专利名称：用于产生特定类型细胞的代表性单克隆抗体的组合物及方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域。具体地，本发明涉及能与特定细胞类型的代表性抗原、尤其是细胞表面抗原相结合的单克隆抗体群的产生。本发明包括的组合物和方法特别适合用以分离组织选择性、亚组织选择性或细胞类型特异性的单克隆抗体。
背景技术：
细胞表面抗原(CSAs)是锚定在细胞质膜上的分子。细胞表面抗原由蛋白、糖蛋白、多糖和胆质的大家族组成，它们不仅是细胞质膜的结构成分，而且更重要的是它们是多种生物学功能的调节因子。已经鉴定、克隆了许多种CSA，并发现它们在由外部刺激，如在多种细胞应答中达到极点的生长因子和激素引发的信号转导中起着重要作用。其中包括细胞分裂、分化、凋亡和游动性。细胞表面抗原如受体，尤其是粘附蛋白的缺陷可导致多种疾病的发生，包括多种癌症、血管疾病和神经元疾病。
特定细胞类型的细胞表面抗原的鉴定往往要先产生与该细胞类型中存在的抗原有反应性的单抗隆抗体，紧接着利用相应的单克隆抗体通过免疫亲合作用进行表面抗原的纯化。用作制备单克隆抗体库的传统免疫原包括在含血清的培养基中增殖的特定细胞类型的膜提取物或完整细胞。上述任何一种免疫原都不会必然产生可与特定细胞类型代表性的抗原特异结合的单克隆抗体群，也未被优化以产生可与天然构型的抗原相结合的单克隆抗体。表面抗原的提取涉及去污剂或其它有机溶剂的使用，已知它们可使质膜双层解离，因而使表面抗原与其天然环境分离开。培养用作免疫原的细胞时添加血清也具有很多重大缺点。
血清是由许多作用不明确的大、小生物分子组成的极复杂的混合物。对大多数细胞来说，血清并不是它们在所来源的最初组织中接触到的生理性液体。在体内，一个细胞可能在涉及组织损伤和血液凝固的特殊情况下才会接触到血清。在体外，血清中存在的各种激素和生长因子可以刺激细胞的过度生长和/或终末分化，伴随有细胞表面抗原、分泌型蛋白、胞桨或核蛋白的表达改变。血清因子的复杂组合也可抑制特定细胞类型的生长和/或分化，引起细胞形态和活力的改变。此外，已知许多血清生物分子可以粘附到细胞表面。这些生物分子包括但不限于转运蛋白(例如白蛋白)、附着和铺展因子(例如胶原和纤连蛋白)和各种血清脂质。这些外部分子吸附到细胞表面不仅会导致产生可与该特定细胞类型中的非代表性分子发生交叉反应的抗体，而且还会掩盖天然抗原的呈递，因而进一步降低所生成的单克隆抗体群的“代表性”。
因此，相当有必要寻找适当的组合物和方法，用来产生能与特定细胞类型上代表性的抗原特异结合的单克隆抗体。这些单克隆抗体的生产将极大地促进新抗原的鉴定和特定细胞类型上存在的细胞表面抗原组合的阐明。本发明满足这些需要并同时具备相关的优点。
发明概述本发明的主要方面是产生能同代表特定细胞类型的抗原相结合的单克隆抗体群的技术设计。此抗体生产技术能使同特定细胞类型表面不存在的抗原交叉反应的非代表性抗体的产生降到最低程度，同时使抗原尤其是表面抗原最大程度地保持完整，以产生同特定细胞类型的天然抗原结合的多种单克隆抗体。此方法产生的独特候选抗体库能识别在某些机体组织中选择性表达(组织选择性)的、定位于这些组织的特定区域(亚组织选择)或特定细胞层(细胞类型特异性)的抗原。
所以，本发明提供了一种免疫宿主哺乳动物以产生和对该宿主哺乳动物异源的代表特定细胞类型的抗原相结合的单克隆抗体的方法。此方法包括将所述细胞类型的大量完整活细胞导入哺乳动物体内，其中细胞表面无血清。
一方面，用于免疫宿主哺乳动物的细胞是在无血清的培养基中培养的。另一方面，用于免疫的细胞是以单层或聚集体的形式生长的。再另一方面，细胞是生长在生物学或非生物学基质上的，其中的生物学基质选自胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和聚赖氨酸；非生物学基质选自硝酸纤维素、尼龙和聚四氟乙烯膜。
另一方面，用于免疫的细胞可以是胚胎细胞也可以是成年个体细胞。另一方面，细胞可以来源于外胚层、中胚层或内胚层。在一个优选的实施方案中，细胞选自ASC、ESC、ROG、BUD、RED、NODD、BR516、RL-65或NEP细胞。
本发明还提供了一种产生同特定细胞类型的表面抗原相结合的单克隆抗体的方法。此方法包括(a)用同宿主哺乳动物异源的特定细胞类型的大量完整活细胞免疫宿主动物，其中所用细胞表面无血清；(b)将被免疫的动物的淋巴样细胞同无限增殖化细胞系融合产生可生产单克隆抗体的杂交瘤；(c)在有利于单克隆抗体分泌的条件下培养杂交瘤；和(d)选择能分泌同用来免疫的完整活细胞上存在的表面抗原结合的单克隆抗体的杂交瘤。一方面，杂交瘤的选择可以通过免疫测定方法如ELISA或免疫印迹法的来实现。另一方面，杂交瘤的选择可以通过细胞分选过程如FACS来实现。
本发明包括通过上述方法获得的杂交瘤群和单克隆抗体群。在一方面，此法获得的单克隆抗体特异性地结合细胞表面抗原的胞外域。
本发明还提供如下单克隆抗体群，其与血清生物分子无实质的免疫反应性，且其中至少含有一种与组织选择性、亚组织选性或细胞类型特异性的抗原反应的抗体。
本发明进一步提供一种确定特定细胞类型表面上存在的抗原组合的方法，其含有如下步骤(a)用同宿主哺乳动物异源的特定细胞类型的完整活细胞免疫哺乳动物，其中所述细胞表面无血清；(b)将被免疫动物的淋巴样细胞同无限增殖化细胞系融合，产生能生产单克隆抗体的杂交瘤；(c)在利于单克隆抗体分泌的条件下培养该杂交瘤；(d)选择能产生与(a)的完整活细胞上存在的细胞表面抗原结合的单克隆抗体的杂交瘤；和(e)鉴定单克隆抗体结合的抗原，由此确定所述特定细胞类型上存在的细胞表面抗原组合。
在一方面，对相应抗原的鉴定还涉及从特定细胞类型中获得cDNA，以至少高于相应内源性抗原表达水平(如果存在的话)五倍的水平在第二种细胞中表达该cDNA，筛选特异性结合上述(d)中选择出的杂交瘤所产生的单克隆抗体的第二种细胞类型细胞。
附图简述
图1是从BUD和RED细胞制备的细胞裂解物的免疫印迹，所用的抗体针对已知在胰腺发育早期表达的蛋白。大约100μg蛋白在4-20％SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶上分离，用小鼠单克隆抗人细胞角蛋白7(1/500)、兔多克隆抗大鼠PDX1(1/500)、兔多克隆抗牛羧肽酶A(1/500)或者兔多克隆抗大鼠酪氨酸羟化酶(1/1000)抗体进行免疫印迹。
图2(A)说明用单克隆抗体(MABs)2160(红色)、2161(蓝色)和2115(橙色)分析BUD、TR-1、RIN-F和ASC细胞的FACS结果。对照(绿色)组没有第二抗体。还显示了用MAbs 2160、2161和2115对BUD(B)和TR-1(C)细胞进行的免疫荧光染色。
图3说明Ag2101、PDX1和Ag2160沿大鼠胚胎肠管的免疫定位。12天的大鼠胚胎冰冻切片用MAb2101染色。箭头指示胰芽中的染色(A1-2)。还显示了用兔多克隆抗大鼠PDX1(B1-2)和MAb2160(C1-2)对解剖的12.5天大鼠胚胎内脏进行的染色。
图4说明用MAbs2117(A)、2160(B)、2161(C)和2115(D)对18天大鼠胚胎鼻毛的冰冻切片进行染色的结果。注意，尽管此结构可以被全部四种抗体识别，但每种单克隆抗体染色鼻毛内不同的细胞亚群。
图5(A-E)说明用MAb2160对9、10、12、15或18天的大鼠胚胎的冰冻切片进行染色的结果。对MAb2160在鼻毛、嗅上皮(OE)、耳(E)、下颌下腺、咽、肺(L)、胰腺(P)、肠(I)、膀胱和直肠(R)的上皮细胞中的染色进行观察。较高的放大倍数显示e20大鼠胚胎耳(F)、直肠(e18)(G)和成年胰脏(H)的染色。在(H)中，在导管上皮细胞而不是在胰岛细胞中检测到MAb2160的染色。
图6的A组呈现Ag2160的完整DNA序列和推导出的氨基酸序列。核苷酸编号在序列的右侧显示，氨基酸编号在序列的左侧显示。预测的序列显示了可能的信号肽(黑色下划线)、2个潜在的N-连接的糖基化位点(灰色下划线)、和单个的23个氨基酸的跨膜区(灰框)。B组是推导出的氨基酸顺序的Kyte-Doolittle图。也指出了推测出的起始和终止密码子。下划线的部分是推测出的疏水信号肽和疏水跨膜域。C组是Ag2160的同系物mEGP、hEGP-2、hEGP-1的序列对比。疏水信号肽和疏水跨膜域有下划线。该蛋白序列与I型甲状腺球蛋白序列重复(框起来的)作了对比。保守的半胱氨酸残基为粗体的形式，并指明了高度保守的区域。D组是显示Ag2160 mRNA的组织分布的Northern印迹图。
图7的A组显示MAb216对BUD细胞生长的抑制作用。BUD细胞在加入0-100μg/ml MAb2160(黑色，圆圈)或无关Ab(白色，三角)(A)的情况下培养5天。在第五天，测定细胞数和细胞体积。B组显示融合蛋白P2160对BUD细胞生长的抑制作用。细胞在有或无0-100μg/mlP2160(黑色，圆圈)或一种带HIS-6标签的无关融合蛋白(白色，三角)的情况下培养，分析的方法与A相同。每个值代表3(A)或2(B)个独立实验的均数±SEM，每个实验做三次重复**P＜0.01；***P＜0.001。C组显示从用MAb2160(10μg/ml)或P2160(10μg/ml)处理的BUD制备细胞的免疫沉淀物的免疫印迹结果。处理2小时后，裂解BUD细胞，用抗磷酸-Ser/Thr/Tyr(anti-Phospho-Ser/Thr/Tyr)(IP P-Ser/Thr/Tyr)抗体或MAb2160(IP Ag2160)对其进行免疫沉淀。抗P-Ser/Thr/Tyr的免疫沉淀物中的蛋白用MAb2160进行印迹(左侧组)，抗MAb2160免疫沉淀物的蛋白用抗P-Ser/Thr/Tyr抗体进行印迹。
图8显示9、10、12、15或18天的大鼠胚胎的冰冻切片用MAb2117进行的染色的结果。
图9显示成年大鼠冰冻切片的MAb2117染色。
图10显示由MAb2117识别的Ag2117的部分cDNA克隆。
