜结构域。然后将编码杂合受体的DNA构建物插入宿主细胞。将表达杂合受体的细胞在存在结合结构域的配基的条件下进行培养,并检验应答。该系统提供了使用容易获得的配基、用于分析zalpha11介导的信号转导的方法。该系统还可以用于测定特定细胞系能否应答zalpha11转导的信号。第二类杂合受体多肽包含zalpha11的胞外(结合配基)结构域(大致是SEQ ID NO2的第20位(Cys)至第237位(His)残基)和第二种受体(优选细胞因子受体)的胞质结构域,和跨膜结构域。跨膜结构域可能衍生至任一种受体。这第二类杂合受体在已知能够应答第二种受体转导的信号的细胞中表达。综上所述,这两类杂合受体使得在基于受体的检验系统中能够使用广泛的细胞类型。
然后将经发现表达zalpha11配基的细胞用于制备cDNA文库,并如上所述由此分离编码配基的cDNA。本发明由此在新的受体多肽之外还提供了克隆受体的多肽配基的方法。
zalpha11表达的组织特异性暗示在早期胸腺细胞发育和免疫应答调控中的作用。这些过程涉及应答一种或多种细胞因子与其同源受体的结合而刺激细胞增殖和分化。就这种受体的组织分布而言,激动剂(包括天然配基)和拮抗剂在体外和体内应用中具有大量潜力。经鉴定为受体激动剂的化合物可以用于在体外和体内刺激靶细胞的增殖和发育。例如,激动剂化合物可以作为已知成分的细胞培养基的成分使用,而且可以单独使用或与其它细胞因子和激素联合使用,以取代在细胞培养中通常使用的血清。由此激动剂可以用于特异启动培养物中的T细胞、B细胞、淋巴样和髓样谱系其它细胞、和造血细胞的生长和/或发育。
zalpha11的激动剂配基可以用于刺激细胞介导的免疫和用于刺激淋巴细胞的增殖,诸如在治疗涉及免疫抑制的感染中,包括某些病毒感染。其它用途包括肿瘤抑制,其中恶性转化会产生具有抗原性的肿瘤细胞。激动剂配基可以用于诱导细胞毒性,这种细胞毒性可能由效应细胞(诸如T细胞、TK(天然杀伤)细胞、或LAK(淋巴活化的杀伤)细胞)的活化介导,或者由凋亡途径直接诱导。激动剂配基还可以用于通过升高受影响细胞类型的水平而治疗白细胞减少症,和用于在骨髓移植后增强T细胞群的再生。
拮抗剂配基或化合物可能在免疫系统抑制中有效用,诸如在治疗自身免疫疾病中,包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、糖尿病、炎症性肠疾病、Crohn病、等等。免疫抑制还可以通过抑制受影响细胞类型的增殖,用于降低组织或器官移植排斥和用于治疗T细胞特异的白血病或淋巴瘤。
zalpha11还可以在检测配基循环水平的诊断系统中使用。在相关实施方案中,抗体或可特异结合zalpha11的其它试剂可以用于检测正在循环的受体多肽。配基或受体多肽水平的升高或降低水平可能指示病理学状况,包括癌症。可溶性受体多肽可能有助于病理学过程,而且可能是潜在疾病的间接标记。例如,人血清中可溶性IL-2受体水平的升高经证明与多种炎症和肿瘤状况有关,诸如心肌梗死、哮喘、重症肌无力、类风湿性关节炎、急性T细胞白血病、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、结肠癌、乳腺癌、和卵巢癌(Heaney等人,血液(Blood)87847-857,1996)。
可以通过表达编码zalpha11细胞因子结合结构域(人类受体(SEQID NO2)的大约第20位(Cys)至第237位(His)残基)或非人类受体的相应区域的截短DNA,而制备zalpha11受体的配基结合多肽,或“可溶性受体”。优选以基本不含跨膜和胞内多肽片段的方式制备胞外结构域。此外,上述zalpha11细胞因子结合结构域内的配基结合多肽片段还可以作为zalpha11可溶性受体用于此处所述用途。为了指导受体多肽由宿主细胞的外排,可以将受体DNA与编码第二种肽诸如t-PA分泌肽或zalpha11分泌肽的第二种DNA片段连接。为了帮助分泌的受体多肽的纯化,可以将C末端延伸与受体多肽融合,诸如多聚组氨酸标签、物质P、FlagTM肽(Hopp等人,生物技术(Bio/Technology)61204-1210,1988;购自Eastman Kodak公司,New Haven,CT)、或有抗体或其它特异结合剂可供利用的另一种多肽或蛋白质。
在另一种方法中,受体胞外结构域可以作为与免疫球蛋白重链恒定区的融合体表达,通常是包含两个恒定区结构域、缺乏可变区的Fc片段。这些融合体通常以多聚体分子分泌,其中Fc部分相互形成二硫键,两条受体多肽紧密排列。这种融合体可以用于亲和纯化溶液中的同源配基,作为体外实验工具,通过特异滴定配基而在体外阻断信号,和作为拮抗剂,通过非肠道施用而在体内结合循环的配基并将其清除出循环。为了纯化配基,在有助于受体-配基结合的条件下(通常是近生理学温度、pH、和离子强度),向含配基的样品(如细胞条件培养基或组织提取物)中加入zalpha11-Ig嵌合体。然后使用固定在固相支持物(如不溶性树脂珠)上的蛋白A由混合物分离嵌合体-配基复合物。然后使用传统化学技术,诸如盐或pH梯度,洗脱配基。或者,嵌合体自身能够结合固相支持物,如上进行结合和洗脱。收集液可以再次分离,直至达到期望水平的纯度。
此外,zalpha11可溶性受体可以作为“配基池”(ligand sink),即拮抗剂,用于在不希望存在配基的体内或体外治疗性或其它应用中结合配基。例如,在表达大量生物活性zalpha11配基的癌症中,zalpha11可溶性受体可以作为体内配基的直接拮抗剂使用,而且可能有助于降低与疾病有关的进展和症状。此外,zalpha11可溶性受体可以通过结合原本将增强那些癌症增殖的体内配基,而用于减缓过量表达zalpha11受体的癌症进展。zalpha11可溶性受体的相似体外应用,包括例如用于选择在zalpha11配基不存在的情况下生长的细胞系的负选择。
此外,zalpha11可溶性受体可以用于体内或诊断性应用,以检测体内或组织样品中表达zalpha11配基的癌症。例如,zalpha11可溶性受体可以与此处所述放射性标记或荧光标记缀合,并通过体外配基-受体型结合实验或荧光成像实验,用于检测组织样品中配基的存在。此外,放射性标记的zalpha11可溶性受体可以体内施用,以通过本领域已知的放射性成像方法,检测表达配基的实体瘤。
对应于该新DNA的mRNA组织分布的分析显示在淋巴组织中有表达,包括胸腺、脾、淋巴结、和外周血白细胞。这些数据指示zalpha11受体在免疫细胞增殖、分化、和/或激活中的作用,并暗示在免疫应答发展和调控中有一定作用。数据还暗示zalpha11与其配基的相互作用可能刺激髓细胞的增殖和发育,且如IL-2、IL-6、LIF、IL-11、和OSM(Baumann等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2688414-8417,1993)一样可能诱导肝细胞中的急性蛋白质合成。
优选将本发明多肽纯化至≥80%纯,更优选≥90%纯,甚至更优选≥95%纯,尤其优选药用纯,即超过99.9%纯(就大分子,特别是其它蛋白质和核酸污染而言),且不含传染原和热原。优选的经纯化多肽基本上不含其它多肽,特别是动物来源的其它多肽。
可以使用分级分离和/或传统纯化方法和介质纯化表达的重组zalpha11多肽(或者zalpha11的嵌合或融合多肽)。硫酸铵沉淀和酸或离液剂抽提可以用于样品的分级分离。例示性的纯化步骤可以包括羟基磷灰石层析、大小排阻层析、FPLC、和反相高效液相层析。合适的层析介质包括衍生化葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特化硅胶、等等。优选PEI、DEAE、QAE、和Q衍生物。例示性的层析介质包括那些用苯基、丁基、或辛基衍生化的介质,诸如Phenyl-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas,Montgomeryville,PA)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)、等等;或聚丙烯类树脂,诸如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等等。合适的固相支持物包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂、等等,它们在将要使用的条件中是不溶的。这些支持物可以用能使蛋白质通过氨基、羧基、巯基、羟基、和/或碳水化合物部分附着其上的反应基团修饰。偶联化学法的范例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化、和用于碳二酰亚胺偶联化学法的羧基和氨基衍生物。这些和其它固相介质在本领域是众所周知、广泛使用、且可由供应商获得。将受体多肽结合到支持介质上的方法在本领域中是已知的。具体方法的选择是常规设计的问题,部分由所选支持物的特性确定。参阅如《亲和层析原理和方法》,Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala,Sweden,1988。
本发明多肽可以利用其生物化学、结构、和生物学特性分离。例如,固定化金属离子吸附(IMAC)层析可用于纯化富含组氨酸的蛋白质,包括包含多聚组氨酸标签的蛋白质。简而言之,首先用二价金属离子使凝胶带电,以形成螯合物(Sulkowski,生化动态(Trends inBiochem.)31-7,1985)。富含组氨酸的蛋白质将根据所用金属离子而以不同亲和力吸附于此基质上,并可用竞争性洗脱、降低pH、或用强螯合剂将其洗脱。其它纯化方法包括用凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白质(酶学方法(Methods in Enzymol.),第182卷,蛋白质纯化指南”,M.Deutscher(编),Acad.Press,San Diego,1990,第529-539页)。在本发明的其它实施方案中,可以构建感兴趣多肽与亲和标签(如麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白结构域)的融合体以便于纯化。
此外,使用本领域中描述的方法,可以利用发明的zalpha11的区域或结构域,结合其它人类细胞因子受体家族蛋白质或异源蛋白质,构建多肽融合体或杂合zalpha11蛋白(Sambrook等人,同上,Altschul等人,同上,Picard,生物学现行观点(Cur.Opin.Biology)5511-515,1994,及其参考文献)。这些方法能够确定感兴趣多肽中大结构域或区域的重要生物学意义。这种杂合体可能改变反应动力学、结合特性、缩小或扩大底物特异性、或改变多肽的组织和细胞定位,而且可以用于改变结构未知的多肽。
使用本领域技术人员已知的方法,通过制备融合蛋白中各组分并将其化学法缀合,可以制备融合多肽或蛋白质。或者,可以使用已知技术产生以正确读码框编码融合蛋白之一或多个成分的多核苷酸,并通过此处所述方法表达。例如,本发明zalpha11中赋予生物学功能的部分或全部结构域可以与另一细胞因子家族成员中的功能等价结构域进行交换。这种结构域包括(但不限于)此处公开的分泌信号序列、胞外细胞因子结合结构域、跨膜结构域、和胞内信号结构域、BoxI和BoxII位点。根据构建的融合体的不同,预期这种融合蛋白可能具有与本发明多肽或其它已知家族蛋白相同或相似的生物学功能特征。而且,这种融合蛋白可能展示此处公开的其它特性。
可以使用标准分子生物学技术和克隆技术,交换zalphpa11多肽及与之融合的多肽的等价结构域。通常,如上所述,将编码感兴趣结构域(如此处所述zalpha11结构域)的DNA片段与至少一个编码附加多肽(例如来自另一种细胞因子受体的结构域或区域,诸如IL-2受体)的其它DNA片段可操作连接于同一读码框内,并插入适当表达载体。一般构建DNA构建体时,将编码多肽相应区的几个DNA片段可操作连接于同一读码框内,以形成编码完整融合蛋白或其功能部分的单一构建体。例如,DNA构建体可编码从N末端到C末端包含信号多肽、细胞因子结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域的融合蛋白。这种融合蛋白可以如此处所述表达、分离、并分析其活性。
还可以通过化学法合成制备zalpha11多肽或其片段。zalpha11多肽可以是单体或多聚体;已糖基化或未被糖基化;已PEG化或未被PEG化;可能包括或可能不包括起始甲硫氨酸残基。
本发明多肽还可以通过完全固相合成法、部分固相法、片段缩合法、或典型溶液合成法合成。用于合成多肽的方法在本领域是众所周知的。参阅例如Merrifield,美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.)852149,1963;Kaiser等人,生化分析(Anal.Biochem.)34595,1970。在固相支持物上完整合成期望肽后,用将多肽由树脂上切割下来并除去大部分侧链保护基团的试剂处理肽-树脂。这些方法在本领域已很完善。
本发明分子的活性可以使用测量细胞分化和增殖的多种实验进行测量。这些实验在本领域是众所周知的。
本发明蛋白质可以用于例如处理淋巴、免疫、发炎、脾、血液、或骨紊乱,而且可以在体外使用培养细胞或在体内通过对适当动物模型施用本发明要求的分子进行测量。例如,表达zalpha11可溶性受体多肽的宿主细胞可以包埋在藻酸环境中并注射(植入)到受体动物中。藻酸-多聚L-赖氨酸微囊化、选择性渗透膜包裹、和扩散室是捕获经转染哺乳动物细胞或原代哺乳动物细胞的方法。这些类型的非免疫原性“包裹”使得由捕获的细胞分泌或释放的蛋白质和其它大分子扩散到受体动物中。最重要的是,胶囊可掩饰并屏蔽外来的包埋细胞免受受体动物免疫应答。这些包裹化可以将所注射细胞的寿命由几小时或几天(裸露细胞)延长至几周(包埋细胞)。藻酸线提供了用于产生包埋细胞的简单且快速的方法。
产生藻酸线所需材料在本领域是众所周知的。在例示性步骤中,在无菌H2O中制备3%藻酸,并过滤除菌。恰在藻酸制备前,将藻酸溶液再次过滤。将大约50%细胞悬浮液(含大约5×105-5×107个细胞/ml)与3%藻酸溶液混和。1ml藻酸/细胞悬浮液以大约15分钟挤到100mM过滤除菌的CaCl2溶液中,以形成“线”。然后将挤出的线转移到50mM CaCl2中,再然后转移到25mM CaCl2中。然后将线在去离子水中漂洗,之后通过在0.01%多聚L-赖氨酸中温育进行包被。最后,将线用乳化Ringer氏溶液漂洗,并由溶液洗到注射器中(不用针头)。然后在注射器上装上大孔针头,并将线以最小体积的乳化Ringer氏溶液腹膜注射到受体中。
用于检验本发明蛋白质的体内方法涉及病毒投递系统。用于该目的的例示性病毒包括腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、和腺伴随病毒(AAV)。腺病毒(双链DNA病毒)是目前研究得最好的用于投递异源核酸的基因投递载体(综述见T.C.Becker等人,细胞生物学方法(Meth.Cell Biol.)43161-189,1994;和J.T.Douglas和D.T.Curiel,科学和医学(Science&Medicine)444-53,1997)。细胞毒系统具有多种优点(i)腺病毒适合相对较大的DNA插入片段;(ii)能够生长至高滴度;(iii)感染广泛的哺乳动物细胞类型;和(iv)能够与大量不同启动子一起使用,包括普遍存在的、组织特异的、和可调控的启动子。同样的,由于腺病毒在血流中是稳定的,所以它们能够通过静脉注射而施用。
使用其部分腺病毒基因组已删除的腺病毒载体,通过直接连接或通过与共转染质粒的同源重组,将插入片段掺入病毒DNA。在例示性系统中,由病毒载体删除了重要的E1基因后,除非由宿主细胞(人类293细胞系是范例)提供E1基因,否则病毒将不再复制。当给完整动物静脉施用时,腺病毒主要靶向肝。如果腺病毒投递系统具有E1基因删除,则病毒在宿主细胞中不能复制。然而,宿主细胞(如肝)将表达并加工(且分泌,如果存在分泌信号序列)异源蛋白质。分泌的蛋白质将在高度血管化的肝中进入循环,并且可以测定对感染动物的影响。
此外,包含多种病毒基因删除的腺病毒载体可以在降低或消除对载体的免疫应答的尝试中使用。这些腺病毒删除了E1,而且还包含E2A或E4删除(M.Lusky等人,病毒学杂志(J.Virol.)722022-2032,1998;S.E.Raper等人,人类基因治疗(Human Gene Therapy)9671-679,1998)。另外,E2b删除据报导可降低免疫应答(A.Amalfitano等人,病毒性杂志(J.Virol.)72926-933,1998)。此外,通过删除完整腺病毒基因组,可以容纳非常大的异源DNA插入片段。所谓“无胆”腺病毒(删除了所有病毒基因)的产生特别有利于插入较大的外源DNA插入片段。综述见P.Yeh和M.Perricaudet,FASEB杂志(FASEB J.)11615-623,1997。
腺病毒系统还可以用于在体外产生蛋白质。通过在细胞不能快速分裂的条件下培养腺病毒感染的非293细胞,细胞能够较长时间的产生蛋白质。例如,将BHK细胞在细胞容器中培养至汇合,然后暴露于编码感兴趣分泌蛋白的腺病毒载体。然后将细胞在使得经感染细胞存活几周而无显著细胞分裂的无血清条件中培养。或者,腺病毒载体感染的293细胞能够作为贴壁细胞或在悬浮培养中以相对较高的细胞密度培养,以产生大量的蛋白质(参阅Garnier等人,细胞技术(Cytotechnol.)15145-155,1994)。无论使用哪种方案,根据表达的蛋白质在细胞中的分布,表达的分泌异源蛋白质可以由细胞培养液上清、裂解液、或膜部分重复分离。在经感染的293细胞生产方案中,还可以有效获得非分泌蛋白质。
就观察到的zalpha11的组织分布而言,激动剂(包括天然配基、底物、辅助因子、等等)和拮抗剂具有大量的潜在的体外和体内应用。经鉴定为zalpha11激动剂的化合物可以用于刺激免疫和造血细胞在体外和体内生长。例如,zalpha11和激动剂化合物可以作为合成细胞培养基的成分使用,而且可以单独使用或与其它细胞因子和激素联合使用以取代在细胞培养中通常使用的血清。激动剂由此可以用于特异促进T细胞、B细胞、和其它淋巴样和髓样谱系细胞在培养中的生长和/或发育。此外,zalpha11可溶性受体、激动剂、或拮抗剂可以用于测量由分离的原代骨髓培养物至集落形成的刺激的体外实验。这些实验在本领域是众所周知的。
拮抗剂也可以作为研究试剂用于定性分析配基-受体相互作用的位点。zalpha11活性的抑制剂(zalpha11拮抗剂)包括抗zalpha11抗体和可溶性zalpha11受体,以及其它肽和非肽试剂(包括核酶)。
zalpha11还可以用于鉴定其活性的调节剂(如拮抗剂)。将待测化合物加到此处公开的实验中,以鉴定抑制zalpha11活性的化合物。除了此处公开的那些实验,可以在设计用于测量zalpha11结合、寡聚化、或刺激/抑制依赖zalpha11的细胞应答的多种实验中测试样品对zalpha11活性的抑制。例如,表达zalpha11的细胞系可以用应答zalpha11刺激的细胞途径的报导基因构建体进行转染。这种报导基因构建体在本领域是已知的,而且通常包含与编码实验可检测蛋白质(诸如荧光素酶)的基因可操作连接的zalpha11 DNA应答元件。DNA应答元件可以包括(但不限于)cAMP应答元件(CRE)、激素应答元件(HRE)、胰岛素应答元件(IRE)(Nasrin等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)875273-5277,1990)、和血清应答元件(SRE)(Shaw等人,细胞(Cell)56563-572,1989)。cAMP应答元件的综述见Roestler等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263(19)9063-9066,1988和Habener,分子内分泌学(Molec.Endocrinol.)4(8)1087-1094,1990。激素应答元件的综述见Beato,细胞(Cell)56335-344,1989。将候选化合物、溶液、混和物、或来自各种细胞类型的提取物或条件培养基,通过zalpha11刺激报导基因表达增长的现象,测试增强zalpha11受体活性的能力。这种类型的实验通过结合受体或通过刺激部分信号级联反应,能够检测直接刺激zalpha11信号转导活性的化合物。如此,提供了鉴定zalpha11多肽激动剂的方法,包括提供应答zalpha11多肽的细胞,将第一份细胞在待测化合物不存在的条件下培养,将第二份细胞在待测化合物存在的条件下培养,并检测第二份细胞相对于第一份细胞其细胞应答的增加。此外,可以使用包含上述报导基因构建体、但不表达zalpha11受体的第三份细胞,作为对照细胞,以评价非特异的、或非zalpha11介导的对报导基因的刺激。因此激动剂(包括天然配基)可以用于刺激或增强zalpha11多肽的功能。
zalpha11配基结合多肽,诸如此处公开的细胞因子结合结构域,还可以用于纯化配基。将多肽固定在固相支持物上,诸如琼脂糖珠、交联琼脂糖、玻璃、纤维素树脂、硅基树脂、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺、或在使用条件下稳定的类似材料。用于将多肽连接到固相支持物上的方法在本领域是已知的,包括胺化学法、溴化氰激活、N-羟基丁二酰亚胺激活、环氧化物激活、巯基激活、和酰肼激活。将产生的介质装成柱,并使含配基的流体流过柱子1次或多次,使得配基结合受体多肽。然后使用不同的盐浓度、离液剂(盐酸胍)、或pH破坏配基-受体结合而将配基洗脱。
可以有利的采用使用配基结合受体(或抗体、互补物/抗互补物对的成员之一)或其结合片段和可购买的生物传感器的实验系统(如BIAcoreTM,Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ;或SELDITM技术,Ciphergen公司,Palo Alto,CA)。将这些受体、抗体、互补物/抗互补物对成员、或其片段固定在受体芯片的表面上。该仪器的使用公开于Karlsson,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)145229-240,1991和Cunningham和Wells,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)234554-563,1993。使用胺或巯基化学法将受体、抗体、成员、或其片段共价连接到吸附在流动池中金膜上的葡聚糖纤维上。使待测样品流过流动池。如果样品中存在配基、表位、或互补物/抗互补物对的另一成员,则它将相应结合固定的受体、抗体、或成员,引起介质折射率的变化,表现为金膜表面振子共振(surface plasmon resonance)的变化。该系统能够测定结合和解离速率,由此能够计算结合亲和力,并评价结合的化学计量。
配基结合受体多肽还可以在本领域已知的其它实验系统中使用。这些系统包括用于测定结合亲和力的Scatchard分析(参阅Scatchard,纽约科学院年鉴(Ann.NY Acad.Sci.)51660-672,1949)和量热法实验(Cunningham等人,科学(Science)253545-548,1991;Cunningham等人,科学(Science)245821-825,1991)。
zalpha11多肽还可以用于制备可结合zalpha11表位、肽、或多肽的抗体。将zalpha11多肽或其片段作为抗原(免疫原)接种动物,并引发免疫应答。本领域技术人员将领会,抗原或免疫原性表位可以包含较大多肽内的氨基酸段,根据多肽的不同,该氨基酸段可以由大约10个氨基酸至长达大约全长多肽或更长。合适的抗原包括SEQ ID NO2的第20位(Cys)至第538位(Ser)氨基酸编码的zalpha11多肽,或其连续9-519个氨基酸的片段。优选作为抗原使用的肽是此处公开的细胞因子结合结构域、胞内信号结构域、BoxI和BoxII位点,和zalpha11亲水性肽,诸如本领域技术人员由疏水性图预测的、例如由基于6残基滑动框的Hopp/Woods亲水性特性测定的肽,其中忽略埋藏的G、S、和T残基以及暴露的H、Y、和W残基(见图1)。zalpha11亲水肽包括包含选自下组的氨基酸序列的肽(1)SEQ ID NO2的第51位(Trp)至第61位(Glu)氨基酸;(2)SEQ ID NO2的第136位(Ile)至第143位(Glu)氨基酸;(3)SEQ ID NO2的第187位(Pro)至第195位(Ser)氨基酸;(4)SEQ ID NO2的第223位(Phe)至第232位(Glu)氨基酸;和(5)SEQ ID NO2的第360位(Glu)至第368位(Asp)氨基酸。另外,zalpha11的保守基元和保守基元之间的可变区是合适的抗原。此外,小鼠zalpha11多肽(SEQ ID NO85)的相应区域可以用于产生针对小鼠zalpha11的抗体。由该免疫应答产生的抗体可以如此处所述分离和纯化。用于制备和分离多克隆和单克隆抗体的方法在本领域是众所周知的。参阅例如Cooligan等人(编),免疫学现行方案(Current Protocols in Immunology),National Institutes ofHealth,John Wiley and Sons公司,1995;Sambrook等人,分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual),第2版,冷泉港,NY,1989;和J.G.R.Hurrell(编),单克隆杂交瘤抗体技术和应用(Monoclonal Hybridoma AntibodiesTechniquesand Applications),CRC Press公司,Boca Raton,FL,1982。
对于本领域技术人员显而易见的是,可以通过用zalpha11多肽或其片段接种多种温血动物(诸如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠、和大鼠)产生多克隆抗体。zalpha11多肽的免疫原性可以通过佐剂的使用而增加,诸如明矾(氢氧化铝)或者弗氏完全或不完全佐剂。可以用于免疫的多肽还包括融合多肽,诸如zalpha11或其部分与免疫球蛋白或麦芽糖结合蛋白的融合体。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原类”,则该部分可以与大分子载体(诸如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)、或破伤风类毒素)有利连接以用于免疫。
如此处所用,术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体、和抗原结合片段,诸如F(ab’)2和Fab蛋白裂解片段,还包括经基因工程改造的完整抗体或其片段(诸如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体、等等),以及合成的抗原结合肽和多肽。非人类抗体可以通过将非人类CDR嫁接到人类框架和恒定区上,或者通过掺入完整的非人类可变结构域(任选的通过取代暴露的残基将它们用类人类表面“覆盖”,产生“经镶饰”抗体)进行人源化。在某些情况中,人源化抗体可以在人类可变区框架结构域中保留非人类残基以增强正确结合特征。通过将抗体人源化,可以增加生物学半寿期,并降低对人类施用后不利免疫反应的可能性。
此处可以用于产生或选择抗体的其它技术包括在体外将淋巴细胞暴露于zalpha11蛋白或肽,并选择噬菌体或相似载体中的抗体展示库(例如通过使用固定化或经标记zalpha11蛋白或肽)。编码具有潜在zalpha11多肽结合结构域的多肽的基因可以通过筛选在噬菌体(噬菌体展示)上或在细菌(诸如E.coli)上展示的随机肽库而获得。编码多肽的核苷酸序列可以由多种方法获得,诸如通过随机诱变和随机多核苷酸合成。这些随机肽展示库可以用于筛选与已知靶相互作用的肽,所述靶可以是蛋白质或多肽,诸如配基或受体、生物学或合成大分子、或者有机或无机物质。用于产生和筛选这些随机肽展示库的技术在本领域是众所周知的(Ladner等人,美国专利号5,223,409;Ladner等人,美国专利号4,946,778;Ladner等人,美国专利号5,403,484;和Ladner等人,美国专利号5,571,698),随机肽展示库和用于筛选这些库的试剂盒可以由例如Clontech(Palo Alto,CA)、Invitrogen公司(SanDiego,CA)、New England Biolabs公司(Beverly,MA)、和PharmaciaLKB Biotechnology公司(Piscataway,NJ)购买。可以使用此处公开的zalpha11序列筛选随机肽展示库以鉴定可结合zalpha11的肽。与zalpha11多肽相互作用的这些“结合肽”可以用于标记细胞;用于通过亲和纯化分离同源多肽;它们可以与药物、毒素、放射性核素、等等直接或间接缀合。这些结合肽还可以用于诸如筛选表达文库和中和活性等分析方法。结合肽还可以用于测定zalpha11多肽的循环水平、检测或定量分析作为潜在病理学或疾病标记的可溶性zalpha11多肽的诊断性实验。这些结合肽还可以作为zalpha11“拮抗剂”用于在体外或体内阻断zalpha11的结合和信号转导。这些抗zalpha11结合肽可以用于抑制可结合zalpha11的配基的作用。
如果1)抗体展示结合活性的阈值水平,和/或2)抗体与相关多肽分子不显著发生交叉反应,则确定这些抗体是可特异结合的。首先,如果此处的抗体与zalpha11多肽、肽、或表位的亲和力比与对照(非zalpha11)多肽的结合亲和力至少高10倍,则抗体是可特异结合的。优选抗体展示10-6M-1或更高的亲和力(Ka),优选10-7M-1或更高,更优选10-8M-1或更高,最优选10-9M-1或更高。抗体的结合亲和力可以由本领域普通技术人员通过例如Scatchard分析(G.Scatchard,纽约科学院年鉴(Ann.NY Acad.Sci.)51660-672,1949)容易的测定。
其次,如果抗体与相关多肽分子不显著发生交叉反应,则确定抗体是可特异结合的。如果例如使用标准Western印渍(Ausubel等人,同上),抗体可检测到zalpha11而非已知相关多肽,则抗体与相关多肽分子不显著发生交叉反应。已知相关多肽的范例是定向进化同源物,来自相同物种的蛋白质家族成员(如IL-6)、zalpha11多肽、和非人类zalpha11。此外,抗体可以用于针对已知相关多肽的筛选,以分离特异结合本发明多肽的群体。例如,可以将针对zalpha11的抗体吸附在附着于不溶性基质上的相关多肽上;将zalpha11特异的抗体在适当的缓冲条件下流经基质。这种筛选能够分离与紧密相关多肽不发生交叉反应的多克隆和单克隆抗体(《抗体实验室手册(AntibodiesALaboratory Manual)》,Harlow和Lane(编),冷泉港实验室出版社,1988;免疫学现行方案(Current Protocols in Immunology),Cooligan等人(编),国家卫生协会(National Institutes of Health),John Wiley and Sons公司,1995)。特异抗体的筛选和分离在本领域是众所周知的。参阅《基础免疫学(Fundamental Immunology)》,Paul(编),Rayen出版社,1993;Getzoff等人,免疫学进展(Adv.in Immunol.)431-98,1988;《单克隆抗体原理和实践(MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice)》,J.W.Goding(编),Academic出版有限公司,1996;Benjamin等人,免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)267-101,1984)。
本领域技术人员知道的多种实验可以用于检测可特异结合zalpha11蛋白或肽的抗体。例示性实验详细描述于《抗体实验室手册(AntibodiesA Laborotory Manual)》,Harlow和Lane(编),冷泉港实验室出版社,1988。这些实验的代表性范例包括并行免疫电泳、放射性免疫实验、放射性免疫沉淀、酶联免疫吸附实验(ELISA)、点印渍或Western印渍实验、抑制或竞争实验、和三明治实验。另外,可以筛选结合野生型及突变型zalpha11蛋白或多肽的抗体。
zalpha11的抗体可以用于标记表达zalpha11的细胞;用于通过亲和纯化分离zalpha11;用于测定zalpha11多肽循环水平的诊断性实验;用于检测或定量分析作为潜在病理学或疾病标记的可溶性zalpha11;用于采用FACS的分析方法;用于筛选表达文库;用于产生抗独特型抗体;和作为在体外和体内阻断zalpha11活性的中和抗体或拮抗剂。合适的直接标签或标记包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒、等等;间接标签或标记可以使用生物素/链霉亲和素或其它互补物/抗互补物对作为中介。此处的抗体还可以与药物、毒素、放射性核素、等等直接或间接缀合,这些缀合物可以用于体内诊断性或治疗性应用。此外,zalpha11或其片段的抗体可以用于在体外实验中,例如Western印渍或本领域已知的其它实验中,检测变性zalpha11或其片段。
