专利名称：由k5多糖衍生具有高抗血栓形成活性的糖胺聚糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及以可任选纯化的K5多糖为原料制备由K5多糖衍生而成具有高抗血栓形成活性的糖胺聚糖及其制备方法。
背景技术：
糖胺聚糖是工业提取不同动物器官所得的生物聚合物，如肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和透明质酸。
具体地说，肝素主要提取自猪的肠粘膜或牛肺，它是由重复二糖单位形成的一种混合链，所述二糖单位由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸)和氨基糖(葡萄糖胺)通过α-1→4或β-1→4键结合而形成。糖醛酸单位的2位可被硫酸化，葡萄糖胺单位可被N-脱乙酰化或N-硫酸化及6-O-硫酸化。此外，葡萄糖胺的3位可含有一个硫酸根，含量约0.5％。肝素是一种多分散性共聚物，分子量约3,000至约30,000D。
Lindahl等人(1986，Lane D.and Lindahl U.(Eds.)″Heparin-Chemical and Biological Properties；ClinicalApplications″)、Edward Arnold(London，pages 159-190)及Lindahl U.Feingold，D.S.和Rodén L.(1986，TIBS，11，221-225)叙述了哺乳动物肝素的天然生物合成及该产物的性质。
由称为活性五糖的抗凝血酶III(AT III)的五糖连接区所形成的序列是肝素与AT III高亲和力结合的必要结构，因此，该序列对肝素活性很重要。该序列含有一个3位被硫酸化的葡萄糖胺单位，肝素链的其它部分不存在这样一个单位。除了通过AT III而有活性外，肝素也可通过激活肝素辅因子II(HC II)和选择性抑制抗凝血酶来发挥其抗凝血活性和抗血栓形成活性。众所周知，激活HC II所需的最小糖序列是一条含有至少24个单糖的链(Tollefsen D.M.，1990 Seminars in Thrombosis and Haemostasis 16，66-70)。
众所周知，按照Vann W.F.，Schmidt M.A.，Jann B.，Jann K.，(1981)European Journal of Biochemistry 116，359-364中所述，大肠杆菌株分离出来的荚膜多糖K5表明肝素和硫酸类肝素前体(N-acetylheparosan)的序列相同，即是由重复二糖葡萄糖醛酸基(glucoronyl)-β-1→4-葡萄糖胺结构形成的混合链。这种化合物经过化学修饰，如Lormeau等人的美国专利5,550,116和Casu等人(Carbohydrate Research，1994，263，271-284)所述，或者经过化学及酶修饰制成一些产物，其在体外具有同一类由动物器官提取的肝素的体外凝血生物活性。
最早对多糖K5的化学和酶修饰进行叙述的是意大利专利IT1230785，多糖K5(下文简称“K5”)受到以下作用(a)N-脱乙酰化/N-硫酸化；(b)葡萄糖醛酸单位的酶C5差向异构化；(c)2-O和/或6-O-硫酸化；以及(d)任选的酶3-O-硫酸化，但这种方法制备的产物的活性较动物器官提取的肝素所具有的活性差很多，下文把由动物器官提取的肝素称为“市售肝素”或“标准肝素”，后一种命名称作第四国际标准肝素。
WO 92/17507公开了一种以K5为原料制备类肝素产物的方法，该方法包括以下步骤(a)N-脱乙酰化和N-硫酸化，(b)C5差向异构化，及(c)O-硫酸化，步骤(c)可选择在N-再硫酸化之后进行。由此方法制成的产物所含艾杜糖醛酸的量很低(大约占糖醛酸总量的20％)。
WO 96/14425和US 5,958,899公开了一种以K5为原料制备具有高含量艾杜糖醛酸的类肝素产物的改进方法，该方法包括以下步骤(a)N-脱乙酰化和N-硫酸化，(b)用C5差向异构酶进行差向异构化，及(c)使至少一些游离羟基硫酸化，步骤(b)可在受控条件下进行。由于在O-硫酸化过程中损失了N-硫酸根，所以由此方法制成的产物所含的N-硫酸根的量不多。
WO 97/43317和US 6,162,797公开了具有高抗凝血活性的K5衍生物，它们是通过使K5进行以下步骤而制成的(a)N-脱乙酰化和N-硫酸化，(b)C5差向异构化，(c)先用有机碱使差向异构化产物在它们的盐中转化并透析，再使其O-过硫酸化，(d)N-再硫酸化。由此方法制备的产物具有很高的全抗凝血活性。
WO 98/42754公开了一种制备具有高抗血栓形成活性的糖胺聚糖(包括K5衍生物)的方法，所述制备K5的方法由以下步骤组成(a)N-脱乙酰化和N-硫酸化，(b)用C5差向异构酶进行差向异构化，(c)O-过硫酸化，(d)使过硫酸化产物的盐在溶剂中局部O-脱硫酸化，(e)N-再硫酸化，以及可选择地，(f)O-再硫酸化。这种可选择的6-O-再硫酸化使6-O-硫酸化得以完全恢复，进一步提高抗-Xa活性(A.Naggi等人，Seminars in Thrombosis andHaemostasis，2001，27/5，437-443)。实际上，此方法的缺点是当不进行可选择的O-再硫酸化步骤(f)时制成的产物没有O-硫酸根，或者当进行步骤(f)时它们又会损失N-硫酸根。因此，不完全N-或O-，特别是6-O-硫酸化作用(始终低于60％)使C5-差向异构化K5多糖的抗-Xa值很低，以致在不完全N-硫酸化时抗-Xa/aPPT之比很低，或者在不完全6-O-硫酸化时抗血栓形成活性或HC II很低，故抗-II a/aPPT和/或HC II/aPPT之比也很低。
发明内容
我们发现，由大肠杆菌的K5多糖衍生而来的新型糖胺聚糖，其分子量为3,000到30,000，含有对AT III具有高亲和力以及具有高抗凝血活性和抗血栓形成活性的链为25％至50％(重量)。
所述糖胺聚糖通过一种方法合成，该方法按顺序基本上包括以下步骤(i)多糖K5的N-脱乙酰化/N-硫酸化，(ii)葡萄糖醛酸部分对相应的艾杜糖醛酸部分的羧基局部C5差向异构化，(iii)过硫酸化，(iv)选择性O-脱硫酸化，(v)任选的6-O-硫酸化，以及(vi)N-硫酸化。
此外还发现，使步骤(iii)结束时得到的产物进行O-脱硫酸化135到165分钟，可以制成新的化合物，其具有最佳抗血栓形成活性，而且出血可能性比其它任何一种类肝素糖胺聚糖都低。
本发明特别发现，具有很高抗血栓形成活性且出血可能性比肝素低的新型糖胺聚糖可以用以下方法制成，所述方法按顺序包括以下步骤(i)多糖K5的N-脱乙酰化/N-硫酸化，(ii)葡萄糖醛酸部分对相应的艾杜糖醛酸部分的羧基局部C5差向异构化，(iii)过硫酸化，(iv)控制时间和温度，选择性O-脱硫酸化，(v)6-O-硫酸化，(vi)N-硫酸化，该方法还包括在步骤(ii)-(vi)之一结束时进行任选的解聚步骤。按照这个反应次序，这些新型糖胺聚糖几乎被完全N-硫酸化及高度6-O-硫酸化，因此与用上述方法制备的糖胺聚糖不同。
更加具体地说，令人惊奇地发现，如果在上述方法的步骤(iv)中，50-70℃下使步骤(iii)结束时所得的产物在二甲基亚砜/甲醇的混合物中进行选择性O-过硫酸化135到165分钟，可制成新型肝素类糖胺聚糖，所述糖胺聚糖的抗-Xa活性至少与标准肝素同一个数量级，全抗凝血活性例如以aPPT表示，比标准肝素低，肝素辅因子II(HC II)活性至少与标准肝素一样高，而抗-IIa(抗血栓形成)活性比标准肝素高得多，所述新型糖胺聚糖出血的危险也比市售肝素低。另外，业已发现，在以上所述的条件下进行步骤(iv)，步骤(vi)结束时所得的化合物所具有出血危险低的生物活性在解聚后仍得以保持，解聚产物的所述活性表现为很高的抗血栓形成活性，抗-Xa和HC II活性与标准肝素的活性同一个数量级，而全抗凝血活性比标准肝素低。所以，在受控条件下进行步骤(iv)可以克服已知方法上面提到的缺点，并能获得新型糖胺聚糖，其选择性抗血栓形成活性得到提高，可用作特异性凝血控制及抗血栓药。
下文将多糖K5衍生物中N-脱乙酰化K5多糖称为“脱乙酰化K5”，N-脱乙酰化N-硫酸化K5多糖称为“N-硫酸化K5”，C5差向异构化N-脱乙酰化N-硫酸化K5多糖称为“C5-差向异构化N-硫酸化K5”，步骤(iv)结束时所得的C5差向异构化N-脱乙酰化N，O-硫酸化K5，无论有否解聚都称为“C5-差向异构化N，O-硫酸化K5”。除非另外指出，原料K5及其衍生物都采用它们的钠盐形式。
图1所示为按照Vann W.F.等人(1981，European Journal ofBiochemistry 116，359-364)所述得到的K5多糖工作标准的1H-NMR谱图，反复纯化直到1H-NMR谱图的4.9至5.2ppm区段的峰几乎完全消失。
图2所示为实施例1的原料K5多糖的1H-NMR谱图。
图3所示为用作实施例1(i)用作原料的纯化K5多糖的1H-NMR谱图。
图4所示为实施例1(i)制成的N-硫酸化K5多糖的13C-NMR谱图。
图5所示为实施例1(ii-1)的固定化C-5差向异构酶效率的1H-NMR谱图。