图11是显示Ag2117 mRNA组织分布的Northern印迹图。
实施本发明的方式在进行此发明的全过程中，参考了各种出版物、专利和公开的专利说明书，这些都作了明确的引用。这些出版物、专利和公开的专利说明书所公开的内容引入本文作为参考，以便更充分地说明此发明所涉及的现有技术。定义除非另有说明，本发明所使用的是本领域已知的常规免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和DNA重组技术。参照例如Sambrook等的分子克隆实验室手册(Molecular CloningA LaboratoryManual)第二版(1989)；当代分子生物学实验指南(Current Protocolsin Molecular Biology)(F.M.Ausubel，等(1987))；系列从书“酶学方法(Methods in Enzymology)”(Academic Press，Inc.)PCR2实用方法(PCR2A Practical Approach)(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Tayler编(1995))，抗体实验室手册(Antibodies，ALaboratory Manual)(Harlow和Lane编(1988))和动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney编(1987))。
在说明书和权利要求书中所使用的单数形式包括复数的含义，除非上下文中另有清楚的说明。如术语“细胞”包括大量细胞，包括其混合物。
此文所用术语“抗体”指一种多肽或一组至少包含一个抗体结合部位的多肽。“抗体结合部位”或“结合域”是由抗体分子的可变域折叠而形成的，这种折叠形成其内表面形状及电荷分布与抗原表位的这些特征互补的三维结合空间，这使得可同抗原发生免疫反应。抗体结合部位可来源于重链和/或轻链的域(分别称VH和VL)，形成有助于抗原结合的高变环。术语“抗体”包括例如脊椎动物抗体、杂合抗体、嵌合抗体、改变了的抗体、单价抗体、Fab蛋白和单域抗体。
本文所用术语“单克隆抗体”指具有基本上均一的抗体群的抗体组合物。这并非是要限定该抗体的来源或产生方式。单克隆抗体是高度特异的，并针对单一的抗原部位。传统的(多克隆)抗体制品典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，与此相比，每一种单克隆抗体都指向抗原的单个决定簇。
“单克隆抗体群”是指多种异质的单克隆抗体，即组成该群体的单个单克隆抗体可识别相互不同的抗原决定簇。
抗体与抗原“特异地结合”是指它同此种抗原结合的亲合力大于它同其它参照抗原包括多肽或其它物质的亲合力。
本文中“抗原”是指可被抗体特异性地识别和结合的物质。抗原可包括肽、蛋白、糖蛋白、多糖和脂质；它们的部分和其组合。
“免疫原”一词是本领域技术人员熟知的。它是在注入适当宿主(通常是哺物动物)体内之后能刺激抗体产生的抗原。通过本领域熟知的许多技术可使化合物具备免疫原性，这些技术包括与载体交联或结合以增加效价、与有丝分裂原混合以增强免疫应答和与佐剂联合以增强抗原呈递作用等。
本文中“表面抗原”是指细胞的质膜成份。这包括构成质膜的整合膜蛋白和外周膜蛋白、糖蛋白、多糖和脂质。“整合膜蛋白”指穿过细胞质膜脂质双层的跨膜蛋白。典型的整合膜蛋白包含至少一个通常由疏水氨基酸残基组成的“跨膜片段”。外周膜蛋白不延伸到脂双层的疏水内部中，它们只通过与其它膜蛋白的非共价相互作用结合在细胞膜表面。
细胞或多肽的“免疫反应性”是指细胞或多肽特异地同本发明中的抗体结合的能力。“免疫反应性”一词用于单克隆抗体群时是指抗体群特异性地同代表特定类型细胞的抗原结合。
针对用于免疫的细胞而言，术语“异源的”是指细胞来源于与受体基因型不同的实体。例如，异源细胞可来源于与受体不同的种(species)或同一个种的不同个体。来源于某一个种某一个体的胚胎细胞与同一个种的成年个体间存在异源性。
如果一个细胞来源于胚胎的三个胚层外胚层、内胚层或中胚层之一，则分别称此细胞为“外胚层”、“内胚层”或“中胚层”来源的。外胚层是产生表皮细胞和神经系统的外层。内胚层是胚胎的内层，产生消化管及其相关器官的内壁，这些器官包括但不限于胰腺和肝脏。中胚层产生几个器官(包括但不限于心脏、肾脏、性腺)、结缔组织(如骨、肌肉、肌腱)和血细胞。
术语“培养基”和“细胞培养基”可替换使用。此术语是指脊柱动物细胞在培养的过程中生长的液体环境。培养基包括理化、营养和激素环境。当细胞培养基中基本上没有哺乳动物来源的血清(如胎牛、马、人、兔的血清)时，该培养基称为“无血清”培养基。“基本上没有”的含义是细胞培养基中包含约0-5％的血清，优选约0-1％的血清，最优选约0-0.1％的血清。
“已知成分培养基”是指含有细胞生存和/或生长所必需的营养和激素成份的培养基，因而该培养基的成分是已知的。通常情况下，已知成分培养基通过加入细胞生存和/或生长所需的营养和生长因子来配制。典型的已知成分培养基至少提供来自下列一种或多种类别物质的一种成分(a)所有的必需氨基酸，通常是20种基本氨基酸加胱氨酸；b)能量来源，通常是碳水化合物的形式如葡萄糖；c)维生素和/或其它低浓度的必需有机化合物；d)游离脂肪酸；和e)痕量元素，痕量元素是指典型地只需要极低浓度的无机化合物或天然存在的元素，通常在微摩尔范围内。已知成分培养基也可任选地添加如下某种类中的一种或多种成分a)一种或多种促有丝分裂剂；b)盐和缓冲剂，如钙、镁和磷酸盐；c)核苷和碱基，如腺苷和胸腺嘧啶核苷，次黄嘌呤；和d)蛋白和组织水解物。
“促有丝分裂剂”或“生长因子”是指刺激哺乳动物细胞有丝分裂的分子。通常，促有丝分裂剂或生长因子能促进培养中的哺乳动物细胞的存活和增殖，且是多肽。促有丝分裂多肽可以是不论何种方法产生(如，可以通过内源途径分离产生，也可以通过合成技术包括重组技术来产生)的“天然的”、或者是“天然序列”的多肽(即，具有天然生长因子的氨基酸序列)，也可以是它们的变体或突变体(见如下的定义)。优选促有丝分裂多肽与人体来源的生长因子或其片断有同样的氨基酸序列。非限定性的例子包括erbB受体家族一个或多个成员的激活剂；提高培养基中cAMP水平的物质(如毛喉素、霍乱毒素、cAMP或其类似物)；粘附分子如神经细胞粘附分子(N-CAM)，层粘连蛋白或纤连蛋白；孕酮；神经营养因子如骨源神经营养因子(BDNF)和睫状神经营养因子(CNTF)；神经营养蛋白3、4、5或6(NT-3、NF-4、NT-5或NT-6)；或神经生长因子如NGF-β；血小板来源的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如酸性FGF(aFGF)和碱性FGF(bFGF)；血管内皮生长因子(VEGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子，包括IGF-I、IGF-II和des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；和激素如雌激素、睾酮、甲状腺激素、胰岛素和任何列在Mather，J.P.和Roberts，P.E.(1998)编写、纽约Plenum出版社出版的“细胞和组织培养介绍(Introduction to Cell and TissueCulture)”一书中138-139页表8.2上的促有丝分裂剂。
“实验对象”或“个体”在这里可以通用，指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于兔、鼠科动物、类人猿、人、农用动物、用于体育活动的动物和宠物。免疫原的准备建立无血清细胞培养物本发明所用免疫原由基本上均一的活的完整的哺乳动物细胞组成，该细胞表面无血清存在。任何能培养生长的哺乳动物细胞都可用作候选免疫原。适于体外培养的细胞可以来源于胚胎或成年组织，正常或肿瘤组织，以及发育上来源于外胚层、内胚层或中胚层的组织。能培养生长的特定细胞类型的非限制性例子包括结缔组织成份如成纤维细胞、骨骼组织(骨和软骨)、骨骼肌、心肌、平滑机、上皮组织(如肝、肺、乳腺、皮肤、膀胱和肾)、神经细胞(神经胶质和神经元)、内分泌细胞(肾上腺、垂体、胰岛细胞)、黑色素细胞和许多不同类型的造血细胞。培养细胞可以是从机体组织新分离的(称为原代培养物)，也可以是通过原代培养细胞的扩增和/或克隆传代培养的(称细胞系)。
为保证细胞表面无血清存在，典型地，将细胞培养在无血清但添加了特定细胞类型存活和/或生长所需的激素、生长因子或任何其它因子的已知成分培养基中。尽管维持细胞生存的已知成分培养基保持了细胞的活力、形态、代谢能力和潜在的细胞分化能力，但促进细胞生长的已知成分培养基提供了细胞增殖或繁殖所需的所有化学物质。控制哺乳动物细胞体外生存和生长的常规参数是本领域已知的。在不同的细胞培养体系中可以控制的理化参数是如pH、pO2、温度和渗透压。为优化培养环境，细胞的营养需要通常是在开发成提供最佳环境的标准培养基配方中提供。营养物质可以分成几类氨基酸和它们的衍生物、碳水化合物、糖、脂肪酸、复杂脂质、核酸衍生物和维生素。除了维持细胞代谢的营养物质，大部分细胞还需要来自至少下列一类的一种或多种激素类固醇类、前列腺素类、生长因子、垂体激素和在无血清培养基中促进增殖的肽类激素(Suto，G.H.等“激素已知的培养基中细胞的生长(Growth of Cells in Hormonally DefinedMedia)”，Cold Sprag Harbor Press，N.Y.，1982)。除激素之外，细胞的体外存活和生长可能还需转运蛋白，例如转铁蛋白(血浆铁转运蛋白)、血浆铜蓝蛋白(一种铜转运蛋白)和高密度脂蛋白(脂质载体)。最佳激素或转运蛋白的选择根据每种细胞类型的不同而改变。这些激素或转运蛋白大部分需要外源加入，在极少情况下，发现突变细胞系不需要加入任何特殊因子。
