专利名称：抗肿瘤羧烷基牛膝多糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多糖类免疫调节剂及其制备方法，特别是涉及免疫调节剂牛膝多糖类衍生物及其制备方法。
近年来，多糖衍生物的抗病毒作用已引起国内外药物学家和病毒学家的极大兴趣。但在多糖的结构改造中，羧烷基化合物的制备较为困难，不是取代度低就是造成原有多糖结构遭到破坏，而且，并非所有多糖羧烷基化之后其活性都能提高，如地衣多糖经O-羧甲基化后抗肿瘤活性却大大降低。羧烷基在糖残基上所处位置，引入的数量，以及羧烷基在链上均匀分布的程度都对多糖的构象产生影响，只有调节最佳构像，多糖才能发挥最大的生物活性[化学通报，9，54，(1999)]。
本发明对牛膝多糖进行了羧烷基化，制得了羧烷基牛膝多糖。所述的羧烷基牛膝多糖的13C-NMR图谱数据是果糖呋喃环上的碳的化学位移数据δ62.5～63.1、105.5～107.0、79.0～79.5、77.1～77.2和/或86.0～87.0、82.6～83.0、65.2，葡萄糖吡喃环上的碳的化学位移数据δ95.2、73.8、75.3、82.2、74.9，羧基碳的化学位移数据δ179.5～181.0，羧烷基的亚烷基碳的化学位移数据δ72.0～73.0。其IR图谱的数据如下3700～3000cm-1的强宽峰为分子间及分子内羟基吸收，2950～2850cm-1为C-H键伸缩振动，1610～1595cm-1的强峰为羧酸盐C＝O伸缩振动，1450～1400cm-1为羰基旁亚烷基的剪式振动，1350～1300cm-1为C-H非平面摇摆振动，1150～1000cm-1强宽峰为糖环上C-O-C醚键不对称伸缩振动和C-OH键伸缩振动的叠加，940～920cm-1为呋喃环伸缩振动。
寡糖和多糖结构的复杂性给寡糖和多糖的结构分析带来了极大的困难。本发明的羧烷基牛膝多糖据分析其取代度、糖数具有如右所示结构右式中R＝H或(CH2)kCOOM，其中k＝1～3，M＝K、Na、Ca1/2，a，b，c，d，o，p，q＝2～19，a+b+c+d+o+p+q＝2～19。尤以下述结构为主下式中m、n＝2～19，
因为多糖羧烷基取代度的大小不仅影响其溶解度等理化性质，而且直接影响其生理活性，所以采用钠元素百分含量分析法和红外光谱定量分析法相对照，得到羧甲基牛膝多糖(CMAbPS)的产物的取代度例如表1所示，其羧甲基取代度在0.2～2.5之间，主要是在0.2～1.5之间表1
所述钠元素百分含量分析法是测得样品中钠元素百分含量Na％，取代度DS’＝(1.62×Na％)/(23-0.8×Na％)。所述红外光谱定量分析法是采用Bio-Rad FTS-185红外光谱仪的Win-IR曲线拟合图，通过拟合单独计算出-OCH2COONa的峰面积S1600cm-1，用S1600cm-1与表征葡萄糖环骨架振动的吸收峰面积S930cm-1之比表征产物中羧甲基的取代度DS”。
本发明的羧烷基牛膝多糖可通过如下方法合成在室温～100℃下，用C2～C4的氯烷酸、溴烷酸或碘烷酸为羧烷基化试剂，加入碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等，在水溶液中与牛膝多糖反应0.1～10小时，生成不同取代度的羧烷基牛膝多糖，所述的牛膝多糖与羧烷基化试剂的摩尔比为1∶1～10，所述的羧烷基化试剂是C2～C4的氯烷酸、溴烷酸或碘烷酸。推荐的反应温度是80～100℃，推荐反应2～5小时，推荐反应摩尔比1∶3～6。通过改变溶剂的量及反应试剂的比例关系，可生成不同取代度的羧烷基牛膝多糖。反应后将反应溶液中和，再经分离纯化可得纯品。
经生物活性试验，研究结果显示羧烷基牛膝多糖具有较好的抑制小鼠Lewis肺癌和S-180肿瘤的效果，并能提高小鼠NK细胞活性，具有增强免疫活性的作用。
本发明的羧烷基牛膝多糖由于引入了羧基离子，克服了多糖羧烷基化的困难，实现了多糖的结构改造，使得其溶解性水溶性更好，用有机溶剂沉淀法也比单纯牛膝多糖的纯化更为有效，制得的羧烷基化合物取代度一般在0.2～2.5间，取代度高，调节了最佳构像，而且其合成方法简便，制备的羧烷基牛膝多糖具有抗肿瘤及增强免疫功能的作用，适于工业化。
图2是CMAbPS经Sephadex G-25柱层析分离图(1.2cm×60cm)，淋洗液0.1M NaCl，流速0.33ml/min，6min/tube。其是将DEAE-Cellulose纯化的CMAbPS再经Sephadex G-25柱层析，苯酚—硫酸法隔管检测A490得到。
图3是CMAbPS的HPLC图，分析柱TSK-2000SW，洗脱液双蒸水，流速1ml/min，检测器RI，其是将上述二次柱层析纯化的纯品经HPLC分析得到。
图4是CMAbPS的红外光谱图。图5是CMAbPS的13C-NMR图谱。
图6是AbPS的质谱总图，显示为六～十六糖。
图7、8、9、10是将AbPS按四个分子量段分别获得的质谱图，显示为四～二十一糖。
具体实施例方式