图6所示为实施例1(ii)结束时所得的差向异构化产物的1H-NMR谱图。
图7所示为实施例1(iii)制成的过硫酸化化合物的13C-NMR谱图。
图8所示为实施例1(iv)制成的二硫化合物的13C-NMR谱图。
图9所示为实施例1(vi)制成的化合物的13C-NMR谱图。
图10所示为实施例2制成的低分子量化合物的13C-NMR谱图。
具体实施例方式
本发明涉及一种K5糖胺聚糖的制备方法，其包括以下步骤(i)多糖K5的N-脱乙酰化/N-硫酸化，(ii)葡萄糖醛酸部分对相应的艾杜糖醛酸部分的羧基局部C5差向异构化，(iii)过硫酸化，(iv)选择性O-脱硫酸化，(v)任选的6-O-硫酸化，(vi)N-硫酸化，其中步骤(iv)包括用甲醇/二甲基亚砜的混合物处理步骤(iii)结束时所得的过硫酸化产物135-165分钟。
所述处理时间最好约150分钟。
由步骤(ii)到步骤(vi)所得的本发明的产物可用WO 82/03627所述的方法化学解聚，这种解聚最好在步骤(vi)之后进行。
根据一优选实施例，用甲醇/二甲基亚砜的混合物处理步骤(iii)结束时所得的过硫酸化产物是约60℃下进行约150分钟。根据这种优选方法，由步骤(i)-(iii)所得的过硫酸化产物制成新型糖胺聚糖，其具有最佳抗血栓形成活性，出血可能性也比其它任何一种类肝素糖胺聚糖低。
按照这种优选方法再加上如果步骤(ii)至少40％葡萄糖醛酸部分进行局部差向异构化，40-60℃下步骤(iii)过硫酸化在疏质子溶剂进行10-20小时，而且实际进行步骤(v)选择性6-O-硫酸化，可制成特别感兴趣的K5糖胺聚糖。
所以，本发明的另一个目的在于提供一种新型糖胺聚糖的制备方法，其包括以下步骤(i)使多糖K5与N-脱乙酰化试剂反应，再用N-硫酸化试剂处理N-脱乙酰化产物；(ii)用葡萄糖醛酸基C5差向异构酶使所得的N-硫酸化K5受到C-5差向异构化作用，得到C5差向异构化N-硫酸化K5，其中艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比为60/40到40/60；(iii)将艾杜糖醛酸含量占总糖醛酸40％-60％的C5差向异构化N-硫酸化K5转化为其叔盐或季盐，再在40-60℃下用O-硫酸化试剂在疏质子极性溶剂中处理所得的盐10-20小时；(iv)50-70℃下用二甲基亚砜/甲醇的混合物处理所得的具有O-过硫酸化产物有机碱的盐135-165分钟；(v)0-5℃下用O-硫酸化试剂处理所得的具有局部O-脱硫酸化产物有机碱的盐；(vi)用N-硫酸化试剂处理所得的产物；步骤(ii)到(vi)之一结束时所得的任何产物都可任选地使其解聚。
用作原料的K5可以是通过生产K5的野生或克隆大肠杆菌株发酵而得到的任何一种产物。具体地说，可采用上述K5中的任一种，优选为M.Manzoni等人(Journal Bioactive CompatiblePolymers，1996，11，301-311)或WO 01/02597所述的其中一种，它最好预先经过纯化。
优选的K5原料具有较低分子量，特别是分子量分布在约1,500到约15,000范围内，优选约2,000到约9,000，平均分子量约5,000，或者具有较高分子量，特别是分子量分布在约10,000到约50,000范围内，优选约20,000到约40,000，平均分子量约30,000。优选的K5原料的分子量分布在约1,500到约50,000范围内，平均分子量为20,000到25,000。所有分子量以道尔顿(D)表示。K5及其下文所述的衍生物的分子量采用已知分子量的肝素组分作为标准来计算。
通常，由大肠杆菌制备K5多糖的第一步是按照意大利专利申请MI99A001465(WO 01/02597)及用下列培养基在烧瓶进行发酵脱脂大豆 2克/升磷酸氢钾 9.7克/升磷酸二氢钾 2克/升氯化镁 0.11克/升柠檬酸钠 1克/升硫酸铵 1克/升葡萄糖 2克/升水 1,000毫升pH7.3培养基在120℃灭菌20分钟。另外准备葡萄糖溶液，在120℃灭菌30分钟，将该溶液加在培养基中。向烧瓶中倾倒地注入大肠杆菌细胞Bi 8337/41(O10K5H4)悬浮液，所述悬浮液含胰蛋白大豆琼脂的斜面，并且在37℃恒定搅拌(160rpm，每转6cm)保温24小时。测量细菌生长，用显微镜计算细胞。在另一步骤中，把0.1％上述烧瓶培养基倒入含有上述同一种培养基的14升Chemap-Braun发酵罐中，发酵在下列条件进行18小时曝气1vvm(vvm是每分钟每液体体积的空气体积)、搅拌速度400rpm、温度37℃。测量发酵期间的pH值、氧气、残留的葡萄糖、产生的K5多糖及细菌生长。
发酵结束时将温度升到80℃，保持10分钟。以10,000rpm的转速离心分离细胞与培养基，上清液用SS316(MST)组件超滤，所述组件配有正常截留分子量为800到10,000D的PES滤膜，使体积减至1/5。再在4℃加入4体积丙酮沉淀K5多糖，沉淀物4℃放置过夜，最后10,000rpm离心20分钟或过滤。
接着，在37℃用Aspergillus Orizae的II型蛋白酶在含0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)(10毫克/升滤液)的0.1M氯化钠和0.15MpH8乙二胺四乙酸(EDTA)中去蛋白90分钟。该溶液在配有正常截留分子量为800到10,000D的滤膜的SS316组件上超滤，用1M氯化钠提取2次，用水洗至超滤液的吸收消失。再次用丙酮沉淀K5多糖，发酵罐的产率为850毫克/升。通过测定糖醛酸(咔唑方法)、质子和碳核磁共振、紫外线及蛋白含量来测量多糖的纯度。纯度超过80％。
由此所得的多糖由两种不同分子量的组分组成，用75HRPharmacia层析柱通过高效液相色谱法测定它们的分子量分别是30,000和5,000D，室温下以硫酸钠为流动相，流动速度为0.5毫升/分钟，采用两根串联Bio-sil SEC 250柱(BioRad)测得单一组分的停留时间约9分钟。这种测量是对照已知分子量的肝素组分的曲线而进行。质子的核磁共振见图2。
这样一种K5多糖可用作本发明方法的原料，因为它的纯度足以进行所述的方法。这种原料最好先经过纯化。
用Triton X-100处理可适当纯化多糖K5。通常将Triton X-100加在已经足够纯的上述K5多糖的1％水溶液中，直至浓度达到5％。溶液在55℃搅拌2小时。将温度升到75℃，冷却至室温过程中形成两相。上层相(有机相)重复热处理2次，形成两相。最后减压浓缩含有多糖的水相，用乙醇或丙酮沉淀。弃掉有机相。样本的纯度由质子核磁共振控制，所得的纯度为95％。
这种处理的产率是90％。
在步骤(i)中，采用本领域已知的方法使原料K5 N-脱乙酰化，再N-硫酸化。通常，取10克纯的K5溶解在100-2,000毫升2N氢氧化钠中，40-80℃下反应一段时间，直到完全N-脱乙酰化，这段时间不会超过30小时。该溶液冷却至室温，用6N盐酸调pH值至中性。
含有N-脱乙酰化K5的溶液保持在20-65℃，加入10-40克碳酸钠和10-40克硫酸化试剂，所述硫酸化试剂选自有效试剂，如吡啶.三氧化硫和三甲胺.三氧化硫加成物等等。硫酸化试剂的加入时间是可变化的，最长为12小时。反应结束时，溶液冷却至室温，若需要，用5％盐酸溶液调pH值至7.5-8。
用已知技术，例如用截留分子量为1,000D的螺旋膜(prepscalecartridge-Millipore)通过渗滤从盐纯化该产物。当渗透液的导电率少于1,000μS，优选少于100μS时表示该过程完成。用同一个过滤系统作为浓缩器将所得的产物浓缩至多糖浓度为10％。若需要，采用已知技术使浓缩液干燥。
通过碳13核磁共振测到N-硫酸盐/N-乙酰基之比在10/0到7/3范围内。
本发明步骤(ii)的C5差向异构化可采用溶液或固定化形式的葡萄糖醛酸基C5差向异构酶，例如在特定二价阳离子存在下进行，特别是有至少40％差向异构化，所述酶选自包括重组的葡萄糖醛酸基C5差向异构酶、小鼠肥大细胞瘤的葡萄糖醛酸基C5差向异构酶及牛肝提取的葡萄糖醛酸基C5差向异构酶的组，所述二价阳离子选自包括Ba、Ca、Mg和Mn的组，如WO 01/72848所述。一般来说，差向异构化作用按以下方法进行-用酶溶液进行C5差向异构化按照Campbell P.等人(Analytical Biochemistry 131，146-152(1983))所述的计算方法，将1.2×107到1.2×1011cpm(每分钟计数值)的天然或重组C5差向异构酶溶于2-2,000毫升25mM pH值在5.5和7.4之间的Hepes缓冲液中，所述缓冲液含有0.001-10克N-硫酸化K5和一种或多种离子，所述离子选自钡、钙、镁、锰，浓度在10和60mM范围内。反应在30和40℃，优选在37℃进行1-24小时。反应结束时在100℃使酶灭活10分钟。
使该产物通过二乙氨乙基树脂(DEAE树脂)或DEAE装置Sartobind，脱离2M氯化钠，最后在Sephadex G-10树脂脱盐而纯化，或者用2体积乙醇沉淀并通过IR 120H+树脂生成钠盐而使它纯化。
用WO 96/14425所述的1H-NMR计算到所得产物的艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比在40∶60和60∶40之间。
