专利名称：牛膝多糖衍生物、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多糖免疫调节剂及其制备方法和用途，特别是牛膝多糖衍生物类免疫调节剂。
牛膝多糖的分子末端为一个α-D-批喃葡萄糖，后面接2→6连接或2→1连接的β-D-呋喃果糖，牛膝多糖的ESI质谱显示其包括四糖～二十一糖，以六糖～十五糖为主。牛膝多糖具有抗肿瘤和增强免疫功能的作用。
近年来，多糖衍生物的抗病毒作用已引起国内外药物学家和病毒学家的极大兴趣。例如，不少含有硫酸酯、磷酸酯的多糖具有独特的生物活性。如β-(1→3)-D-葡聚糖磷酸化后，活性大大提高；羟乙基化的茯苓聚糖显示了较好的抗肿瘤活性，但高取代的羟乙基化茯苓聚糖却无抗肿瘤活性[Chem.Pharm.Bull.，1989，37，1838]。
目前，国内外对多糖磷酸化和羟烷基化的研究不多，且取代度不高，这极不利于对其进行结构于功能关系的研究。本发明对牛膝多糖进行了磷酸化及羟炕基化。
本发明对牛膝多糖进行了衍生化，包括磷酸酯化或羟烷基化，制得了牛膝多糖衍生物包括牛膝多糖磷酸酯(盐)及羟烷基牛膝多糖。 寡糖和多糖结构的复杂性给寡糖和多糖的结构分析带来了极大的困难。本发明的牛膝多糖磷酸酯(盐)及羟烷基牛膝多糖据分析其取代度、糖数具有如右所示结构右式中R＝H、PO3Na2或(CH2)kOH，其中k＝2～4，a，b，c，d，o，p，q＝2～19，a+b+c+d+o+p+q=2～19。尤以下述结构为主 其中牛膝多糖磷酸酯(盐)的13C-NMR图谱数据例如果糖呋喃环上的化学位移数据δ63.3～63.6、106.0～107.0、79.4～80.9、77.5～78.4或83.0～84.1、65.0～66.2ppm，葡萄糖吡喃环上的碳的化学位移数据δ95.5、74.1、75.5、82.8、74.6、63.0ppm。牛膝多糖磷酸酯(盐)的红外图谱的数据例如3700～3000cm-1的强宽峰为分子间及分子内羟基吸收，2950～2870cm-1为C-H键伸缩振动，1266cm-1为P＝O键振动，950～1050cm-1为P-O-C不对称振动，1000～1100cm-1为C-O-C醚键不对称伸缩振动。对牛膝多糖磷酸酯(盐)产物中的磷含量进行测定，计算得其取代度在0.1～2左右，其计算公式如下D.S.＝(162*P)/(3100-124*P)。其中D.S.为取代度，P为磷的百分含量。例如
其中羟乙基牛膝多糖的13CNMR(D2O)谱例如果糖呋喃环上的异头碳的化学位移δ105.9～107.0；葡萄糖吡喃环上的异头碳的化学位移δ95.2；羟乙基上的1位亚甲基的化学位移δ74.5、74.9、75.4，2位亚甲基的化学位移δ63.1、63.2、63.3、63.4。羟乙基牛膝多糖的IR(KBr)谱例如3370cm-1的强宽峰为分子间及分子内羟基吸收，2950、2900cm-1为C-H伸缩，羟乙基化后该吸收峰比母体有所增强，1457cm-1为亚甲基的剪式振动，1357cm-1为C-H的非平面摇摆振动，1150～1000cm-1强宽峰为糖环上醚键C-O-C不对称伸缩振动和键伸缩振动的叠加，937cm-1为呋喃环伸缩振动。892cm-1为-CH2-CH2-的平面摇摆振动。羟乙基牛膝多糖的元素分析例如C，42.87％；H，6.82％。
本发明的牛膝多糖衍生物可通过如下方法合成在0～100℃下，用磷酸化试剂或羟烷基化试剂，在有机溶剂或碱性水溶液中与牛膝多糖反应，生成不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(盐)或羟烷基牛膝多糖，所述的羟烷基化试剂是分子式为(CH2)kO的环氧烷或分子式为X(CH2)kOH的取代烷烃，所述的磷酸化试剂是三氯氧磷、二聚磷酸钠、多聚磷酸、五氧化二磷等，所述的牛膝多糖与磷酸化试剂或羟烷基化试剂的摩尔比为1∶1～9。推荐的反应时间为0.5～72小时。