用于特定细胞类型的已知成分培养基的配制一般通过本领域熟知的三种方法进行。第一种方法涉及在基础营养培养基中添加充当血清作用的各种生物分子细胞特异性和非细胞特异性的激素如促有丝分裂剂、转运蛋白、附着和铺展因子(Barnes，D.和Sato，G.(1980)分析生物化学(Anal.Biochem.)，102255)。商业上供应各种基础营养培养基。这些基本培养基的非限制性例子包括F12/DME、Ham’s F10(Sigma)、最低基本培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)(DMEM，Sigma)和Iscove氏改良Eagle培养基(Iscove’sModified Eagle’s Medium)(IMDM)。此外，Ham和Wallace(1979)酶学方法(Meth.Enz.)5844，Barnes和Sato(1980)分析生物化学102255或者Mather，J.P.和Roberts，P.E.(1998)的“细胞和组织培养介绍”(纽约Plenum出版社)描写的任何基础培养基都可使用。
添加生物分子例如尤其是多肽因子的试验最好是分步进行，在已知生长刺激因子存在的情况下试验新多肽因子。在某些情况下这样做是必要的，因为多肽因子的作用很少是简单地相加。或者，一些多肽因子单独使用时能维持细胞的生存或刺激其生长，但共同使用时其作用被抵消或变为抑制性。通常，细胞在无血清培养基中的最佳生长需要胰岛素和转铁蛋白。这两种因子须首先经过试验。大部分细胞系还需要一种或多种生长因子。这些因子包括但不限于上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、胰岛素样生长因子I和II(IGFI，IGFII)、神经生长因子(NGF)、heregulin、神经调节蛋白、转化生长因子(TGFs)、血小板来源的生长因子(PDGFs)、白细胞介素(ILs)和其它造血细胞生长因子。
配制适于培养特定细胞类型的已知成分培养基的第二种方法是对已存在的营养培养基进行如下重新配制首先降低血清浓度，直至细胞生长受限，然后再调整营养培养基中每个成份的浓度直至细胞生长恢复(Ham，R.G.和McKeehan，W.L.(1979)学术出版社(AcademicPress)，5344；Ham，R.G.(1981)实验药理学手册(Handbook ofExperimental Pharmacology)，5713)。通过以上两种技术，来自胚胎或成年个体器官、正常或肿瘤组织、外胚层、中胚层或内胚层来源的细胞的许多哺乳动物细胞系都已在无血清培养基中建立。Freshney，R.I.(1986)“实用动物细胞培养方法(Animal CellCulture，A Practical Approach)”(IRL出版社)总结了44种细胞无血清培养的培养基条件，这些细胞有包括成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、造血细胞、淋巴样细胞的非转化细胞以及来源于多种癌、腺癌和成神经细胞瘤的转化细胞。Sato，G.H.等(1982)在“激素已知的培养基中细胞的生长(Growth of Cells in Hormonally DefinedMedia)”中详述了在无血清培养基中培养内分泌、外分泌、乳腺、神经或生殖道来源的细胞的方法。
因为如果细胞类型相同，则为一种细胞类型设计的培养基一般情况下可以支持其它细胞系和独立来源的原代培养物的生长(Li，R.H.等(1996)，神经科学方法杂志(J.Nerosci.Methods)，6757-69；Li，R.H.等(1996)，神经科学杂志(J.Neroscience)16(6)2012-2019；Levi，A.D.D.等(1997)实验神经病学(ExperimentalNeurology)14325-36)，所以，另一种已经建立好的方法涉及试验与已经发现可以支持相似细胞类型存活和/或生长的培养基最密切相关的已知成分培养基。各种类型细胞所需营养和激素条件的大量信息极大地促进了技术人员对适合任一给定细胞生存、生长所需的一整套培养基条件的探寻。在建立无血清细胞培养物时，前述的任何方法或由此调整后的方法都可以单独或以任何组合来使用。
据此，本发明提供了在无血清培养基中建立的各种细胞系，它们随后作为免疫原用于产生识别代表这些细胞系的抗原的抗体。在一个实施方案中，本发明提供了来源于鼠脊神经节的胚胎神经膜细胞(ESC)和成年神经膜细胞(ASC)(美国专利5721139；美国专利5714385；Li，R(1997)，内分泌学(Endocrinology)，1382648-2657)。在另一个实施方案中，本发明提供从解剖的大鼠e12胚胎胰芽(BUD)和大鼠e17导管上皮(RED)的原代培养物中建立的两株胰上皮细胞系。在另一个实施方案中，本发明还提供了大鼠肺支气管上皮细胞如RL-65细胞系。在另一个实施方案中，本发明还提供来源于鼠卵泡的未分化的颗粒细胞系(ROG)。在另一个实施方案中，本发明还提供新生儿肺上皮细胞系BR516、鼠早期胚胎(9天)神经上皮细胞系NEP和来源于非肥胖型糖尿病小鼠胰导管上皮细胞的细胞系NODD。产生RL-65、ROG、BR516、NEP细胞的方法描述于美国专利5,364,785；Li，R.等(1997)内分泌学，138(7)2648-2657；Roberts，P.E.(1992)动物细胞技术基础和应用方面(Animal Cell Techologybasic and appliedAspects)335-341；Roberts，P.E.(1990)美国生理学杂志(Am.J.physiol)，3L415-L425；和Li，R.H.等(1996)内分泌(Endocrine)5205-217，这些文献引入本文作为参考。在无血清培养基中建立NODD细胞的方法基本与本文叙述的建立RED所使用的方法相同(参见实施例1)。细胞活力的维持本发明中的免疫原为活的完整细胞。活细胞能够锚定在固相基质(substrate)中以单层形式生长或在悬浮培养中以聚集体(aggregate)的形式生长。基质的选择大体上根据细胞类型决定。大部分细胞可以在由玻璃、塑料或陶器材料制成的基质上增殖。对某些细胞类型如神经、上皮和肌肉细胞，基质优选预先用促进细胞附着和铺展的带电荷物质包被。通常使用的包被材料包括带净正电荷的生物学基质。生物学基质的非限定性的例子包括细胞外基质/粘附蛋白如层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原，或合成多肽如聚赖氨酸。各种非生物学基质如硝酸纤维素、尼龙、聚四氟乙烯或任何其它植入材料也可用于支持无血清培养基中细胞的生长。
收获培养于不同基质上的细胞时要注意维持细胞膜的完整性，保存细胞膜的成分。传统方法解离锚定细胞或细胞层用象丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶这样的强力蛋白水解酶，与此不同，本发明的细胞免疫原典型地使用最低程度损伤细胞表面抗原的物质从培养基质上解离。这些物质包括螯合剂如EDTA和EGTA，它们结合细胞和基质粘附所必需的二价金属离子(例如钙和镁)。其它的适宜细胞解离剂包括胶原酶、分散酶和中性蛋白酶，这些解离剂与丝氨酸蛋白酶抑制剂(如大豆胰蛋白酶抑制剂)结合使用。用这些解离剂处理细胞通常导致细胞外基质成分瓦解，细胞表面蛋白得以保存。解离锚定于固体基质上的细胞需要的时间依所选蛋白酶的不同而不同，但正常情况下为约3到30分钟，优选约5到15分钟。酶处理温度可以是室温或37℃左右。过量的酶用pH和盐浓度在生理范围内的、本领域技术人员常规制备的缓冲液轻轻冲洗除去。
在免疫之前，细胞活力可以通过膜完整性测定来确定。评价膜完整性的方法是本领域熟知的。最常用的方法是用一种与活或死细胞反应的染料对细胞染色。本领域技术人员将了解，染料的例子包括台盼兰、伊红Y、萘黑、尼格罗黑、藻红B和固绿。
需要时，免疫原可以与佐剂混合以增强宿主的免疫应答。适合的佐剂有氢氧化铝，明矾，QS-21(美国专利5,057,540)，DHEA(美国专利5,407,684和5,077,284)包括它的前体和修饰形式(如DHEA-S，DHEA的磺化形式)，β-2微球蛋白(WO 91/16924)，胞壁酰二肽，胞壁酰三肽(美国专利5,171,568)和单磷酰脂质A(monophosphryl lipidA)(美国专利4,436,728；WO 92/16231)和它的衍生物，例如DetoxTM和BCG(美国专利4,726,947)。其它适合的佐剂包括但不限于弗氏佐剂、铝盐、角鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽(MDP)、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制品、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈和其衍生物和免疫刺激复合物(ISCOM)如那些在Takahashi等(1990)自然(Nature)344873-875中论述的。优选的佐剂是Ribi Immunochem Research公司生产的Ribi佐剂系统。免疫和杂交瘤的产生宿主动物免疫的途径和程序通常采用已建立的常规抗体刺激和生产方法。
为鼠被用做实验模型时，可以考虑，依照本发明的方法，可操作包括人在内的任何哺乳动物实验对象或来自它们的抗体生产细胞作为产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的基础。典型的方法是向宿主动物的腹膜内接种免疫原性量的细胞，再用类似量的免疫原加强免疫。或者，非生物膜基质上生长的细胞也可以通过外科手术的方法经腹膜内途径植入宿主动物体内。在最后一次加强免疫的几天后收集淋巴样细胞、优选来自宿主脾脏的淋巴样细胞，并由此制备细胞悬浮液，以备融合过程中使用。