-用固定化酶进行C5差向异构化无论是天然还是重组的C5差向异构酶采用最常用的酶连接技术，例如溴化氰、戊二醛、碳二亚胺或者使酶与离子交换树脂反应或者用膜吸收，都可固定化在不同的惰性载体上，包括树脂、膜或由反应官能团衍生而来的玻璃珠。根据本发明，在底物N-硫酸化K5存在下使酶与惰性载体进行结合反应，以避免酶的连接活化位点丧失活性。按以下进行固定化酶活性的测定在37℃下使一定量N-硫酸化K5，在存在有25mM Hepes、0.1M氯化钾、0.01％Triton X-100和0.15M pH7.4 EDTA缓冲液的固定化酶层析柱上，以流速为0.5毫升/分钟，循环过夜，所述的N-硫酸化K5的量理论上可由固定化酶的每分钟循环次数差向异构化。该产物经过DEAE层析法纯化和Sephadex G-10脱盐后，冷冻干燥，并用质子核磁共振计算艾杜糖醛酸的含量。
艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比大约为30/70。
取20-1,000毫升25mM pH值在6到7.4的Hepes缓冲液，所述缓冲液含有一种或多种选自钡、钙、镁、锰浓度在10和60mM之间的离子，以及0.001-10克温度在30和40℃之间的N-硫酸化K5，30到40℃下使该缓冲液以30-160毫升/小时流速在层析柱循环1-24小时，所述层析柱在惰性载体上含有1.2×107到3×1011cpm固定化酶。反应结束时样本采用在溶液进行差向异构化所提到的同一种方法纯化。
所得产物的艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比在40∶60和60∶40之间。
根据一优选实施例，所述C5差向异构化用固定化形式的酶进行，包括使20-1,000毫升25mM pH值在6到7.4的Hepes溶液通过层析柱循环，所述Hepes溶液含有0.001-10克N-硫酸化K5和一种浓度在10和60mM之间的所述阳离子，所述层析柱在惰性载体上含有1.2×107到3×1011cpm固定化酶，所述pH值最好约等于7，所述C5差向异构化最好在约30℃使所述溶液以200毫升/小时流速循环约24小时下实现。
步骤(iii)由O-过硫酸化作用组成，进行该步骤时先将C5差向异构化N-硫酸化K5转为其叔盐或季盐，再在40-60℃下用O-硫酸化试剂处理所述盐10-20小时。含有步骤(ii)的差向异构化产物的溶液浓度为10％，一般在10℃冷却，经过IR 120 H+柱或等价物(35-100毫升)。柱和装该产物的容器保持在10℃。待溶液通过后，用去离子水清洗树脂，直至经过的流体pH值大于6(约3体积去离子水)。酸性溶液用叔胺或季胺如四丁基氢氧化铵(15％水溶液)调至中性，得到多糖的铵盐。该溶液浓缩至最小体积，冷冻干燥。所得的产物悬浮于20-500毫升二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中，并加入15-300克硫酸化试剂如固体形式的吡啶.三氧化硫加成物或在DMF或DMSO溶液中的吡啶.三氧化硫加成物。20-70℃溶液保持2-24小时，最好在40-60℃保持15-20小时。反应结束时将溶液冷却至室温，加入氯化钠饱和丙酮溶液直到完全沉淀。过滤分离沉淀物与溶剂，沉淀物溶于最小量的去离子水(例如100毫升)中，加入氯化钠配成0.2M溶液。该溶液用2N氢氧化钠调至pH7.5-8，并加入丙酮直到完全沉淀。过滤分离沉淀物与溶剂。所得的固体溶于100毫升去离子水中，并按步骤(i)所述的方法通过超滤从残留的盐纯化该固体。
将部分所得的产物冷冻干燥，以便用13C-NMR对过硫酸化产物作结构分析。根据Casu B.等人(Carbohydrate Research 1975，39，168-176)的方法计算所制成的产物每个二糖的硫酸盐含量是2.8-3.5。葡萄糖胺的6位有80-95％被硫酸化，2位则完全无被硫酸化。氨基糖的3位及糖醛酸的2位和3位还有其它硫酸根。
步骤(iv)由选择性O-脱硫酸化组成，该步骤是本发明方法的关键步骤，因为它可在步骤(vi)结束时制备糖胺聚糖，糖胺聚糖解聚后得到基本上保持较高抗血栓形成活性的低分子量产物。通常使含有步骤(iii)产物的溶液通过阳离子交换树脂IR 120 H+或等价物(35-100毫升)。待溶液通过后，用去离子水清洗树脂，直至经过的流体pH值大于6(约3体积去离子水)。酸性溶液用吡啶调至中性。该溶液浓缩至最小体积，冷冻干燥。所得的产物用20-2,000毫升DMSO/甲醇(9/1，体积/体积)溶液处理，50-70℃溶液保持135-165分钟，最好在60℃保持约150分钟。最后向该溶液加入10-200毫升去离子水，用氯化钠饱和丙酮溶液处理直到完全沉淀。
通过选择性O-脱硫酸化首先除去葡萄糖胺6位的硫酸根，然后除去糖醛酸3位和2位的硫酸根，最后是氨基糖3位的硫酸根。所得到的样本的13C-NMR谱图(图8)显示葡萄糖胺残基(56ppm处的信号)被完全N-脱硫酸化，在67.6ppm处的信号减少而在62.2ppm处出现信号表示几乎被完全6-O-脱硫酸化。65和86ppm处的信号分别表示2-O-硫酸化艾杜糖醛酸和3-O-硫酸化葡萄糖醛酸。按照已知的方法，例如利用截留分子量为1,000的螺旋膜(prepscale cartridge-Millipore)，通过渗滤纯化所得的固体。当渗透液的导电率少于1,000μS，优选少于100μS时表示该过程完成。用同一个过滤系统作为浓缩器将所得的产物浓缩至多糖浓度为10％。若需要，采用常规技术使浓缩液干燥。
步骤(v)由选择性6-O-脱硫酸化组成，如果希望实施下列步骤(vi)再进行解聚之后获得具有与肝素同样高的抗血栓形成活性，抗-Xa和HC II活性以及较低aPTT的化合物，就必须进行该步骤。进行选择性6-O-脱硫酸化时使选择性O-脱硫酸化产物转化为其叔盐或季盐，并在低温特别是0-5℃下用O-硫酸化试剂处理所述的盐0.5-3小时。通常进行6-O-硫酸化会按照上述步骤(iii)O-硫酸化步骤。参照步骤(iv)所述的渗滤方法纯化所得的固体。取少量冷冻干燥，通过13C-NMR作结构分析。如果按照Casu等人所述(Arzneimittel-Forschung Drug Research，1983，33，135-142)，用核磁共振计算6-O硫酸根的含量少于约85％，重复步骤(v)。
因为O-过硫酸化步骤损失的N-硫酸根百分比不可忽略，所以必须进行步骤(vi)。因此按照步骤(i)N-硫酸化所述的方法处理步骤(v)得到的溶液，分离本发明的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5。
无论步骤(ii)至(vi)之一结束时获得何种高分子量产物，它们都可通过化学解聚得到最终产物低分子量糖胺聚糖，其高抗血栓形成活性、抗-Xa和HC II活性与标准肝素同一数量级，而且aPTT活性比标准肝素低。
一般来说，进行本发明的方法时依次进行步骤(i)至(vi)，并使步骤(vi)结束时得到的高分子量C5-差向异构化N，O-硫酸化K5解聚。当然，如果采用可选择的预先纯化的低分子量K5组分作为原料来制备低分子量C5-差向异构化N，O-硫酸化K5，则无需解聚。
该解聚步骤可按照公知的肝素解聚方法进行，例如用亚硝酸，再与硼氢化钠反应(WO 82/03627、EP 37319)，用高碘酸钠(EP287477)、游离基(EP 121067)或消除β位(EP 40144)，以获得由混合链组成的最终产物糖胺聚糖，所述混合链至少80％的分子量分布在约2,000到约10,000的范围内，平均分子量约4,000到约8,000。
通过质子和碳13核磁共振以及诸如抗-Xa、aPTT、HC II、抗-IIa和对AT III的亲和力等测试对由本发明方法制成的糖胺聚糖进行特性分析。如上所述，硫酸化程度，即每个二糖单位的硫酸根数目，以硫酸盐/羧基之比(SO3-/COO-)表示，按照Casu等人，(Carbohydrate Research，1975，39，168-176)所述的方法测定。
步骤(vi)结束时所得的产物，无需作任何解聚也可通过树脂层析或超滤来分馏，获得2,000到8,000D的低分子量组分及25,000到30,000D的高分子量组分。
本发明的方法结束时所得的新型C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖一般以它们的钠盐形式分离出来。所述钠盐可转为另一种盐。所述另一种盐可以是另一种碱金属盐或一种碱土金属盐、铵盐、(C1-C4)三烷基铵盐、铝盐或锌盐。
由本发明方法所得的产物在抗-Xa试验中显示的活性可比拟提取的肝素，当测试的数值涉及抑制凝血酶、肝素辅因子II(HCII)、抗-IIa活性时，该产物的全抗凝血活性较低(aPTT方法)，与标准肝素处于同一个数量级或者比标准肝素高很多。可以预测，这些特性使所得的产物较市售肝素和其它已知的抗凝血糖胺聚糖具有更好的凝血控制和抗血栓形成性质，诸如出血等副作用也较少。