其中通过改变反应溶剂、反应试剂的量、反应时间、反应温度，可生成不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(盐)或羟烷基牛膝多糖。反应后将反应溶液中和，再经分离纯化得纯品。其中羟烷基牛膝多糖的制备方法推荐在碱性水溶液中，用(CH2)kO或X(CH2)kOH作为羟烷基化试剂，与牛膝多糖反应，生成羟烷基牛膝多糖。所述的X＝Cl、Br、I，所述的k＝2～4。其中牛膝多糖磷酸酯(盐)的制备方法推荐在0～50℃下，用三氯氧磷、二聚磷酸钠、多聚磷酸或五氧化二磷为磷酸化试剂，在有机溶剂或碱性水溶液中与牛膝多糖反应，生成牛膝多糖磷酸酯(盐)。所述的有机溶剂是乙腈、吡啶、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬烷-5-烯(DBN)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一烷-7-烯(DBU)或四氢呋喃等；所述的碱性水溶液是无机碱的水溶液或无机碱和无机盐的混合水溶液，所述的无机碱如NaOH、KOH等，例如NaOH的水溶液或NaOH、NaCl的混合水溶液，推荐的NaOH的水溶液的浓度为1％～30％，推荐的NaCl的水溶液的浓度为0～30％。
经生物活性试验，研究结果显示牛膝多糖磷酸酯(盐)或羟烷基牛膝多糖具有较好的抑制Lewis肺癌和S-180肺癌的效果，并能提高小鼠NK细胞活性，具有增强免疫活性的作用。
本发明用简便的合成方法，制备了牛膝多糖磷酸酯(盐)及羟烷基牛膝多糖，大大提高了衍生物的取代度，克服了以往其它多糖取代度低困难。本发明的牛膝多糖磷酸酯(盐)及羟烷基牛膝多糖有利于构效关系的研究，且具有抗肿瘤及增强免疫力的作用，适于工业化。
图4是羟乙基牛膝多糖的13C-NMR图谱。
图5是牛膝多糖磷酸酯(盐)的红外光谱图。样品扫描数32；背景扫描数32。
图6是牛膝多糖磷酸酯(盐)的13C-NMR图谱。
图7是牛膝多糖磷酸酯(盐)的31P谱图8是牛膝多糖(AbPS)的质谱总图。
实施例2取5ml二甲亚砜，加入300mg牛膝多糖搅拌溶解，搅拌下滴加1ml三氯氧磷，加入吡啶使pH在中性左右。在室温搅拌反应，反应2小时后，倾入冰水中，用氢氧化钠中和，丙酮沉淀，离心，将沉淀溶解、透析、冰冻干燥，再经A-50和G-50柱层析纯化，即得牛膝多糖磷酸酯(盐)。所得产物磷酸根的取代度为0.8，具有抗肿瘤和增强免疫活性。
实施例3取10ml乙腈加入2ml吡啶，在冰水浴下滴加2ml三氯氧磷，滴加0.3ml双蒸水，搅拌，将500mg牛膝多糖溶于8ml磷酸三甲酯中，在加入上述反应液中，加入吡啶使pH在7左右。在冰水浴下搅拌反应5小时后，用氢氧化钠调pH至中性。丙酮沉淀，离心，将沉淀溶解、透析、冰冻干燥，再经A-50和G-50柱层析纯化，即得牛膝多糖磷酸酯(盐)。所得产物磷酸根的取代度为1.5，具有抗肿瘤和增强免疫活性。
实施例4取20ml吡啶，加入1.3g P2O5，搅拌，加入几滴蒸馏水，加入经充分搅拌的牛膝多糖吡啶液，移至100℃油浴中，加热反应1hr后，倾入冰水中，2N NaOH中和。丙酮沉淀，溶解，透析，浓缩，冰冻干燥。再经A-50和G-50柱层析纯化，即得牛膝多糖磷酸酯(盐)。
实施例5称260mg三聚磷酸钠溶于水，调pH至12，加入牛膝多糖250mg。室温搅拌反应4hr。2N HCl中和，丙酮沉淀，溶解，透析，浓缩，冰冻干燥。再经A-50和G-50柱层析纯化，即得牛膝多糖磷酸酯(盐)。
实施例6牛膝多糖500mg溶于1％～30％氢氧化钠与0％～30％氯化钠的混合溶液中，在冰浴中加入环氧乙烷0.5ml，加完后，0～50℃反应24小时。反应结束后，将溶液用1M盐酸中和至pH＝7，丙酮沉淀，离心，透析，冷冻干燥，Sephadex G-25柱层析纯化。