用普通的体细胞杂交瘤技术(见Kohler，B.和Milstein，C.(1975)自然256495-497，由Buck，D.W.，等，(1982)修改，In Vitro，18377-381)制备来源于淋巴细胞和无限增殖化骨髓瘤细胞的杂交瘤。可利用的骨髓瘤细胞系包括但不限于X63-Ag8.653和那些来源于美国圣地亚哥细胞分散中心Salk研究所(Salk Institute，CellDistribution Center，San Diego，Calif.，USA)的骨髓瘤细胞系。大体上，该技术涉及用融合剂如聚乙二醇或本领域技术人员熟知的电学方法融合淋巴样细胞和骨髓瘤细胞。融合后，细胞从融合培养基中分离出来，然后在选择性生长培养基如HAT培养基中培养，以除去未杂交的亲代细胞。这里介绍的任何加入或未加入血清的培养基都能用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。细胞融合的另一种替代方法是，使用EBV无限增殖化B细胞生产本发明的单克隆抗体。如需要，将杂交瘤扩增和亚克隆，并通过常规的免疫分析方法(如放射免疫方法、酶联免疫法或荧光免疫方法)检测培养上清是否存在抗免疫原活性。
本发明的杂交瘤包括产生免疫所用细胞类型代表性抗原的特异性单克隆抗体的亲代杂交瘤所有衍生物、后代细胞。
产生这些抗体的杂交瘤可以用已知的方法体内或体外生长。如果需要，可通过常规的免疫球蛋白纯化方法如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析和超滤方法，从培养基或体液中分离单克隆抗体。如果存在不想要的活性，可以将该制品通过由连接在固相上的免疫原制成的吸附剂，然后从免疫原上洗脱或释放所需要的抗体来除去所述不想要的活性。单克隆抗体的特性分析和选择用无血清的完整活细胞免疫宿主动物产生具有以下特征的单克隆抗体群(a)没有与血清生物分子的实质免疫反应性；(b)与免疫所用细胞类型代表性的表面抗原结合；和(c)至少包含一种与某种机体组织中选择性表达的(组织选择性)、位于这些组织的特定部位(亚组织选择性)或特定细胞层(细胞类型选择性)的某种抗原结合的抗体。
“没有实质的免疫反应性”是通过测试该单克隆抗体群是否与全血清生物分子起反应而确定的。如果一群单克隆抗体在以1∶10,000、优选1∶1000、更优选1∶500的稀释度使用时，与全血清生物分子不产生可检测到的结合，则这群单克隆抗体便被认为与全血清生物分子无实质的免疫反应性。全血清的测试可以在0.001(v/v)，优选0.01％，更优选0.1％，甚至更优选1％的浓度下测试。抗原的结合可以通过免疫测定方法例如ELISA和免疫印迹法来检测。优选通过免疫印迹用还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的全血清生物分子来检测。
该单克隆抗体群识别代表特定类型细胞的表面抗原的能力可针对呈现具有天然构型之表面抗原的特定类型完整活细胞来测试。例如结合到表面抗原上的抗体可以通过免疫测定方法直接检测，例如将标记抗体与固定在基质上的完整活细胞进行反应。或者，可以通过细胞分选的方法检测与表面抗原的结合，此方法涉及用与可检测剂偶联的抗体标记靶细胞，然后用细胞分选仪分离标记和未标记的细胞。一种复杂的细胞分离方法是荧光激活细胞分选法(FACS)。细胞以单个细胞的形式在细小的液流中通过激光束，然后检测结合了荧光标记抗体的每一个细胞的荧光。
免疫测定法和细胞分选技术如FACS也能用于分离组织选择性、亚组织选择性或细胞类型特异性的单克隆抗体。组织选择性的单克隆抗体结合并非广泛在实验对象所有机体组织中表达的抗原。机体组织的类型包括但不限于胰脏、食管、肺、肾、结肠、胃、脑、肝、心脏、卵巢、皮肤、乳腺、肌肉、骨骼、子宫、膀胱、骨髓和各种体液。如果单克隆抗体同定位在一个组织的某些部位的靶抗原结合，那么这种单克隆抗体是亚组织选择性。大部分组织是由各种类型的细胞层组合成的复杂结构。细胞类型特异的单克隆抗体能与单一组织或其在发育上相关的组织中的某些细胞层或细胞类型特异性表达的抗原发生反应。细胞类型特异的单克隆抗体是那些能同下列细胞类型特异结合的单克隆抗体上皮细胞、内皮细胞、神经元、神经膜细胞、肌细胞、红细胞、淋巴细胞、胶质细胞、星形细胞和间质细胞。单克隆抗体的组织选择性一般通过免疫组化分析来检验，在此方法中，对冷冻或固定组织切片和/或组织匀浆用各种浓度的此种抗体染色。单克隆抗体的亚组织选择性可以通过比较被检组织不同切片的染色情况来检测。细胞类型特异的单克隆抗体一般通过对不同类型细胞的粗裂解物进行免疫印迹来鉴定，或通过基于被检单克隆抗体同特定细胞类型天然表面抗原的特异结合分选不同类型细胞来鉴定。细胞分选技术如FACS尤其适用于分离与表面抗原胞外域结合的单克隆抗体。免疫测定和细胞分选的操作步骤在本领域内已被很好地建立，所以此处不赘述。
本发明中的单克隆抗体能与许多不同的载体结合。载体可以是活性的和/或惰性的。常用的载体包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然的和修饰过的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、磁铁矿(magnetite)。对于本发明的目的，载体可以是可溶性的，也可以是不可溶性的。本领域技术人员知道用于结合抗体的其它适合的载体，或能够用常规的实验技术确定哪些是合适的载体。
本发明的单克隆抗体也能与可检测剂成一种半抗原结合。此复合物可通过标准的免疫组织化学技术如Harlow和Lane(1988)(同上)中介绍的免疫组化方法检测样品中与抗体特异结合的抗原。本领域普通的技术人员了解多种标记物和标记方法。可用在本发明中的标记物类型的例子包括放射性同位素、酶、胶态金属、荧光化合物、生物发光化合物和化学发光化合物。本领域普通技术人员知道其它用于结合抗体的适合标记物，或能通过常规实验确定适合的标记物。而且，这些标记物与本发明抗体的结合可使用本领域普通技术人员熟知的标准技术来进行。
可获得更高灵敏性的另一技术包括把抗体与低分子量的半抗原偶联。然后这些半抗原可以通过第二种反应特异地检测。例如常用的半抗原例如可与抗生物素蛋白反应的生物素，可与特异的抗半抗原抗体反应的dinitropherryl、吡哆醛和荧光素。参见Harlow和Lane(1988)(同上)。
本发明的单克隆抗体群和产生这些单克隆抗体的本发明杂交瘤可以用于诊断和/或治疗。
使用上述普通技术产生了能与胚胎胰导管细胞的代表性抗原相结合的单克隆抗体群。被检的15种单克隆抗体的库(pool)中，13种识别细胞表面不同的抗原，此点是由检测抗体同完整的、未透化处理的细胞结合的交叉竞争实验确定的。FACS分析进一步证实了抗体是指向细胞表面抗原胞外域的。以Mab2160和Mab2117二种单克隆抗体为例进行的免疫组化分析揭示了它们对某些机体组织、一种组织内的亚组织结构和特定细胞层染色的选择性。靶抗原的分离和鉴定本发明的单克隆抗体为分离和克隆靶抗原提供了特异试剂。本文中，术语“分离的”是指从事实上正常与抗原或其片段相连的细胞或其它组分中分离出来的。
本发明单克隆抗体识别的表面抗原可以通过本领域技术人员熟知的许多方法来分离。代表性的方法是靶抗原从组织匀浆或细胞裂解物中免疫沉淀和免疫亲合纯化。两种方法都是首先使靶抗原与固定在固相基质(如A蛋白和G蛋白琼脂糖凝胶颗粒(sepharose bead))上的单克隆抗体结合，之后使结合的抗原与未结合的蛋白分开，最后从偶联抗体的固相基质上将抗原洗脱下来。洗脱下来的抗原的随后分析可以包括用于确定分子量的电泳，以及用于测定靶抗原氨基酸序列的蛋白质测序。基于推导出的氨基酸序列，然后可以通过重组克隆方法获得编码该抗原的cDNA，这些重组克隆方法包括PCR、文库筛选、在现有的核酸数据库中进行同源性搜索、或它们的任何组合。通常使用的数据库包括但不限于GenBank、EMBL、DDBJ、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS和HTGS。
克隆靶表面抗原的一个优选方法是通过用抗体“淘洗(panning)”表达目的细胞表面抗原的细胞。“淘洗”过程按如下方式进行获得表达目的抗原的细胞的cDNA，然后在第二种细胞类型中超量表达这些cDNA，并筛选与所述单克隆抗体特异结合的第二种细胞类型细胞。
cDNA可以根据本领域的标准方法通过逆转录特定细胞类型的mRNA来获得。具体地，mRNA可以依照Sambrook等(分子克隆实验室手册，第二版1989)提出的方法使用各种细胞裂解酶或化学溶液分离得到，或者通过核酸结合树脂，依照生产商提供的使用说明提取获得。然后将该合成cDNA导入表达载体，以在第二种类型的细胞中产生抗原。不言而喻的是，表达载体要么作为附加体要么作为染色体DNA中的一个整合部分，在宿主细胞中必须是能复制的。适宜的表达载体包括质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒)、粘粒等。
包含目的多核苷酸的载体可以通过下列许多适合方法中的任何一种导入宿主细胞，这些方法包括电穿孔，用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行的转染，微粒轰击，脂转染和感染(其中载体是一种感染剂，如痘苗病毒，这将在下面讨论)。导入载体或多核苷酸的方法的选择常取决于宿主细胞的特性。
任何能够过超量表达异源DNA的宿主细胞都可以用于分离编码靶表面抗原的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性例子包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。优选地，宿主细胞表达这些cDNA的水平比该宿主细胞中相应内源性抗原(如果存在)的表达水平高大约5倍，更优选10倍，甚至更优选20倍。对能与所选择抗体特异结合的宿主细胞的筛选可以通过免疫测定，优选FACS来实现。通过鉴定单个靶抗原，即可确定在特定类型细胞中所表达的细胞表面抗原的组合。