所以，本发明的另一个目的是提供可用以下一种方法得到的新型C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖，所述方法包括(i)使多糖K5与N-脱乙酰化试剂反应，再用N-硫酸化试剂处理N-脱乙酰化产物；(ii)用葡萄糖醛酸基C5差向异构酶使所得的N-硫酸化K5受到C-5差向异构化，得到C5差向异构化N-硫酸化K5，其中艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比为60/40到40/60；(iii)使艾杜糖醛酸含量占总糖醛酸40％-60％的C5差向异构化N-硫酸化K5转化为其叔盐或季盐，再在40-60℃下用O-硫酸化试剂在疏质子极性溶剂中处理所得的盐10-20小时；(iv)50-70℃下用二甲基亚砜/甲醇的混合物处理所得的具有O-过硫酸化产物有机碱的盐135-165分钟；(v)0-5℃下用O-硫酸化试剂处理所得的具有局部O-脱硫酸化产物有机碱的盐；(vi)用N-硫酸化试剂处理所得的产物；步骤(ii)到(vi)之一结束时所得的任何产物都可任选地使其解聚并使最终产物的钠盐可任选地转化为另一种盐。
特别优选的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖是那些用上述方法制备的产物，其中步骤(iv)在约60℃下在二甲基亚砜/甲醇(9/1，体积/体积)的混合物中进行约150分钟。
由K5衍生而来的一类优选糖胺聚糖是以预先纯化的K5为原料进行步骤(i)到(vi)而制成的，其中步骤(iv)约60℃下在二甲基亚砜/甲醇(9/1)混合物中进行约150分钟，可选择使所得的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5受到亚硝酸解聚，再用硼氢化钠还原。
所述其它优选的盐是另一种碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、(C1-C4)三烷基铵盐、铝盐或锌盐。
按照包括上述步骤(i)到(vi)的方法，再加上可选择的解聚和形成盐而制成的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖具有下图所示的结构I。
所以，本发明的另一个目的是提供由混合链组成的新型糖胺聚糖，所述链有至少90％以一般式I表示。
式中，40-60％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，n是3到100的整数，R、R1、R2和R3表示氢原子或SO3-硫酸根，约65％到约50％的R、R1、R2和R3是氢，其余为SO3-，分布如下-R3占SO3-约85％到约95％；-R2占SO3-约17％到约21％；
-在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约15％到约35％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约20％到约40％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比3％到7％；R1和R不能同时是SO3-，在25-45％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.3到约2.9，相应的阳离子是化学或药学上可接受的阳离子。
本文的术语“化学上可接受的”指一种用于化学合成的阳离子，如铵或(C1-C4)三烷基铵离子，或者指一种用于纯化产物的阳离子。
优选的硫酸化程度是约2.4到约2.7，约60％到约55％的R、R1、R2和R3是氢，其余为SO3-硫酸根。
优选的低分子量糖胺聚糖由混合链组成，所述混合链至少80％以一般式I表示，式中n是3到15。
在这些低分子量糖胺聚糖之中，特别优选的糖胺聚糖是混合链的分子量分布在约2,000到约10,000范围内，平均分子量约4,000到约8,000的糖胺聚糖。
这类优选的糖胺聚糖由平均分子量约6,000到约8,000的混合链组成，所述链至少90％以上述一般式I表示，式中约55％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位；R3占SO3-约85％到约90％；R2占SO3-约20％；在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约25％到约30％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-硫酸根约0到5％；在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约30％到约35％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-硫酸根0到约5％；在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约5％；R1和R不能同时是SO3-，在约30到约40％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.5到约2.7，相应的阳离子是化学或药学上可接受的阳离子。
这类特别优选的低分子量糖胺聚糖由平均分子量约7,000的混合链组成，所述链至少90％以上述一般式I表示，式中约55％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，以及-R3占SO3-约85％；-R2占SO3-约20％；-艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约25％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约30％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约5％；R1和R不能同时是SO3-，在约40％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.55，相应的阳离子是化学或药学上可接受的阳离子。
对步骤(iv)后所得的化合物作13C-NMR，测量分别表示3-O-硫代-葡萄糖醛酸单位和2-O-硫代-艾杜糖醛酸单位的83和62ppm处的面积，并考虑步骤(vi)加入的SO3-硫酸根百分比与硫酸根的总量相比可以忽略，测定葡萄糖醛酸部分3位和艾杜糖醛酸部分2位的硫酸根百分比。
优选化学和药学上可接受的阳离子是由碱金属、碱土金属、铵、(C1-C4)三烷基铵、铝或锌衍生而来的阳离子，特别优选是钠和钙离子。
优选的高分子量糖胺聚糖由混合链组成，所述混合链至少80％以一般式I表示，式中n是20到100。
在这些高分子量糖胺聚糖之中，优选的糖胺聚糖是混合链的分子量分布在约9,000到60,000范围内，平均分子量约12,000到约30,000的糖胺聚糖。
这类特别优选的高分子量糖胺聚糖由平均分子量约14,000-16,000的混合链组成，所述链至少90％以上述一般式I表示，式中约55％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，以及-R3占SO3-约85％到约90％；-R2占SO3-约20％；-在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约25％到约30％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约30％到约35％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约5％；R1和R不能同时是SO3-，在约30％到约40％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.5到约2.7，相应的阳离子是化学或药学上可接受的阳离子。优选的平均分子量约15,700。
用依次包括上述步骤(i)到(vi)的方法，再加上可选择的解聚和形成盐而制成的新型糖胺聚糖，特别是由混合链组成的糖胺聚糖，而所述90％混合链以一般式I表示，式中R、R1、R2和R3如上述定义，相应的阳离子是化学或药学上可接受的阳离子，优选为钠和钙离子，这些糖胺聚糖在凝血参数方面显示感兴趣的生物活性。具体地说，所述的新型糖胺聚糖的抗-Xa和HC II活性至少与标准肝素同一个数量级，抗-IIa(抗血栓形成)活性比标准肝素高，全抗凝血活性(以aPTT滴度表示)比标准肝素低。更加具体地说，所述的新型糖胺聚糖的抗-Xa/aPTT、HC II/aPTT和抗-IIa/aPTT之比是1.5到3，HC II/抗-Xa之比是1到3。
由于本发明的糖胺聚糖具有这样一些特性，所以它们可单独使用或与药学上可接受的赋形剂或稀释剂结合使用，用于凝血控制和进行抗血栓形成处理，特别是用于预防或治疗血栓形成。