实施例7牛膝多糖500mg溶于20％氢氧化钠与3％氯化钠的混合溶液中，在冰浴中加入环氧乙烷1.0ml，加完后，35℃反应12小时。然后，再次在冰浴中加入环氧乙烷1.0ml，35℃反应12小时，反应结束后，将溶液用1M盐酸中和至pH＝7，丙酮沉淀，离心，透析，冷冻干燥，Sephadex G-25柱层析纯化。
实施例8 牛膝多糖磷酸酯(盐)的生物活性研究我们对不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(盐)送检生物活性测定，其结果如下1、牛膝多糖磷酸酯(盐)对小鼠Lewis肺癌足趾接种的疗效试验
*表示试验组与阴性对照组相比p＜0.012、牛膝多糖磷酸酯(盐)对小鼠S-180肉癌(腋皮下接种)的试验结果
*表示试验组与阴性对照组相比p＜0.013、牛膝多糖磷酸酯(盐)对荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影响
#为(效应细胞+靶细胞OD均值)-效应细胞OD均值*表示试验组与阴性对照组相比p＜0.0权利要求
1.一种牛膝多糖衍生物，其特征是包括牛膝多糖磷酸酯(盐)或羟烷基牛膝多糖，所述的牛膝多糖磷酸酯(盐)或羟烷基牛膝多糖具有如下结构 式中R＝H、PO3Na2或(CH2)kOH，其中k＝2～4，a，b，c，d，o，p，q＝2～19，a+b+c+d+o+p+q＝2～19。
2.如权利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征是具有如下结构 式中m、n＝2～19，m+n＝2～19，R如权利要求1所述。
3.如权利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征是所述的PO3Na2取代度在0.1～2左右。
4.如权利要求1所述的牛膝多糖衍生物的制备方法，其特征是包括如下步骤(1)或步骤(2)(1)在0～100℃下，用(CH2)kO或X(CH2)kOH作为羟烷基化试剂，所述的k＝2～4，所述的X＝Cl、Br、I，在碱性水溶液中与牛膝多糖反应，其中牛膝多糖与羟烷基化试剂的摩尔比为1∶1～9，生成羟烷基牛膝多糖；(2)在0～100℃下，用三氯氧磷、二聚磷酸钠、多聚磷酸或五氧化二磷为磷酸化试剂，在有机溶剂或碱性水溶液中与牛膝多糖反应，其中牛膝多糖与磷酸化试剂的摩尔比为1∶1～9，生成牛膝多糖磷酸酯(盐)。
5.如权利要求4所述的牛膝多糖衍生物的制备方法，其特征是所述的有机溶剂是乙腈、吡啶、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬烷-5-烯、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一烷-7-烯或四氢呋喃。
6.如权利要求4所述的牛膝多糖衍生物的制备方法，其特征是所述的碱性水溶液是无机碱的水溶液或无机碱和无机盐的混合水溶液。
7.如权利要求6所述的牛膝多糖衍生物的制备方法，其特征是所述的无机碱的水溶液或无机碱和无机盐的混合水溶液是NaOH的水溶液或NaOH、NaCl的混合水溶液。
8.如权利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征在于所述的牛膝多糖衍生物具有抗肿瘤和增强免疫功能作用。
全文摘要
本发明涉及牛膝多糖衍生物包括牛膝多糖磷酸酯(盐)及羟烷基牛膝多糖，其是用磷酸化试剂或羟烷基化试剂，在相应条件下与牛膝多糖生成不同取代度的牛膝多糖衍生物，这一系列不同取代度的牛膝多糖衍生物经生物活性试验表明，具有抗肿瘤及增强免疫功能的作用。
文档编号C08B37/00GK1397565SQ0211098
公开日2003年2月19日 申请日期2002年3月8日 优先权日2002年3月8日
发明者田庚元, 陈晓明, 张健 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 浙江京新药业股份有限公司