zalpha11的抗体可以用于标记表达受体的细胞并检验zalpha11表达水平,用于亲和纯化,在诊断性实验中用于测定可溶性受体多肽的循环水平,采用荧光激活细胞分拣术的分析方法中。二价抗体可以作为激动剂用于模拟zalpha11配基的作用。
此处的抗体还可以与药物、毒素、放射性核素、等等直接或间接缀合,这些缀合物可以用于体内诊断性或治疗性应用。例如,识别本发明zalpha11的抗体或结合多肽可以用于鉴定或治疗表达对应抗互补分子(即zalpha11受体)的细胞或器官。更具体的说,抗zalpha11抗体或者其生物活性片段或部分可以与可检测或细胞毒性分子偶联,并投递到具有表达zalpha11分子的细胞、组织、或器官的哺乳动物中。
合适的可检测分子可以与可结合zalpha11的多肽(“结合多肽”,包括上文公开的结合肽)、抗体、或其生物活性片段或部分直接或间接附着。合适的可检测分子包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒、等等。合适的细胞毒性分子可以与多肽或抗体直接或间接附着,包括细菌或植物毒素(例如白喉毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、等等),以及治疗性放射性核素,诸如131I、188Rh、或90Yt(与多肽或抗体直接附着,或者通过例如螯合部分等方法间接附着)。结合多肽或抗体还可以与细胞毒性药物(诸如阿霉素)缀合。对于可检测或细胞毒性分子的间接吸附,该可检测或细胞毒性分子可以与互补物/抗互补物对的成员之一缀合,而另一个成员与结合多肽或抗体部分结合。对于这些目的,生物素/链霉亲和素是例示性互补物/抗互补物对。
在另一个实施方案中,结合多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白可以用于靶向的细胞或组织抑制或消除(例如用于处理癌细胞或组织)。或者,如果结合多肽具有多个功能结构域(即激活结构域或配基结合结构域,加上靶向结构域),则只包含靶向结构域的融合蛋白可以合适的将可检测分子、细胞毒性分子、或互补分子等导向感兴趣的细胞或组织类型。在只包含单个结构域的融合蛋白包含互补分子的情况中,抗互补分子可以与可检测或细胞毒性分子缀合。这些结构域-互补分子融合蛋白由此代表用于一般性抗互补物-可检测/细胞毒性分子缀合物的细胞/组织特异投递的一般性靶向载体。
在另一个实施方案中,如果结合多肽-细胞因子或抗zalpha11抗体靶向过度增殖细胞,则zalpha11结合多肽-细胞因子或抗体-细胞因子融合蛋白可以用于增强体内杀伤靶组织(例如血液、淋巴、结肠和骨髓癌)(参阅Hornick等人,血液(Blood)894437-4447,1997)。他们描述了能够将细胞因子靶向期望作用位点并由此增强细胞因子局部浓度的融合蛋白。合适的抗zalpha11抗体靶向非期望细胞或组织(即肿瘤或白血病),且融合的细胞因子通过效应细胞介导改进的靶细胞裂解。用于该目的的合适的细胞因子包括例如白介素2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
或者,此处所述的zalpha11结合多肽或抗体融合蛋白可以用于通过直接刺激zalpha11调控的凋亡途径导致表达zalpha11的过度增殖细胞死亡,从而增强靶组织的体内杀伤。
此处所述的生物活性结合多肽或抗体缀合物可以经口、静脉内、动脉内、或导管内投递,或者可以局部导入期望的作用位点。
结合细胞因子受体的四螺旋束细胞因子以及由激活的淋巴细胞产生的其它蛋白质在全身细胞的细胞分化、激活、募集、和动态平衡中具有重要的生物学作用。治疗性效用包括需要免疫调节的疾病的治疗,包括自身免疫疾病,诸如类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、和糖尿病。zalpha11拮抗剂或激动剂,包括可溶性受体和天然配基,在炎症调控中可能是重要的,并因此可以用于治疗类风湿性关节炎、哮喘、溃疡性结肠炎、炎症性肠疾病、Crohn氏疾病、和脓毒症。zalpha11拮抗剂或激动剂,包括可溶性受体和天然配基,可能在介导肿瘤发生中具有作用,并因此用于治疗癌症。zalpha11拮抗剂或激动剂,包括可溶性受体和天然配基,可能是抑制免疫系统的潜在治疗剂,对降低移植排斥很重要。zalpha11配基可能在预防移植物对宿主疾病中具有效用。
或者,zalpha11拮抗剂或激动剂,包括可溶性受体和天然配基可能激活免疫系统,对加强针对传染病的免疫力、治疗无免疫应答患者(诸如HIV+患者)、或改进疫苗比较重要。具体而言,zalpha11拮抗剂或激动剂,包括可溶性受体和天然配基可以调控、刺激、或扩增NK细胞或其后代,在治疗病毒性感染中有治疗价值,并可作为抗肿瘤因子。NK细胞被认为在消除转移性肿瘤细胞中具有重要作用,而患有转移性和实体瘤的患者的NK细胞活性水平降低(Whiteside等人,微生物学和免疫学现行课题(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)230221-244,1998)。
编码zalpha11多肽的多核苷酸可以用于期望增加或抑制zalpha11活性的基因治疗应用。如果某哺乳动物已突变或缺失zalpha11基因,则可以将zalpha11基因导入该哺乳动物的细胞。在一个实施方案中,将编码zalpha11多肽的基因在病毒载体中导入体内。这些载体包括减毒或缺陷的DNA病毒,诸如(但不限于)单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、等等。优选完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷病毒。缺陷病毒在导入细胞后无感染性。缺陷病毒载体能够施用于特异的、局部区域的细胞,而不用担心会感染其它细胞。特定载体的范例包括(但不限于)缺陷的单纯疱疹病毒(HSV1)载体(Kaplitt等人,分子和细胞神经科学(Molecu.Cell.Neurosci.)2320-330,1991);减毒的腺病毒载体,诸如Stratford-Perricaudet等人描述的载体(临床调查杂志(J.Clin.Invest.)90626-630,1992);和缺陷的腺伴随病毒载体(Samulski等人,病毒学杂志(J.Virol.)613096-3101,1987;Samulski等人,病毒学杂志(J.Virol.)633822-3828,1989)。
在另一个实施方案中,可以将zalpha11基因导入逆转录病毒载体,如Anderson等人所述,美国专利号5,399,346;Mann等人,细胞(Cell)33153,1983;Temin等人,美国专利号4,650,764;Temin等人,美国专利号4,980,289;Markowitz等人,病毒学杂志(J.Virol.)621120,1988;Temin等人,美国专利号5,124,263;国际专利出版物编号WO 95/07358,1995年3月16日由Dougherty等人发表;和Kuo等人,血液(Blood)82845,1993。或者,可以通过使用脂质体的体内脂转染法导入载体。合成阳离子脂质可以用于制备体内转染编码标记的基因的脂质体(Felgner等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)858027-8031,1988)。使用脂质体将外源基因导入体内特定器官具有某些实践优势。脂质体针对特定细胞的分子靶向作用代表一个方面的优势。更具体的说,导向转染特定细胞代表一个方面的优势。例如,导向转染特定细胞类型在细胞异质组织中特别有利,诸如胰、肝、肾、和脑。脂质可以与用于靶向目的的其它分子化学偶联。靶向的肽(如激素或神经递质)、蛋白质(诸如抗体)、或非肽分子可以与脂质体化学偶联。
可以由体内除去靶细胞;作为裸露DNA质粒导入载体;然后将经转化细胞重新移植回体内。可以通过本领域已知的方法,如转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪的使用、或DNA载体转运蛋白的使用,将用于基因治疗的裸露DNA载体导入期望的宿主细胞。参阅如Wu等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267963-967,1992;Wu等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26314621-14624,1988)。
反义方法学可以用于抑制zalpha11基因转录,诸如抑制体内细胞增殖。可以设计与zalpha11编码多核苷酸(如SEQ ID NO1显示的多核苷酸)中的片段互补的多核苷酸,用于结合zalpha11编码mRNA,并抑制该mRNA的翻译。可将这些反义多核苷酸用于抑制zalpha11多肽编码基因在细胞培养物或主体中的表达。
另外,作为细胞表面分子,zalpha11多肽可以作为将基因治疗导入细胞的靶。该应用特别适合于将治疗基因导入正常表达zalpha11的细胞,诸如淋巴细胞和PBL,或表达zalpha11多肽的癌细胞。例如,病毒基因治疗(诸如上文所述)可以被靶向到表达细胞受体(诸如zalpha11多肽)而非病毒受体的特异细胞类型。识别靶细胞表面上的zalpha11分子的抗体或其它分子可以用于引导病毒感染并将基因治疗物质施用于靶细胞。参阅S.L.C.Woo,自然生物技术(NatureBiotech.)141538,1996;T.J.Wickham等人,自然生物技术(NatureBiotech.)141570-1573,1996;Douglas J.T.等人,自然生物技术141574-1578,1996;B.Rihova,生物技术评论(Crit.Rev.Biotechnol.)17149-169,1997;和R.G.Vile等人,今日分子医学(Mol.Med.Today)484-92,1998。例如,包含与zalpha11特异抗体融合的病毒中和性Fab片段的双特异性抗体可以用于将病毒引导到表达zalpha11受体的细胞,并使包含基因元件的病毒有效进入细胞。参阅例如T.J.Wickman等人,病毒学杂志(J.Virol.)717663-7669,1997;和T.J.Wickman等人,病毒学杂志(J.Virol.)706831-6838,1996。
本发明还提供了可以用于诊断性应用的试剂。例如,zalpha11基因,包含zalpha11 DNA或RNA的探针或其亚序列,可以用于确定zalpha11是否位于16号染色体,或者是否发生了突变。zalpha11位于16号染色体的16p11.1区(见实施例3)。位于zalpha11基因座的可检测染色体畸变包括(但不限于)非整倍体、基因拷贝数变化、插入、删除、限制性位点变化、和重排。这些畸变可以使用本发明多核苷酸通过采用分子基因技术检测,诸如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、荧光原位杂交法、采用PCR技术的短串联重复(STR)分析、和本领域已知的其它基因连锁分析技术(Sambrook等人,同上;Ausubel等人,同上;Marian,胸(Chest)108255-265,1995)。
基因定位的精确知识可以用于大量目的,包括1)确定序列是否为现有毗连序列的部分并获得各种形式(诸如YAC、BAC、或cDNA克隆)的其它附近序列;2)提供显示与某些染色体区域连锁的遗传病的可能的候选基因;和3)可能有助于确定特定基因可能具有的功能的交叉对照模型生物,诸如小鼠。
zalpha11基因位于16号染色体的16p11.1区。已知功能的多种基因位于该区。例如,白介素4(IL-4)细胞因子受体α亚基(造血受体家族成员)位于16p12.1-p11.2。该亚基可能与zalpha11形成异二聚体。此外,zalpha11多核苷酸探针可以用于检测与IL-4受体缺陷有关的畸变或基因型,诸如一些过敏性炎症紊乱和哮喘中涉及的那些(K.A.Deichman等人,Exp.Allergy 28151-155,1998;H.Mitsuyasu等人,自然遗传学(Nature Genet.)19119-120,1998)。另外,zalpha11多核苷酸探针可以用于检测与炎症性肠疾病有关的畸变或基因型,其易感标记位于16p12-q13(J.H.Cho等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)957502-7507,1998)。此外,zalpha11多核苷酸探针可以用于检测与位于16pter-p13.3的血红蛋白基因座有关的畸变或基因型,特别是与α-珠蛋白生成障碍性贫血综合症有关的血红蛋白α缺陷,诸如胎儿水肿病(综述见M.P.Chui和J.S.Waye,血液(Blood)912213-2222,1998)。此外,在其它基因座中,III型Wilms肿瘤(16q)、Rubenstein-Taybi综合症(16p13.3)、严重的婴儿多囊性肾病(16p13.3)自身都证明是人类疾病状况,并位于人类基因组中该区域。关于16号染色体的该区域,参阅公开的WWW服务器(http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/getmap?chromosome=16p11.1)上的在线人类孟德尔遗传(OMIM)基因图及其参考文献。所有这些均可以作为显示与zalpha11基因相同染色体区域连锁的遗传病的可能的候选基因。
相似的,zalpha11基因座的缺陷可能导致可遗传的人类疾病状况。本发明的分子,诸如本发明的多肽、拮抗剂、激动剂、多核苷酸、和抗体将有助于与zalpha11基因缺陷有关的检测、诊断、预防、和治疗。
还可以构建经改造而表达zalpha11基因的小鼠,称为“转基因小鼠”,和zalpha11基因功能完全缺失的小鼠,称为“基因敲除小鼠”(Snouwaert等人,科学(Science)2571083,1992;Lowell等人,自然(Nature)366740-742,1993;M.R.Capecchi,科学(Science)2441288-1292,1989;R.D.Palmiter等人,遗传学年鉴(Annu.Rev.Genet.)20465-499,1986)。例如,过量表达zalpha11的转基因小鼠,不管是普遍地还是受控于组织特异性或组织限制性启动子的表达,都可以用于研究过量表达是否产生表型。例如,野生型zalpha11多肽、多肽片段、或其突变体的过量表达可能改变正常的细胞过程,导致一种表型,可用来鉴定zalpha11表达功能相关的组织,并可能指示为zalpha11、其激动剂或拮抗剂的治疗靶。例如,需改造的转基因小鼠优选表达“显隐性”表型的小鼠,诸如过量表达连接了跨膜结构域的zalpha11胞外细胞因子结合结构域(SEQ ID NO2的大约第20位(Cys)至第255位(Leu)氨基酸)的小鼠。此外,这种过量表达表达可能产生与人类疾病相似的表型。类似地,zalpha11基因敲除小鼠可用于确定体内是否确实需要zalpha11。基因敲除小鼠的表型可预测zalpha11拮抗剂,诸如本文此处公开的那些,可能具有的体内效应。小鼠或人类zalpha11 cDNA可以用于分离鼠zalpha11mRNA、cDNA、和基因组DNA,随后可以用于产生基因敲除小鼠。这些小鼠可用于在体内系统中研究zalpha11基因及其编码的蛋白质,并可作为相应人类疾病的体内模型。此外,此处所述的针对zalpha11的zalpha11反义多核苷酸或核酶的转基因小鼠表达可以类似的应用于上述转基因小鼠。
关于药学应用,本发明的可溶性受体多肽可以根据传统方法配制成用于经非胃肠道途径,尤其静脉内或皮下途径投递。静脉给药通常是在一至几小时的时间段内通过大药丸注射或灌注给予。通常,药用配方包括zalpha11可溶性受体多肽,并联合药学可接受的载体,诸如生理盐水、缓冲盐水、5%葡萄糖水溶液等等。配方中还可包括一或多种赋形剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂、清蛋白以防止蛋白质损失在瓶表面等。制剂配制方法在本领域是众所周知的,并描述于例如《雷明顿药剂学原理与实践(RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy)》,Gennaro(编),Mack出版公司,Easton,PA,第19版,1995。治疗剂量通常范围为每天0.1-100μg/kg患者体重,优选每天0.5-20mg/kg,准确剂量由临床医生根据公认标准,并考虑待治病情的特点和严重程度以及患者状况等而定。剂量的确定属于本领域普通技术人员水平之内。该蛋白质可以用于急性治疗,时间一周以上或略少,常常1-3天;或者可以用于慢性治疗,时间超过数月或数年。通常,zalpha11可溶性受体的治疗有效量是足以产生临床显著效果的量。
本发明由以下非限制实施例进行进一步的描述。
实施例实施例1
人类zalpha11的鉴定使用EST序列获得全长zalpha11扫描翻译DNA数据库,鉴定到发现是I型细胞因子受体家族成员的表达序列标签(EST)序列,并命名为zalpha11。
通过EST来源的cDNA的序列分析进行了EST序列的确认。使用下列引物获得了该cDNA克隆,并进行了测序ZC 447(SEQ ID NO5)、ZC 976(SEQ ID NO6)、ZC 19345(SEQ ID NO7)、ZC 19346(SEQID NO8)、ZC 19349(SEQ ID NO9)、ZC 19350(SEQ ID NO10)、ZC 19458(SEQ ID NO11)、ZC 19459(SEQ ID NO12)、ZC 19460(SEQ ID NO13)、ZC 19461(SEQ ID NO14)、ZC 19572(SEQ ID NO15)、ZC 19573(SEQ ID NO16)、ZC 19657(SEQ IDNO17)。插入片段为2945bp,且为全长。
实施例2组织分布使用Human Multiple Tissue NorthernTMBlot(MTNI、MTNII、和MTNIII)(Clontech)进行Northern印渍分析。使用实施例1中所述cDNA进行PCR,其中引物为寡ZC19,181(SEQ ID NO18)和ZC19,182(SEQ ID NO19)。PCR条件如下94℃ 1.5min;94℃ 15sec/68℃30sec 35个循环;72℃ 10min;4℃过夜。将PCR反应产物的样品进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。看到了预期大小175bp的条带。根据制造商的说明书,使用商业性试剂盒(QiaexIITM,Qiagen)凝胶纯化175bp的PCR片段,并使用RediprimeIITM(Amersham;一种随机引发标记系统)用32P-dCTP进行放射性标记。然后使用Nuc-TrapTM柱(Stratagene)根据制造商的说明书纯化探针。使用ExpressHybTM(Clontech)溶液进行预杂交,并作为Northern印渍的杂交液。杂交使用1-2×106cpm/ml经标记探针于65℃进行过夜。然后将印渍在2×SSC/1%SDS中于25℃ 15min清洗4次,随后在0.1×SSC/0.1%SDS中于50℃清洗1次。在淋巴结、外周血白细胞、和胸腺中检测到大约3kb和5kb的转录本。
还使用Human RNA Master BlotsTM(Clontech)进行了点印渍。用于点印渍的方法和条件与上述多组织印渍(Multiple Tissue Blot)的相同。点印渍在胸腺、淋巴结、和脾中具有最强的信号。
还使用Human Cancer Cell Line MTNTM(Clontech)进行了Northern分析。使用实施例1中所述cDNA进行PCR,引物为寡ZC19,907(SEQ IDNO20)和ZC19,908(SEQ ID NO21)。PCR条件如下95℃ 1min/60℃1min/72℃ 1.5min 35个循环;72℃ 10min;4℃过夜。将PCR反应产物的样品进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。看到了预期大小1.2kb的条带。根据制造商的说明书,使用商业性试剂盒(QiaQuickTMGelExtraction Kit;Qiagen)凝胶纯化1.2kb的PCR片段,并使用Prime-ItIITM(Stratagene;一种随机引发标记系统)用32P-dCTP进行放射性标记。然后使用Nuc-TrapTM柱(Stratagene)根据制造商的说明书纯化探针。使用ExpressHybTM(Clontech)溶液进行预杂交,并作为Northern印渍的杂交液。杂交使用1-2×106cpm/ml经标记探针于65℃进行2小时。然后将印渍在2×SSC/1%SDS中于25℃ 15min清洗4次,随后在0.1×SSC/0.1%SDS中于50℃ 30min清洗2次。在由Burkitt淋巴瘤衍生的Raji细胞系中看到强信号。
实施例3基于PCR的zalpha11基因的染色体定位使用商业性的“GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel”(Research Genetics公司,Huntsville,AL)将zalpha11定位在16号染色体。GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel包含来自93种放射性杂交克隆的PCR可扩增DNA和2种对照DNA(HFL供体和A23受体)。公开的WWW服务器(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)能够将使用GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel构建的人类基因组的基因组研究放射性杂交图(“WICGR”放射性杂交图)相对于Whitehead Institute/MIT Center定位。
关于使用“GeneBridge 4 RH Panel”的zalpha11定位,在96孔微量滴定板(Stratagene,La Jolla,CA)中建立20μl反应体系,并用于“RoboCycler Gradient 96”热循环仪(Stratagene)。95个PR反应体系的每一个包含2μl 10×PCR反应缓冲液(ClontechLaboratories公司,Palo Alto,CA)、1.6μl dNTP混和液(每种2.5mM,Perkin-Elmer,Foster City,CA)、1μl有义引物ZC19,954(SEQ IDNO22)、1μl反义引物ZC19,955(SEQ ID NO23)、2μl“RediLoad”(Research Genetics公司,Huntsville,AL)、0.4μl 50×AdvantageKlenTaq Polymerase Mix(Clontech)、25ng来自各个杂交克隆或对照的DNA和水,总体积20μl。将反应体系用等量矿物油封盖。PCR循环仪条件如下预变性94℃ 4min;94℃ 45sec/68℃ 45sec/72℃1min 35个循环;72℃ 7min。将反应液在2%琼脂糖凝胶(LifeTechnologies)上通过电泳进行分离。
结果显示,zalpha11定位在16号染色体WICGR放射性杂交图上距框架标记WI-3768为9.54 cR 3000处。近端和远端框架标记分别为WI-3768和TIGR-A002K05。使用周围标记将zalpha11定位在完整16号染色体图(Genetic Location Database,University ofSouthhampton,WWW服务器http//cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/)上的16p11.1区域。
实施例4人类MPL-zalpha11多肽嵌合体的构建与zalpha11胞内信号结构域融合的MPL胞外和跨膜结构域使用引物为ZC17,212(SEQ ID NO24)和ZC19,914(SEQ ID NO25)的PCR,由包含MPL受体的质粒(PHZ1/MPL质粒)分离MPL受体的胞外和跨膜结构域。反应条件如下95℃ 1min;95℃ 1min/45℃1min/72℃ 2min 35个循环;72℃ 10min;10℃浸泡。将PCR产物在1%低熔点琼脂糖(Boerhinger Mannheim,Indianapolis,IN)上进行电泳,并使用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示分离大约1.5kb的MPL受体片段。
使用引物为ZC19,913(SEQ ID NO26)和ZC20,097(SEQ ID NO27)的PCR,由包含zalpha11受体cDNA的质粒分离zalpha11的胞内结构域。zalpha11受体编码序列的相应多核苷酸序列显示于SEQ ID NO1的第69位至第1682位核苷酸。反应条件同上。将PCR产物在1%低熔点琼脂糖(Boerhinger Mannheim)上进行电泳,并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒根据制造商的指示分离大约900bp的zalpha11片段。
将上述两种分离片段以1∶1的体积比混和,并用于以ZC17,212(SEQID NO24)和ZC20,097(SEQ ID NO27)为引物的PCR反应,以产生MPL-zalpha11嵌合体。反应条件如下95℃ 1min;95℃ 1min/55℃1min/72℃ 2min 35个循环;72℃ 10min;10℃浸泡。将所有PCR产物在1%低熔点琼脂糖(Boerhinger Mannheim)上进行电泳,并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示分离大约2.4kb的MPL-zalpha11嵌合体片段。将MPL-zalpha11嵌合体片段用EcoRI(BRL)和XbaI(Boerhinger Mannheim)根据制造商的指示进行消化。将所有消化物在1%低熔点琼脂糖(Boerhinger Mannheim)上进行电泳,并使用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示分离经切割的MPL-zalpha11嵌合体片段。将产生的经切割MPL-zalpha11嵌合体插入下述表达载体。
将受体表达载体pZP-5N用EcoRI(BRL)和HindIII(BRL)根据制造商的指示进行消化,并如上所述进行凝胶纯化。将此载体片段与上文分离的经EcoRI和XbaI切割的MPL-zalpha11嵌合体和XbaI/HindIII接头片段在连接反应中进行连接。连接使用T4连接酶(BRL)于15℃进行过夜。将连接样品经电穿孔进入DH10B ElectroMAXTM电感受态E.coli细胞(25μF,200Ω,2.3V)。将转化体铺在LB+氨苄青霉素平板上,并通过确认MPL-zalpha11嵌合体的PCR(以ZC17,212(SEQ ID NO24)和ZC20,097(SEQ ID NO27)为引物,PCR条件如上所述)筛选单菌落。
通过使用下列引物的序列分析确认MPL-zalpha11嵌合体序列ZC12,700(SEQ ID NO28)、ZC5,020(SEQ ID NO29)、ZC6,675(SEQ ID NO30)、ZC7,727(SEQ ID NO31)、ZC8,290(SEQ IDNO32)、ZC19,572(SEQ ID NO15)、ZC6,622(SEQ ID NO33)、ZC7,736(SEQ ID NO34)、和ZC9,273(SEQ ID NO35)。插入片段约为2.4kb,且为全长。
实施例5在使用Alamar Blue的BAF3实验中基于MPL-zalpha11嵌合体的增殖A.表达MPL-zalpha11嵌合体的BaF3细胞的构建在完全培养基(添加10%热灭活胎牛血清、2ng/ml鼠IL-3(mIL-3)(R&D,Minneapolis,MN)、2mM L-glutaMax-1TM(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)、和PSN抗生素(Gibco BRL)的RPMI培养基(JRH Bioscience公司,Lenexa,KS))中,维持由鼠骨髓衍生的依赖白介素-3(IL-3)的前淋巴细胞系BaF3(Palacios和Steinmetz,细胞(Cell)41727-734,1985;Mathey-Prevot等人,分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)64133-4135,1986)。在进行电穿孔前,使用Qiagen Maxi Prep Kit(Qiagen)根据制造商的指示,制备并纯化pZP-5N/MPL-zalpha11 DNA(实施例4)。将用于电穿孔的BaF3细胞在RPMI培养基中清洗1次,然后以107个细胞/ml的细胞密度重悬于RPMI培养基。将1ml重悬的BaF3细胞与30μg pZP-5N/MPL-zalpha11质粒DNA混和,并转移至单个一次性电击槽(Gibco BRL)中。于室温温育15分钟后,由电穿孔装置(CELL-PORATORTM;Gibco BRL)给予细胞两次连续轰击(800 lFad/300V;1180 lFad/300V)。恢复5分钟后,将经电穿孔的细胞转移至50ml完全培养基中,并于温箱中静置15-24小时(37℃,5%CO2)。然后将细胞离心,并重悬于装在T-162烧瓶中的50ml含GeneticinTM(Gibco)选择(500μg/ml G418)的完全培养基,以分离G418抗性群。如下所述检验经转染BaF3细胞群(此后称为BaF3/MPL-zalpha11细胞)的信号能力。B.使用Almar Blue增殖实验测试BaF3/MPL-zalpha11细胞的信号能力将BaF3/MPL-zalpha11细胞离心,并在完全培养基(如上所述,但是不含mIL-3,此后称为“不含mIL-3的培养基”)中清洗。将细胞离心,并清洗3次,以确保除去了mIL-3。然后在血球计中对细胞进行计数。将细胞以5000个细胞/孔(每个孔100μl不含mIL-3的培养基)铺在96孔板中。
使用用不含mIL-3的培养基稀释至500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62ng/ml、30ng/ml、15ng/ml、7.5ng/ml、3.75ng/ml、1.8ng/ml、0.9ng/ml、0.5ng/ml、和0.25ng/ml浓度的血小板生成素(TPO)评价BaF3/MPL-zalpha11细胞的增殖。向BaF3/MPL-zalpha11细胞中加入100μl经稀释TPO。总实验体积是200μl。使用未加入TPO的不含mIL-3的培养基进行阴性对照的平行实验。将实验板于37℃、5%CO2温育3天,以20μl/孔加入Alamar Blue(Accumed,Chicago,IL)。Alamar Blue给出基于存活细胞数目的荧光读数,由此直接测量相对于阴性对照的细胞增殖。将板再一次于37℃、5%CO2温育24小时。在FmaxTM平板计数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上使用SoftMaxTMPro程序于波长544(激发)和590(发射)读板。
结果确认了zalpha11受体胞内部分的信号能力,因为血小板生成素在62ng/ml和更高浓度诱导的增殖约为背景的10倍。
实施例6表达全长zalpha11的表达载体的构建使用以ZC19,905(SEQ ID NO36)和ZC19,906(SEQ ID NO37)为引物的PCR,由含zalpha11受体cDNA的质粒分离完整zalpha11受体。反应条件如下95℃ 1min;95℃ 1min/55℃ 1min/72℃ 2min 35个循环;72℃ 10min;10℃浸泡。将PCR产物在1%低熔点琼脂糖(Boerhinger Mannheim)上进行电泳,并使用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示分离大约1.5kb的zalpha11 cDNA。
将纯化的zalpha11 cDNA用BamHI(Boerhinger Mannheim)和EcoRI(BRL)根据制造商的指示进行消化。将所有消化物在1%低熔点琼脂糖(Boerhinger Mannheim)上进行电泳,并使用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒根据制造商的指示分离经切割的zalpha11片段。将产生的经切割zalpha11嵌合体插入下述表达载体。
