专利名称：人体蛋白cd2上糖链的甘露八糖的简易合成的制作方法
技术领域：
本发明属于有生物活性的寡糖的制备领域，特别是涉及能用于药物筛选的寡糖的合成方法。
人体重要的，有防卫作用的蛋白CD2含有与天冬酰胺连接的寡糖链，具有如下的结构 这个寡糖由八个甘露糖分子与两个乙酰氨基葡萄糖分子组成，研究表明这个寡糖链对蛋白CD2的生物功能非常重要，去掉糖链的蛋白CD2不再具有黏附和抗体的功能(见M.A.Recny，等J.Biol.Chem.1992，267，22428-22434；A.R.N.Arulanandam，等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1993，90，11613-11620).因此糖链的结构对蛋白的功能影响很大。以上结构式的括弧中所示的即是这个甘露八糖，制备这个甘露八糖对研究整个糖链至关重要，且这个甘露八糖本身就可能具有重要的生物活性，本专利将首次报道它的简明制备。其特点是用部分保护的糖为受体，通过高区选糖基化的方法来制备。
本发明的合成方法在于以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(9)为起始物进行甘露八糖的简易合成。
以甘露糖苷1为糖基受体，以α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯2为糖基供体，一步法缩合成3，6位连接的甘露五糖3，脱掉乙叉基再乙酰化，选择性地脱掉1位乙酰基然后用三氯乙睛活化即得到五糖供体4。如下反应式所示 Bz＝苯甲酰基，Ac＝乙酰基α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯的糖基供体2由甘露糖原酸酯7缩合，得到α1→2连接的甘露双糖8，脱掉烯丙基后再用三氯乙睛活化1位即得到2，而糖的原酸酯7由乙酰基溴代甘露糖5制备，如下反应式所示 Bz＝苯甲酰基，Ac＝乙酰基All＝烯丙基使4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷与双糖供体2缩合，选择性地得到3位连接的三糖，将三糖的苄叉基水解，即得到4，6位为游离羟基的三糖受体，如下反应式所示 五糖供体4与三糖受体12选择性地在12的6位缩合，得到保护的八糖13，用碱脱掉乙酰基即得到八糖15，如下反应式所示 下面结合实施例对本发明进行详细的说明。
(1)保护的甘露核心五糖3的合成将1，2乙叉基甘露糖1(1.03克，5毫摩尔)，α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯的糖基供体2(11.5克，10毫摩尔)溶于100毫升二氯甲烷中，冷却至-10℃，在搅拌下加入三甲基硅三氟甲磺酸酯100微升，然后使反应物自然升温到室温，五小时后加200微升三乙胺结束反应，减压下蒸掉溶剂，柱层析分离后得中间物3(16.5克，77％)。m.p141-144℃；[α]D-11.5°(c1.1，CHCl3)；1H NMRδ 7.98-7.25(m，60H，Bz-H)，5.67(dd，1H，J 3.0Hz，J 1.7Hz)，5.64(dd，1H，J 3.1Hz，J 1.7Hz)，5.53(s，1H)，5.26(q，1H，CH3-CH)，5.20(s，1H)，5.12(d，1H，J 1.6Hz)，5.08(d，1H，J 1.7Hz)，5.05(d，1H，J 1.7Hz)，2.01(s，3H，CH3CO)，2.00(s，3H，CH3CO)，1.50(d，3H，CH3-CH).(2)甘露五糖供体4的合成将保护的甘露核心五糖3(2186毫克，1毫摩尔)溶于10毫升90％的三氟乙酸中，在室温下搅拌，用TLC(乙酸乙酯/石油醚1/1)监测反应，反应完成后减压下蒸掉溶剂，柱层析分离后得中间物，将此中间物溶于10毫升吡啶中，加入乙酸酐5毫升，五小时后反应完成，减压下蒸掉溶剂，两步反应后得到的全酰化的产品2201毫克，收率94％，将此产品(2244毫克，1毫摩尔)溶于二氯甲烷(20毫升)中，加入CCl3CN(0.1毫升，1毫摩尔)及DBU(14微升，0.1毫摩尔)反应混合物搅拌2小时后完成，浓缩混合物，用柱层析法精制(2/1石油醚/乙酸乙酯)，得到结晶的五糖供体4(2150毫克，90％)M.p.135-137℃； (c＝1.3 in CHCl3)；1H NMR δ＝(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)9.03，8.10-7.26，6.35，6.05，5.96，5.91，5.88，5.85，5.80，5.74，5.68-5.66，5.64，5.45，5.43，5.17，5.09，4.61-4.43，4.33，4.30，4.22-4.18，3.89-3.84，3.59-3.56，2.26，2.10，2.02，2.00；元素分析计算值(％)C124H108O42NCl3C 62.30，H 4.52；实测值 C 62.45，H 4.40.(3)3，4，6-三-O-苯甲酰基-β-D-甘露糖1，2-烯丙基原酸酯(7)将2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露糖溴(8.22克，20毫摩尔)加入到烯丙醇(40mL)中，在搅拌下加入2，4-二甲基吡啶(2.3毫升，20毫摩尔)，反应在室温下进行，用TLC检测(1∶1石油醚/乙酸乙酯)。反应完成后，减压下浓缩，残余物悬浮于无水甲醇中MeOH(20毫升)，加入甲醇钠的甲醇溶液(2摩尔，0.4毫升)，混合物搅拌过夜，反应完成。将反应液减压浓缩，残余物用柱层析分离，得到粉末状6(4.72克，90％)。