所以，本发明的另一个目的是提供一些药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的药学有效量的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖，这些糖胺聚糖用以下方法制备如上所述进行上述步骤(i)到(vi)，再加上可选择的解聚和形成药学上可接受的盐，并结合药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
优选的活性成分按照上述步骤(i)到(vi)，再加上形成药学上可接受的盐而制备的，以预先纯化的K5为原料，约60℃下在二甲基亚砜/甲醇(9/1，体积/体积)中进行步骤(iv)约150分钟，并使步骤(vi)结束时所得的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5解聚。由此所得的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖优选的活性成分是碱金属盐、碱土金属盐、铝盐或锌盐。
具体地说，本发明提供一些药物组合物，所述药物组合物包括一作为活性成分的药学有效量的由混合链组成的糖胺聚糖以及一药学载体，所述链至少90％以上述一般式I表示，式中40-60％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，n是3到100的整数，R、R1、R2和R3表示氢原子或SO3-硫酸根，约65％到约50％的R、R1、R2和R3是氢，其余为SO3-硫酸根，分布如下-R3占SO3-约85％到约95％；-R2占SO3-约17％到约21％；-在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约15％到约35％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；
-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约20％到约40％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比3％到7％；R1和R不能同时是SO3-，在25-45％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.3到约2.9，相应的阳离子是化学或药学上可接受的阳离子。
更加具体地说，上述组合物用于凝血控制或者预防或治疗血栓形成。
在所述药物组合物中，所述的糖胺聚糖活性成分配成有效剂量供静脉、皮下或局部使用，或者用于预防或治疗由凝血系统失调引起的疾病，如动脉或静脉血栓，治疗血肿或用作手术过程的控凝剂。
在供静脉或皮下注射的制剂中，糖胺聚糖活性成分溶于水，若需要有缓冲液，可在无菌条件下将溶液装在小瓶或注射器中。
所述药物组合物的单位剂量是0.1到2毫升水含有5到100毫克最好20到50毫克活性成分。
在作局部使用的组合物中，糖胺聚糖活性成分与本领域公知的药学上可接受的载体或稀释剂混合，制成凝胶、乳膏、软膏、喷射药水或溶液。在所述组合物中，糖胺聚糖活性成分的浓度最好是0.01％到15％(重量)。
优选的药物组合物包括一作为活性成分、药学上有效量的糖胺聚糖以及一药学载体，所述糖胺聚糖由以上述一般式I表示的混合链组成，其中抗衡离子是药学可接受的离子，优选选自碱金属离子、碱土金属离子、铝离子和锌离子，最好是钠或钙离子。
在这些优选糖胺聚糖中，优选的活性成分是那些含有至少80％以一般式I表示的链的糖胺聚糖，式中n是3到15或者20到100，特别优选的是那些含有分子量分布约2,000到约10,000，平均分子量约4,000到约8,000或者含有分子量分布约9,000到约60,000，平均分子量约12,000到约30,000的混合链的糖胺聚糖。
特别优选的药物组合物包括作为活性成分由解聚混合链组成的糖胺聚糖，所述链至少90％以上述一般式I表示，式中40-60％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，n是3到100的整数，R、R1、R2和R3表示氢原子或SO3-硫酸根，约65％到约50％的R、R1、R2和R3是氢，其余为SO3-硫酸根，分布如下-R3占SO3-约85％到约95％，优选约85％；-R2占SO3-约17％到约21％，优选约20％；-在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约15％到约35％，优选约25％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约20％到约40％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约3到约7％；R1和R不能同时是SO3-，在25-45％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.3到约2.9，优选约2.4到约2.7，相应的阳离子是药学上可接受的阳离子，所述解聚混合链含有至少80％所述链，分子量分布约2,000到约10,000，平均分子量约4,000到约8,000。
优选的药物组合物含有作为活性成分的药学上有效量的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖由平均分子量约6,000到约8,000的混合链组成，而所述链至少90％以上述一般式I表示，式中约55％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，R3占SO3-约85％到约90％；R2占SO3-约20％；在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约25％到约30％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约30％到约35％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约5％；R1和R不能同时是SO3-，在约30％到约40％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.5到约2.7，相应的阳离子是化学或药学上可接受的阳离子。
这类优选的低分子量糖胺聚糖活性成分由平均分子量约7,000的混合链组成，所述链至少90％以上述一般式I表示，式中约55％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，以及-R3占SO3-约85％；-R2占SO3-约20％；-在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约25％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约30％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约5％；R1和R不能同时是SO3-，在约40％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.55，相应的阳离子是药学上可接受的阳离子。特别优选的糖胺聚糖活性成分具有这些特性，且平均分子量为7,400。
最后，本发明涉及有效量的所述糖胺聚糖，用于凝血控制以及治疗抗血栓形成。
所以，本发明的又一目的是提供一种哺乳动物凝血控制或者预防或治疗血栓形成的方法，所述方法包括给需要凝血控制或需要所述预防或治疗的所述哺乳动物施加一药学上有效量的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖，所述糖胺聚糖通过进行上述步骤(i)到(vi)，再加上可选择的解聚和形成药学上可接受的盐而制成。
更加具体地说，所述方法包括给所述的哺乳动物施加一药学有效量由混合链组成的糖胺聚糖，所述链至少90％以上述一般式I表示，具体规定同上所述。
下列实施例对本发明进行详细说明，但并不构成对本发明的限制。
本文指出分子量的一般特性及糖胺聚糖的生物活性，与未分级肝素(第四国际标准)和低分子量肝素(第一国际标准)进行比较。
根据Harenberg和De Vries(J.Chromatography，1983，261，287-292)或者用单柱(Pharmacia 75HR)或者用双柱(BioRad Bio-silSEC250)计算分子量，特别是平均分子量。最终产物的分子量由于本发明的方法所采用的反应条件而可能与原料多糖的分子量不同。
根据D.P.Thomas等人(Thrombosis and Haemostasis，1981，45，214)测定相对第四国际标准肝素的抗-Xa活性。
全抗凝血活性的aPPT试验按照Andersson等人(ThrombosisResearch，1976，9，575)的方法进行。
HC II活性试验按以下方法进行取20微升0.05PEU/毫升(PEU血浆当量单位)HC II(Stago)的水溶液与80微升不同浓度的待检测样本溶液及在0.02M pH7.4 tris缓冲液中的50微升凝血酶混合，所述缓冲液含有0.15M盐酸和0.1％PEG-6,000。该溶液在37℃培养60秒，再加入50微升1mM显色底物光谱酶(Spectrozyme)(American Diagnostic)。采用自动血凝度计ACL 7000(Instrumentation Laboratory)在405nm处记录反应的每秒测定值，连续记录180秒。