以下实例对本发明代表性单克隆抗体的制备、特征分析和应用提供了详细的描述。这些实施例并不旨在以任何方式限制本发明。
实施例材料和方法实施例1胚胎胰导管上皮细胞在无血清培养基中的培养采用前人描述方法的修改方法分离胚胎导管(Githens，S.，等(1989)25679-688)。为产生RED细胞系，将2、3或18天的SpragueDawley妊娠大鼠通过CO2窒息处死。将胚胎转移至包含20μg/ml庆大霉素的冰冷Hank’s平衡盐溶液中。在解剖显微镜下于冰上取出胚胎胰脏(embryonic pancreati)，放入F12/DME中。向每皿置于1ml F12/DME中的12-15个胰腺，加入25μl含大豆胰蛋白酶抑制剂(1mg/1ml)的胶原酶-分散酶(50mg/ml)溶液。然后该皿在37℃孵育30′，并伴随不断吹打以使组织分解成更小的碎片。将消化物置于5％BSA梯度的顶部后，通过离心洗涤消化物。通过组织筛或200目的Nitex布过滤，作进一步解离。
将组织碎片，主要是导管，通过在F12/DME中800×g离心6分钟洗涤。然后将其重悬在如下生长培养基中，该生长培养基由添加了14Frhu-胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(10μg/ml)、EGF(10ng/ml)、乙醇胺(1μM)、抑酶肽(25μg/ml)、葡萄糖(5mg/ml)、磷酸乙醇胺(1μM)、三碘甲腺原氨酸(5pM)、硒(25nM)、氢化可的松(0.5μM)、孕激素(10nM)、毛喉素(1μM)、heregulin β177-244(10nM)和牛垂体提取物(BPE)(5μl/ml，75μg/ml蛋白)的F12/DME构成。然后把该细胞悬浮液平均分配到纤连蛋白包被或胶原包被的24孔板中。48-72小时内培养物中形成囊样结构。取出这些囊样结构，洗去上清液。把它们重新悬浮在14F生长培养基中，并重新铺在胶原或纤连蛋白包被的板上。该囊样结构在24小时之内发生贴附并开始展开。5-7天后，这些培养物有75％汇合，此时通过如下方式将这些培养物按1∶2分开比例传代培养在胰蛋白酶-EDTA中解离，用1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂进行中和，通过离心洗涤，之后重悬在14F生长培养基中，并将其铺在纤连蛋白包被的板上。此后，每3-4天以高分开比例(1∶3到1∶5)分开培养物。通过在96孔微滴定板的15％自身调节培养基(selfconditioned medium)中系列克隆，成纤维细胞污染达到最小并全部地除去(Mather，J.P.和Sato，G.H.(1979)实验细胞生理学(exp.cellphysiol.)，124215-211；Koberts，P.E.，等(1990)美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)，3L415-L425)。
从12天的Sprague Dawley妊娠大鼠建立BUD培养物。解剖出胚胎后，手术取下背侧和腹侧胰外突，不经过最初的组织酶解解离即将其培养在48孔板的不同孔中。按上述方法处理细胞。BUD和RED细胞都连续培养至少80代群体倍增。它们一直保持正常核型，被证实为大鼠来源的，且无支原体污染。
实施例2抗BUD/RED细胞表面蛋白的单克隆抗体的产生用5×106完整BUD或RED细胞不加佐剂免疫Balb/c小鼠，每周1次，持续10-15周。或者，将生长在硝酸纤维素板上的细胞通过外科手术植入小鼠腹膜内，每2周一次，持续6周。按下面的描述，通过FACS分析结合情况，检测被免疫的小鼠血清中的抗BUD和RED的抗体。具有最高滴度的小鼠再给予5×106细胞加强免疫。三天后，依照Oi，V.和Herzenkerg，L.(1980)“产生免疫球蛋白的杂交细胞系”描述的方法，用50％聚乙二醇4000融合来自鼠脾脏的淋巴细胞和鼠骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653。融合后的细胞以200,000/孔的密度加到96孔组织培养板中，然后用HAT补充培养基(HAT media supplement)(Sigma，St.Louis，MO)选择杂交瘤。融合后第10天，用FACS检测杂交瘤培养上清中的BUD/RED特异性单克隆抗体。然后将产生能结合BUD和RED细胞系的单克隆抗体的杂交细胞对TR-1大鼠内皮细胞系进行筛选。被选择的杂交瘤通过有限稀释的方法克隆，以产生稳定的杂交瘤。MAbs在腹水中产生，经过A蛋白-Sepharose柱(Fermentech，Inc.，Edinburgh，Scotland)纯化，4℃无菌贮存在PBS中。
实施例3 FACS分析用0.5mM EDTA作用15分钟将细胞从组织培养瓶中解离，用胶原酶/分散酶(Boehringer Mannheim，indianapolis，IN)处理10分钟，1400rpm离心5分钟，重悬在含1％BSA和2mM EDTA的PBS(FACS稀释液)中。计数细胞，调细胞浓度至107/ml，取0.1ml细胞与溶解在100μl FACS稀释液中的1μg纯化Mabs于4℃孵育30分钟。洗涤样品，重新悬浮在0.1ml稀释液中，然后与1μg羊抗鼠IgG的结合了FITC的F(ab’)2片段于4℃孵育20分钟。洗涤细胞，重新悬浮在0.5mlFACS稀释液中，用FACScan细胞分选仪(Becton Dickinson，Mt.View，CA)分析。
通过FACS筛选除BUD和RED细胞系外，结合其它各种细胞系的单克隆抗体。这些细胞系包括RIN-M和RIN-F大鼠胰岛素瘤细胞系(Gazdar，A.F.等(1980)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，773519-3523)；ARIP大鼠腺泡瘤细胞系(Jessop.N.W.和Hay，R.J.(1980)In Vitro，16212)；NODD鼠成年胰导管细胞系(用建立RED的同样方法在该实验室建立，但它是从成年NOD小鼠胰脏开始)；BR516肺上皮细胞系(Roberts，P.E.等(1992)动物细胞技术基础和应用方面，335-341；Roberts，等(1990)美国生理学杂志，3L415-L425)；大鼠成年(ASC)和胚胎(ESC)神经膜细胞系(Li，R.H.(1996)神经科学方法杂志，6757-69)；RAT-1大鼠成纤维细胞系(Botchan，M.，等(1976)细胞(Cell)，9269-287)；TR-1大鼠毛细血管内皮细胞系(Mather，J.P.，等(1982)纽约科学院年报(Annalsof the New York Academy of Sciences)，38544-68)；TR-M大鼠管周肌样细胞系(Mather，J.P.，等(1982)纽约科学院年报，38344-68)，原代新生大鼠心肌细胞培养物rCM(Lai，J.，等(1996)美国生理学杂志，271H2197-H2208)。所有细胞系或在含10％胎牛血清的F12/DMEM培养基中(ARIP，RIN-F，RIN-M，RAT-1，TR-1，TR-M)或在适合于细胞系的文献已发表过的激素补料培养基中(BR-516，NODD，ASC，ESC，rCM)培养。
实施例4免疫组化分析从9、10、12、15或18天的妊娠Sprague Dawley大鼠体内取出的胚胎立即在液氮中冷冻，然后在-70℃保存至切片。用冷冻切片机把胚胎组织切成4-6μm厚的切片，空气晾干，在丙酮中固定5分钟，空气晾干过夜。BUD和TR-1细胞单层用4％多聚甲醛固定。在用葡萄糖氧化酶/葡萄糖法(Andrew和Jasani，1987)抑制内源性过氧化酶，用抗生物素/生物素封闭试剂盒(Vector，Burlingame，USA)封闭内源生物素，和用PBS/1％BSA(25分钟)封闭内源性免疫球蛋白结合位点后，用纯化的Mabs 2160、2161、2115或2117(在PBS/1％BSA中的浓度分别是4.8μg/ml、1.66μg/ml、2.1μg/ml和1.8μg/ml)在切片或细胞上覆盖2小时。之后，样品与结合若丹明的抗鼠IgG(Chemicon，Temecula，CA)或生物素-大鼠抗小鼠IgG1(1∶500)(Zymed.Sanfrancisco，CA)共同孵育2小时，与过氧化物酶连接的链霉抗生物素(4mg/ml)(Jackson，West Grove，FL)孵育30分钟。用PBS漂洗几次后，用3-氨基-9-乙基咔唑免疫染色10-15分钟。切片用Mayer’s苏木素复染，甘油凝胶(glycergel)封固(Dako)。对e9、e10、e12、e15和e18胚胎进行免疫组化分析时，都进行两个独立的实验，并且每个胚胎、每种MAb或对照至少检测了四个切片。
从12天小鼠胚胎体内切下肠管固定在3％多聚甲醛溶液中过夜。冲洗后，7分钟内用丙酮-20℃透化处理，然后用PBS/1％BSA/1％DMSO/2％羊血清封闭内源免疫球蛋白结合位点。组织与兔多克隆抗大鼠POX1(1∶1000)或与MAb2160(1∶400)孵育过夜。在与第二抗体Cy3-连接的亲合法纯化的羊抗小鼠或兔IgG孵育过夜后，进行免疫染色分析。
实施例5 mRNA的分离和表达文库的构建从培养的BUD细胞用In Vitrogen FastTrack 2.0 mRNA分离系统直接分离信使RNA。定向cDNA转录本用Gibco-BRL SuperScript质粒系统从5mg poly-(A)+mRNA制备，然后用5％聚丙烯酰胺-TBE平板凝胶进行分离。洗脱的cDNA连接至哺乳动物表达载体pRK5D的XhoI-NotI位点，然后在生产商建议的条件下电穿孔进入Gibco-BRL DH10B细胞。