将6溶于吡啶(30毫升)中，在搅拌下滴加苯甲酰氯(8.2毫升，70毫摩尔)。三小时后反应完成，用常规方法对反应液进行后处理，用柱层析(3/1石油醚/乙酸乙酯)精制。得到结晶的化合物7(10.33克，～100％)。(4)2-O-乙酰基-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖烯丙基苷(8)化合物7在高真空下干燥二小时，然后溶于二氯甲烷(80毫升)中，在-42℃氮气保护下滴加TMSOTf(100微升)，2小时后，TLC(3/1石油醚/乙酸乙酯)指示反应完成。用三乙胺中和，减压浓缩，柱层析精制得到固体的8(6.72克，66％).m.p 148-150℃；[α]D+3.0°(c 1.3，CHCl3)；1HNMR δ 8.07-7.33，5.99，5.90-5.85，5.70，5.28-5.18，5.16，5.11，4.61-4.47，4.39-4.36，4.15-4.13，3.95-3.92，2.03.计算值C59H52O18C，67.56；H，4.96实测值C，67.60；H，4.92.(5)2-O-乙酰基-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯(2)将化合物8(524毫克，0.5毫摩尔)加入到含乙酸钠(293毫克，3毫摩尔)的90％乙酸(10毫升)中，再加入PdCl2(89毫克，0.5毫摩尔)，混合物在室温下搅拌12小时，TLC(2/1石油醚/乙酸乙酯)指示反应完成，用二氯甲烷(30毫升)稀释，用水、饱和碳酸氢纳溶液洗涤，减压浓缩有机相，用柱层析精制，得到2-O-乙酰基-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖(456毫克)，将其溶于二氯甲烷(20毫升)中，加入CCl3CN(0.1毫升，2毫摩尔)及DBU(14微升，0.18毫摩尔)，反应6小时后完成，减压下浓缩反应液，柱层析精制得到结晶的化合物2(473毫克，两步收率90％)，m.p 139-142℃；[α]D-1.5°(c 1.1，CHCl3)；1H NMR δ 8.64，8.02-7.26，6.59，6.09，5.95-5.87，5.70，5.20，4.68-4.48，2.03。计算值C58H48O18Cl3NC，60.31；H，4.16.实测值C，60.34；H，4.15.(6)三糖受体12的制备双糖供体2(1153毫克，1毫摩尔)与单糖受体9(308毫克，1毫摩尔)在真空下干燥2小时，然后溶于二氯甲烷(50毫升)中，在-20℃，搅拌下加入TMSOTf(15微升，0.08毫摩尔)，反应在搅拌下进行2小时，温度逐步升至室温，用三乙胺终止反应，浓缩反应物用柱层析法精制(1∶1.5石油醚-乙酸乙酯)得到结晶的三糖10(1194毫克，92％)；M.p.135-137℃； (c＝0.9 in CHCl3)；13C NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝169.29，166.48，165.89，165.69，165.67，165.45，165.07，101.92，99.95，99.39，98.87，78.66，75.84，73.32，71.28，70.51，69.83，69.46，69.44，68.91，67.89，66.85，64.14，63.40，62.77，55.01；1H NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝8.06-7.32，5.95-5.85，5.83，5.77，5.61，5.56，5.40，5.30，5.02，4.91，4.90，4.60-4.50，4.47，4.36，4.29-4.17，4.15-4.05，4.02-3.95，3.88，3.82，2.01；将10(1298毫克，1毫摩尔)溶于吡啶(30毫升)中，加入乙酸酐(1毫升，10毫摩尔)，反应物在搅拌下过夜，TLC(1.5∶1石油醚-乙酸乙酯)指示反应完成，用常规方法处理反应物，用柱层析法精制(2∶1石油醚-乙酸乙酯)后，定量地得到结晶的三糖11；M.p.130-132℃； (c＝0.9 in CHCl3)；元素分析计算值(％)C74H68O24(1340)C 66.27，H 5.07；实测值C 66.40，H 5.00.将11(1340毫克，1毫摩尔)溶于甲醇(50毫升)中，加入乙酰氯(0.05毫升，0.7毫摩尔)反应物在室温下搅拌过夜后完成，产物浓缩后用柱层析精制(1.5∶1石油醚-乙酸乙酯)后得到固体的三糖受体12(1127毫克，90％)； (c＝1.3 in CHCl3)；13C NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝170.18，169.84，166.28，166.09，165.49，165.47，164.44，164.42，99.97，99.69，97.97，78.60，75.64，72.37，71.20，70.83，69.54，69.48，69.10，68.97，68.44，68.07，67.17，64.92，64.89，62.30；1H NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝8.06-7.26，5.96，5.90-5.78，5.75，5.65，5.62，5.38，5.28，5.20，5.12，4.84，4.64-4.38，4.18，4.14，4.06，3.95，3.78，3.70，2.22，2.02；元素分析计算值(％)C67H64O24(1252)C 64.22，H 5.11；实测值C 63.96，H 5.14.