抗IIa试验按以下方法进行取30微升0.5U/毫升AT III(Chromogenix)在0.1M pH7.4 tris缓冲液中的溶液与30微升不同浓度的待检测样本溶液及在0.1M pH7.4 tris缓冲液中的60微升凝血酶[5.3nKat(酶活性单位)/ml-Chromogenix]混合。该溶液在37℃培养70秒，再加入60微升0.5mM显色底物S-2238(Chromogenix)水溶液。采用自动血凝度计ACL 7000(Instrumentation Laboratory)在405nm处记录反应的每秒测定值，连续记录90秒。
根据Hk等人(FEBS Letters，1976，66，90-93)的方法测定AT III的亲和力。
实施例1如意大利专利申请MI99A001465(WO 01/02597)所述，通过发酵制备10克K5多糖，纯度为80％(图2)，将这些多糖溶于去离子水中，配成1％的溶液。加入Triton X-100使浓度达到5％，55℃溶液搅拌2小时。使该溶液的温度升到75℃，保持在该温度下直至获得均匀混浊的体系，再将溶液快速冷却至室温。冷却期间形成两相。上层相(有机相)重复所述热处理二次。最后使含K5的水相减压浓缩到1/10，用丙酮或乙醇沉淀。弃掉有机相。
所得的产物用质子核磁共振检测并与工作标准的谱图(图1)作比较，确定是K5，纯度为90％(图3)，用双柱高效液相色谱法(BioRad Bio-sil SEC250)分析确定停留时间是9分钟。
这个方法按下列步骤进行(i)将预先纯化的K5溶于1,000毫升2N氢氧化钠溶液中，60℃保持18小时。溶液冷却至室温，再用6N盐酸调pH至中性。得到N-脱乙酰化K5。
使含N-脱乙酰化K5的溶液保持在40℃，一步加入10克碳酸钠，并在10分钟内加入20克吡啶.三氧化硫加成物。反应结束时将溶液冷却至室温，再用5％盐酸溶液调pH为7.5-8。
所得的产物是N-硫酸化K5，采用截留分子量为1,000D的螺旋膜(prepscale cartridge-Millipore)通过渗滤从盐纯化该产物。当渗透液的导电率少于100μS时中止纯化过程。用同一个渗滤系统将膜截留的产物浓缩到10％多糖，然后冻干。
用碳13核磁共振测定所得产物的N-硫酸盐/N-乙酰基之比是9.5/0.5(图4)。
(ii)1-固定化C5差向异构酶的制备按照WO 98/48006的方法制备5毫克重组C5差向异构酶，相当于1.2×1011cpm(每分钟计数值)，将这些酶溶于200毫升含0.1M氯化钾、0.1％Triton X-100和15mM乙二胺四乙酸(EDTA)的25mM pH7.4 Hepes缓冲液中，加入100毫克步骤(i)所得的N-硫酸化K5。4℃该溶液用30,000D的滤膜渗滤，直到N-硫酸化K5在渗透液消失。通过对200mM pH7碳酸氢钠渗滤改变滤膜保留的溶液的缓冲液，浓缩至50毫升后，加入50毫升CNBr活化的琼脂糖4B树脂，4℃反应过夜。反应结束时用Quantigold方法(Diversified Biotec)测量经过离心后的上清液残留的酶的含量。上清液不含有酶，表示所述的方法使所有酶固定化。为了占据其余的空位点，用100mM pH8 tris清洗树脂。要测量固定化酶的活性，将理论上相当于1.2×107cpm的固定化酶装入层析柱。在层析柱中，使按步骤(i)所述方法制成的1毫克N-硫酸化K5溶于含25mMHepes、0.1M氯化钾、0.015M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.01％TritonX-100的pH7.4缓冲液中，37℃该溶液通过所述层柱重新循环过夜，流速为0.5毫升/分钟。
用DEAE层析系统纯化并经Sephadex G-10脱盐后，使样本冻干，采用WO 96/14425所述的质子核磁共振技术分析其艾杜糖醛酸的含量。
艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比是30/70(图5)。
2-差向异构化取10克N-硫酸化K5溶于600毫升含50mM氯化钙的25mMpH7 Hepes缓冲液中。使配好的溶液通过50毫升装有含固定化酶的树脂的层析柱重新循环。
反应在30℃进行24小时，流速为200毫升/小时。所得的产物通过渗滤纯化，并用乙醇沉淀。沉淀物溶于水，浓度为10％。
所得的差向异构化产物的艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比是54/46，而原料的艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比是0/100。
用1H-NMR计算差向异构化百分比(图6)。
采用咔唑方法(Bitter和Muir，Anal.Biochem.39 88-92(1971))测量糖醛酸相对标准的含量，计算产率是90％。
(iii)含有步骤(ii)所得的差向异构化产物的溶液用冷浴冷却至10℃，再通过IR 120 H+阳离子交换树脂(50毫升)。层析柱和装洗脱溶液的容器都保持在10℃。待溶液通过后，用3体积去离子水清洗树脂。经过的流动液pH值大于6。酸性溶液用15％四丁基氢氧化铵水溶液调至中性。该溶液在旋转蒸发器中真空浓缩到体积的1/10，并冻干。将产物悬浮于200毫升二甲基甲酰胺(DMF)中，加入溶于200毫升DMF中的150克吡啶.三氧化硫加成物。45℃溶液保持18小时。反应结束时使溶液冷却至室温，加入1,200毫升氯化钠饱和丙酮溶液。过滤分离所得的沉淀物与溶剂，将沉淀物溶于100毫升去离子水中，并加入氯化钠使浓度达到0.2M。溶液用2N氢氧化钠调pH为7.5-8，加入300毫升丙酮。过滤分离沉淀物。将所得的固体溶于100毫升去离子水中，如步骤(i)所述那样通过渗滤从残留的盐纯化这些固体。
用少量干燥的过硫酸化产物作13C-NMR，见图7。
(iv)使含有步骤(iii)的产物的溶液通过IR 120 H+阳离子交换树脂(50毫升)。待溶液通过后，用3体积去离子水清洗树脂。经过的流动液pH值大于6。酸性溶液用吡啶调至中性。40℃下该溶液在旋转蒸发器中真空浓缩到体积的1/10，并冻干。所得的产物是吡啶盐，加入500毫升二甲基亚砜/甲醇(9/1，体积/体积)溶液。60℃下该溶液保持2.5小时，再加入50毫升去离子水，最后用1,650毫升氯化钠饱和丙酮溶液处理。如步骤(i)所述那样通过渗滤纯化所得的固体，溶液的浓度为10％。
用少量干燥的产物作13C-NMR，见图8，其显示氨基糖6位的硫酸根含量是20％。
(v)使含有步骤(iv)的产物的溶液通过IR 120 H+阳离子交换树脂(50毫升)。待溶液通过后，用3体积去离子水清洗树脂。经过的流动液pH值大于6。酸性溶液用15％四丁基氢氧化铵水溶液调至中性。该溶液在旋转蒸发器中真空浓缩到体积的1/10，并冻干。所得的产物是四丁基铵盐，悬浮于200毫升DMF中。悬浮液冷却至0℃，用在100毫升DMF中的40克吡啶，三氧化硫加成物处理。一步加入硫酸化试剂。0℃溶液保持1.5小时，再加用750毫升氯化钠的饱和丙酮溶液处理。
如步骤(i)所述通过渗滤纯化所得的固体。
(vi)如步骤(i)N-硫酸化所述的方法处理步骤(v)的溶液。
用少量干燥的产物作13C-NMR，见图9。
所得的化合物的平均分子量是15,700(按照Harenberg和DeVries(J.Chromatography)的双柱层析法测定，BioRad Bio-silSEC250)，硫酸盐/羧基之比是2.55，艾杜糖醛酸含量是54％，N-硫酸盐含量大于90％，6-O硫酸盐含量是85％，3-O硫酸化葡萄糖胺含量是20％，艾杜糖醛酸2-O-硫酸盐含量是25％，葡萄糖醛酸3-O-硫酸盐含量是30％，不存在O-硫酸氢化糖醛酸单位，未硫酸化的糖醛酸单位含量约40％。考虑到硫酸盐/羧基之比是2.55，以差额法计算2-O-硫酸化葡萄糖醛酸和3-O硫酸化艾杜糖醛酸单位含有约5％硫酸根。此外，所得的化合物含有55％对AT III具有高亲和力的组分，将标准肝素的体外抗凝血活性定为100，所得的化合物的体外抗凝血活性如下抗-Xa 157、aPTT 78、抗-IIa 373、HC II 161。
实施例2如WO 82/03627所述，将实施例1步骤(vi)结束时所得的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5在受控条作下受到亚硝酸解聚。更加具体地说，取5克样本溶于250毫升水中，并用恒温槽冷却至4℃。用预先冷却至4℃的1N盐酸调pH至2，再加入10毫升1％亚硝酸钠溶液，若需要，用1N盐酸调pH至2。混合物缓慢搅拌15分钟，用预先冷却至4℃的1N氢氧化钠中和溶液，再加入溶于13毫升去离子水的250毫克硼氢化钠，缓慢搅拌4小时。用1N盐酸调该混合物的pH至5，所述混合物再搅拌10分钟，破坏过量的硼氢化钠，最后用1N氢氧化钠中和。产物用3体积乙醇沉淀回收，并在真空烘箱干燥。