将受体表达载体pZP-5N用BamHI(Boerhinger Mannheim)和EcoRI(BRL)根据制造商的指示进行消化,并如上所述进行凝胶纯化。将此载体片段与上文分离的经BamHI和EcoRI切割的zalpha11片段在连接反应中进行连接。连接使用T4连接酶(BRL)于15℃进行过夜。将连接样品经电穿孔进入DH10B ElectroMAXTM电感受态E.coli细胞(25μF,200Ω,2.3V)。将转化体铺在LB+氨苄青霉素平板上,并通过确认zalpha11序列的PCR(以ZC19,905(SEQ ID NO36)和ZC19,906(SEQ ID NO37)为引物,PCR条件如上所述)筛选单菌落。
通过使用下列引物的序列分析确认了MPL-zalpha11序列ZC12,700(SEQ ID NO28)、ZC5,020(SEQ ID NO29)、ZC20,114(SEQ ID NO38)、ZC19,459(SEQ ID NO12)、ZC19,954(SEQ IDNO39)、和ZC20,116(SEQ ID NO40)。插入片段约为1.6kb,且为全长。
实施例7在使用Alamar Blue的BAF3实验中基于zalpha11的增殖A.表达zalpha11受体的BaF3细胞的构建使用30μg上文实施例6所述的zalpha11表达载体,如上文实施例5A所述,构建了表达全长zalpha11受体的BaF3细胞。将表达zalpha11受体mRNA的BaF3细胞命名为BaF3/zalpha11。如下文实施例8和12将这些细胞用于筛选zalpha11活性。
实施例8使用Alamar Blue增殖实验用BaF3/zaopha11细胞筛选zalpha11活性A.用于测试zalpha11活性的存在的猴原代细胞来源如下所述将来自猴原代脾细胞的条件培养基用于测试活性的存在与否。将猴脾细胞用5ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)(Calbiochem,San Diego,CA)和0.5μg/ml依屋诺霉素TM(Calbiochem)活化72小时。如下所述将来自经刺激的猴脾细胞的上清液用于检验BaF3/zalpha11细胞的增殖。B.使用Alamar Blue增殖实验用BaF3/zalpha11细胞筛选zalpha11活性将BaF3/MPL-zalpha11细胞离心,并在不含mIL-3的培养基中清洗。将细胞离心并清洗3次,以确保除去了mIL-3。然后在血球计中对细胞进行计数。将细胞以5000个细胞/孔(每个孔100μl不含mIL-3的培养基)铺在96孔板中。
使用用不含mIL-3的培养基稀释至50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5%、0.75%、和0.375%浓度的来自经活化猴脾(见上文实施例8A)的条件培养基评价BaF3/zalpha11细胞的增殖。向BaF3/zalpha11细胞中加入100μl经稀释的条件培养基。总实验体积是200μl。将实验板于37℃、5%CO2温育3天,其间以20μl/孔加入AlamarBlue(Accumed,Chicago,IL)。将板再一次于37℃、5%CO2温育24小时。如上所述(实施例5)在FmaxTM平板计数器(Molecular Devices)上读板。
结果确认了BaF3/zalpha11细胞对经活化猴脾条件培养基中存在的因子的应答性增殖。50%浓度下的应答经测量约为背景的4倍。BaF3野生型细胞不对该因子发生应答增殖,说明该因子对zalpha11受体特异。C.用于分离zalpha11活性的人原代细胞来源使用10×10ml含肝素的真空管,由6名捐献者每名采集100ml血样。合并来自6名捐献者的血液(600ml),用PBS 1∶1稀释,并使用Ficoll-PaquePLUS(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)分离。在菲科尔(ficoll)梯度上分离后原代人细胞产量为1.2×109个细胞。
将细胞悬于9.6ml MACS缓冲液(PBS/0.5%EDTA/2mM EDTA)。取出1.6ml细胞悬浮液并加入0.4ml CD3微珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)。将混和液于4℃温育15分钟。将用CD3珠标记的这些细胞用30ml MACS缓冲液进行清洗,然后重悬于2ml MACS缓冲液。
根据制造商的指示制备VS+柱(Miltenyi)。然后将VS+柱置于VarioMACSTM磁场(Miltenyi)。用5ml MACS缓冲液平衡柱子。然后将分离的原代人细胞加到柱子上。使CD3阴性细胞能够通过。将柱子用9ml(3×3ml)MACS缓冲液漂洗。然后将柱子由磁场转移到15ml falcon管上。向柱子中加入5ml MACS缓冲液以洗脱CD3+细胞,并使用制造商提供的活塞冲刷结合的细胞。将上述细胞与CD3磁珠的温育、清洗、和VS+柱步骤(温育至洗脱)再重复5次。合并6次柱层析分离得到的CD3+收集液。CD3+选择的人T细胞的产量为3×108个细胞。
取合并的CD3+选择的人T细胞样品染色,并在荧光抗体细胞分拣器(FACS)上进行分拣,以评价其纯度。CD3+选择的人T细胞含91%的CD3+细胞。
通过在RPMI/5% FBS/10ng/ml PMA/0.5μg/ml依屋诺霉素(Calbiochem)中于37℃温育13小时,活化CD3+选择的人T细胞。如下所述测试来自这些经活化的CD3+选择的人T细胞的上清液中的zalpha11活性。D.使用BaF3/zalpha11细胞和Alamar Blue增殖实验测试来自经活化的CD3+选择的人T细胞的上清液中的zalpha11活性将BaF3/zalpha11细胞离心,并在不含mIL-3的培养基中清洗。将细胞离心并清洗3次,以确保除去了mIL-3。然后在血球计中对细胞进行计数。将细胞以5000个细胞/孔(每个孔100μl不含mIL-3的培养基)铺在96孔板中。
使用用不含mIL-3的培养基稀释至50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5%、0.75%、和0.375%浓度的来自经活化CD3+选择的人T细胞(见上文实施例8C)的条件培养基评价BaF3/zalpha11细胞的增殖。向BaF3/zalpha11细胞中加入100μl经稀释的条件培养基。总实验体积是200μl。如实施例8B所述,温育并检验实验板。
结果确认了BaF3/zalpha11细胞对经活化CD3+选择的人T细胞条件培养基中存在的因子发生应答性增殖。50%浓度下的应答经测量约为背景的10倍。BaF3野生型细胞不对该因子应答进行增殖,说明该因子对zalpha11受体特异。
实施例9表达zalpha11可溶性受体的哺乳动物表达载体的构建zalpha11CEE、zalpha11CFLG、zalpha11CHIS和zalpha11-Fc4A.含zalpha11CEE、zalpha11CFLG、和zalpha11CHIS的zalpha11哺乳动物表达载体的构建制备用于表达zalpha11多肽的可溶性胞外结构域的表达载体pC4zalpha11CEE,其中构建物设计成表达包含预测起始甲硫氨酸并于预测跨膜结构域附近截断、具有C末端Glu-Glu标签(SEQID NO41)的zalpha11多肽。
使用ZC19,931(SEQ ID NO42)和ZC19,932(SEQ ID NO43)作为引物(加入了Asp718和BamHI限制性位点),经PCR产生zalpha11DNA的700bp片段。使用包含zalpha11受体cDNA的质粒作为模板。如下进行zalpha11片段的PCR扩增94℃ 0.5min 25个循环;94℃ 10sec/50℃ 30sec/68℃ 45sec 5个循环;4℃保存。通过氯仿/酚抽提和异丙醇沉淀纯化反应液,并用Asp718和BamHI(Gibco BRL)根据制造商的方案进行消化。通过1%琼脂糖凝胶电泳看到了预计大小700bp的条带,切下胶块,并使用QiaexIITM纯化系统(Qiagen)根据制造商的指示纯化DNA。
将经切割DNA亚克隆到经BamHI和Asp718切割的质粒pC4EE中。pC4zalpha11CEE表达载体使用天然zalpha11信号肽,并将Glu-Glu标签(SEQID NO41)附加在zalpha11多肽编码多核苷酸序列的C末端。质粒pC4EE是含表达盒的哺乳动物表达载体,该表达盒包含小鼠金属硫蛋白-1启动子、用于插入编码序列的多克隆限制性位点、终止密码子、和人类生长激素终止子。该质粒还包含E.coli复制起点、具有SV40启动子、增强子、和复制起点的哺乳动物选择标记表达单位、DHFR基因、和SV40终止子。
将大约30ng经限制性消化的zalpha11插入片段和大约12ng经消化载体于16℃连接过夜。每个连接反应取1ul,根据制造商的指示经独立电穿孔进入DH10B感受态细胞(Gibco BRL,Gaithersburg,MD),并铺在含50mg/ml氨苄青霉素的LB平板上,温育过夜。通过对由单菌落的2ml液体培养物制备的DNA进行限制性分析筛选菌落。通过序列分析确认阳性克隆的插入片段序列。使用QIAGEN大量制备试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示进行大量质粒的制备。
将相同过程用于制备含C末端his标签(包含一排6个组氨酸残基)和C末端flag(SEQ ID NO49)标签的zalpha11可溶性受体,zalpha11CFLAG。为了构建这些构建物,上述载体包含HIS或FLAG标签,以取代Glu-Glu标签(SEQ ID NO41)。B.可溶性zalpha11受体zalpha11-Fc4的哺乳动物表达构建通过同源重组构建了包含完整或部分zalpha11编码多核苷酸的表达质粒。使用PCR分离zalpha11 cDNA的片段,该片段包含来自zalpha11受体胞外结构域的多核苷酸序列。用于产生zalpha11片段的两种引物是(1)用于PCR的引物由5’至3’都包含40bp的载体侧翼序列(插入片段的5’)和对应于zalpha11胞外结构域5’末端的17bp(SEQ ID NO44);和(2)Fc4多核苷酸序列(SEQ ID NO45)5’末端的40bp和对应于zalpha11胞外结构域3’末端的17bp(SEQ ID NO46)。用于与zalpha11融合的Fc4片段通过相似方式的PCR产生。用于产生Fc4片段的两种引物是(1)包含来自zalpha11胞外结构域3’末端的40bp和Fc45’末端的17bp的5’引物(SEQ ID NO47);和(2)包含载体序列的40bp(插入片段的3’)和Fc43’末端的17bp的3’引物(SEQ ID NO48)。
上述每次反应的PCR扩增如下进行94℃ 2min;94℃ 30sec/60℃ 30sec/72℃ 1min 25个循环;72℃ 5min;4℃保存。由100μl PCR反应液取10μl,在0.8%LMP琼脂糖凝胶(Seaplaque GTG)上用1×TBE缓冲液进行电泳分析。向剩余的90μl PCR反应液加入5μl 1M NaCl和250μl无水乙醇进行沉淀。所用表达载体由质粒pCZR199(保藏于美国典型培养物收藏中心,10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209,编号98668)衍生,并用SmaI(BRL)进行切割。表达载体由质粒pCZR199衍生,是含表达盒的哺乳动物表达载体,该表达盒包含CMV立即早期启动子、来自小鼠免疫球蛋白重链基因座可变区的共有内含子、用于插入编码序列的多克隆限制性位点、终止密码子、和人类生长激素终止子。表达载体还包含E.coli复制起点、具有SV40启动子、增强子、和复制起点的哺乳动物选择标记表达单位、DHFR基因、和SV40终止子。所用表达载体由pCZR199通过用CMV立即早期启动子取代金属硫蛋白启动子而构建。
取100μl酵母(酿酒酵母)感受态细胞,与10μl各含大约1μgzalpha11和Fc4插入片段和100ng经SmaI(BRL)消化的表达载体混和,并转移到0.2cm电击槽中。将酵母/DNA混合物于0.75kV(5kY/cm),“无穷大”Ω,25μF进行电穿孔。向每个电击槽中加入600μl 1.2M山梨醇,并将酵母分成2份,每份300μl,分别铺在URA-D平板上,并于30℃温育。
大约48小时后,将来自单个平板的Ura+酵母转化体重悬于1ml H2O,离心沉淀酵母细胞。将细胞沉淀重悬于1ml裂解缓冲液(2%Triton-100/1% SDS/100mM NaCl/10mM Tris pH8.0/1mM EDTA)。向装有300μl经酸洗玻璃珠和200μl酚-氯仿的Eppendorf管中加入500μl裂解混和物,旋涡振荡1min,间歇2-3次,随后在Eppendorf离心机中于最高速度离心5分钟。将300μl水相转移到新管中,加入600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA,随后于4℃离心10分钟。将DNA沉淀重悬于100μl H2O。
使用0.5-2ml酵母DNA制备物和40μl DHi0B细胞(Gibco BRL)进行E.coli电感受态细胞的转化。将细胞于2.0kV,25mF,400Ω进行电脉冲。电穿孔后,将1ml SOC(2%细菌用胰胨(Difco,Detroit,MI)/0.5% 酵母提取物(Difco)/10mM NaCl/2.5mM KCl/10mMMgCl2/10mM MgSO4/20mM葡萄糖)分成250μl每份,铺在4块LB AMP平板(LB肉汤(Lennox)/1.8%细菌用琼脂(Difco)/100mg/L氨苄青霉素)上。
通过限制性消化鉴定包含正确的zalpha-Fc4表达构建物的单克隆,以确认zalpha11-Fc4插入片段的存在和确认各种DNA序列已经正确的连接在一起。将阳性克隆的插入片段进行序列分析。使用Qiagen大量试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示分离大量质粒DNA。
实施例10zalpha11可溶性受体多肽的转染和表达将BHK570细胞(ATCC No.CRL-10314)第27代以1.2×106个细胞/孔(6孔板)置于800μl无血清(SF)DMEM培养基(DMEM/Gibco BRL HighGlucose)(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)中。使用LipofectinTM(Gibco BRL),在无血清(SF)DMEM中,将细胞用上述(见实施例9)包含zalpha11CEE/CFLG/CHIS的表达质粒进行转染。zalpha11CEE/CFLG/CHIS每种取3μg,分别在1.5ml管中用SF DMEM稀释至终体积100μl。在另外的各个管中,加入15μl LipofectinTM(Gibco BRL)与100μl SF DMEM混和。将LipofectinTM混和物于室温温育30-45分钟,然后加入DNA混和物,并于室温温育大约10-15分钟。
将所有DNALipofectiTM混和物加到铺板细胞上,并涂步均匀。将细胞于37℃温育大约5小时,然后转移到分开的150mm MAXI平板上,终体积30ml DMEM/5%胎牛血清(FBS)(Hyclone,Logan,UT)。将平板于37℃、5%CO2温育过夜,并于第二天用选择培养基(5%FBS/DMEM/1μM氨甲喋呤(MTX))替换DNALipofectinTM混和物。
转染后大约10-12天,将平板用10ml SF DMEM进行清洗。吸出清洗培养基,并用7.25ml无血清DMEM替换。然后将预先浸泡在SF DMEM中的无菌Teflon筛网(Spectrum Medical Industries,Los Angeles,CA)置于克隆细胞集落上。然后将预先浸泡在SF DMEM中的无菌硝酸纤维素滤膜置于筛网上。将硝酸纤维素上的定向标记转移到培养盘上。然后将平板在37℃、5%CO2温箱中温育5-6小时。
温育后,取出滤膜/筛网,吸去培养基,并换入5%FBS/DMEM/1μM MTX。然后将滤膜在10%脱脂奶粉/Western A缓冲液(Western A50mM Tris pH7.4/5mM EDTA/0.05%NP-40/150mM NaCl/0.25%明胶)中于室温在摇床上封闭15分钟。然后将滤膜分别与抗Glu-Glu、抗FLAG、或抗His抗体-HRP缀合物在2.5%脱脂奶粉/Western A缓冲液中于室温在摇床上温育1小时。然后将滤膜于室温用Western A清洗3次,每次5-10分钟。将滤膜用ultra ECL试剂(Amersham公司,Arlington Heights,IL)根据制造商的指示进行显色,并在Lumi-Imager(Roche公司)上进行观察。
将阳性表达克隆集落挑取到12孔板的1ml 5%FCS/DMEM/5μM MTX中,然后生长至汇合。然后通过SDS-PAGE和Western分析测试条件培养基样品中的表达水平。每种构建物挑取3个表达水平最高的克隆;将其中2个进行冻存,1个进行扩增用于支原体测试和大量IT化种子制备。B.可溶性zalpha11受体zalpha11-Fc4的哺乳动物表达将BHK570细胞(ATCC No.CRL-10314)铺在10cm组织培养皿中,并于37℃、5%CO2,在DMEM/FBS培养基(DMEM/Gibco BRL High Glucose(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)/5%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)/1mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences,Lenexa,KS)/1mM丙酮酸钠(Gibco BRL))中培养过夜,至大约50-70%汇合。然后使用LipofectamineTM(Gibco BRL)在无血清(SF)培养基配剂(DMEM/10mg/ml转铁蛋白/5mg/ml胰岛素/2mg/ml胎球蛋白/1% L-谷氨酰胺/1%丙酮酸钠)中,用包含zalpha11-Fc4(见实施例9)的质粒转染细胞。将包含zalpha11-Fc4的质粒在15ml管中用SF培养基稀释至总终体积640ml。将35ml LipofectamineTM(Gibco BRL)与605ml SF培养基混和。向DNA混和物中加入LipofectamineTM混和物,并于室温温育大约30分钟。向DNALipofectamineTM混和物中加入5ml SF培养基。将细胞用5ml SF培养基漂洗1次,吸去培养基,并加入DNALipofectamineTM混和物。将细胞于37℃温育5小时,然后每个平板加入6.4ml DMEM/10% FBS/1% PSN培养基。将平板于37℃温育过夜,第二天用新鲜的5% FBS/DMEM培养基替换DNALipofectamineTM混和物。转染后第二天,将细胞以1∶10、1∶20、和1∶50转移到150mm平板的选择培养基(上述DMEM/FBS培养基添加1mM氨甲喋呤(Sigma Chemical公司,St.Louis,MO))中。转染后第5天,用新鲜的选择培养基替换细胞上的培养基。转染后大约10天,将每次转染的2个150mm培养皿中的氨甲喋呤抗性集落用胰蛋白酶处理,合并细胞,并铺在T-162烧瓶中转移至大量培养。
实施例11来自BHK570细胞的zalpha11可溶性受体的纯化A.来自BHK570的zalpha11CEE多肽的纯化除非另外注明,所有操作于4℃进行。下列步骤用于纯化含C末端GluGlu(EE)标签的zalpha11多肽。在ProFluxA30上用Amicon S10Y3螺旋柱体将30升工业化细胞条件培养基浓缩至1.6升。向来自经转染BHK570细胞(见实施例10)的经浓缩的1.6升工业化细胞条件培养基中加入蛋白酶抑制剂溶液,至终浓度2.5mM乙二胺四乙酸(EDTA,SigmaChemical公司,St.Louis,MO)/0.003mM亮抑蛋白酶肽(Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)/0.001mM胃蛋白酶抑制剂(Boehringer-Mannheim)/0.4mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)。取样用于分析,大量的体积冻存于-80℃直至开始纯化。通过SDS-PAGE和使用抗EE HRP缀合抗体的Western印渍分析测定经浓缩的工业化细胞条件培养基中的总靶蛋白浓度。
将100ml抗EE G-Sepharose(如下所述制备)装到Waters AP-5,5cm×10cm玻璃柱中。将柱子流式填充,并在BioCad Sprint(PerSeptiveBioSystems,Framingham,MA)上用磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4平衡。将经浓缩的工业化细胞条件培养基融解,0.2微米过滤除菌,调pH7.4,然后上样(流速1ml/min,过夜)。将柱子用10倍柱体积(CV)的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)清洗,然后用200ml含0.5mg/ml EE肽(Anaspec,San Jose,CA)的PBS(pH6.0)洗脱,流速5ml/min。所用EE肽的序列是EYMPME(SEQ ID NO41)。将柱子用10CV的PBS清洗,然后用5CV的0.2M甘氨酸(pH3.0)洗脱。将经甘氨酸洗脱的柱子用2CV的5× PBS调pH7.0,然后在PBS(pH7.4)中平衡。整个洗脱层析中收集5ml收集液,并监测于280和215nm的光吸收;同样保留并分析流出液和清洗液。通过SDS-PAGE银染法和使用抗EE HRP缀合抗体的Western印渍,分析EE-多肽洗脱峰收集液中的靶蛋白。合并感兴趣的多肽洗脱收集液,并使用截留分子量10,000Da的滤膜旋转浓缩器(Millipore,Bedford,MA)根据制造商的指示由60ml浓缩至5.0ml。
为了将zalpha11CEE与其它共纯化蛋白质分开,将经浓缩多肽洗脱合并收集液于pH8.0进行POROS HQ-50(强阴离子交换树脂,RerSeptiveBioSystems,Framingham,MA)。倒入1.0×6.0cm柱,并在BioCad Sprint上流式装填。使柱子带上对抗离子,然后在20mM TRIS pH8.0(Tris(羟甲基氨基甲烷))中平衡。将样品以1∶13稀释(以降低PBS的离子强度),然后以5ml/min在Poros HQ柱上上样。将柱子用10CV的20mMTris pH8.0清洗,然后用40CV的20mM Tris/1M NaCl梯度洗脱,流速10ml/min。整个层析过程收集1.5ml收集液,并监测于280和215nm的光吸收。通过SDS-PAGE银染法,分析洗脱峰收集液。合并感兴趣的收集液,并使用截留分子量10,000Da的滤膜旋转浓缩器(Millipore,Bedford,MA)根据制造商的指示浓缩至1.5-2ml。
为了将zalpha11CEE与游离EE肽和任何污染的共纯化蛋白质分开,将合并的浓缩收集液在1.5×90cm Sephadex S200(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱上进行层析,平衡和上样都使用PBS,并使用BioCadSprint,流速1.0ml/min。整个层析过程收集1.5ml收集液,并监测于280和215nm的光吸收。通过SDS-PAGE银染法,定性分析洗脱峰收集液,并合并最纯的收集液。该物质代表纯化的zalpha11CEE多肽。
最后将该经纯化物质进行4ml ActiClean Etox(Sterogene)柱层析,以除去任何残余内毒素。将样品4次通过经PBS平衡的重力柱,然后将柱子用3ml PBS清洗1次,并与“经清洁的”样品合并。然后将物质通过0.2微米滤膜除菌,并冻存于-80℃,直至分装。
在SDS-PAGE凝胶的Western印渍、考马斯蓝染色和银染上,zalpha11CEE多肽是表观分子量为50,000Da的主要条带。该条带在还原和非还原凝胶上的迁移率相同。
通过BCA分析(Pierce,Rockford,IL)测定经纯化物质的蛋白质浓度,并根据我们的标准步骤,将蛋白质分装并冻存于-80℃。在IEF(等电聚焦)凝胶上,蛋白质表现的pI小于4.5。zalpha11CEE多肽的浓度为1.0mg/ml。
制备用于给兔子注射的经纯化zalpha11CEE多肽,并递交给R&RResearch and Development(Stanwood,WA)以制备抗体。给兔子注射以产生抗人zalpha11CEE-BHK血清(见下文实施例15)。
为了制备抗EE Sepharose,使用500ml Nalgene 0.45微米滤器,将100ml柱床体积的蛋白G-Sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)用100ml含0.02%叠氮钠的PBS清洗3次。将凝胶用6.0倍体积的200mM三乙醇胺pH8.2(TEA,Sigma,St.Louis,MO)清洗,并加入等体积的含900mgEE抗体的抗体溶液。于4℃温育过夜后,通过如上所述用5倍体积的200mM TEA清洗树脂,除去未结合的抗体。将树脂重悬于2倍体积的TEA,转移到合适的容器中,并加入溶于TEA的dimethylpimilimidate-2HCl(Pierce,Rockford,IL),至终浓度36mg/ml蛋白G-Sepharose凝胶。将凝胶于室温摇动45分钟,并如上所述使用滤器除去液体。然后通过与5倍体积的溶于200mM TEA的20mM乙醇胺于室温温育10分钟,封闭凝胶上的非特异性位点。然后将凝胶用5倍体积的含0.02%叠氮钠的PBS清洗,并在该溶液中于4℃保存。B.来自BHK570的zalpha11CFLAG多肽的纯化除非另外注明,所有操作于4℃进行。下列步骤用于纯化含C末端FLAG(FLG)(Sigma-Aldrich公司)标签的zalpha11多肽。在ProFluxA30上用Amicon S10Y3螺旋柱体将30升工业化细胞条件培养基浓缩至1.7升。向来自经转染BHK570细胞(见实施例10)的1.7升经浓缩的工业化细胞条件培养基中加入蛋白酶抑制剂溶液,至终浓度2.5mM乙二胺四乙酸(EDTA,Sigma Chemical公司,St.Louis,MO)/0.003mM亮抑蛋白酶肽(Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)/0.001mM胃蛋白酶抑制剂(Boehringer-Mannheim)/0.4mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)。取样用于分析,大量的体积冻存于-80℃直至开始纯化。通过SDS-PAGE和使用抗FLAG(Kodak)HRP缀合抗体的Western印渍分析测定工业化细胞条件培养基中的总靶蛋白浓度。将125ml抗FLAGM2-Agarose亲和凝胶(Simga-Aldrich公司)倒入Waters AP-5,5cm×10cm玻璃柱中。将柱子流式填充,并在BioCadSprint(PerSeptive BioSystems,Framingham,MA)上用磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4平衡。将经浓缩的工业化细胞条件培养基融解,0.2微米过滤除菌,调pH7.4,然后上样(流速1ml/min,过夜)。将柱子用10倍柱体积(CV)的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)清洗,然后用250ml含0.5mg/ml FLAG(Sigma-Aldrich公司)肽的PBS(pH6.0)洗脱,流速5ml/min。所用FLAG肽的序列是DYKDDDDK(SEQ ID NO49)。将柱子用10CV PBS清洗,然后用5CV 0.2M甘氨酸(pH3.0)洗脱。将经甘氨酸洗脱的柱子用2CV的5× PBS调pH7.0,然后在PBS(pH7.4)中平衡。整个洗脱层析收集5ml收集液,并监测于280和215nm的光吸收;同样保留并分析流出液和清洗液。通过SDS-PAGE银染法和使用抗FLAGHRP缀合抗体的Western印渍,分析FLAG-多肽洗脱峰收集液的靶蛋白。合并感兴趣的多肽洗脱收集液,并使用截留分子量10,000Da的滤膜旋转浓缩器(Millipore,Bedford,MA)根据制造商的指示由80ml浓缩至12ml。
为了将zalpha11CFLG与其它共纯化蛋白质分开,将多肽洗脱合并收集液于pH8.0进行POROS HQ-50(强阴离子交换树脂,RerSeptiveBioSystems,Framingham,MA)。装1.0×6.0cm柱,在BioCad Sprint上流式填充。使柱子带上对抗离子,然后在20mM TRIS pH8.0(Tris(羟甲基氨基甲烷))中平衡。将样品以1∶13稀释(以降低PBS的离子强度),然后以5ml/min在Poros HQ柱上上样。将柱子用10CV的20mMTris pH8.0清洗,然后用40CV的20mM Tris/1M NaCl梯度洗脱,流速10ml/min。整个层析过程收集1.5ml收集液,并监测于280和215nm的光吸收。通过SDS-PAGE银染法,分析洗脱峰收集液。合并感兴趣的收集液,并使用截留分子量10,000Da的滤膜旋转浓缩器(Millipore,Bedford,MA)根据制造商的指示浓缩至1.5-2ml。
为了将zalpha11CFLG多肽与游离FLAG肽和任何污染的共纯化蛋白质分开,将合并的浓缩收集液在1.5×90cm Sephadex S200(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱上进行层析,平衡和上样都使用PBS,并使用BioCad Sprint,流速1.0ml/min。整个层析过程收集1.5ml收集液,并监测于280和215nm的光吸收。通过SDS-PAGE银染法,定性分析洗脱峰收集液,并合并最纯的收集液。该物质代表纯化的zalpha11CFLG多肽。
最后将该纯化物质进行4ml ActiClean Etox(Sterogene)柱层析,以除去任何残余内毒素。将样品4次通过经PBS平衡的重力柱,然后将柱子用3ml PBS清洗1次,并与“经清洁的”样品合并。然后将物质通过0.2微米滤膜除菌,并冻存于-80℃,直至分装。
在SDS-PAGE凝胶的Western印渍、考马斯蓝染色和银染上,zalpha11CFLG多肽是表观分子量为50,000Da的主要条带。该条带在还原和非还原凝胶上的迁移率相同。
通过BCA分析(Pierce,Rockford,IL)测定经纯化物质的蛋白质浓度,并根据我们的标准步骤,将蛋白质分装并冻存于-80℃。在IEF(等电聚焦)凝胶上,蛋白质表现的pI小于4.5。zalpha11CFLG多肽的浓度为1.2mg/ml。C.来自经转染BHK570细胞的zalpha11-Fc4多肽的纯化除非另外注明,所有操作于4℃进行。下列步骤用于纯化含C末端与人IgG/Fc融合的zalpha11多肽(zalpha11-Fc4;实施例8和9)。将来自用zalpha11-Fc4转染的BHK570细胞(实施例10)的12,000ml条件培养基滤过0.2mm滤膜除菌,然后加入蛋白酶抑制剂溶液,至终浓度0.001mM亮抑蛋白酶肽(Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)/0.001mM胃蛋白酶抑制剂(Boehringer-Mannheim)/0.4mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)。装蛋白G Sepharose柱(6ml柱床体积,Pharmacia Biotech),并用500ml PBS(Gibco BRL)清洗。将添加的条件培养基通过柱子,流速10ml/min,随后用1000ml PBS(GibcoBRL)清洗。用0.1M甘氨酸(pH3.5)将zalpha11-Fc4洗脱,收集2ml收集液,直接加入0.2ml 2M Tris pH8.0将收集液pH调至7.0。
通过SDS-PAGE和使用抗人Fc(Amersham)抗体的Western印渍,定性分析洗脱收集液。还原SDS-PAGE凝胶的Western印渍揭示了收集液2-10中包含80,000Da的免疫反应性蛋白质。SDS-PAGE的银染也揭示了收集液2-10中包含80,000Da的zalpha11Fc多肽。合并收集液2-10。
通过BCA分析(Pierce,Rockford,IL)测定合并收集液的蛋白质浓度,并根据我们的标准步骤,将该物质分装并冻存于-80℃。合并收集液的浓度为0.26mg/ml。