(7)八糖15的制备将五糖供体4(1193毫克，0.5毫摩尔)及三糖受体12(626毫克，0.5毫摩尔)在真空下干燥2小时，然后溶于二氯甲烷(30毫升)中，在-20℃下加入TMSOTf(7.5微升，0.08毫摩尔)，反应在搅拌下进行3小时，温度逐步升至室温，用三乙胺中和，浓缩反应物，将得到的浆状物用柱层析法精制(1∶1石油醚-乙酸乙酯)，得到八糖13(1426毫克，82％)； -18.0°(c＝0.9 in CHCl3)；质谱MALDI-TOF分析计算值C189H170O653478.99[M].实测值3479[M]；元素分析计算值(％)C189H170O65(3479)C 65.21，H 4.89；实测值C 65.36，H 4.76.将13(1043毫克，0.3毫摩尔)溶于吡啶(20毫升)中，加入乙酸酐(1毫升，10毫摩尔)，在室温，搅拌下5小时，反应完成，用常规方法处理反应液，浓缩有机相，用柱层析法精制(1.5∶1石油醚-乙酸乙酯)，定量地得到固体的14 (c＝1.0 in CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝8.02-7.26，6.31，6.01，5.98-5.83，5.78-5.70，5.67-5.60，5.56，5.48，5.45-5.30，5.23，5.20，5.12，5.10，5.08，5.03，4.95，4.92，4.70-4.42，4.25，4.20，3.87-3.76，3.74，3.60-3.45，2.28，2.23，2.08，2.01，2.00，2.09，1.96；质谱MALDI-TOF计算值C191H172O663521.01[M].实测值3521[M]；将14(704毫克，0.2毫摩尔)溶于用氨饱和的甲醇(4毫升)中，室温下反应7天后，将反应物浓缩，用Sephadex LH-20(甲醇)精制后得到奖状的游离的八糖15(230毫克，85％)；13C NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝136.88，118.54，101.98，101.86，101.86，100.56，100.36，100.28，98.99，97.60，78.44，78.38，72.75，72.26，70.71，70.22，69.85，69.58，69.50，69.08，66.42，66.32，66.24，66.03，65.24，65.03，64.65，60.80，60.68，60.48，59.96，58.23，1H NMR(400MHz，D2O，25℃，TMS)δ＝5.87，5.31，5.28，5.25，5.20，5.08，4.95，4.80，4.60，4.05-3.53；质谱MALDI-TOF计算值C51H86O411354.46[M].实测值1354.66[M].
权利要求
1.一种以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(9)为起始物的简易甘露八糖合成法。其特征在于以甘露糖苷1为糖基受体，以α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯2为糖基供体，一步法缩合成3，6位连接的甘露五糖3，脱掉乙叉基再乙酰化，选择性地脱掉1位乙酰基然后用三氯乙睛活化即得到五糖供体4。如下反应式所示 Bz＝苯甲酰基，Ac＝乙酰基
2.一种以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖(9)烯丙基苷为起始物的简易甘露八糖合成法。其特征在于α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯的糖基供体2由甘露糖原酸酯7缩合，得到α1→2连接的甘露双糖8，脱掉烯丙基后再用三氯乙睛活化1位即得到2，而糖的原酸酯7由乙酰基溴代甘露糖5制备，如下反应式所示 Bz＝苯甲酰基，Ac＝乙酰基All＝烯丙基
3.一种以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(9)为起始物的简易甘露八糖合成法。其特征在于使4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷与双糖供体2缩合，选择性地得到3位连接的三糖，将三糖的苄叉基水解，即得到4，6位为游离羟基的三糖受体，如下反应式所示
4.一种以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(9)为起始物的简易甘露八糖合成法。其特征在于五糖供体4与三糖受体12选择性地在12的6位缩合，得到保护的八糖13，用碱脱掉乙酰基即得到八糖15，如下反应式所示
全文摘要
本发明涉及生物体内起重要生物学作用的甘露八糖α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→3)－{α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→3)－[－α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→6)]－α－D－甘露糖－(1→6)}－a－D－甘露糖的简便化学合成法。
文档编号C08B37/00GK1381503SQ0111076
公开日2002年11月27日 申请日期2001年4月20日 优先权日2001年4月20日
发明者孔繁祚, 朱玉亮 申请人:中国科学院生态环境研究中心