实施例1取牛膝多糖250mg，用10ml双蒸水溶解，加入247mg氢氧化钾溶解，然后加入286mg溴丁酸，95℃下搅拌反应1小时。然后用1mol/L盐酸中和至pH＝7，用5倍体积丙酮沉淀、离心、透析、冷冻干燥，再经DEAE-Cellulose及SephadexG-25柱层析纯化，即得羧丙基牛膝多糖(241mg)，用这种方法得到的羧丙基牛膝多糖中羧丙基取代度为0.2，具有抗肿瘤和增强免疫活性。
实施例2取牛膝多糖250mg用5ml双蒸水溶解，加入494mg氢氧化钠溶解，然后加入571mg氯乙酸，95℃下搅拌反应3小时。然后用1mol/L盐酸中和至pH＝7，用5倍体积丙酮沉淀、离心、透析、冷冻干燥，再经DEAE-Cellulose及SephadexG-25柱层析纯化，即得羧甲基牛膝多糖(286mg)，用这种方法得到的羧甲基牛膝多糖中羧甲基取代度为0.7，13C-NMRδ63.03，62.97，62.93，62.88，62.86，62.79，62.75，62.71，107.00，106.87，106.78，106.71，106.67，106.51，106.17，106.13，105.95，105.88，79.43，79.40，79.31，79.24，79.16，79.13，79.04，77.19，77.13，83.83，82.98，82.86，82.79，82.70，65.2，95.20，73.80，75.30，74.90，180.63，180.58，180.43，180.36，180.32，180.23，180.12，180.00，179.89，179.71，179.62，72.25，72.22，82.22，86.90，86.77，86.50，86.44.
实施例3取牛膝多糖250mg，用2.5ml双蒸水溶解，加入617mg氢氧化钾溶解，然后加入714mg氯乙酸，室温下搅拌反应10小时。然后用lmol/L盐酸中和至pH＝7，用5倍体积丙酮沉淀、离心、透析、冷冻干燥，再经DEAE-Cellulose及SephadexG-25柱层析纯化，即得羧甲基牛膝多糖(340mg)，用这种方法得到的羧甲基牛膝多糖中羧甲基取代度为1.5，具有抗肿瘤和增强免疫活性。
实施例4 羧甲基牛膝多糖的生物活性研究我们对羧甲基牛膝多糖CMAbPS(DS＝0.849)进行分离、纯化之后，送检生物活性测定，其结果如下
1.羧甲基牛膝多糖对小鼠Lewis肺癌足趾接种的疗效试验
***表示显著性差异，p小于0.012.羧甲基牛膝多糖对小鼠S-180肉瘤(腋皮下接种)的试验结果
***p小于0.013.羧甲基牛膝多糖对荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影响
***为实验组OD均值/效应对照组OD均值，p小于0.01。#为靶细胞OD均值。
权利要求
1.一种羧烷基牛膝多糖，其特征是其13C-NMR图谱的数据如下果糖呋喃环上的碳δ62.5～63.1、105.5～107.0、79.0～79.5、77.1～77.2和/或86.0～87.0、82.6～83.0、65.2，葡萄糖吡喃环上的碳δ95.2、73.8、75.3、82.2、74.9，羧基碳δ179.5～181.0，羧烷基的亚烷基碳δ72.0～73.0；其IR图谱的数据如下3700～3000cm-1强宽峰，2950～2850cm-1强峰，1610～1595cm-1，1450～1400cm-1，1350～1300cm-1，1150～1000cm-1强宽峰，940～920cm-1。
2.如权利要求1所述的羧烷基牛膝多糖，其特征是具有如下结构
3.如权利要求2所述的羧烷基牛膝多糖，其特征是具有如下结构 式中m、n＝2～19，m+n＝2～19，R如权利要求1所述。
4.如权利要求1所述的羧烷基牛膝多糖，其特征是所述的羧烷基取代度为0.2～2.5。
5.如权利要求4所述的羧烷基牛膝多糖，其特征是所述的羧烷基取代度为0.2～1.5。
6.如权利要求1所述的羧烷基牛膝多糖的制备方法，其特征是在水溶液中，用羧烷基化试剂和碱，与牛膝多糖在室温～100℃下反应0.1～10小时，生成羧烷基牛膝多糖，所述的牛膝多糖与羧烷基化试剂的摩尔比为1∶1～10，所述的羧烷基化试剂是C2～C4的氯烷酸、溴烷酸或碘烷酸。
7.如权利要求6所述的羧烷基牛膝多糖的制备方法，其特征是再经DEAE-Cellulose及Sephadex G-25柱层析纯化，制得羧烷基牛膝多糖纯品。
8.如权利要求1所述的羧烷基牛膝多糖，其特征在于所述的羧烷基牛膝多糖具有抗肿瘤和增强免疫功能作用。
全文摘要
本发明涉及抗肿瘤羧烷基牛膝多糖,其是用氯烷酸、溴烷酸或碘烷酸为羧烷基化试剂,加入碱,在相应条件下与牛膝多糖生成不同取代度的羧烷基牛膝多糖,这一系列不同取代度的羧烷基牛膝多糖经生物活性试验表明,具有抗肿瘤及增强免疫功能的作用。
文档编号C08B37/00GK1344747SQ01132018
公开日2002年4月17日 申请日期2001年10月26日 优先权日2001年10月26日
发明者田庚元, 邓乐华 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 浙江新昌京新制药有限公司