图10所示为制成的化合物的13C-NMR谱图。该化合物的平均分子量是7,400，硫酸盐/羧基之比是2.55，艾杜糖醛酸含量是54％，N-硫酸盐含量大于90％，6-O硫酸盐含量是85％，3-O硫酸化葡萄糖胺含量是20％，艾杜糖醛酸2-O-硫酸盐含量是25％，葡萄糖醛酸3-O-硫酸盐含量是30％，不存在O-硫酸氢化糖醛酸单位，未硫酸化的糖醛酸单位含量约40％。考虑到硫酸盐/羧基之比是2.55，以差额法计算2-O-硫酸化葡萄糖醛酸和3-O硫酸化艾杜糖醛酸单位含有5％硫酸根。此外，所得的糖胺聚糖含有34％对ATIII具有高亲和力的组分，将标准肝素的体外抗凝血活性定为100，所得的糖胺聚糖的体外抗凝血活性如下抗-Xa 99、aPTT 52、抗-IIa 203、HC II 108。将第一国际标准的低分子量肝素(LMWH)的所述活性定为100，与之相比较，由此所得的解聚C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖的抗凝血活性如下抗-Xa 117、aPTT 173、抗-IIa 615(LMWH不测定HC II)。这些结果显示所得的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖的-抗-IIa/aPTT和抗-IIa/抗-Xa之比分别是标准肝素的约4倍和2倍。
-抗-IIa/aPTT和抗-IIa/抗-Xa之比分别是标准LMWH的约3.5倍和约5倍。
-HC II/aPTT和HC II/抗-Xa之比分别是标准肝素的约2倍和与之相等。
抗-Xa和HC II活性与标准肝素相若，而aPTT活性约为标准肝素的一半。
实施例3在步骤(ii)用Jin-Ping L等人所述方法(Characterization ofD-glucuronosyl-C5 epimerase involved in the biosynthesis ofheparin and heparan sulphate.Journal Biological Chemistry，2001，Vol.276，20069-20077)制备的重组酶重复实施例1。所得的化合物的平均分子量是14,900(按照Harenberg和De Vries的双柱层析法测定，BioRad Bio-sil SEC250)，硫酸盐/羧基之比是2.7，艾杜糖醛酸含量是54％，N-硫酸盐含量大于90％，6-O硫酸盐含量是90％，3-O硫酸化葡萄糖胺含量是20％，艾杜糖醛酸2-O-硫酸盐含量是30％，葡萄糖醛酸3-O-硫酸盐含量是35％，不存在O-硫酸氢化糖醛酸单位，未硫酸化的糖醛酸单位含量约30％。考虑到硫酸盐/羧基之比是2.7，以差额法计算2-O-硫酸化葡萄糖醛酸和3-O硫酸化艾杜糖醛酸单位含有约5％硫酸根。此外，将标准肝素的体外抗凝血活性定为100，所得的化合物的体外抗凝血活性如下抗-Xa 166、aPTT 76、抗-IIa 400、HC II 283。
无需作详细阐述相信本领域技术人员都能参照以上叙述来完全实施本发明。所以，上述优选的具体实施例只作为举例说明本发明而不以任何方式对本发明揭示的内容构成任何限制。
本领域技术人员根据上文可轻易地断定本发明的必要特征，在不脱离本发明的精神和范围内可对本发明作各种变化和改进，以使其适应各种应用和条件。
权利要求
1.一种K5糖胺聚糖的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(i)多糖K5的N-脱乙酰化/N-硫酸化，(ii)葡萄糖醛酸部分对相应的艾杜糖醛酸部分的羧基局部C5差向异构化，(iii)过硫酸化，(iv)选择性O-脱硫酸化，(v)任选的6-O-硫酸化，以及(vi)N-硫酸化，其中步骤(iv)包括用甲醇/二甲基亚砜的混合物处理步骤(iii)结束时所得的过硫酸化产物135-165分钟。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述处理时间约150分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述处理在约60℃进行约150分钟。
4.一种新型糖胺聚糖的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(i)使多糖K5与N-脱乙酰化试剂反应，再用N-硫酸化试剂处理N-脱乙酰化产物；(ii)用葡萄糖醛酸基C5差向异构酶使所得的N-硫酸化K5受到C-5差向异构化作用，得到C5差向异构化N-硫酸化K5，其中艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比为60/40到40/60；(iii)将艾杜糖醛酸含量占总糖醛酸40％-60％的C5差向异构化N-硫酸化K5转化为其叔盐或季盐，再在40-60℃下用O-硫酸化试剂在疏质子极性溶剂中处理所得的盐10-20小时；(iv)50-70℃下用二甲基亚砜/甲醇的混合物处理所得的具有O-过硫酸化产物有机碱的盐135-165分钟；(v)0-5℃下用O-硫酸化试剂处理所得的具有局部O-脱硫酸化产物有机碱的盐；(vi)用N-硫酸化试剂处理所得的产物；步骤(ii)到(vi)之一结束时所得的任何产物都可任选地使其解聚。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法使用预先纯化的K5作为原料。
6.如权利要求4和5中任何一项所述的方法，其特征在于步骤(i)中，使用肼或其盐或者碱金属氢氧化物作为N-脱乙酰化试剂，使用吡啶.三氧化硫加成物或三甲胺.三氧化硫加成物作为N-硫酸化试剂。
7.如权利要求4至6中任何一项所述的方法，其特征在于步骤(ii)中，在二价阳离子存在下，采用溶液或固定化形式的酶葡萄糖醛酸基C5差向异构酶进行所述的C5差向异构化。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述二价阳离子包括Ba、Ca、Mg、Mn中至少一种。
9.如权利要求4至8中任何一项所述的方法，其特征在于步骤(ii)中，所述差向异构酶包括重组的葡萄糖醛酸基C5差向异构酶、小鼠肥大细胞瘤的葡萄糖醛酸基C5差向异构酶及牛肝提取的葡萄糖醛酸基C5差向异构酶。
10.如权利要求4至9中任何一项所述的方法，其特征在于所述的C5差向异构化用固定化形式的酶进行并且包括使20-1,000毫升25mM pH值在6到7.4的Hepes溶液通过层析柱再循环，所述Hepes溶液含有0.001-10克N-硫酸化K5和一种浓度在10和60mM之间的所述阳离子，所述层析柱在惰性载体上含有1.2×107到3×1011cpm固定化酶。
11.如权利要求4至9中任何一项所述的方法，其特征在于所述pH值约等于7以及所述的C5差向异构化在约30℃用重组酶使所述溶液以约200毫升/小时的流速循环约24小时下实现。
12.如权利要求4至11中任何一项所述的方法，其特征在于步骤(iii)中，使用吡啶.三氧化硫加成物作为O-硫酸化试剂。
13.如权利要求4至12中任何一项所述的方法，其特征在于步骤(iv)中，所述反应在约60℃下在二甲基亚砜/甲醇(9/1，体积/体积)中进行约150分钟。
14.如权利要求4至13中任何一项所述的方法，其特征在于使用预先纯化的K5作为原料，步骤(iv)中，所述反应在约60℃下在二甲基亚砜/甲醇(9/1，体积/体积)中进行约150分钟。
15.如权利要求4至14中任何一项所述的方法，其特征在于步骤(v)中，所述6-O-硫酸化是在0-5℃用吡啶。三氧化硫加成物作为O-硫酸化试剂下实现。
16.如权利要求4至15中任何一项所述的方法，其特征在于步骤(vi)中，使用吡啶.三氧化硫或三甲胺.三氧化硫加成物作为N-硫酸化试剂。
17.如权利要求4至16中任何一项所述的方法，其特征在于使步骤(vi)结束时所得的产物受到亚硝酸解聚，再用硼氢化钠还原。
18.如权利要求4至17中任何一项所述的方法，其特征在于采用预先纯化的K5作为原料并在步骤(iv)中，所述反应在约60℃下在二甲基亚砜/甲醇(9/1，体积/体积)中进行约150分钟，使步骤(vi)结束时所得的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖受到亚硝酸解聚，再用硼氢化钠还原。
19.如权利要求4至18中任何一项所述的方法，其特征在于所得的糖胺聚糖以其钠盐形式分离出来。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于使所述的钠盐再转化为另一种盐。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于所述的另一种盐是另一种碱金属盐或者一种碱土金属盐、铵盐、(C1-C4)三烷基铵盐、铝盐或锌盐。