实施例12使用zalpha11可溶性受体zalpha11CEE、zalpha11CFLG和zalpha11-Fc4的实验竞争性抑制实验中的(突变型)可溶性受体将BaF3/zalpha11细胞离心,并在不含mIL-3的培养基中清洗。将细胞离心并清洗3次,以确保除去了mIL-3。然后在血球计中对细胞进行计数。将细胞以5000个细胞/孔(每个孔100μl不含mIL-3的培养基)铺在96孔板中。
以50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5%、0.75%、和0.375%浓度,含或不含10μg/ml zalpha11可溶性受体(CEE、C-flag、和Fc4构建物;见实施例10和11),在分开的实验中加入上文实施例8所述来自经活化猴脾细胞和CD3+选择细胞的培养基。总实验体积是200μl。
将实验板于37℃、5%CO2温育3天,其间以20μl/孔加入AlamarBlue(Accumed)。将平板再一次于37℃、5%CO2温育24小时。如上所述(实施例5)在FmaxTM平板计数器(Molecular Devices)上读板。结果证明了来自10μg/ml不同zalpha11可溶性受体构建物的细胞生长完全被抑制,确认了每种样品中的因子对zalpha11受体是特异的。
使用上述实验绘制滴定曲线(稀释可溶性受体)。zalpha11CEE和zalpha11CFLG可溶性zalpha11受体在低至20ng/ml都能够完全抑制生长。突变型zalpha11-Fc4可溶性zalpha11受体只在1.5μg/ml有效。
实施例13人类zalpha11在E.coli中的表达A.表达人zalpha11/MBP-6H融合多肽的表达载体pCZR225的构建通过同源重组构建包含编码C末端与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的人类zalpha11可溶性受体的多核苷酸的表达质粒。MBP-zalpha11可溶性受体融合多肽的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO50,相应的蛋白质序列显示于SEQ ID NO51。在实施例14中命名为huzalpha11/MBP-6H的融合多肽包含与人类zalpha11可溶性受体(SEQ ID NO51的第389位(Cys)至第606位(His)氨基酸)融合的MBP部分(SEQ ID NO51的第1位(Met)至第388位(Ser)氨基酸)。使用PCR分离人类zalpha11cDNA的片段(SEQ ID NO52)。在产生人类zalpha11片段的PCR反应中使用了两种引物(1)引物ZC20,187(SEQ ID NO53),包含40bp的载体侧翼序列和对应于人类zalpha11氨基末端的25bp,和(2)引物ZC20,185(SEQ ID NO54),包含对应于侧翼载体序列3’末端的40bp和对应于人类zalpha11羧基末端的25bp。PCR反应条件如下94℃30sec/50℃ 30sec/72℃ 1min 25个循环;4℃保存,双份进行。由100μl PCR反应体系取2μl,用1×TBE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上进行分析,看到了预期的大约660bp片段。将剩余90μl PCR反应液与第二管PCR管混和,并加入400μl无水乙醇沉淀。如下所述,将沉淀的DNA用于重组到经SmaI切割的受体载体pTAP98中,以产生编码MBP-zalpha11融合体的构建物。
质粒pTAP98由质粒pRS316和pMAL-c2衍生得到。质粒pRS316是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)穿梭载体(P.Hieter和R.Sikorski,遗传学(Genetics)12219-27,1989)。pMAL-c2(NEB)是E.coli表达质粒。它携带驱动MalE(编码MBP的基因)的tac启动子,随后是His标签、凝血酶切割位点、克隆位点、和rrnB终止子。使用酵母同源重组构建载体pTAP98。将100ng经EcoRI切割的pMAL-c2与1μg经PvuI切割的pRS316、1μg接头、和1μg经ScaI/EcoRI切割的pRS316重组。接头由ZC19,372(SEQ ID NO55)(100pmol)ZC19,351(SEQID NO56)(1pmol)ZC19,352(SEQ ID NO57)(1pmol)和ZC19,371(SEQ ID NO58)(100pmol)在PCR反应中组合而成。PCR反应条件如下94℃ 30sec/50℃ 30sec/72℃ 30sec 10个循环;4℃保存。通过100%乙醇沉淀浓缩PCR产物。
将100μl酵母感受态细胞(酿酒酵母)与10μl含大约1μg上述人类zalpha11受体PCR产物的混和物和100ng经SmaI消化的pTAP98载体混和,并转移到0.2cm电击槽中。对酵母/DNA混和物进行电脉冲(0.75kV(5kY/cm),无限Ω,25μF)。向每个电击槽中加入600μl 1.2M山梨醇,然后将醇母分成2份各300μl,分别铺在URA D平板上,并于30℃温育。
大约48小时后,将来自单个平板的Ura+酵母转化体重悬于1ml H2O,离心沉淀酵母细胞。将细胞沉淀重悬于1ml裂解缓冲液(2%Triton-100/1% SDS/100mM NaCl/10mM Tris pH8.0/1mM EDTA)。向装有300μl经酸洗的玻璃珠和200μl酚-氯仿的Eppendorf管中加入500μl裂解混和物,旋涡振荡1min,间歇2-3次,随后在Eppendorf离心机中于最高速度离心5分钟。将300μl水相转移到新管中,加入600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA,随后于4℃离心10分钟。将DNA沉淀重悬于100μl H2O。
使用1μl酵母DNA制备物和40μl MC1061(Casadaban等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)138179-207,)细胞进行E.coli电感受态细胞的转化。将细胞于2.0kV,25μF,400Ω进行电脉冲。电穿孔后,将0.6ml SOC(2% BactoTM胰胨(Difco,Detroit,MI)/0.5%酵母提取物(Difco)/10mM NaCl/2.5mM KCl/10mM MgCl2/10mMMgSO4/20mM葡萄糖)铺在MM/CA+AMP 100mg/L平板(Pryor和Leiting,蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)10309-319,1997)上。
通过表达鉴定包含正确的人类zalpha11受体表达构建物的细胞。将细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的MM/CA中于37℃振摇培养2小时。用1mM IPTG对1ml培养物进行诱导。2-4小时后,每种培养物取250μl,与250μl经酸洗的玻璃柱和250μl含5%β ME及染料的Thorner缓冲液(8M尿素/100mM Tris pH7.0/10%甘油/2mM EDTA/5% SDS)混和。将样品旋涡震荡1分钟,并于65℃加热10分钟。在4%-12%PAGE凝胶(NOVEX)的每条泳道上上样20μl。在1×MES缓冲液中进行电泳。将阳性克隆命名为pCZR225,并进行序列分析。MBP-zalpha11融合体的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO50。B.人类huzalpha11/MBP-6H融合多肽的细菌表达用1μl测序DNA转化BL21菌株。对细胞进行电脉冲(2.0kV,25μF,400Ω)。电穿孔后,加入0.6ml含100mg/L氨苄青霉素的MM/CA。
将细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的MM/CA中于37℃振摇培养2小时。用1mM IPTG对1ml培养物进行诱导。2-4小时后,每种培养物取250μl,与250μl经酸洗的玻璃柱和250μl含5%β ME及染料的Thorner缓冲液(8M尿素/100mM Tris pH7.0/10%甘油/2mM EDTA/5%SDS)混和。将样品旋涡震荡1分钟,并于65℃加热10分钟。在4%-12%PAGE凝胶(NOVEX)的每条泳道上上样20μl。在1×MES缓冲液中进行电泳。将阳性克隆进行培养,用于纯化huzalpha11/MBP-6H融合蛋白质(见下文实施例14)。
实施例14E.coli发酵物中huzalpha11/MBP-6H可溶性受体的纯化除非另外注明,所有操作于4℃进行。下列步骤用于纯化huzalpha11/MBP-6H可溶性受体多肽。将包含pCZR225构建物且表达huzalpha11/MBP-6H可溶性受体的E.coli细胞(实施例13)在SuperBrothII(12g/L Casien/24g/L酵母提取物/11.4g/L磷酸氢二钾/1.7g/L磷酸二氢钾;Becton Dickenson,Cockeysville,MD)中进行培养,并在0.5%甘油中冻存。取20g冻存于SuperBrothII+甘油中的细胞,用于纯化蛋白质。将冻存细胞融化,并在蛋白酶抑制剂溶液(提取缓冲液)中稀释10倍,然后裂解细胞并释放huzalpha11/MBP-6H可溶性受体蛋白。经稀释细胞包含终浓度20mM Tris(JT Baker,Philipsburg,NJ)/100mM NaCl(Mallinkrodt,Paris,KY)/0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF,Sigma Chemical公司,St.Louis,MO)/2μg/ml亮抑蛋白酶肽(Fluka,Switzerland)/2μg/ml抑酶肽(Sigma)。使用French Press细胞破碎系统(Constant Systems有限公司,Warwick,UK)于-7℃至-10℃和30K PSI裂解细胞。在进行French Press之前和之后,通过A600读数检验经稀释细胞的破碎。将裂解细胞于18,000G离心45分钟,以除去破碎细胞碎片,并将上清液用于纯化蛋白质。通过BCA蛋白质实验(Pierce,Rockford,IL)根据制造商的指示测定上清液中的总靶蛋白浓度。
将25mlTalon金属亲和树脂(Clontech,Palo Alto,CA)(如下所述制备)装到Bio-Rad的2.5cm D×10cm H玻璃柱中。填充柱,并用10倍柱体积(CV)的Talon平衡缓冲液(20mM Tris/10mM NaCl pH8.0)通过重力进行平衡。将上清液批量加到Talon金属亲和树脂上,并摇动过夜。将树脂装回柱子中,并用10CV的Talon平衡缓冲液通过重力进行清洗,然后用140ml洗脱缓冲液(Talon平衡缓冲液+200mM咪唑-FlukaChemical)重力洗脱。将Talon柱用5CV的20mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸pH5.0(MES,Sigma)、5CV蒸馏水进行清洗,然后保存于20%乙醇/0.1%叠氮钠。整个洗脱层析过程收集14ml收集液,将收集液读取于280nm和320nm的光吸收并进行BCA蛋白质实验;同样保留并分析流出液和清洗液。合并感兴趣的蛋白质洗脱收集液,并直接在Amylose树脂(New England Biolabs,Beverly,MA)上上样。
为了获得更纯的huzalpha11/MBP-6H多肽,将Talon亲和洗脱合并收集液进行Amylose树脂(22ml)pH7.4层析。装2.5cm D×10cm HBio-Rad柱,填充,并在10CV Amylose平衡缓冲液(20mM Tris(JT Baker)/100mM NaCl(Mallinkrodt)/1mM PMSF(Sigma)/10mM β-巯基乙醇(BMF,ICN Biomedicals公司,Aurora,OH)pH7.4)中平衡。通过重力上样,流速0.5ml/min。将柱子用10CV的Amylose平衡缓冲液清洗,然后用约2CV Amylose平衡缓冲液+10mM麦芽糖(FlukaBiochemical,Switzerland)通过重力洗脱。整个层析过程收集5ml收集液,并读取280nm和320nm的吸光值。用1CV蒸馏水、5CV 0.1%(w/v)SDS(Sigma)、5CV蒸馏水、5CV Amylose平衡缓冲液再生Amylose柱。
合并感兴趣的收集液,并在Slide-A-Lyzer(Pierce)中用4×4L PBSpH7.4(Sigma)透析以除去低分子量污染、变换缓冲液、和脱盐。PBS变换后,收获的物质代表纯化的huzalpha11/MBP-6H多肽。通过SDS-PAGE考马斯染色和使用抗兔HRP缀合抗体(Rockland,Gilbertsville,PA)的Western印渍分析,分析经纯化的huzalpha11/MBP-6H多肽。如BCA分析所测,huzalpha11/MBP-6H多肽的浓度为1.92mg/ml。
制备用于给兔子注射的经纯化huzalpha11/MBP-6H多肽,并递交给R&R Research and Development(Stanwood,WA)以制备抗体。给兔子注射以产生抗huzalpha11/MBP-6H血清(见下文实施例15)。
实施例15zalpha11多克隆抗体通过用经纯化huzalpha11/MBP-6H多肽(实施例14)或经纯化的重组zalpha11CEE可溶性受体(实施例11A)免疫两只雌性新西兰白兔,制备了多克隆抗体。相应的多克隆抗体分别命名为兔抗huzalpha11/MBP-6H和兔抗huzalpha11-CEE-BHK。每只兔最初腹膜内(IP)注射200mg于完全弗氏佐剂(Pierce,Rockford,IL)中的经纯化蛋白质,随后每3周加强IP注射100mg于不完全弗氏佐剂中的经纯化蛋白质。第三次加强注射后7至10天,对动物进行取血,并收集血清。然后每3周对兔加强免疫和取血。
使用由10mg经纯化huzalpha11/MBP-6H多肽(实施例14)/gCNBr-Sepharose制备的CNBr-Sepharose 4B蛋白柱(Pharmacia LKB),由兔血清亲和纯化zalpha11特异性多克隆抗体,随后在PBS中20x透析过夜。通过使用1mg/ml适当蛋白质抗原作为抗体靶的ELISA滴定检验,定性分析zalpha11特异性抗体。经兔抗huzalpha11/MBP-6H亲和纯化的抗体的检测下限(LLD)是500pg/ml的稀释液。经兔抗huzalpha11-CEE-BHK亲和纯化的抗体的LLD是50pg/ml的稀释液。
实施例16表达zalpha11受体的细胞的RT-PCR鉴定分离特异人类细胞类型,并通过RT-PCR筛选zalpha11表达。通过穿过100μM尼龙细胞滤布(FalconTM,Bectin Dickenson,FranklinLakes,NJ)进行机械破碎,由新鲜人扁桃体分离B细胞。使用VarioMACSVS+磁性柱和CD19微珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)根据制造商的指示通过正选择由B细胞悬浮液富集CD19+B细胞。由人apheresed血样分离T细胞和单核细胞。通过CD3微珠VarioMACS正选择纯化CD3+T细胞,通过VarioMACS负选择柱(Miltenyi)根据制造商的指示纯化单核细胞。将来自各个群的样品染色,并通过荧光抗体细胞分拣(FACS)(Bectin Dickinson,San Jose,CA)分析进行分析,以测定富集百分比和产量。CD19+B细胞为大约96%纯,CD3+B细胞为大约95%纯,单核细胞为大约96%纯。
使用本领域标准方法由静息或激活的所有三种细胞类型制备RNA。直接由上述柱制备的静息细胞分离RNA。通过以500,000个细胞/ml在含5ng/ml PMA(Calbiochem,La Jolla,CA)和0.5μg/ml依屋诺霉素(Calbiochem)的RPMI+10%FBS中培养4和24小时,激活CD19+和CD3+细胞。通过在含10ng/ml LPS(Sigma St.Louis MO)和10ng/ml rh IFN-g(R&D,Minneapolis,MN)的RPMI+10%FBS中培养24小时,激活单核细胞。收获细胞,并在PBS中清洗。使用RNeasy MidiprepTMKit(Qiagen,Valencia,CA)根据制造商的指示由细胞沉淀制备RNA,使用SuperscriptITMKit(Gibco BRL,Grand Island,NY)根据制造商的指示合成cDNA第一条链。
在PCR反应中使用寡ZC19907(SEQ ID NO20)和ZC19908(SEQ IDNO21),在上述样品中筛选对应于zalpha11信使的1.2kb片段。使用Taq聚合酶(BRL Grand Island NY)进行PCR扩增,条件如下95℃1min/60℃ 1min/72℃ 30sec 35个循环;72℃ 10min;4℃保存。由各个50μl反应体系取10μl,在2%琼脂糖1×TAE凝胶上进行电泳,以鉴定得到的产物。PCR产物评分为(-)无产物;(+)条带可见;(++)条带亮度增加;(+++)最明显的条带,结果显示于下文表5。表5
这些结果指示,zalpha11信使存在于静息的人CD19+B细胞中,并随促有丝分裂激活而增加。人CD3+T细胞似乎也表达zalpha11信使,但是只在激活4小时后。在静息或激活的人单核细胞中没有明显信使。
实施例17zalpha11免疫组织化学A.细胞和组织制备阳性对照组织包括用zalpha11转染的BaF3细胞(实施例7)和已知表达zalpha11的淋巴组织,包括由HSD(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,IN)获得的小鼠淋巴结、脾、和胸腺,由RegionalPrimate Research Center(University of Washington,Seattle,WA)获得的猴淋巴结和脾,由CHTN(Cleveland,OH)获得的人淋巴结和脾。每种组织样品的阴性对照包括(1)未转染的BaF3细胞,(2)已知不表达zalpha11的来自小鼠和人的肝和脑,(3)在无一抗的条件下用抗体稀释缓冲液(Ventann Bioteck Systems,Tucson,AZ)染色,和(4)在竞争实验中使用zalpha11可溶性蛋白质。
还检验了其它细胞样品。检验了未刺激和经刺激的HL60细胞。HL60细胞是能够用不同试剂分化成髓细胞或粒细胞谱系的前髓细胞系。如下制备经刺激的HL60样品(1)用10ng/ml佛波醇-肉豆蔻酰酯-乙酸酯(PMA)(Sigma,St.Louis,MO)处理HL60细胞48小时,以分化成单核细胞谱系细胞;和(2)用1.25%DMSO(Sigma)处理HL60细胞4天,以分化成类嗜中性粒细胞。另外,检验了来自新鲜人类血液的人类多形核(PMN)细胞、人类粒细胞、人类外周血淋巴细胞(PBL)、和人类单核细胞(使用本领域常规方法在室内制备)。将上述细胞和组织在10%NBF(Surgipath,Richmond,IL)中固定过夜,在parapalstX-tra(Oxford Scientific,St.Louis,MO)中包埋,并用Reichart-Jung 2050 microme(Leica Instruments GmbH,Nussloch,德国)以5μm切片。B.免疫组织化学将组织切片脱蜡、用缓冲液(水)水合、并在Antigen RetrievalCitra缓冲液(BioGenex,San Roman,CA)中进行HIER蒸气处理20分钟。将5%正常山羊血清(Vector,Burlingame,CA)用于封闭非特异结合10分钟。使用针对zalpha11可溶性受体蛋白的多克隆抗体(兔抗huzalpha11-MBP-6H和兔抗huzalpha11-CEE-BHK;见实施例15)作为一抗,分别以1∶200和1∶400稀释液进行免疫细胞化学筛选分析。使用生物素缀合的山羊抗兔IgG(Vector;产品目录号BA-1000,1.5mg/ml)作为二抗,1∶200稀释液。在分开的样品中,通过向一抗中加入额外的zalpha11CEE可溶性受体蛋白(10×过量)(实施例11A)以预先封闭一抗免疫反应从而进行蛋白质竞争实验。该竞争实验作为zalpha11特异的兔多克隆抗体的对照使用。在Ventana ChemMate 500仪器上使用ChemMate DAB试剂盒(与链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物一起应用的经标记链霉亲和素-生物素试剂盒,和DAB底物)根据制造商的指示,并使用制造商的苏木精复染30秒(Ventana BiotekSystems,Tucson,AZ)进行检测。
在PMA-激活的HL60细胞中观察到zalpha11的高表达。在未刺激的PBL和HL60细胞中观察到低水平表达。小鼠脾、胸腺、和淋巴结的小群细胞显示阳性染色。用DMSO刺激的人类和猴的淋巴结和脾以及HL60细胞都显示微弱染色或无染色。在细胞和组织中看到的信号使用过量zalpha11可溶性受体蛋白时可大部分竞争掉。脑和肝的阴性对照组织不显示染色。
实施例18使用针对zalpha11可溶性受体的多克隆兔抗血清鉴定表达zalpha11受体的外周血单核细胞(PBMNC)由正常捐献者获得200ml肝素化新鲜血液。将血液用PBS以1∶1稀释,使用Ficoll-Paque PLUS梯度(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)分离,并收集淋巴细胞界面。将细胞在PBS中洗2次,并以2×106个细胞/ml的浓度重悬于RPMI+5%FBS培养基。
为了确定zalpha11受体的表达是否受淋巴细胞活化状态的影响,即在静息和激活细胞之间是否有所不同,使用多种刺激条件1)未刺激,即仅用培养基(RPMI+5%FBS培养基);2)用10ng/ml PMA+0.5μg/ml依屋诺霉素(均来自Calbiochem)刺激;和3)PHA激活(植物血凝素-P,Difco/VWR)。将细胞于37℃温育17小时,然后收集用于染色,以检测zalpha11受体的表达。
使用了间接染色方案。简而言之,将人类淋巴细胞悬于染色缓冲液(PBS+0.02% NaN3+1%BSA+2%正常人血清),并将2×105个细胞以50μl/孔铺于96孔板中。使用针对zalpha11CEE可溶性受体的抗体(实施例15)确定它们是否与分离的人类淋巴细胞上的B细胞(CD19)、T细胞(CD3)、或单核细胞标记(CD14)共染色。将针对zalpha11可溶性受体的兔多克隆血清(免抗huzalpha11-CEE-BHK)(实施例15)以10μg/ml作为用于鉴定淋巴细胞上zalpha11的抗体使用。将二抗,即山羊抗兔Ig-FITC(Biosource,Camarillo,CA)用于观察与zalpha11受体结合的兔抗huzalpha11-CEE-BHK抗体。同时使用其它抗体染色T细胞(CD3-PE;PharMingen,San Diego,CA)、B细胞(CD19-PE)(PharMingen)和单核细胞(CD14-PE)(PharMingen),以鉴定这些细胞类型上抗zalpha11受体抗体的染色。使用各种对照确定非特异结合和染色的背景水平(1)无关兔多克隆血清作为非特异对照使用;和(2)仅使用二抗测定该试剂的背景结合。以大约10倍过量使用纯化的zalpha11CEE可溶性受体(实施例11)作为竞争性抑制剂,以确认针对zalpha11可溶性抗体的兔抗huzalpha11-CEE-BHK抗体的特异性。
将细胞铺板并加入一抗和共染色抗体后,将细胞在冰上温育30分钟,用染色缓冲液清洗2次,并在冰上用二抗即山羊抗兔Ig-FITC(Biosource)染色30分钟。将细胞用染色缓冲液清洗2次,每个孔重悬于200μl含约1μg/ml活力染料7AAD(Sigma,St.Louis,MO)的染色缓冲液。在FACS-Caliber(Becton-Dickinson,San Jose,CA)上对样品读数,并分析活性细胞。
针对zalpha11受体的兔多克隆抗体染色静息B细胞。在静息B细胞上的信号比使用无关兔血清获得的信号更亮,而且加入过量zalpha11CEE可溶性受体时,B细胞上信号的减弱程度比T细胞高。使用分开的B和T细胞重复该实验,结果非常相似。另外,用针对zalpha11受体的多克隆兔抗huzalpha11-CEE-BHK抗体进行的染色在静息B细胞上最强。
实施例19各种组织中zalpha11受体的表达使用实时定量RT-PCRA.用于定量RT-PCR的引物和探针先前已经描述了使用ABI PRISM 7700序列检测系统(PE AppliedBiosystems公司,Foster City,CA)的实时定量RT-PCR(参阅C.A.Heid等人,基因组研究(Genome Research)6986-994,1996;U.E.M.Gibson等人,基因组研究(Genome Research)6995-1001,1996;S.Sundaresan等人,内分泌学(Endocrinology)1394756-4764,1998)。该方法包括使用包含报导子和淬灭荧光染料的基因特异探针。当探针完整时,由于淬灭染料非常接近,故报导染料发射是阴性的。在使用其它基因特异性正向和反向引物的PCR延伸过程中,探针经Taq聚合酶5’核酸酶活性切割释放报导染料,导致荧光发射上升。
使用引物设计软件Primer ExpressTM(PE Applied Biosystems,Foster City,CA)设计用于zalpha11表达的实时定量RT-PCR分析的引物和探针。设计了跨越内含子-外显子接合点的人类zalpha11引物,以消除基因组DNA的扩增。在(下文)PCR反应中以约300nM浓度使用正向引物ZC22,277(SEQ ID NO59)和反向引物ZC22,276(SEQ ID NO60)以合成143bp产物。合成了相应的zalpha11 TaqMan探针,命名为ZG31(SEQID NO61),并用PE Applied Biosystems标记。ZG31探针用报导荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE AppliedBiosystems)标记于5’末端,用淬灭荧光染料(6-羧基-四甲基-罗丹明)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)标记于3’末端。
作为测试RNA样品完整性和质量的对照,使用由PE AppliedBiosystems订购的引物和探针组(产品目录号4304483)在所有RNA样品(下文)中筛选rRNA。试剂盒包含rRNA正向引物(SEQ ID NO66)和rRNA反向引物(SEQ ID NO67)、rRNA TaqMan探针(SEQ ID NO68)。rRNA探针用报导荧光染料VIC(PE Applied Biosystems)标记5’末端,用淬灭荧光染料TAMRA(PE Applied Biosystems)标记3’末端。rRNA结果还可以作为内源对照,并用于校正测试样品中观察到的zalpha11 mRNA表达结果。
制备了上文实施例16所述来自人类CD3、CD19、和单核细胞类型的RNA样品。使用RNeasyMiniprepTM试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据制造商的指示,由大约107个表达人类zalpha11受体的BaF3细胞(实施例7)制备对照RNA。B.实时定量RT-PCR通过使用一步RT-PCR方法(PE Applied Biosystems)分析总RNA样品,测定了zalpha11 mRNA的相对水平。通过标准方法分离来自表达人类zalpha11受体的BaF3细胞的总RNA,并用于绘制用于定量的标准曲线。曲线包括用于rRNA筛选的2.5-2.5×10-4ng/μl范围和用于zalpha11筛选的250-0.025ng/μl范围的10倍系列稀释液,每个标准曲线点测定3次。来自人类CD3、CD19、和单核细胞的总RNA样品也3次测定人类zalpha11转录水平和作为内源对照的rRNA水平。在25μl总体积中,对每份RNA样品进行一步RT-PCR反应大约25ng总RNA溶于缓冲液A(50mM KCl,10mM Tris-HCl);内部标准染料是羧基-x-罗丹明(ROX);适当引物(大约50nM用于rRNA样品的rRNA引物(SEQ ID NO66和SEQ ID NO67);和大约300nM用于zalpha11样品的ZC22,277(SEQID NO59)和ZC22,276(SEQ ID NO60)引物);适当探针(大约50nM用于rRNA样品的rRNA TaqMan探针(SEQ ID NO68),大约100nM用于zalpha11样品的ZG31(SEQ ID NO61)探针);5.5mM MgCl2;300μM每种d-CTP、d-ATP、和d-GTP和600μM d-UTP;MuLV逆转录酶(0.25U/μl);AmpliTaqTMGold DNA聚合酶(0.025U/μl)(PE AppliedBiosystems);和RNA酶抑制剂(0.4U/μl)(PE Applied Biosystems)。PCR热循环条件如下1个循环的起始逆转录(RT)步骤,48℃ 30min;随后1个循环使用AmpliTaq GoldTM(PE Applied Biosystems)的激活步骤,95℃ 10min;随后40个循环的扩增95℃ 15sec/60℃ 1min。
通过使用制造商所述标准曲线方法测定了相对zalpha11 RNA水平(PE Biosystems,用户公告第2号ABI Prism 7700序列检测系统,基因表达的相对定量,1997年12月11日)。使用rRNA测量值对zalpha11水平进行标准化,并使用静息CD3+RNA样品标准值。任意选择静息CD3作为标准值,给出数值1.00。将剩余样品与标准值进行比较。数据显示于下文表6。表6
CD3+在4和24小时时zalpha11受体表达增加15倍。静息CD19的受体表达相对于静息CD3+增加20倍。4小时刺激时的表达水平增加3倍,在24小时后降至静息水平。单核细胞在该实验中没有检测到zalpha11受体表达。
实施例20表达zalpha11受体的细胞的原位杂交鉴定分离特异人类组织,并通过原位杂交筛选zalpha11表达。制备各种人类组织(包括胸腺、脾、扁桃体、淋巴结、和肺),制切片,并进行原位杂交。将组织在10%缓冲福尔马林中固定,并在石蜡中使用标准技术(实施例17)进行封闭。将组织制4-8微米切片。使用标准方案(http//dir.niehs.nih.gov/dirlep/ish.html的“非同位素原位杂交的发展”)制备组织。简而言之,用HistoClear(NationalDiagnostics,Atlanta,GA)将组织切片脱石蜡,然后用乙醇脱水。然后将它们用蛋白酶K(50μg/ml)(Boehringer Diagnostics,Indianapolis,IN)于37℃消化2-20分钟。该步骤之后进行组织的乙酰化和再次水合。
设计了针对人类zalpha11序列的两种原位探针,并通过PCR产生。设计了两组寡聚体,以产生用于zalpha11 cDNA分开区域的探针(1)将寡ZC23,684(SEQ ID NO62)和ZC23,656(SEQ ID NO63)用于产生zalpha11的413bp探针;和(2)将寡ZC23,685(SEQ ID NO64)和ZC23,657(SEQ ID NO65)用于产生zalpha11的430bp探针。第二种探针位于第一种zalpha11探针3’的1500bp。各组的反义寡聚体还包含T7 RNA聚合酶启动子的有效序列,使得可以容易的由这些PCR产物转录产生反义RNA探针。PCR反应条件如下94℃ 30sec/60℃ 1min/72℃ 1.5min 30个循环。使用Qiagen旋转柱纯化PCR产物,随后酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。随后用洋地黄毒苷(Boehringer)或生物素(Boehringer)使用体外转录系统(Promega,Madison,WI)根据制造商的指示标记探针。
用洋地黄毒苷或生物素标记的zalpha11探针(上文)进行原位杂交。以1-5pmol/ml的浓度向切片中加入探针,于55-60℃温育12-16小时。随后将切片在2×SSC和0.1×SSC中于50℃清洗。使用tyramide信号扩增(TSA)(TSA,原位间接试剂盒;NEN)扩增信号,并用Vector红色底物试剂盒(Vecter Lab)根据制造商的指示观察。然后用苏木精(Vector Laboratories,Burlingame,CA)将切片复染。