实施例6淘选法回收编码靶抗原的cDNA克隆BUD细胞文库的筛选是通过前述的一种技术修改后进行的(Seed和Aruffo，1987)。简言之，cDNA文库通过电穿孔法转染进入COS细胞(Neumann，E.，等(1982)EMBO J.，7841-845)。培养2天后，重新悬浮转染的COS细胞，然后与表1中显示的抗体库以每种2mg/ml的浓度孵育，再重新放入被亲合纯化的兔抗小鼠IgG和IgM包被的培养皿中。从附着细胞制备的Hirt上清液用于转化感受态大肠杆菌。扩增后，收获细菌菌落，用碱性小量提取法分离质粒cDNA(Birnboim，H.C.和Doly，J.(1979)核酸研究(Nueleic Acids Research)，71513-1523)，然后感染至COS细胞中以进行新一轮免疫选择。用抗体库进行三轮淘选后，针对单个纯化的MAbs进行其后的淘选。
实施例7基因序列分析以引物步行策略(primer walking strategy)用ABI Dye-teminator TM Chemistry(PE Applied Biosystems，Foster City USA)测定克隆2160的序列(Sanger，F.，等(1977)国家科学院学报，745463-5467)。用ABI 377仪收集序列(PE Applied Biosystems，FosterCity.CA)。通过二条DNA链的不同步行引物生成的基因序列在Sequencher TM(Gene Codes Corp，Ann Arbor，MI)上编辑和装配。所有的数据库序列分析通过的内部序列分析程序(Genentech Inc.，South San Francisco，CA)进行。使用ALIGN(Dayhoff，M.O.，等(1983)酶学方法(Methods Enzymol.)，91524-545)程序分析克隆2160、mEGP、hEGP-1与hEGP2之间的关系。
实施例8细胞裂解物的免疫印迹分析未经处理的和经MAb2160(10μg/ml)或P2160(10vg/ml)处理的BUD和RED细胞或者溶解在PBS/1％NP40/0.5％脱氧胆酸盐/0.1％SDS/5mM EDTA中，裂解物加载在4-20％Novex Tris-甘氨酸凝胶上；或者溶解在包含10mM Tris pH8.0、150mM氯化钠、1％脱氧胆酸钠、1％(v/v)triton-X-100、0.1％十二烷基磺酸钠、1mM亮抑蛋白酶肽和1mM PMSF的缓冲液中，裂解物同抗磷酸-Ser/Thr/Tyr单克隆抗体(Clontech)或MAb2160免疫共沉淀，煮沸后加载到4-12％Novex Tris-甘氨酸凝胶上。该凝胶在100V电泳，然后在0.5Amp的条件下向Protran硝酸纤维素膜(Schleicher和Schuell，Keene，NH)上电转膜60分钟。硝酸纤维素膜在室温下用PBS/5％脱脂牛奶/0.5％吐温20/0.01％硫柳汞(分析缓冲液)封闭1小时。将印迹用PBS/0.05％吐温20(PBST)洗涤，然后与每种MAb(1μg/ml)，抗磷酸-Ser/Thr/Tyr单克隆抗体(Clontech)或抗胰腺标志的抗体(细胞角蛋白7(1∶500)、PDX1(1∶500)、羧肽酶A(1∶500)、酪氨酸羟化酶(1∶1000))孵育1小时。用PBST洗膜，然后与1∶5000稀释的羊抗鼠IgG或抗兔IgG过氧化物酶孵育1小时。充分洗膜，用Amersham ECL化学发光系统(Amersham，Arlington Heights，VA)显影。
实施例9 Nothern印迹分析来自指明人或大鼠成年组织的poly-(A)+RNA印迹购自Clontech(Palo Alto，CA)，将其与用随机引物(2×106cpm/ml)标记(Feinberg和Vogelstein，1983)的克隆2160的1.29kb(γ32p)dCTP cDNA探针杂交。杂交1小时后，在65℃，用0.1×SSC/0.1％SDS洗膜，在70℃条件下进行放射自显影。
实施例10融合蛋白2160(P2160)胞外域(ECD)HIS-6的制备根据蛋白2160胞外域的DNA序列，合成特异PCR引物。每个C末端引物添加一个HIS-6标签序列，用于亲合纯化目的。p2160 ECDcDNA通过PCR产生后插入到pRK5中。pRK5是一个使用巨细胞病毒启动子/增强子，并在插入的cDNA序列下游含有猿猴病毒40(SV40)终止和聚腺苷酸化信号的表达载体。将这些结构用脂质转染胺试剂(Lipofectamine)瞬时转染至人胚胎肾293细胞中。表达的蛋白用填充镍的螯合Sepharose柱(Amersham Parmacia Biotech，Piscataway，N.J.)纯化。蛋白浓度通过测定OD280值来确定。结果与讨论BUD和RED胚胎胰导管上皮细胞系分别从大鼠e12胚胎胰芽(BUD)和大鼠e17导管上皮(RED)的原代培养物建立两种胰上皮细胞系。培养是在选择用于上皮细胞生长的优化无血清培养基中开始和进行的。14F培养基中的每一成份都有利于这些细胞的最佳生长(表I)。在这些条件下，成纤维细胞和间充质细胞在两次传代内即从培养物中丢失，剩下的全部是上皮细胞。对于BUD和RED细胞，培养物分别有一个11.4和14小时的对数期群体倍增时间。细胞形成一个接触抑制的单层，具有正常的核型，并持续生长了80次群体倍增以上而无明显的细胞形态和细胞生长曲线的变化。与以前用此方法建立啮齿类动物细胞系的工作一致(Loo，D.，等(1989)细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol.)，139484-491；Roberts，P.E.，等(1990)美国生理学杂志，3L415-L425)，未发现细胞衰老现象。
为了更好地阐明BUD和RED细胞系的特点，我们通过Western印迹研究了已知在胰腺发育早期阶段存在的各种蛋白质在这些细胞系中的存在情况(图1)。研究发现，BUD细胞表达细胞角蛋白7(MW54KD)，而RED细胞在较少地表达细胞角蛋白7，此蛋白仅存在于胰导管上皮中(Bouwens，L.(1998)J.Pathol.，184234-239)。BUD和RED细胞表达另一种导管标志羧肽酶A(35kD)(Kim，S.K.，等(1997)发育(Development)，1244243-4252)。羧肽酶原(45kD)也在两类细胞系上存在。两种胰BUD和RED细胞系还表达调节胰岛素基因表达的含同源异型域的转录因子PDX1(42KD)，此蛋白在小鼠胰腺个体发育过程中的出现早于胰岛素(Watada，H.，等(1996)糖尿病(Diabetes)，451826-1831)。酪氨酸羟化酶，一种早期胰岛先祖(Teitelman，G.和Lee，J.K.(1987)Dev.Biol.，121454-466)和导管标志，也在BUD细胞检测到，并在RED细胞中以较少的量存在。
针对BUD和RED细胞表面蛋白的单克隆抗体使用完整的活BUD和RED细胞免疫小鼠，产生单克隆抗体(MAbs)。基于其与RED和BUD细胞的结合情况，选择出10种单克隆抗体(表IIA)。发现Mabs 2116、2117和2140与TR-1内皮细胞系反应(Mather，J.P.，等(1982)纽约科学院年报，38344-68)。MAbs 2101、2103和2104是IgM，其余的是IgG。基于Western印迹结果，由这些MAbs识别的不同蛋白的分子量在20～120KDa之间变化(表II)。MAbs 2103、2104和2140不适合Western印迹分析。免疫印迹和交叉竞争实验的结果提示，MAbs对2100/2101和2115/2116识别相同的抗原。所有其它抗体识别不同的抗原决定簇。
为进一步表征不同MAbs所靶向的抗原，用所产生的不同抗BUD/RED MAbs对各种正常和肿瘤来源的细胞系进行FACS分析。与预料的相同，BUD(图2A1)和RED细胞对全部所产生的MAbs都呈现阳性结果(表II)。免疫细胞化学证实该染色本质上是细胞表面染色(图2B)。所有选择的抗体还在某种程度上同来源于成年非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠胰腺导管上皮细胞的NODD细胞系以及正常新生肺上皮细胞系BR516结合(Roberts，P.E.，等(1992)动物细胞技术基础和应用方面，335-341；Roberts，P.E.，等(1990)美国生理学杂志，3L415-L425)。与TR-1大鼠内皮细胞系结合的三种抗体也与除心肌细胞外的其它被检验细胞类型结合(表II，图2A3，A4)。这些结果同TR-1细胞上获得的免疫细胞化学结果一致(图2C)。
相反，MAbs 2100/01、2103、2104、2160和2161更加特异，不与包括若干胰岛素瘤和腺泡肿瘤来源的细胞系(RIN-M、RIN-F、ARIP)在内的大部分其它被测细胞类型结合(表II，图2A)。
Ag2101、PDX1和Ag2160在胰腺发育的早期阶段沿肠管的免疫定位也可使用针对BUD和RE细胞的MAbs进行胚胎大鼠胰腺的免疫组化研究。用MAb2100对e12大鼠胚胎所做的染色揭示了抗原2101在此阶段的胰脏特异性(图3A)。仅有经过此肠管区域的切片在胰芽上呈现强而特异的染色。在不加第一抗体或使用小鼠同型IgG的对照组中，在肛门部位观察到非特异信号。我们还使用MAb2160研究了沿e12.5大鼠胚胎肠管的免疫反应性(图3C)，并将其与使用兔多克隆抗大鼠PDX1所观察到的染色(图3B)做了比较。PDXI免疫反应性主要见于背侧胰腺并且是在沿消化道的有限区域内。在腹侧胰腺中也观察到较弱的信号。从胃的下部到胰腺的腹侧外突沿腹层细胞MAb2160呈现强反应性。在背侧胰腺和腹侧胰芽(信号较弱)中沿正在发育中的导管也观察到强烈的信号。