22.一种可由以下方法得到的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖，其特征在于所述方法包括(i)使多糖K5与N-脱乙酰化试剂反应，再用N-硫酸化试剂处理N-脱乙酰化产物；(ii)用葡萄糖醛酸基C5差向异构酶使所得的N-硫酸化K5受到C-5差向异构化，得到C5差向异构化N-硫酸化K5，其中艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸之比为60/40到40/60；(iii)使艾杜糖醛酸含量占总糖醛酸40％-60％的C5差向异构化N-硫酸化K5转化为其叔盐或季盐，再在40-60℃下用O-硫酸化试剂在疏质子极性溶剂中处理所得的盐10-20小时；(iv)50-70℃下用二甲基亚砜/甲醇的混合物处理所得的具有O-过硫酸化产物有机碱的盐135-165分钟；(v)0-5℃下用O-硫酸化试剂处理所得的具有局部O-脱硫酸化产物有机碱的盐；(vi)用N-硫酸化试剂处理所得的产物；步骤(ii)到(vi)之一结束时所得的任何产物都可任选地使其解聚并使最终产物的钠盐可任选地转化为另一种盐。
23.如权利要求22所述的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖，其特征在于步骤(iv)在约60℃下在二甲基亚砜/甲醇(9/1，体积/体积)的混合物中进行约150分钟。
24.如权利要求22所述的C5-差向异构化N，O-硫酸化K5糖胺聚糖，其特征在于采用预先纯化的K5作为原料并在步骤(iv)中，所述反应在约60℃下在二甲基亚砜/甲醇(9/1，体积/体积)中进行约150分钟，使步骤(vi)结束时所得的产物受到亚硝酸解聚，再用硼氢化钠还原。
25.一种由混合链组成的糖胺聚糖，其特征在于所述链至少90％以一般式I表示， 式中，40-60％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，n是3到100的整数，R、R1、R2和R3表示氢原子或SO3-硫酸根，约65％到约50％的R、R1、R2和R3是氢，其余为SO3-，分布如下-R3占SO3-约85％到约95％；-R2占SO3-约17％到约21％；-在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约15％到约35％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约20％到约40％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比3％到7％；R1和R不能同时是SO3-，在25-45％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.3到约2.9，相应的阳离子是化学或药学上可接受的阳离子。
26.如权利要求25所述的糖胺聚糖，其特征在于所述相应的阳离子是碱金属离子、碱土金属离子、铝离子或锌离子。
27.如权利要求25所述的糖胺聚糖，其特征在于所述相应的阳离子是钠离子或钙离子。
28.如权利要求25-27中任何一项所述的糖胺聚糖，其特征在于对于硫酸化程度约2.4到约2.7，约60％到约55％的R、R1、R2和R3是氢，其余为SO3-。
29.如权利要求25-28中任何一项所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链中至少80％的链以一般式I表示，式中n是3到15。
30.如权利要求29所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链中的所述链的分子量分布在约2,000到约10,000范围内，平均分子量约4,000到约8,000。
31.如权利要求30所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链中的所述链的平均分子量约6,000到约8,000，所述至少90％链以一般式I表示，式中约55％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位；R3占SO3-约85％到约90％；R2占SO3-约20％；在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约25％到约30％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-硫酸根0到约5％；在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约30％到约35％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-硫酸根0到约5％；在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约5％；R1和R不能同时是SO3-，在约30到约40％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.5到约2.7。
32.如权利要求31所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链中的链的平均分子量约7,000，所述链至少90％以一般式I表示，式中约55％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，以及-R3占SO3-约85％；-R2占SO3-约20％；-在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约25％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约30％，在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约5％；R1和R不能同时是SO3-，在约40％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.55。
33.如权利要求32所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链的平均分子量是7,400。
34.如权利要求25-28中任何一项所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链中至少80％的所述链以一般式I表示，式中n是20到100。
35.如权利要求34所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链的分子量分布在约9,000到约60,000范围内，平均分子量约12,000到约30,000。
36.如权利要求35所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链中的链的平均分子量约14,000-16,000，所述链至少90％以一般式I表示，式中约55％糖醛酸单位是艾杜糖醛酸单位，以及-R3占SO3-约85％到约90％；-R2占SO3-约20％；-在艾杜糖醛酸单位中R1占SO3-约25％到约30％，在葡萄糖醛酸单位中R1占SO3-0到约5％；-在葡萄糖醛酸单位中R占SO3-约30％到约35％，在艾杜糖醛酸单位中R占SO3-0到约5％；-在R1，葡萄糖醛酸单位中和在R，艾杜糖醛酸单位中SO3-总百分比约5％；R1和R不能同时是SO3-，在约30％到约40％糖醛酸单位中R1和R都是氢；硫酸化程度约2.5到约2.7。
37.如权利要求36所述的糖胺聚糖，其特征在于所述混合链的平均分子量是15,700。
38.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括一作为活性成分、药学上有效量的如权利要求22-37所述的糖胺聚糖作为其药学上可接受的盐，以及一药学上可接受的载体。
39.一种哺乳动物凝血的控制方法，其特征在于所述方法包括给需要所述的凝血控制的所述哺乳动物施加一药学上有效量的如权利要求22-37所述的糖胺聚糖。
40.一种哺乳动物血栓形成的预防或治疗方法，其特征在于所述方法包括给所述哺乳动物施加一药学上有效量的如权利要求22-37所述的糖胺聚糖。
41.如权利要求39至40中任何一项所述的方法，其特征在于所述有效量以含有5到100毫克所述的糖胺聚糖的药物组合物施加。
全文摘要
本发明以可选择纯化的K5多糖作为原料通过一种方法制备由K5多糖衍生具有高抗血栓形成活性的糖胺聚糖，其用于凝血控制及作为抗血栓药，所述方法包括以下步骤N－脱乙酰化/N－硫酸化、葡萄糖醛酸部分至少40％进行C5差向异构化、O－过硫酸化、选择性O－脱硫酸化、6－O－硫酸化、N－硫酸化以及任选的解聚，其中选择性O－脱硫酸化步骤是在50－70℃用二甲基亚砜/甲醇的混合物处理过硫酸化产物135－165分钟实现的。因此，由控制选择性O－脱硫酸化步骤的反应时间以及使最后N－硫酸化步骤结束时所得的产物解聚，可得到特别是感兴趣的新型抗血栓形成化合物。
文档编号C08B37/00GK1531555SQ01822710
公开日2004年9月22日 申请日期2001年12月17日 优先权日2000年12月18日
发明者帕斯夸·奥雷斯特, 乔治·佐派蒂, 佐派蒂, 帕斯夸 奥雷斯特 申请人:帕斯夸·奥雷斯特, 乔治·佐派蒂, 帕斯夸 奥雷斯特