在胸腺、扁桃体、肺、和淋巴结中看到信号。阳性染色细胞似乎是淋巴细胞和相关细胞。
实施例21小鼠zalpha11受体的分离A.小鼠基因组文库筛选通过用含完整cDNA的人类zalpha11受体多核苷酸探针探查小鼠基因组文库,获得起始部分小鼠zalpha11序列。通过使用ZC19,905(SEQID NO36)和ZC19,906(SEQ ID NO37)引物的PCR产生人类zalpha11cDNA,并使用包含全长人类zalpha11的质粒(如实施例1)作为模板。PCR反应条件如下98℃ 1min/68℃ 1min/72℃2min 35个循环;72℃ 10min。将PCR产物在1%低熔点琼脂糖(Boerhinger Mannheim)上进行电泳,并使用QiaquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示分离大约1.5kb人类zalpha11 cDNA。将该人类zalpha11 cDNA用于筛选小鼠基因组DNA文库(下文)。
所用小鼠基因组DNA文库是embl3 SP6/T7λBamHI克隆文库(Clontech,Palo Alto,CA)。将7.2×105pfu的该文库铺在24块NZY平板的E.coli K802宿主菌苔上。使用Hybong-N滤膜(AmershamPharmacia,Buckinghamshire,England,UK)根据制造商的指示浸提噬菌斑。将滤膜在1.5M NaCl和0.5M NaOH中变性10分钟,然后在1.5MNaCl和0.5M Tris-HCl(pH7.2)中中和10分钟。使用STRATALINKER UV交联仪(Stratagene)于1200焦耳将DNA附着在滤膜上。将滤膜在预清洗缓冲液(0.25×SSC/0.25% SDS/1mM EDTA)中于65℃预清洗,以除去细胞碎片,更换溶液3次,共45分钟。将滤膜在含0.1mg/ml变性鲑鱼精DNA的ExpresshybTM溶液(Clontech)中于50℃预杂交过夜。用32P使用RediprimeII随机引物标记系统(Amersham Pharmacia)根据制造商的指示标记大约50ng纯化的人类zalpha11 cDNA(上文)。使用NucTrapTM推柱(Stratagene,La Jolla,CA)由zalpha11 cDNA探针除去未掺入的放射性。将滤膜在含大约0.5-大约1×106cpm/mlzalpha11 cDNA探针、大约0.1mg/ml变性鲑鱼精DNA、和0.5μg/mlcot-1 DNA的ExpresshybTM溶液(Clontech)中杂交。杂交于50℃进行过夜。将滤膜在2×SSC/0.1% SDS中于室温清洗2小时(多次更换清洗液),然后将温度升至60℃继续清洗1小时(更换缓冲液1次)。于-80℃曝光过夜,显示6个噬菌斑,代表初级分离物。
为了获得次级噬菌斑分离物,用巴斯德移液管挑取代表初级分离物的6个噬菌斑,并在含几滴氯仿的1ml SM(0.1M NaCl/50mM TrispH7.5/10mM MgSO4/0.02%明胶)中洗脱过夜。测定噬菌体滴度后,将6个初级分离物最初栓子中噬菌体估计量的大约12.5×(12.5×面积)铺在包埋在NZY maxi平板上10mM MgSO4/NZY顶层琼脂糖中的E.coliK802细胞菌苔上,并于37℃培养过夜。使用Hybond-N滤膜(AmershamPharmacia)根据制造商的指示浸提噬菌斑。将滤膜如上固定。将第二轮滤膜于65℃在预清洗缓冲液(2×SSC/0.1% SDS/1mM EDTA)中预清洗,以除去细胞碎片,3次更换溶液,共45分钟。然后将第二轮滤膜预杂交,并如上所述制备zalpha11 cDNA探针。
将第二轮滤膜如上所述在含大约106cpm/ml zalpha11 cDNA探针(含大约0.1mg/ml变性鲑鱼精DNA)的ExpresshybTM溶液(Clontech)中杂交。杂交于50℃进行过夜。上述用于初级筛选的清洗条件,用于此次级筛选。于-80℃曝光过夜后,6个最初初级噬菌斑分离物中的2个在次级筛选中确认为阳性。用巴斯德移液管挑取在次级筛选中与人类zalpha11 cDNA杂交的阳性噬菌斑,并命名为7b1和20b1。
在200μl SM中于4℃过夜洗脱分离的噬菌斑7b1和20b1。将每种分离物范围为10-2-10-6的10倍系列稀释液铺在宿主E.coli K802细胞上,以测定滴度。分离物20b1的滴度为4×103pfu/μl,并进一步处理。通过将105pfu/板铺在汇合的宿主E.coli K802细胞上制备4块平板,以进行噬菌体DNA制备。将平板于37℃培养大约6.5小时,直至噬菌斑裂解开始汇合。然后将噬菌体于4℃在每板12ml SM中洗脱过夜。然后将平板于室温振摇1小时,取出上清液;加入1%氯仿,再次将上清液振摇15分钟。使用Wizardλ制备DNA纯化系统(Promega,Madison,WI;IV和VI部分)制备20b1噬菌体DNA。
将20b1噬菌体DNA样品用多种限制酶切割产生用于Southern印渍的DNA片段。将消化物在1%TBE琼脂糖凝胶上进行电泳。将凝胶在0.25MHCl中浸泡30分钟;在蒸馏水中漂洗;在0.5M NaOH和1.5M NaCl中浸泡40分钟,更换1次溶液;并在1.5M NaCl和0.5M Tris-HCl(pH7.2)中中和40分钟,更换1次溶液。建立TURBOBLOTTERTM快速向下转移系统(Schleicher&Schuell,Keene,NH)以将DNA转移到Nytran/BA-S膜(Schleicher&Schuell)上过夜。使用STRATALINKER UV交联器(Stratagene,La Jolla,CA)于1200焦耳将DNA固定在Nytran上。将印渍如上所述预杂交。如上所述标记并纯化大约50ng人类zalpha11cDNA用作探针。如上所述将滤膜在含大约106cpm/ml zalpha11 cDNA探针和大约0.1mg/ml变性鲑鱼精DNA的ExpresshybTM溶液(Clontech)中杂交。杂交于50℃进行过夜。如上所述将印渍清洗并使胶片于-80℃曝光过夜。
Southern显示由BamHI/StuI消化产生的一个DNA片段以预计大小范围1.3-1.6kb与人类zalpha11cDNA探针发生杂交。处理该片段。将大约3μg 20b1λDNA用20单位BamHI(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)和20单位StuI(NEB,Beverly,MA)于37℃切割2小时。将消化物在1%TBE琼脂糖凝胶上进行电泳,并由凝胶切下1.3kb双链和1.6kb双链条带,使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)由琼脂糖提取DNA。由于制备DNA产量低,不可能通过进一步限制性消化分析确定与人类zalpha11 cDNA探针杂交的片段是BamHI/StuI还或StuI/StuI片段。由此,使用Zero平端PCR克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)用5μl 1.3kb双链片段和5μl 1.6kb双链片段进行平端连接。平端连接产生含两种1.6kb片段和一种1.3kb片段的阳性克隆。将这些克隆用EcoRI(Life Technologies)消化,该位点位于插入1.6和1.3kb片段的T重叠位点的侧翼。进行另一次Southern印渍以确定与人类zalpha11 cDNA探针杂交的最初片段。处理1%TBE凝胶,并如上所述将DNA转移到Nytran印渍上。
如上所述将印渍在10ml杂交液中预杂交。制备不同的人类zalpha11多核苷酸探针。通过使用寡ZC19,905(SEQ ID NO36)和ZC20,097(SEQ ID NO27)的PCR产生另一种全长zalpha11 cDNA人类zalpha11片段,用作探针。PCR反应条件如下95℃ 1min;95℃1min/55℃ 1min/72℃ 2min 35个循环;72℃ 10min。将PCR产物在1%低熔点琼脂糖(Boerhinger Mannheim)上进行电泳,并使用QiaquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离大约1.5kb人类zalpha11cDNA。如上所述用32P标记并纯化大约50ng该分离的人类zalpha11 cDNA片段。如上所述将滤膜在含大约106cpm/ml zalpha11 cDNA探针、大约0.1mg/ml变性鲑鱼精DNA、和0.5μg/ml变性cot-1 DNA的ExpresshybTM溶液(Clontech)中杂交。如上所述进行杂交和清洗。用印渍使胶片于-80℃曝光1.5小时,1.3kb插入片段与人类zalpha11探针强杂交。
将该克隆测序,发现包含带终止密码子和上游内含子序列的小鼠zalpha11 3’编码外显子。所用测序引物是ZC3,424(SEQ ID NO86)、ZC694(SEQ ID NO87)、ZC24,399(SEQ ID NO88)、和ZC24,400(SEQ ID NO89)。包括3’外显子的小鼠zalpha11基因组序列显示于SEQ ID NO69。在SEQ ID NO69中,3’外显子编码序列起始于第543位核苷酸,终止于第1262位核苷酸,编码240个氨基酸的外显子(SEQ ID NO70)。B.小鼠cDNA组的PCR筛选通过使用ZC24,432(SEQ ID NO71)和ZC24,433(SEQ ID NO72)作为引物(每种大约20pmol)的PCR,筛选一组可获得的内部和商业性小鼠cDNA(Clontech;Life technologies,Gaithersburg,MD)。PCR反应条件如下94℃ 2min;94℃ 20sec/64℃ 30sec/72℃ 30sec32个循环;72℃ 5min。小鼠脾、树突状细胞、新生皮肤、骨髓、野生型BaF3细胞、EL4细胞、和肺显示预计450bp大小的强PCR产物。C.5’嵌套RACE使用20pmol ZC9,739(SEQ ID NO73)和ZC24,434(SEQ ID NO74)作为引物,CD90+选择的小鼠脾marathon cDNA作为模板进行5’RACE。使用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)根据制造商的指示制备marathon cDNA。PCR反应条件如下94℃ 1min;94℃ 20sec/70℃ 1.5min 5个循环;94℃ 20sec/64℃ 20sec/72℃ 1.5min 25个循环;72℃ 5min。
为了富集小鼠zalpha11 5’RACE产物,使用上述用于最初5’RACE的PCR反应条件进行嵌套5’RACE反应,不同的是使用嵌套引物ZC24,431(SEQ ID NO75)和ZC9,719(SEQ ID NO76),以及1μl 20倍稀释的最初5’RACE反应液(上述)作为模板。将产物通过凝胶电泳纯化,使用QiaexII琼脂糖凝胶提取试剂盒(Qiagen)洗脱DNA,并使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)亚克隆。通过菌落PCR使用10pmolZC24,431(SEQ ID NO75)和ZC24,511(SEQ ID NO77)鉴定阳性克隆。PCR反应条件如下94℃ 2min;94℃ 20sec/64℃ 20sec/72℃ 30sec 35个循环;72℃ 5min。对嵌套5’RACE反应每个取2个亚克隆测序。所有克隆包含一些zalpha11序列,但是都不完整。由不完整的5’RACE克隆和代表小鼠zalpha11多核苷酸的预定部分序列和相应多肽的3’外显子序列(SEQ ID NO70)产生编辑序列。部分小鼠zalpha11 cDNA的预定序列显示于SEQ ID NO78(5’末端)和SEQ ID NO80(3’末端);在SEQ ID NO78(5’末端)和SEQ ID NO80(3’末端)之间仍有大约330个核苷酸的未知序列,方包含完整小鼠zalpha11 cDNA(见下文)。SEQ ID NO78和SEQ ID NO80的相应氨基酸序列分别显示于SEQ IDNO79(N末端)和SEQ ID NO81(C末端)。D.全长PCR由小鼠起始Met的上游UTR和终止密码子的下游设计了用于全长PCR的引物。在PCR反应中,使用引物ZC24,616(SEQ ID NO82)和ZC24,615(SEQ ID NO83)每种20pmol,小鼠树突状细胞marathon cDNA或新生小鼠皮肤内部cDNA文库作为模板。PCR反应条件如下94℃1min;94℃ 20sec/66℃ 2min 30个循环;72℃ 5min。通过凝胶电泳纯化PCR产物,使用Qiaquick凝胶提取试剂盒洗脱cDNA,并使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)亚克隆。对每个PCR反应的2个亚克隆测序。所用测序引物是ZC694(SEQ ID NO87)、ZC3,424(SEQ ID NO86)、ZC24,431(SEQ ID NO75)、ZC24,511(SEQ ID NO77)、ZC24,806(SEQ ID NO90)、和ZC24,807(SEQ ID NO91)。全长小鼠zalpha11cDNA序列显示于SEQ ID NO84。对应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO85。
由上文可以理解,尽管此处为了举例说明而描述了本发明的特定实施方案,但在不偏离本发明精神和范围的前提下,可以做各种修改。相应的,本发明仅由所附权利要求书作出限定。
序列表<110>ZymoGenetics,公司<120> 细胞因子受体zalpha11<130>98-55PC<150>09/159,254<151>1998-09-23<150>09/265,117<151>1999-03-09<150>09/347,930<151>1999-07-06<160>91<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>2887<212>DNA<213>人类<220>
<221>CDS<222>(69)...(1682)<400>1gaagcagcag gtaccccctc cacatcccta gggctctgtg atgtaggcag aggcccgtgg60gagtcagc atg ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg ctg ctc110Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10cag gga ggc tgg ggc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat tac ctc 158Gln Gly Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu15 20 25 30cag acg gtc atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc agc acg 206Gln Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr35 40 45ctc acc ctt acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc 254Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala50 55 60acc tcc tgc agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat gcc acc 302Thr Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr65 70 75tac acc tgc cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac att ttc 350Tyr Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe80 85 90agt gtc aac atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag tgt ggc 398Ser Val Asn 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Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile210 215 220ttt cag acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac cct cac ctg 782Phe Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu225 230 235ctg ctt ctc ctc ctg ctt gtc ata gtc ttc att cct gcc ttc tgg agc 830Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser240 245 250ctg aag acc cat cca ttg tgg agg cta tgg aag aag ata tgg gcc gtc 878Leu Lys Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val255 260 265 270ccc agc cct gag cgg ttc ttc atg ccc ctg tac aag ggc tgc agc gga 926Pro Ser Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly275 280 285gac ttc aag aaa tgg gtg ggt gca ccc ttc act ggc tcc agc ctg gag 974Asp Phe Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu290 295 300ctg gga ccc tgg agc cca gag gtg ccc tcc acc ctg gag gtg tac agc1022Leu Gly Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser305 310 315tgc cac cca cca cgg agc ccg gcc aag agg ctg cag ctc acg gag cta1070Cys His Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu320 325 330caa gaa cca gca gag ctg gtg gag tct gac ggt gtg ccc aag ccc agc1118Gln Glu Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser335 340 345 350ttc tgg ccg aca gcc cag aac tcg ggg ggc tca gct tac agt gag gag1166Phe Trp Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu355 360 365agg gat cgg cca tac ggc ctg gtg tcc att gac aca gtg act gtg cta1214Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu370 375 380gat gca gag ggg cca tgc acc tgg ccc tgc agc tgt gag gat gac ggc1262Asp Ala Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly385 390 395tac cca gcc ctg gac ctg gat gct ggc ctg gag ccc agc cca ggc cta1310Tyr Pro Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu400 405 410gag gac cca ctc ttg gat gca ggg acc aca gtc ctg tcc tgt ggc tgt1358Glu Asp Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys415 420 425 430gtc tca gct ggc agc cct ggg cta gga ggg ccc ctg gga agc ctc ctg1406Val Ser Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu435 440 445gac aga cta aag cca ccc ctt gca gat ggg gag gac tgg gct ggg gga1454Asp Arg Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly450 455 460ctg ccc tgg ggt ggc cgg tca cct gga ggg gtc tca gag agt gag gcg1502Leu Pro Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala465 470 475ggc tca ccc ctg gcc ggc ctg gat atg gac acg ttt gac agt ggc ttt1550Gly Ser Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe480 485 490gtg ggc tct gac tgc agc agc cct gtg gag tgt gac ttc acc agc ccc1598Val Gly Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro495 500 505 510ggg gac gaa gga ccc ccc cgg agc tac ctc cgc cag tgg gtg gtc att1646Gly Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile515 520 525cct ccg cca ctt tcg agc cct gga ccc cag gcc agc taatgaggct 1692Pro Pro Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser530 535gactggatgt ccagagctgg ccaggccact gggccctgag ccagagacaa ggtcacctgg 1752gctgtgatgt gaagacacct gcagcctttg gtctcctgga tgggcctttg agcctgatgt 1812ttacagtgtc tgtgtgtgtg tgtgcatatg tgtgtgtgtg catatgcatg tgtgtgtgtg 1872tgtgtgtctt aggtgcgcag tggcatgtcc acgtgtgtgt gtgattgcac gtgcctgtgg 1932gcctgggata atgcccatgg tactccatgc attcacctgc cctgtgcatg tctggactca 1992cggagctcac ccatgtgcac aagtgtgcac agtaaacgtg tttgtggtca acagatgaca 2052acagccgtcc tccctcctag ggtcttgtgt tgcaagttgg tccacagcat ctccggggct 2112ttgtgggatc agggcattgc ctgtgactga ggcggagccc agccctccag cgtctgcctc 2172caggagctgc aagaagtcca tattgttcct tatcacctgc caacaggaag cgaaagggga 2232tggagtgagc ccatggtgac ctcgggaatg gcaatttttt gggcggcccc tggacgaagg 2292tctgaatccc gactctgata ccttctggct gtgctacctg agccaagtcg cctcccctct 2352ctgggctaga gtttccttat ccagacagtg gggaaggcat gacacacctg ggggaaattg 2412gcgatgtcac ccgtgtacgg tacgcagccc agagcagacc ctcaataaac gtcagcttcc 2472ttccttctgc ggccagagcc gaggcgggcg ggggtgagaa catcaatcgt cagcgacagc 2532ctgggcaccc gcggggccgt cccgcctgca gagggccact cgggggggtt tccaggctta 2592aaatcagtcc gtttcgtctc ttggaaacag ctccccacca accaagattt ctttttctaa 2652cttctgctac taagttttta aaaattccct ttatgcaccc aagagatatt tattaaacac 2712caattacgta gcaggccatg gctcatggga cccacccccc gtggcactca tggagggggc 2772tgcaggttgg aactatgcag tgtgctccgg ccacacatcc tgctgggccc cctaccctgc 2832cccaattcaa tcctgccaat aaatcctgtc ttatttgttc atcctggaga attga 2887<210>2<211>538<212>PRT<213>人类<400>2Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly1 5 10 15Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr20 25 30Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr35 40 45Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser50 55 60Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr65 70 75 80Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val85 90 95Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe100 105 110Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val115 120 125Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp130 135 140Pro Ala PheTyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr145150 155 160Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile165 170 175Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys180 185 190Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser195 200 205Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln210 215 220Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu225 230 235 240Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys245 250 255Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser260 265 270Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe275 280 285Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly290 295 300Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His305 310 315 320Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu325 330 335Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp340 345 350Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp355 360 365Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala370 375 380Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro385 390 395 400Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp405 410 415Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser420 425 430Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg435 440 445Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro450 455 460Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser465 470 475 480Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly485 490 495Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp500 505 510Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro515 520 525Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser530 535<210>3<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>共有氨基酸基元<221>变体<222>(1)...(5)<223>Xaa=任何氨基酸<400>3Trp Ser Xaa Trp Ser1 5<210>4<211>1614<212>DNA<213>人工序列<220><223>zalpha11的简并核苷酸序列<221>misc feature<222>(1)...(1614)<223>n=A、T、C或G<221>misc feature<222>(1)...(1614)<223>n=A、T、C或G<400>4atgccnmgng gntgggcngc nccnytnytn ytnytnytny tncarggngg ntggggntgy 60ccngayytng tntgytayac ngaytayytn caracngtna thtgyathyt ngaratgtgg120aayytncayc cnwsnacnyt nacnytnacn tggcargayc artaygarga rytnaargay180gargcnacnw sntgywsnyt ncaymgnwsn gcncayaayg cnacncaygc nacntayacn240tgycayatgg aygtnttyca yttyatggcn gaygayatht tywsngtnaa yathacngay300carwsnggna aytaywsnca rgartgyggn wsnttyytny tngcngarws nathaarccn360gcnccnccnt tyaaygtnac ngtnacntty wsnggncart ayaayathws ntggmgnwsn420gaytaygarg ayccngcntt ytayatgytn aarggnaary tncartayga rytncartay480mgnaaymgng gngayccntg ggcngtnwsn ccnmgnmgna arytnathws ngtngaywsn540mgnwsngtnw snytnytncc nytngartty mgnaargayw snwsntayga rytncargtn600mgngcnggnc cnatgccngg nwsnwsntay carggnacnt ggwsngartg gwsngayccn660gtnathttyc aracncarws ngargarytn aargarggnt ggaayccnca yytnytnytn720ytnytnytny tngtnathgt nttyathccn gcnttytggw snytnaarac ncayccnytn780tggmgnytnt ggaaraarat htgggcngtn ccnwsnccng armgnttytt yatgccnytn840tayaarggnt gywsnggnga yttyaaraar tgggtnggng cnccnttyac nggnwsnwsn900ytngarytng gnccntggws nccngargtn ccnwsnacny tngargtnta ywsntgycay960ccnccnmgnw snccngcnaa rmgnytncar ytnacngary tncargarcc ngcngarytn 1020gtngarwsng ayggngtncc naarccnwsn ttytggccna cngcncaraa ywsnggnggn 1080wsngcntayw sngargarmg ngaymgnccn tayggnytng tnwsnathga yacngtnacn 1140gtnytngayg cngarggncc ntgyacntgg ccntgywsnt gygargayga yggntayccn 1200gcnytngayy tngaygcngg nytngarccn wsnccnggny tngargaycc nytnytngay 1260gcnggnacna cngtnytnws ntgyggntgy gtnwsngcng gnwsnccngg nytnggnggn 1320ccnytnggnw snytnytnga ymgnytnaar ccnccnytng cngayggnga rgaytgggcn 1380ggnggnytnc cntggggngg nmgnwsnccn ggnggngtnw sngarwsnga rgcnggnwsn 1440ccnytngcng gnytngayat ggayacntty gaywsnggnt tygtnggnws ngaytgywsn 1500wsnccngtng artgygaytt yacnwsnccn ggngaygarg gnccnccnmg nwsntayytn 1560mgncartggg tngtnathcc nccnccnytn wsnwsnccng gnccncargc nwsn 1614<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC447<400>5taacaatttc acacagg17<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC976<400>6cgttgtaaaa cgacggcc 18<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19345