另外的免疫组化(IHC)研究为了更好地阐明胚胎发育过程中各种抗原表达的特点，我们用抗BUD/RED MAbs对e9-e18天的大鼠胚胎和成年胰腺做了IHC分析。基于这样分析，抗胰腺上皮细胞系的MAbs可以大致分为二组。其中一组包括MAbs 2100/01、2103、2104、2160和2161，它们特异地靶向胃肠道的上皮细胞和其它内胚层来源的上皮组织(如肺和肾)；而另一组包括MAbs 2115/16、2117和2140，它们结合除上述上皮细胞外，还与其它内皮细胞和神经细胞结合(资料未显示)。有趣的是，尽管不同的抗BUD/RED MAbs染色类似的器官，如鼻毛和直肠，但在许多情况下一个器官中被染色的细胞类型却截然不同。通过比较MAbs 2117、2160、2161和2115对鼻毛的染色，尤其清楚地阐明了这一点(图4)。
在e9大鼠胚胎中(图5A)，MAb2160识别的蛋白质清晰地存在于内脏内胚层相应的一层细胞上。在胚外内胚层水平也观察到弱的染色。在e10大鼠胚胎(图5B)中，内脏内胚层和体壁内胚层被染色。在发育的e12、e15、e18天(图5C-E)，多个器官的上皮细胞也被染色。在e12，MAb2160与嗅窦、肺、肠和结肠的上皮细胞有强烈反应。在e15和e18，这些结构仍然呈阳性反应。在e15，正在发育的耳和胰腺的上皮细胞中也检测到阳性信号。在e18的胚胎中覆盖嗅窦、口腔、舌、咽和气管的复层上皮显示中度染色到强染色(图5E)。下颌下腺和胸腺也有染色。肺、肝和肾上皮观察到弱到中度的免疫反应。小肠和大肠的被覆上皮以及膀胱和尿道的上皮表现强烈反应性。在第18-20天，耳(图5F)、鼻毛(图4B)和包括直肠在内的肛管中(图5G)的上皮细胞膜上可见有清晰染色。正在发育的和成年的胰腺的导管上皮中可见非常强到中度的染色(图5H)。成年胰腺的腺泡细胞呈现少量或无染色，并且除胰岛周围的少数细胞外，成年胰腺的胰岛中未观察到特异信号(图5H)。在所研究的任何年龄，肌肉、骨骼或神经组织中均未见染色反应。
我们对MAb2117所识别抗原的表达也做了详细的检测。e9大鼠胚胎自身未见染色反应。然而，MAb2117识别的蛋白在子宫内衬大量表达(图8A)。子宫隔膜中的大神经纤维和围绕较小微动脉的小神经纤维中分别可见到非常强或中度的染色(资料未显示)。在e10大鼠胚胎中，脊索中可观察到中度染色，而底板中明显无染色(图8B1-2)。子宫间皮可检测到弱染色。在较晚的发育阶段中，e11大鼠胚胎中脊索呈现强烈染色，而底板中度染色(图8C)。此外，在背前神经管侧旁的散布细胞群中观察到中度染色。MAb 2117与心、肺和脊索中的细胞强烈反应(图8D)。在e12(图8E)和e18大鼠胚胎(图8F)中，Ag 2117分布更为广泛，不仅存在于神经结构中，例如脊髓、背根神经节、大脑中的一些结构、舌、胰腺和其它器官的神经，而且还存在于嗅上皮、咽、气管、下颌下腺、胸腺、肺、胰腺、膀胱和直肠的上皮细胞中。心脏和肝脏也见有染色。
在成年大鼠，脑、胰腺和肾脏中可见MAb2117染色(图9)。在大脑，caudate-putamen和终纹纤维的纤维(图9A2)、穹窿下器和连合下器(图9A1，3)以及软脑膜(图9A4)中都可见强染色。在心室上皮中未见染色现象。对于胰腺，在导管和腺泡的上皮细胞中检测到对于Ag2117的强染色。MAb2117还与胰腺的神经发生强烈反应，而在胰岛中未检测到信号(图9B)。在肾脏，肾盂的泌尿上皮存在强烈信号(图9C1)。肾小球旁器也呈现阳性反应，尤其是肾小球外系膜细胞呈现强染色(图9C2)。在肾皮质，远曲小管与MAb2117反应。
抗原编码基因的克隆因为所有MAbs均识别细胞表面抗原的天然构型，所以在表达克隆程序中使用这些抗体来分离编码表面抗原的基因。从BUD细胞制备cDNA文库，并在COS细胞中表达。然后使用这些抗体去“淘选”表达目的细胞表面分子的细胞。首先以包含10种抗体的抗体库进行淘选，到第三轮淘选时，用单个抗体进行淘选，经过5-8轮淘选后获得单个克隆。
使用高效COS细胞表达系统，我们纯化、测序、和表达了编码MAb2160和MAb2117所识别抗原的cDNA克隆。当用FACS分析时，超量表达编码抗原2160(Ag2160)和2117(Ag2117)的基因的COS细胞，表现出与相应MAbs的高水平结合。对于模拟转染的(mocktransfected)COS细胞未观察到特异的结合。
编码Ag2160和Ag2117的cDNA序列编码Ag2160的DNA顺序见图6A，预计包含一个315个氨基酸的开放阅读框，分子量为35KD，与估计的分子量一致(表IIA)。预测蛋白的疏水性图谱提示其为一种整合膜蛋白(图6B)。在该序列中心发现一个具有11个疏水氨基酸的推测信号序列。如果该序列的信号肽酶切割位点位于Glu-Lys-Asp序列之前(Von Heigne，1986)，则Ag2160的胞外域将含有243个氨基酸。该蛋白的富含半胱氨酸的胞外域在天冬酰胺111和198位点包含2个潜在的N连接糖基化位点(NXT/S)，这就可以解释Western印迹检测到的40和50KD间的宽带。Ag2160通过一个疏水的23个氨基酸序列锚定于膜上，此疏水序列把胞外域与带高电荷的26个残基的胞质域(cytoplasmic domain)分开。
MAb2160识别的抗原与小鼠(mEGP)和人的泛-上皮细胞(pan-epithelial)糖蛋白(hEGP-1，hEGP-2)同源。氨基酸顺序比较揭示它与mEGP在氨基酸水平上大约93％同源，在核酸水平上88％同源(Bergsagel，P.L.，等(1992)免疫学杂志(J.Immunol.)，148590-596)。同样，Ag2160与hEGP-2有大约88％同源(Strnad，J.等，(1989)癌症研究(Cancer Res.)，49314-317)，与hEGP-1在氨基酸水平有63％同源(Linnenbach，A.J.，等(1989)美国国家科学院学报，8627-31)。Ag2160和EGPs之间存在最高同源性的区域是在12个半胱氨酸残基、两个潜在的N-连接的糖基化位点、信号序列和跨膜序列的这些区域(图6C)。
使用MAb2117在“淘选”过程中纯化了一个2125bp的部分cDNA克隆(图10)。Ag2117的预测顺序与大鼠造血抗原(HCA)大约有100％的同源性，HCA是鸡神经粘附分子BEN/SC-1/DM-GRASP的大鼠同系物。该鸡BEN的大鼠同系物的预测氨基酸顺序显示存在几个糖基化位点，这可能是65KD的预测分子量与用MAb2117通过Westem印迹所观察到的97KD分子量不同的原因(图10D)。
Ag2160和Ag2117 mRNA在人体内的组织分布采用全长cDNA克隆2160，通过Northern印迹，分析Ag2160在各种正常成人组织中的表达情况。在胰腺、肾、肺、小肠、结肠、甲状腺和胃与气管(表达较弱)中检测到一个1.7kb Ag2160 mRNA的表达(图6D)。这与在大鼠胚胎中用IHC所见到的抗原分布完全一致。肌肉、骨骼和神经组织中未检测到信号。
我们还使用含2117全长cDNA的探针进行了Nothern印迹分析。在正常人体组织，在胰腺、肾脏、肝、肺、胎盘、脾、前列腺、卵巢、小肠、结肠、胃、甲状腺和气管，以及包括脑和脊髓的神经系统组织中检测到高至中度水平的Ag2117 mRNA(5kb)的表达(图11)。这些结果与大鼠胚胎切片和大鼠成年组织切片的免疫组化分析结果一致。另外，在人的心脏中未检测到Ag2117 mRNA的表达信号，这提示胚胎心脏中所观察到的表达可能是短暂的。
MAb2160和融合蛋白P2160的生物学活性为了解Ag2160的生物学作用，我们构建、表达和部分纯化了Ag2160胞外域与HIS-6标签连接的融合蛋白(称为P2160)。然后，我们检测了MAbs2160和P2160的体内和体外生物学活性。为检测这些试剂对表达相应抗原的细胞的体外影响，在存在递增浓度的MAbs 2160、p2160、或存在无关对照抗体或对照HIS标签蛋白的情况下，培养BUD细胞。培养5天后，用胰蛋白酶消化细胞，并确定细胞的数量和体积。如图7所示，用MAb2160进行的处理导致BUD细胞生长的剂量依赖性抑制，以及细胞体积的剂量依赖性增加。当MAb2160的使用浓度低至1μg/ml(6.25nM)时，也能观察到MAb2160的抑制作用。当使用10μg/ml的抗体时，观察到MAb2160的作用达到最大，即33％的生长抑制和BUD细胞体积的12％增加。MAb2160对TR-1细胞的生长和体积没有作用，这与FACS分析中TR-1细胞与MAb2160无结合作用的结果一致。除此之外，在存在浓度高达100μg/ml的无关对照抗体的情况下，培养BUD细胞五天，对于细胞的生长和细胞的体积均无影响。
同样地，在存在递增浓度的P2160的情况下培养BUD细胞。在有P2160时培养BUD细胞也会引起剂量依赖性的细胞生长抑制。抑制细胞生长需要的P2160最小浓度为1μg/ml(28.6nM)。当把100μg/ml的p2160加到培养基中，可观察到细胞增殖的惊人抑制(～＞70％)和细胞体积的增加(～7％)。与MAb2160介导的作用相同，用p2160处理之后，细胞体积的增加和细胞数量的减少相关联。加入对照HIS-6融合蛋白对BUD细胞的数量和体积均无影响(图7B)。
考虑到MAb2160和P2160对BUD细胞生长和体积的影响，推测Ag2160可能通过该蛋白质胞质域和/或其它相关的细胞质蛋白质的蛋白磷酸化改变来传递信号。为确定用MAb2160或P2160处理BUD细胞对磷酸化状态所带来的影响，裂解汇合的细胞培养物，用抗磷酸-Ser/Thr/Tyr MAb或者用MAb 2160进行免疫沉淀，凝胶电泳分离，转移后用抗磷酸-Ser/Thr/Tyr MAb进行免疫印迹。如图6C所示，用MAb2160处理细胞2小时导致出现一个50KD的磷酸化蛋白质。该蛋白的磷酸化发生酪氨酸上，因为用抗磷酸酪氨酸的MAb探测该膜时也出现了相应的条带。当用融合蛋白P2160处理细胞2小时，在磷酸化蛋白质免疫沉淀后，未观察到磷酸化水平的显著改变。然而，当用MAb2160免疫沉淀P2160处理的细胞裂解物时，观察到出现一个100KD的磷酸化蛋白质，同时一个28KD蛋白质的磷酸化减少。用特异的抗P-Tyr进行的平行免疫标记提示该100KD蛋白质在丝氨酸或苏氨酸上磷酸化，而该28KD蛋白在酪氨酸上磷酸化。除此之外，免疫沉淀的Ag2160自身表现出在酪氨酸上磷酸化。