<400>7gaccagtctg gcaactactc c 21<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19346<400>8gctctcagcc aggagaaagc 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19349<400>9ggttggtggg gagctgtttc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19350<400>10gggtgagaac atcaatcgtc 20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19458
<400>11catatcttct tccatagcct c 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19459<400>12ctcctcctgc ttgtcatagt c 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19460<400>13gtaaacgtgt ttgtggtcaa c 21<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19461<400>14tgccctgatc ccacaaagcc 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19572<400>15gtcctgtggc tgtgtctcag 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19573<400>16cagtcagagc ccacaaagcc 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19657<400>17ctgagacaca gccacaggac 20<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19181<400>18tccacatccc tagggctctg tgat24<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19182<400>19gaggttccac atttccagga tgcag 25
<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19907<400>20atggatgtat tccacttcat ggcc24<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19908<400>21actgtcaaac gtgtccatat ccag24<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19954<400>22actgggctgg gggactgc 18<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19955<400>23ccccggggct ggtgaagt 18
<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC17212<400>24ggggaattcg aagccatgcc ctcttgggcc ctc 33<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19914<400>25caatggatgg gtctttagca gcagtaggcc 30<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19913<400>26ggcctactgc tgctaaagac ccatccattg 30<210>27<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC20097<400>27acatctagat tagctggcct ggggtccagg cgt 33<210>28
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC12700<400>28ggaggtctat ataagcagag c 21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC5020<400>29cactggagtg gcaacttcca g 21<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC6675<400>30gtggatgccg aacccagtcc 20<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC7727<400>31tgttcacagc tacctgggct c 21<210>32<211>26
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC8290<400>32ccaccgagac tgcttggatc accttg 26<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC6622<400>33ctgggctgga aactggcaca c 21<210>34<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC7736<400>34cactgtcaga aatggagc 18<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC9273<400>35ggtccctccc cgggcaccga gaga24<210>36<211>36<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19905<400>36acaggatccg tcagcatgcc gcgtggctgg gccgcc36<210>37<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19906<400>37acagaattct tagctggcct ggggtccagg cgt 33<210>38<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC20114<400>38cctgccttct acatgctgaa gg 22<210>39<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19954<400>39actgggctgg gggactgc 18<210>40<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC20116<400>40agcacagtca ctgtgtcaat gg 22<210>41<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Glu-Glu(CEE)标签氨基酸序列<400>41Glu Tyr Net Pro Met Glu1 5<210>42<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19931<400>42ggttggtacc gcaagatgcc gcgtggctgg gccgcc 36<210>43<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19932<400>43cggaggatcc gtgagggttc cagccttcc 29<210>44<211>66<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>跨越载体侧翼区和zalpha11的5’末端的寡核苷酸引物<400>44tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc agggaattca tcgataatgc cgcgtggctg 60ggccgc66<210>45<211>699<212>DNA<213>人类<400>45gagcccagat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag 60ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg120acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc180aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag240tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat200ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc360atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg420gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc480gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct540cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc600aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac660tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 699<210>46<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>跨越zalphall胞外结构域的3’末端和Fc4的5’末端的第一种寡核苷酸引物<400>46gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tcgtgagggt tccagccttc 60ct62<210>47<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>跨越zalpha11胞外结构域的3’末端和Fc4的5’末端的第二种寡核苷酸引物<400>47agacccagtc agaggagtta aaggaaggct ggaaccctca cgagcccaga tcttcagaca60a61<210>48<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>跨越Fc4的3’末端和载体侧翼区的寡核苷酸引物<400>48gtgggcctct ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag60acaggga 67<210>49<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>FLAG标签氨基酸序列<400>49Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>50<211>1821<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码MBP-zalpha11可溶性受体融合蛋白的多核苷酸
<221>CDS<222>(1)...(1821)<400>50atg aaa atc gaa gaa ggt aaa ctg gta atc tgg att aac ggc gat aaa 48Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys1 5 10 15ggc tat aac ggt ctc gct gaa gtc ggt aag aaa ttc gag aaa gat acc 96Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr20 25 30gga att aaa gtc acc gtt gag cat ccg gat aaa ctg gaa gag aaa ttc 144Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe35 40 45cca cag gtt gcg gca act ggc gat ggc cct gac att atc ttc tgg gca 192Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala50 55 60cac gac cgc ttt ggt ggc tac gct caa tct ggc ctg ttg gct gaa atc 240His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile65 70 75 80acc ccg gac aaa gcg ttc cag gac aag ctg tat ccg ttt acc tgg gat 288Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp85 90 95gcc gta cgt tac aac ggc aag ctg att gct tac ccg atc gct gtt gaa 336Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu100 105 110gcg tta tcg ctg att tat aac aaa gat ctg ctg ccg aac ccg cca aaa 384Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys115 120 125acc tgg gaa gag atc ccg gcg ctg gat aaa gaa ctg aaa gcg aaa ggt 432Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly130 135 140aag agc gcg ctg atg ttc aac ctg caa gaa ccg tac ttc acc tgg ccg 480Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro145 150 155 160ctg att gct gct gac ggg ggt tat gcg ttc aag tat gaa aac ggc aag 528Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys165 170 175tac gac att aaa gac gtg ggc gtg gat aac gct ggc gcg aaa gcg ggt 576Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly180 185 190ctg acc ttc ctg gtt gac ctg att aaa aac aaa cac atg aat gca gac 624Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp195 200 205acc gat tac tcc atc gca gaa gct gcc ttt aat aaa ggc gaa aca gcg 672Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala210 215 220atg acc atc aac ggc ccg tgg gca tgg tcc aac atc gac acc agc aaa 720Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys225 230 235 240gtg aat tat ggt gta acg gta ctg ccg acc ttc aag ggt caa cca tcc 768Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser245 250 255aaa ccg ttc gtt ggc gtg ctg agc gca ggt att aac gcc gcc agt ccg 816Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro260 265 270aac aaa gag ctg gca aaa gag ttc ctc gaa aac tat ctg ctg act gat 864Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp275 280 285gaa ggt ctg gaa gcg gtt aat aaa gac aaa ccg ctg ggt gcc gta gcg 912Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala290 295 300ctg aag tct tac gag gaa gag ttg gcg aaa gat cca cgt att gcc gcc 960Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala305 310 315 320acc atg gaa aac gcc cag aaa ggt gaa atc atg ccg aac atc ccg cag 1008Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln325 330 335atg tcc gct ttc tgg tat gcc gtg cgt act gcg gtg atc aac gcc gcc 1056Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala340 345 350agc ggt cgt cag act gtc gat gaa gcc ctg aaa gac gcg cag act aat 1104Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn355 360 365tcg agc tcc cac cat cac cat cac cac gcg aat tcg gta ccg ctg gtt 1152Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val370 375 380ccg cgt gga tcc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat tac ctc cag 1200Pro Arg Gly Ser Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln385 390 395 400acg gtc atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc agc acg ctc 1248Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu405 410 415acc ctt acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc acc 1296Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr420 425 430tcc tgc agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat gcc acc tac 1344Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr435 440 445acc tgc cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac att ttc agt 1392Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser450 455 460gtc aac atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag tgt ggc agc 1440Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser465 470 475 480ttt ctc ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc aac gtg act 1488Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr485 490 495gtg acc ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca gat tac gaa 1536Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu500 505 510gac cct gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat gag ctg cag 1584Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln515 520 525tac agg aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg aga aag ctg1632Tyr Arg Ash Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu530 535 540atc tca gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg gag ttc cgc1680Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg545 550 555 560aaa gac tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc atg cct ggc1728Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly565 570 575tcc tcc tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg gtc atc ttt1776Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe580 585 590cag acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac cct cac tag1821Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His *595 600 605<210>51<211>606<212>PRT<213>人工序列<400> 51Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys1 5 10 15Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr20 25 30Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe35 40 45Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala50 55 60His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile65 70 75 80Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp85 90 95Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu100 105 110Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys115 120 125Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly130 135 140Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro145 150 155 160Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys165 170 175Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly180 185 190Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp195 200 205Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala210 215 220Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys225 230 235 240Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser245 250 255Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro260 265 270Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp275 280 285Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala290 295 300Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala305 310 315 320Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln325 330 335Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala340 345 350Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn355 360 365Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val370 375 380Pro Arg Gly Ser Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln385 390 395 400Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu405 410 415Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr420 425 430Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr435 440 445Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser450 455 460Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser465 470 475 480Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr485 490 495Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu500 505 510Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln515 520 525Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu530 535 540Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg545 550 555 560Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly565 570 575Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe580 585 590Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His595 600 605<210>52<211>657<212>DNA<213>人类<400>52tgccccgacc tcgtctgcta caccgattac ctccagacgg tcatctgcat cctggaaatg 60tggaacctcc accccagcac gctcaccctt acctggcaag accagtatga agagctgaag120gacgaggcca cctcctgcag cctccacagg tcggcccaca atgccacgca tgccacctac180acctgccaca tggatgtatt ccacttcatg gccgacgaca ttttcagtgt caacatcaca240gaccagtctg gcaactactc ccaggagtgt ggcagctttc tcctggctga gagcatcaag300ccggctcccc ctttcaacgt gactgtgacc ttctcaggac agtataatat ctcctggcgc360tcagattacg aagaccctgc cttctacatg ctgaagggca agcttcagta tgagctgcag420tacaggaacc ggggagaccc ctgggctgtg agtccgagga gaaagctgat ctcagtggac480tcaagaagtg tctccctcct ccccctggag ttccgcaaag actcgagcta tgagctgcag540gtgcgggcag ggcccatgcc tggctcctcc taccagggga cctggagtga atggagtgac600ccggtcatct ttcagaccca gtcagaggag ttaaaggaag gctggaaccc tcactag 657<210>53<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC20187<400>53tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc tgccccgacc tcgtctgcta 60caccg 65<210>54<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC20185<400>54tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca ctagtgaggg ttccagcctt 60cctttaac 68<210>55<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19372<400>55tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc 40<210>56<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19351<400>56acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg 60<210>57<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19352<400>57actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg 60<210>58<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC19371<400>58acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg42<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC22277<400>59ccaggagtgt ggcagctttc 20<210>60<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC22276<400>60gcttgccctt cagcatgtag a 21<210>61<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>zalpha11 TaqMan探针ZG31<400>61cggctccccc tttcaacgtg act 23
<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC23684<400>62tcacccttac ctggcaagac 20<210>63<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC23656<400>63taatacgact cactataggg agggggagac acttcttgag t 41<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC23685<400>64aggtctgaat cccgactctg 20<210>65<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC23657<400>65taatacgact cactataggg aggacgtaat tggtgtttaa t 41
<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物、rRNA正向引物<400>66cggctaccac atccaaggaa 20<210>67<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物、rRNA反向引物<400>67gctggaatta ccgcggct 18<210>68<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>rRNA TaqMan探针<400>68tgctggcacc agacttgccc tc 22<210>69<211>1298<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(543)...(1262)<400>69aggcctttca acacggcttt ttagtaattc attccatcta taaacattta tggtacacct 60actgtgtgcc aggtactgag gacacagttg tgatcagggc tagtgtagac acacaagcaa120aactagagac atccggaagt gtcaggagac ggagtagagg ctgggccact tagacctcag 180gctctccctg cacacgtcct caagacctta ggacttagga acctggtccc agcacccagc 240tgttccttgg ctggggcact ggtaactagc gtggatatga gacagaggac agtcagtcct 300tactaaaggt 9ggaacacgg gctctgagaa cggacagtat tgggaaccca ctgggcaggg 360ggttcacaga cagacatcat ggcgcgctct ctctctctct ctctctcctg ttttcttgtt 420cttctgcttt ccccgtctct ggcttgtccc tgtactcccc cccccacccc catctttggc 480tctctctgtt cacacccgac cttgttgtcc ccagctcatg actgtgtgtt tctttctcat 540ag aaa tgg gtt aat acc cct ttc acg gcc tcc agc ata gag ttg gtg 587Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val1 5 10 15cca cag agt tcc aca aca aca tca gcc tta cat ctg tca ttg tat cca 635Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro20 25 30gcc aag gag aag aag ttc ccg ggg ctg ccg ggt ctg gaa gag caa ctg 683Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu35 40 45gag tgt gat gga atg tct gag cct ggt cac tgg tgc ata atc ccc ttg 731Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu50 55 60gca gct ggc caa gcg gtc tca gcc tac agt gag gag aga gac cgg cca 779Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro65 70 75tat ggt ctg gtg tcc att gac aca gtg act gtg gga gat gca gag ggc 827Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly80 85 90 95ctg tgt gtc tgg ccc tgt agc tgt gag gat gat ggc tat cca gcc atg 875Leu Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met100 105 110aac ctg gat gct ggc cga gag tct ggc cct aat tca gag gat ctg ctc 923Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu115 120 125ttg gtc aca gac cct gct ttt ctg tct tgc ggc tgt gtc tca ggt agt 971Leu Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser130 135 140ggt ctc agg ctt gga ggc tcc cca ggc agc cta ctg gac agg ttg agg1019Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg145 150 155ctg tca ttt gca aag gaa ggg gac tgg aca gca gac cca acc tgg aga1067Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg160 165 170 175act ggg tcc cca gga ggg ggc tct gag agt gaa gca ggt tcc ccc cct1115Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro180 185 190ggt ctg gac atg gac aca ttt gac agt ggc ttt gca ggt tca gac tgt1163Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys195 200 205ggc agc ccc gtg gag act gat gaa gga ccc cct cga agc tat ctc cgc1211Gly Ser Pro Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg210 215 220cag tgg gtg gtc agg acc cct cca cct gtg gac agt gga gcc cag agc1259Gln Trp Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser225 230 235agc tagcatataa taaccagcta tagtgagaag aggcct1298Ser240<210>70<211>240<212>PRT<213>Mus musculus<400>70Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val Pro1 5 10 15Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro Ala20 25 30Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu Glu35 40 45Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu Ala50 55 60Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr65 70 75 80Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly Leu85 90 95Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met Asn100 105 110Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu Leu115 120 125Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser Gly130 135 140Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu145 150 155 160Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr165 170 175Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly180 185 190Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys Gly195 200 205Ser Pro Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln210 215 220Trp Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser Ser225 230 235 240<210>71<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24432<400>71atgtctgagc ctggtcactg gtg 23<210>72<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24433<400>72tctgaacctg caaagccact gtc 23<210>73<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC9739<400>73ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>74<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24434<400>74caccagtgac caggctcaga ca 22<210>75<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24431<400>75ccatcacact ccagttgctc ttc 23<210>76<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC9719<400>76actcactata gggctcgagc ggc 23<210>77<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24511<400>77tccagcatag agttggtgcc aca 23<210>78<211>592<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(436)...(592)<400>78cgcccgggca ggtctccgct ggtggccctg tgtttcagtc gcgcacagct gtctgcccac 60ttctcctgtg gtgtgcctca cggtcacttg cttgtctgac cgcaagtctg cccatccctg120gggcagccaa ctggcctcag cccgtgcccc aggcgtgccc tgtctctgtc tggctgcccc180agccctactg tcttcctctg tgtaggctct gcccagatgc ccggctggtc ctcagcctca240ggactatctc agcagtgact cccctgattc tggacttgca cctgactgaa ctcctgccca300cctcaaacct tcacctccca ccaccaccac tccgagtccc gctgtgactc ccacgcccag360gagaccaccc aagtgcccca gcctaaagaa tggctttctg aggaagatcc tgaaggagta420ggtctgggac acagc atg ccc cgg ggc cca gtg gct gcc tta ctc ctg ctg 471Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10att ctc cat gga gct tgg agc tgc ctg grc ctc act tgc tac act gac 519Ile Leu His Gly Ala Trp Ser Cys Leu Xaa Leu Thr Cys Tyr Thr Asp15 20 25tac ctc tgg acc atc acc tgt gtc ctg gag aca cgg agc ccc aac ccc 567Tyr Leu Trp Thr Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro30 35 40agc ata ctc agt ctc acc tgg caa g592Ser Ile Leu Ser Leu Thr Trp Gln45 50<210>79<211>52<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>变体<222>(1)...(51)<223>Xaa=任何氨基酸<400>79Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly1 5 10 15Ala Trp Ser Cys Leu Xaa Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr20 25 30Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser35 40 45Leu Thr Trp Gln50<210>80<211>1229<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(3)...(1196)<400>80ga cgc tat gat atc tcc tgg gac tca gct tat gac gaa ccc tcc aac47Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn1 5 10 15tac gtg ctg aga ggc aag cta caa tat gag ctg cag tat cgg aac ctc 95Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu20 25 30aga gac ccc tat gct gtg agg ccg gtg acc aag ctg atc tca gtg gac 143Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile Ser Val Asp35 40 45tca aga aac gtc tct ctt ctc cct gaa gag ttc cac aaa gat tct agc 191Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser50 55 60tac cag ctg cag atg cgg gca gcg cct cag cca ggc act tca ttc agg 239Tyr Gln Leu Gln Met Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg65 70 75ggg acc tgg agt gag tgg agt gac ccc gtc atc ttt cgg acc cag gct 287Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Arg Thr Gln Ala80 85 90 95ggg gag ccc gag gca ggc tgg gac cct cac atg ctg ctg ctc ctg gct 335Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu Leu Leu Ala100 105 110gtc ttg atc att gtc ctg gtt ttc atg ggt ctg aag atc cac ctg cct 383Val Leu Ile Ile Val Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile His Leu Pro115 120 125tgg agg cta tgg aaa aag ata tgg gca cca gtg ccc acc cct gag agt 431Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr Pro Glu Ser130 135 140ttc ttc cag ccc ctg tgc agg gag cac agc ggg aac ttc aag aaa tgg 479Phe Phe Gln Pro Leu Cys Arg Glu His Ser Gly Asn Phe Lys Lys Trp145 150 155gtt aat acc cct ttc acg gcc tcc agc ata gag ttg gtg cca cag agt 527Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val Pro Gln Ser160 165 170 175tcc aca aca aca tca gcc tta cat ctg tca ttg tat cca gcc aag gag 575Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro Ala Lys Glu180 185 190aag aag ttc ccg ggg ctg ccg ggt ctg gaa gag caa ctg gag tgt gat 623Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu Glu Cys Asp195 200 205gga atg tct gag cct ggt cac tgg tgc ata atc ccc ttg gca gct ggc 671Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu Ala Ala Gly210 215 220caa gcg gtc tca gcc tac agt gag gag aga gac cgg cca tat ggt ctg 719Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu225 230 235gtg tcc att gac aca gtg act gtg gga gat gca gag ggc ctg tgt gtc 767Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly Leu Cys Val240245 250 255tgg ccc tgt agc tgt gag gat gat ggc tat cca gcc atg aac ctg gat 815Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met Asn Leu Asp260 265 270gct ggc cga gag tct ggc cct aat tca gag gat ctg ctc ttg gtc aca 863Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu Leu Val Thr275 280 285gac cct gct ttt ctg tct tgc ggc tgt gtc tca ggt agt ggt ctc agg 911Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser Gly Leu Arg290 295 300ctt gga ggc tcc cca ggc agc cta ctg gac agg ttg agg ctg tca ttt 959Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu Ser Phe305 310 315gca aag gaa ggg gac tgg aca gca gac cca acc tgg aga act ggg tcc1007Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr Gly Ser320 325 330 335cca gga ggg ggc tct gag agt gaa gca ggt tcc ccc cct ggt ctg gac1055Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp340 345 350atg gac aca ttt gac agt ggc ttt gca ggt tca gac tgt ggc agc ccc1103Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys Gly Ser Pro355 360 365gtg gag act gat gaa gga ccc cct cga agc tat ctc cgc cag tgg gtg1151Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val370 375 380gtc agg acc cct cca cct gtg gac agt gga gcc cag agc agc tag1196Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser Ser *385 390 395catataataa ccagctatag tgagaagagg cct 1229<210>81<211>397<212>PRT<213>Mus musculus<400>81Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Tyr1 5 10 15Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu Arg20 25 30Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser35 40 45Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser Tyr50 55 60Gln Leu Gln Met Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg Gly65 70 75 80Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Arg Thr Gln Ala Gly85 90 95Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu Leu Leu Ala Val100 105 110Leu Ile Ile Val Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile His Leu Pro Trp115 120 125Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr Pro Glu Ser Phe130 135140Phe Gln Pro Leu Cys Arg Glu His Ser Gly Asn Phe Lys Lys Trp Val145 150 155 160Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val Pro Gln Ser Ser165 170 175Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro Ala Lys Glu Lys180 185 190Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu Glu Cys Asp Gly195 200 205Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu Ala Ala Gly Gln210 215 220Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Val225 230 235 240Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly Leu Cys Val Trp245 250 255Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met Asn Leu Asp Ala260 265 270Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu Leu Val Thr Asp275 280 285Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser Gly Leu Arg Leu290 295 300Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu Ser Phe Ala305 310 315 320Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr Gly Ser Pro325 330 335Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp Met340 345 350Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys Gly Ser Pro Val355 360 365Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val370 375 380Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser Ser385 390 395<210>82<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24616<400>82ctgcccacct caaaccttca cct 23<210>83<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24615<400>83atgctagctg ctctgggctc cact24<210>84<211>1735<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(143)...