综上所述，我们从胰腺分化的早期阶段建立了两个细胞系。这些细胞系表达包括细胞角蛋白7、PDX1、羧肽酶A、酪氨酸羟化酶在内的标志蛋白，它们是胚胎胰腺上皮细胞特征性的。大量证据提示这些早期上皮细胞最终产生成年胰腺的导管、胰岛和腺泡细胞(Debas等(1997)美国外科学杂志(Am.J.Surg.)，174227-231)。在无血清培养基中建立的这些细胞系使我们能制成特异识别e12.5胚胎胰腺上皮细胞和发育上相关器官的上皮的抗体。采用此策略，我们产生了包括此处给出的10种MAb在内的15种以上的MAb，它们是对细胞表面蛋白特异的，与胚胎学上无关的细胞，如中胚层来源的组织，有最小的交叉反应。我们用此方法制备的所有MAbs均识别表面抗原的胞外域。而且，这些MAbs优选与表现天然构型的抗原结合，如那些保存在冰冻组织和其切片中的抗原。我们制备的很多MAbs不识别固定在Western印迹膜上的变性抗原。
实施例11各种细胞免疫原的比较分析通过举例的方式，这组实验阐明了在无血清培养基中培养的完整活细胞与补充血清的培养基中培养的细胞相比，在产生能与免疫用细胞类型的代表性表面抗原结合的单克隆抗体方面，是更好的免疫原。
在这项研究中，来源于大鼠背根神经节的成年神经膜细胞(rASCs)被用作免疫原。依照美国专利5,721,139，美国专利5,714,385和Li，R.(1997)内分泌学(Endocrinology)，1382648-2657中详述的步骤，分离rASCs并在无血清培养基中增殖。用无血清培养基或补充了血清的培养基中生长的大约5×106到5×107完整rASC细胞经过腹膜内(ip)或经过足垫(foot pad，fp)免疫balb/c小鼠。
几轮加强免疫后，用大约35％到大约50％聚乙二醇4000(Oi，V.和Herzenberg，L.(1980)“产生免疫球蛋白的杂种细胞系(Immunoglobulin-Producing Hybrid Cell Lines)”)将来自小鼠脾脏(对于腹膜内接种的小鼠组)或小鼠淋巴结的淋巴细胞(足垫接种的小鼠组)同骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653融合，产生杂交瘤。用补充或未补充血清的培养基中生长的rASC细胞腹膜内免疫两个小鼠亚组，从中获得大致相等数目的杂交瘤克隆。然而，当使用无血清培养基培养的rASC细胞做免疫原时，发现多四倍的阳性杂交瘤克隆产生针对rASC细胞表面抗原的单克隆抗体。如表I所示，尽管用血清培养基培养的rASC细胞免疫小鼠产生的杂交瘤中仅有3％分泌同完整rASC细胞反应的单克隆抗体，而从用无血清rASC细胞注射的小鼠获得的杂交瘤，有12％产生表现出与完整rASC细胞特异结合的单克隆抗体，这可通过FACS分析来确定(有关FACS的详细实验步骤见实施例3)。同样，在接受上述相同免疫原足垫免疫的小鼠组中，观察到阳性杂交瘤克隆百分率的2倍差异(表1)。显然，不管接种途径如何，表面无血清的细胞在产生能结合表面抗原的单克隆抗体方面更有效。表1
杂交瘤克隆总数代表淋巴细胞与骨髓瘤细胞X63-Ag8.653融合产生的杂交瘤克隆总量。分泌FACS分析确定的能与完整未固定rASC细胞结合的单克隆抗体的杂交瘤克隆表示为“阳性杂交瘤克隆”。相反，那些不能产生抗体或分泌在FACS分析中不能与完整rASC细胞结合的单克隆抗体的杂交瘤表示为“阴性杂交瘤克隆”。
实施例12佐剂在产生与细胞表面抗原反应的单克隆抗体中的作用我们也检测了佐剂在产生针对细胞表面抗原的单克隆抗体中的作用。在本研究中我们使用了三组小鼠，分别用成年大鼠神经膜细胞(rASCs)、成年人神经膜细胞(hASCs)或者人胚胎神经膜细胞(hESCs)，在有或无Ribi佐剂的情况下进行免疫。与实施例10中所示前述实验一样，这些神经膜细胞系是依照美国专利5,721,139、美国专利5,714,365和Li，R.(1997)内分泌学，1382648-2657所描述的方法建立的。杂交瘤的产生和选择也按前所述方法进行。对于所有三组小鼠，我们均观察到，通过融合用细胞免疫原混合Ribi免疫小鼠后得到的淋巴细胞，获得的杂交瘤克隆总数增加了几倍。我们进一步注意到，产生与用来免疫的完整神经膜细胞反应的单克隆抗体的阳性杂交瘤克隆百分率增加了十倍。因此，佐剂如Ribi的应用极大地提高了针对细胞表面抗原的单克隆抗体的产量。表2
杂交瘤克隆总数代表淋巴细胞与骨髓瘤细胞X63-Ag8.653融合产生的杂交瘤克隆总数。分泌FACS分析确定的能与完整未固定细胞免疫原结合的单克隆抗体的杂交瘤克隆表示为“阳性杂交瘤克隆”。相反，那些不能产生抗体或分泌不能与免疫中所用完整细胞结合的单克隆抗体的杂交瘤归为“阴性杂交瘤克隆”。
权利要求
1.免疫宿主哺乳动物产生单克隆抗体群的方法，所述单克隆抗体结合同宿主哺乳动物异源的代表特定细胞类型的抗原，该方法包括将所述细胞类型的大量完整活细胞导入到该哺乳动物体内，其中，所述细胞的表面无血清。
2.权利要求1的免疫哺乳动物的方法，其中，细胞是在无血清培养基中培养的。
3.权利要求1的免疫哺乳动物的方法，其中，细胞是以单层的形式生长的。
4.权利要求1的免疫哺乳动物的方法，其中，细胞是以聚集体的形式生长的。
5.权利要求1的免疫哺乳动物的方法，其中，细胞是在生物学基质或非生物学基质上生长的。
6.权利要求5的免疫哺乳动物的方法，其中，生物学基质选自胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和聚赖氨酸。
7.权利要求5的免疫哺乳动物的方法，其中，非生物学基质选自硝酸纤维素、尼龙和聚四氟乙烯膜。
8.权利要求1的免疫哺乳动物的方法，其中，细胞是胚胎或成年个体来源的。
9.权利要求1的免疫哺乳动物的方法，其中，细胞是外胚层、内胚层或中胚层来源的。
10.权利要求1的免疫哺乳动物的方法，其中，细胞选自ASC、ESC、ROG、BUD、RED、NODD、BR516、RL-65和NEP细胞。
11.产生与特定细胞类型的表面抗原结合的单克隆抗体的方法，包括步骤(a)用特定细胞类型的与宿主哺乳动物异源的大量完整活细胞免疫宿主哺乳动物，其中该细胞表面无血清；(b)将被免疫的哺乳动物的淋巴样细胞和一种无限增殖化细胞系融合，产生分泌单克隆抗体的杂交瘤；(c)在有利于单克隆抗体分泌的条件下培养该杂交瘤；(d)选择分泌与步骤(a)的完整活细胞上存在的表面抗原相结合的单克隆抗体的杂交瘤。
12.权利要求11的产生单克隆抗体的方法，其中所述选择通过免疫测定方法来实现。
13.权利要求12的产生单克隆抗体的方法，其中免疫测定方法选自ELISA和免疫印迹法。
14.权利要求11的产生单克隆抗体的方法，其中所述选择通过细胞分选过程来完成。
15.权利要求14的产生单克隆抗体的方法，其中细胞分选过程是FACS。
16.权利要求11的产生单克隆抗体的方法，其中单克隆抗体与表面抗原的胞外域结合。
17.权利要求11的产生单克隆抗体的方法，其中细胞是在无血清的培养基中培养的。
18.权利要求11的产生单克隆抗体的方法，其中细胞是以单层形式生长的。
19.权利要求11的产生单克隆抗体的方法，其中细胞是以聚集体的形式生长的。
20.权利要求11的产生单克隆抗体的方法，其中细胞是在生物学基质或非生物学基质上生长的。
21.权利要求20的产生单克隆抗体的方法，其中生物学基质选自胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和聚赖氨酸。
22.权利要求20的产生单克隆抗体的方法，其中非生物学基质选自硝酸纤维素、尼龙和聚四氟乙烯膜。
23.权利要求11的产生单克隆抗体的方法，其中细胞是胚胎或成年个体来源的。
24.单克隆抗体群，其没有与血清生物分子的实质的免疫反应性，并且至少包含一种能与组织选择性、亚组织选择性、或细胞类型特异性的抗原反应的抗体。
25.通过权利要求11的方法产生的单克隆抗体群。
26.权利要求25的单克隆抗体群，其中单克隆抗体与细胞表面抗原的胞外域特异性结合。
27.通过权利要求11的方法产生的杂交瘤群。
28.权利要求27的杂交瘤群，其中，杂交瘤产生能与细胞表面抗原的胞外域特异性结合的单克隆抗体。
29.确定特定细胞类型上存在的细胞表面抗原组合的方法，包括步骤(a)用特定细胞类型的与宿主哺乳动物异源的大量完整活细胞免疫宿主哺乳动物，其中该细胞表面无血清；(b)将被免疫的哺乳动物的淋巴样细胞和一种无限增殖化细胞系融合，产生分泌单克隆抗体的杂交瘤；(c)在有利于单克隆抗体分泌的条件下培养该杂交瘤；(d)选择分泌与步骤(a)的完整活细胞上存在的细胞表面抗原相结合的单克隆抗体的杂交瘤。(e)鉴定单克隆抗体结合的抗原，从而确定所述特定细胞类型上存在的细胞表面抗原的组合。
30.权利要求29的方法，其中步骤(e)的鉴定抗原进一步包括获得特定细胞类型的cDNA，在第二种细胞类型中以比相应内源性抗原的表达水平(如果存在)高至少5倍的水平表达这种cDNA，筛选特异结合到(d)中鉴定的杂交瘤所分泌的单克隆抗体上的第二种细胞类型细胞。
31.权利要求1或权利要求11的方法，其中细胞与有效增强宿主哺乳动物免疫应答的佐剂混合。
32.权利要求31的方法，其中佐剂为Ribi佐剂。
全文摘要
本发明提供了一种产生可与代表特定细胞类型的抗原相结合的单克隆抗体群的方法。此方法的独特之处在于它能使同特定类型细胞上不存在的蛋白之间交叉反应的非代表性抗体的产生最小化;同时,最大程度地保持抗原、尤其是表面抗原的完整性,以产生同其天然抗原结合的的多种单克隆抗体。另外,此发明还包括确定特定细胞类型上存在的细胞表面抗原组合的方法。本发明进一步提供杂交瘤和该杂交瘤产生的单克隆抗体群。
文档编号C07K16/00GK1350549SQ99814878
公开日2002年5月22日 申请日期1999年12月22日 优先权日1998年12月22日
发明者J·P·马赛尔, L·N·巴尔德, P·R·罗比尔茨, J－P·F·斯缇芬 申请人:雷文生物技术公司