(1729)<400>84ctgcccacct caaaccttca cctcccacca ccaccactcc gagtcccgct gtgactccca 60cgcccaggag accacccaag tgccccagcc taaagaatgg ctttctgaga aagaccctga120aggagtaggt ctgggacaca gc atg ccc cgg ggc cca gtg gct gcc tta ctc 172Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu1 5 10ctg ctg att ctc cat gga gct tgg agc tgc ctg gac ctc act tgc tac 220Leu Leu Ile Leu His Gly Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr15 20 25act gac tac ctc tgg acc atc acc tgt gtc ctg gag aca cgg agc ccc 268Thr Asp Tyr Leu Trp Thr Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro30 35 40aac ccc agc ata ctc agt ctc acc tgg caa gat gaa tat gag gaa ctt 316Asn Pro Ser Ile Leu Ser Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu45 50 55cag gac caa gag acc ttc tgc agc cta cac agg tct ggc cac aac acc 364Gln Asp Gln Glu Thr Phe Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr60 65 70aca cat ata tgg tac acg tgc cat atg cgc ttg tct caa ttc ctg tcc 412Thr His Ile Trp Tyr Thr Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser75 80 85 90gat gaa gtt ttc att gtc aat gtg acg gac cag tct ggc aac aac tcc 460Asp Glu Val Phe Ile Val Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser95 100 105caa gag tgt ggc agc ttt gtc ctg gct gag agc atc aaa cca gct ccc 508Gln Glu Cys Gly Ser Phe Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro110 115 120ccc ttg aac gtg act gtg gcc ttc tca gga cgc tat gat atc tcc tgg 556Pro Leu Asn Val Thr Val Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp125 130 135gac tca gct tat gac gaa ccc tcc aac tac gtg ctg agg ggc aag cta 604Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu140 145 150caa tat gag ctg cag tat cgg aac ctc aga gac ccc tat gct gtg agg 652Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg155 160 165 170ccg gtg acc aag ctg atc tca gtg gac tca aga aac gtc tct ctt ctc 700Pro Val Thr Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu175 180 185cct gaa gag ttc cac aaa gat tct agc tac cag ctg cag gtg cgg gca 748Pro Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala190 195 200gcg cct cag cca ggc act tca ttc agg ggg acc tgg agt gag tgg agt 796Ala Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser205 210 215gac ccc gtc atc ttt cag acc cag gct ggg gag ccc gag gca ggc tgg 844Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp220 225 230gac cct cac atg ctg ctg ctc ctg gct gtc ttg atc att gtc ctg gtt 892Asp Pro His Met Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ile Ile Val Leu Val235 240 245 250ttc atg ggt ctg aag atc cac ctg cct tgg agg cta tgg aaa aag ata 940Phe Met Gly Leu Lys Ile His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile255 260 265tgg gca cca gtg ccc acc cct gag agt ttc ttc cag ccc ctg tac agg 988Trp Ala Pro Val Pro Thr Pro Glu Ser Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg270 275 280gag cac agc ggg aac ttc aag aaa tgg gtt aat acc cct ttc acg gcc 1036Glu His Ser Gly Asn Phe Lys Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala285 290 295tcc agc ata gag ttg gtg cca cag agt tcc aca aca aca tca gcc tta 1084Ser Ser Ile Glu Leu Val Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu300 305 310cat ctg tca ttg tat cca gcc aag gag aag aag ttc ccg ggg ctg ccg 1132His Leu Ser Leu Tyr Pro Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro315 320 325 330ggt ctg gaa gag caa ctg gag tgt gat gga atg tct gag cct ggt cac 1180Gly Leu Glu Glu Gln Leu Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His335 340 345tgg tgc ata atc ccc ttg gca gct ggc caa gcg gtc tca gcc tac agt 1228Trp Cys Ile Ile Pro Leu Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser350 355 360gag gag aga gac cgg cca tat ggt ctg gtg tcc att gac aca gtg act 1276Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr365 370 375gtg gga gat gca gag ggc ctg tgt gtc tgg ccc tgt agc tgt gag gat 1324Val Gly Asp Ala Glu Gly Leu Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp380 385 390gat ggc tat cca gcc atg aac ctg gat gct ggc cga gag tct ggc cct 1372Asp Gly Tyr Pro Ala Met Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro395 400 405 410aat tca gag gat ctg ctc ttg gtc aca gac cct gct ttt ctg tct tgc 1420Asn Ser Glu Asp Leu Leu Leu Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys415 420 425ggc tgt gtc tca ggt agt ggt ctc agg ctt gga ggc tcc cca ggc agc 1468Gly Cys Val Ser Gly Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser430 435 440cta ctg gac agg ttg agg ctg tca ttt gca aaggaa ggg gac tgg aca 1516Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr445 450 455gca gac cca acc tgg aga act ggg tcc cca gga ggg ggc tct gag agt 1564Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser460 465 470gaa gca ggt tcc ccc cct ggt ctg gac atg gac aca ttt gac agt ggc 1612Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly475 480 485 490ttt gca ggt tca gac tgt ggc agc ccc gtg gag act gat gaa gga ccc 1660Phe Ala Gly Ser Asp Cys Gly Ser Pro Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro495 500 505cct cga agc tat ctc cgc cag tgg gtg gtc agg acc cct cca cct gtg 1708Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Val510 515 520gac agt gga gcc cag agc agc tagcat 1735Asp Ser Gly Ala Gln Ser Ser525<210>85
<211>529<212>PRT<213>Mus musculus<400>85Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly1 5 10 15Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr20 25 30Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser35 40 45Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe50 55 60Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr65 70 75 80Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val85 90 95Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe100 105 110Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val115 120 125Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu130 135 140Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr145 150 155 160Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile165 170 175Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys180 185 190Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr195 200 205Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln210 215 220Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu225 230 235 240Leu Leu Ala Val Leu Ile Ile Val Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile245 250255His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr260 265 270Pro Glu Ser Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe275 280 285Lys Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val290295 300Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro305 310 315 320Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu325 330 335Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu340 345 350Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro355 360 365Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly370 375 380Leu Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met385 390 395 400Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu405 410 415Leu Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser420 425 430Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg435 440 445Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg450 455 460Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro465 470 475 480Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys485 490 495Gly Ser Pro Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg500 505 510Gln Trp Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser515 520 525Ser<210>86<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC3424<400>86aacagctatg accatg 16<210>87<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC694<400>87taatacgact cactataggg 20<210>88<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24399<400>88agcggtctca gcctacagtg 20<210>89<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24400<400>89tgagctgggg acaacaaggt 20<210>90<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24806<400>90tgacgaaccc tccaactacg 20<210>91<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC24807<400>91tgctctcagc caggacaaag 20
权利要求
1.编码zalpha11多肽的分离多核苷酸,其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸残基序列(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列,其中氨基酸同一性百分比是使用FASTA程序进行测定的,其中ktup=1,缺口开放罚分=10,缺口延伸罚分=1,取代矩阵=BLOSUM62,其它参数为缺省值。
2.包含选自下组的多核苷酸序列的分离多核苷酸(a)SEQ ID NO4中第1位核苷酸至第1614位核苷酸所示多核苷酸序列;(b)SEQ ID NO1中第126位核苷酸至第779位核苷酸所示多核苷酸序列;(c)SEQ ID NO1中第126位核苷酸至第833位核苷酸所示多核苷酸序列;(d)SEQ ID NO1中第834位核苷酸至第1682位核苷酸所示多核苷酸序列;(e)SEQ ID NO1中第126位核苷酸至第1682位核苷酸所示多核苷酸序列;和(f)SEQ ID NO1中第69位核苷酸至第1682位核苷酸所示多核苷酸序列。
3.权利要求1的分离多核苷酸,其中zalpha11多肽包含选自下组的氨基酸残基序列(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列。
4.权利要求3的分离多核苷酸,其中zalpha11多肽由选自下组的氨基酸序列组成(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列。
5.权利要求1的分离多核苷酸,其中所述多肽还包含WSWSX结构域。
6.权利要求1的分离多核苷酸,其中所述多肽还包含跨膜结构域。
7.权利要求6的分离多核苷酸,其中所述跨膜结构域由SEQ IDNO2的第238位(Leu)至第255位(Leu)残基组成。
8.权利要求1的分离多核苷酸,其中所述多肽还包含胞内结构域。
9.权利要求8的分离多核苷酸,其中所述胞内结构域含有SEQID NO2的第256位(Lys)至第538位(Ser)残基。
10.权利要求9的分离多核苷酸,其中所述胞内结构域还包含BoxI和BoxII位点。
11.权利要求1的分离多核苷酸,其中所述多肽还包含亲和标签。
12.包含下列可操作连接在一起的元件的表达载体转录启动子;编码zalpha11多肽的DNA片段,其中所述多肽具有SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和转录终止子,其中启动子与所述DNA片段可操作连接,而该DNA片段与转录终止子可操作连接。
13.权利要求12的表达载体,其中还包含与所述DNA片段可操作连接的分泌信号序列。
14.包含权利要求12的表达载体的培养细胞,其中所述细胞表达该DNA片段编码的多肽。
15.包含下列元件的表达载体转录启动子;编码zalpha11多肽的DNA片段,其中所述多肽具有SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;和转录终止子,其中启动子、DNA片段、和转录终止子是可操作连接的。
16.权利要求15的表达载体,其中还包含与所述DNA片段可操作连接的分泌信号序列。
17.权利要求15的表达载体,其中所述多肽还包含与该DNA片段可操作连接的跨膜结构域。
18.权利要求17的表达载体,其中所述跨膜结构域包含SEQ IDNO2的第238位(Leu)至第255位(Leu)残基。
19.权利要求15的表达载体,其中所述多肽还包含与该DNA片段可操作连接的胞内结构域。
20.权利要求19的表达载体,其中所述胞内结构域含有SEQ IDNO2的第256位(Lys)至第538位(Ser)残基。
21.导入了权利要求15的表达载体的培养细胞,其中所述细胞表达该DNA片段编码的可溶性受体多肽。
22.权利要求21的细胞,其中所述细胞的增殖依赖造血生长因子的外源供应。
23.编码融合蛋白的DNA构建物,该DNA构建物包含编码具有选自下组的氨基酸残基序列的多肽的第一种DNA片段(a)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第19位氨基酸(Gly)的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)的氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)的氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第238位氨基酸(Leu)至第255位氨基酸(Leu)的氨基酸序列;(e)SEQ ID NO2中第238位氨基酸(Leu)至第538位氨基酸(Ser)的氨基酸序列;(f)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)的氨基酸序列;和(g)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)的氨基酸序列;和至少另一种编码其它多肽的DNA片段,其中所述第一种和其它DNA片段以同一框架相连;且该第一种和其它DNA片段编码融合蛋白。
24.包含下列可操作连接在一起的元件的表达载体转录启动子;编码权利要求23的融合蛋白的DNA构建物;和转录终止子,其中启动子与DNA构建物可操作连接,而DNA构建物与转录终止子可操作连接。
25.包含权利要求24的表达载体的培养细胞,其中所述细胞表达DNA构建物编码的多肽。
26.产生融合蛋白的方法,包括培养权利要求25的细胞;和分离该细胞产生的多肽。
27.包含与选自下组的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸残基序列的分离多肽(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列,其中氨基酸同一性百分比是使用FASTA程序、且ktup=1、缺口开放罚分=10、缺口延伸罚分=1、取代矩阵=BLOSUM62、而其它参数为缺省值进行测定的。
28.权利要求27的分离多肽,其中所述多肽包含选自下组的氨基酸残基序列(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列。
29.权利要求27的分离多肽,其中所述氨基酸残基序列由选自下组的氨基酸残基序列组成(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;(b)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第255位氨基酸(Leu)所示氨基酸序列;(c)SEQ ID NO2中第256位氨基酸(Lys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;(d)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列;和(e)SEQ ID NO2中第1位氨基酸(Met)至第538位氨基酸(Ser)所示氨基酸序列。
30.权利要求27的分离多肽,其中所述多肽还包含WSXWS基元。
31.权利要求27的分离多肽,其中所述多肽还包含跨膜结构域。
32.权利要求31的分离多肽,其中所述跨膜结构域含有SEQ IDNO2的第238位(Leu)至第255位(Leu)残基。
33.权利要求27的分离多肽,其中所述多肽还包含胞内结构域。
34.权利要求33的分离多肽,其中所述胞内结构域包含SEQ IDNO2的第256位(Lys)至第538位(Ser)残基。
35.权利要求34的分离多肽,其中所述胞内结构域还包含BoxI和BoxII位点。
36.产生zalpha11多肽的方法,包括培养权利要求15的细胞;和分离该细胞产生的zalpha11多肽。
37.包含选自下组的氨基酸序列的分离多肽(a)SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列;且其中该多肽基本上不含通常与造血受体有关的跨膜和胞内结构域。
38.权利要求37的多肽,其中还包含亲和标签。
39.产生zalpha11多肽的方法,包括培养权利要求21的细胞;和分离该细胞产生的zalpha11多肽。
40.产生针对zalpha11多肽的抗体的方法,包括用选自下组的多肽接种动物(a)由9至519个氨基酸组成的多肽,其中所述多肽含有SEQ IDNO2中第20位氨基酸(Cys)至第538位氨基酸(Ser)的连续氨基酸序列;(b)含有SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)的氨基酸序列的多肽;(c)含有SEQ ID NO2中第101位氨基酸(Leu)至第122位氨基酸(Gly)的氨基酸序列的多肽;(d)含有SEQ ID NO2中第141位氨基酸(Asn)至第174位氨基酸(Ala)的氨基酸序列的多肽;(e)含有SEQ ID NO2中第193位氨基酸(Cys)至第261位氨基酸(Val)的氨基酸序列的多肽;(f)含有SEQ ID NO2中第51位氨基酸(Trp)至第61位氨基酸(Glu)的氨基酸序列的多肽;(g)含有SEQ ID NO2中第136位氨基酸(Ile)至第143位氨基酸(Glu)的氨基酸序列的多肽;(h)含有SEQ ID NO2中第187位氨基酸(Pro)至第195位氨基酸(Ser)的氨基酸序列的多肽;(i)含有SEQ ID NO2中第223位氨基酸(Phe)至第232位氨基酸(Glu)的氨基酸序列的多肽;和(j)含有SEQ ID NO2中第360位氨基酸(Glu)至第368位氨基酸(Asp)的氨基酸序列的多肽;且其中多肽在动物体内引发免疫应答产生抗体;并由动物分离抗体。
41.通过权利要求40的方法产生的、可特异结合zalpha11多肽的抗体。
42.权利要求41的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
43.可特异结合权利要求27的多肽的抗体。
44.检测待测样品中zalpha11蛋白质活性调节剂的存在情况的方法,包括培养导入了权利要求15的表达载体的细胞,其中所述细胞在待测样品存在和不存在时表达DNA片段编码的zalpha11蛋白质;并通过生物学或生物化学实验比较在待测样品存在和不存在时zalpha11的活性水平;并由比较结果确定待测样品中zalpha11活性调节剂的存在情况。
45.用于检测待测样品中zalpha11受体配基的方法,包括将待测样品与包含SEQ ID NO2中第20位氨基酸(Cys)至第237位氨基酸(His)所示氨基酸序列的多肽接触;并检测多肽与样品中配基的结合。
46.权利要求45的方法,其中所述多肽还包含跨膜和胞内结构域。
47.权利要求45的方法,其中所述多肽在培养细胞中是膜结合的,而且检测步骤包括测量培养细胞中的生物学应答。
48.权利要求47的方法,其中生物学应答是细胞增殖或报导基因的转录激活。
49.权利要求45的方法,其中多肽被固定在固体支持物上。
全文摘要
此处公开了新的细胞因子受体zalphall的新多肽、编码该多肽的多核苷酸、及相关组合物和方法。该多肽可以在体外和体内的方法中用于检测刺激造血细胞、淋巴样细胞、和髓样细胞增殖和/或发育的配基。结合配基的受体多肽还可以用于在体外和体内阻断配基活性。编码zalphall的多核苷酸位于第16号染色体,可以用于鉴定与人类疾病状况有关的基因组区域。本发明还包括用于产生所述蛋白质的方法及其使用和抗体。
文档编号C07K14/715GK1344320SQ99813533
公开日2002年4月10日 申请日期1999年9月23日 优先权日1998年9月23日
发明者S·R·普莱斯耐尔, D·C·康克林, J·E·诺瓦克, A·K·哈蒙德 申请人:津莫吉尼蒂克斯公司
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