专利名称：聚乙二醇-脂肪酸衍生物及其药物结合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的、对水解稳定的，通过醚键连接的聚乙二醇-脂肪酸衍生物，它们的制备办法，以及该类衍生物与药物的结合产物，及其医药用途。
背景技术：
天然药物活性成分中的蛋白质、多肽、萜类、甾体、生物碱、黄酮、蒽醌、苯丙素酚类等在生理活性上都表现出各种有效的性能，在医药中得到了广泛的应用。它们的甙类、核苷类、多肽类衍生物也有相当的应用。作为天然活性成分，它们具有生物降解快，基本无残留，毒副作用小等优点。但同时也有相应的问题存在，例如生物利用率低、生理半衰期短、水溶性差、引发机体免疫等不利之处。
解决此问题，已广泛地使用聚乙二醇(PEG)衍生物，使其与蛋白质、肽或其他治疗药物结合，以降低生物降解作用，延长药物的生理半衰期、降低其免疫原性和毒性。在临床使用中，PEG及其衍生物作为制作药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用。而将PEG键合到药物分子的尝试在最近十年里也得到了长足的发展。如PEG-intron_，一种α-干扰素与聚乙二醇的键合物就表现出了更长的循环半衰期和更好的治疗效果。紫杉醇与聚乙二醇的键合物也相应的降低了毒性和延长了生物活性。聚乙二醇在人体内的代谢过程已相当清楚，是一种安全的，无副作用的药物改性剂。
聚乙二醇可以用于和很多药物连接。在与药物结合时，常用到一种被称为聚乙二醇化(PEGylation)的工艺，即聚乙二醇两端的一个或二个端基被化学活化后具有一适当的官能团，此官能团对要结合的药物中的至少一个官能团具有活性，能与之形成化学键。形成的键合物可在体内适当的情况下释放出活性成分。
活性聚乙二醇(PEG)衍生物在很多文献中均有报道。第5672662号美国专利描述了制备线形PEG的丙酸和丁酸以及它们的NHS酯。第5643575号美国专利描述了一种U形结构的PEG衍生物，在这种结构中，两个线形PEG结构通过相同的基团连接到同一个分子上。但是在这些酸性基团和PEG之间的连接基团的疏水性从来没有被认真地考虑和研究过。
PEG脂肪酸作为一种表面活性剂在广泛地应用。但是脂肪酸部分在和PEG的连接过程中采用的多是脂肪酸的羧酸基团和PEG中的羟基或者氨基连接，形成的酯键或者酰胺键缺乏一定的稳定性。在这些结构中，脂肪酸的羧酸基团没有了，无法和药物分子键合。
采用醚键连接的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物将会具有更高的水解稳定性，它在PEG骨架和脂肪酸酸性基团之间提供了一个稳定的连接方式，有利于保证脂肪酸在以后的药物连接过程中保持足够的特性。这种连接方式所得到的PEG衍生物和药物连接，将在水溶液中形成一种微球结构，药物分子及疏水性的脂肪酸骨架会被PEG包裹在其中而得到保护。能够有效的降低酶降解作用，提高在生物体内的半衰期和改变体内分布。如果它连接的对象本身也是一个疏水性的药物前体，将会获得更好的效果。当前商业中的PEG的羧酸衍生物，比如羧甲基化PEG、PEG丙酸、PEG丁酸都不具备足够强的疏水性基团，因此它们和药物结合物，比如紫杉醇，不形成微球结构，在水中会很快被水解掉而释放出PEG成分。
本发明所提供的一系列酸性PEG衍生物将具有较长的疏水性基团，因此能够提供更好的半衰期保护和提高治疗效果。针对不同药物的特性可以选用不同长度的疏水性基团，可以有效的提高相应药物的稳定性和生物降解特性。
同时该聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物还可以进一步衍生为其他活性形式，比如NHS酯或者马来酰胺，它们能够在水溶液中和蛋白类药物直接反应获得活性键合物。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种如下式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物 或B′-(CH2)l-O-PEG-O-(CH2)l-B(II)其中，PEG是聚乙二醇聚合物；l是4-18的整数；并且A为C1-12的烷氧基、环烷氧基或烷氧芳基，或一个酯基；B和B’为羧基或选自酯基、酰氯、酰阱、马来酰亚胺和吡啶并二硫化物之一的官能团。
在本发明的一个优选实施方案中，提供一种如下式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物CH3O-PEG-O-(CH2)l-COOH(Ia)或HOOC-(CH2)l-O-PEG-O-(CH2)l-COOH(IIa)
其中PEG是聚乙二醇聚合物，包括支链、直链、星形和树形；l是4-18的整数。
本发明也包括下式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸活性衍生物 或 其中PEG是聚乙二醇聚合物，包括支链、直链、星形和树形；l是4-18的整数；F为一个官能团，它和酸性基团共同组成了一个活性的官能团，包括酯基(比如NHS酯或者HOBT酯)、酰氯、酰阱、马来酰亚胺、吡啶并二硫化物。能够和药物分子中的氨基、羟基，巯基等反应。
本发明还提供如下通式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物 其中，F为一个官能团，它和酸性基团共同组成了一个活性的官能团，包括酯基(比如NHS酯或者HOBT酯)、酰氯、酰阱、马来酰亚胺、吡啶并二硫化物。能够和药物分子中的氨基、羟基，巯基等反应；Y为一个活性官能团，包括酯基(比如NHS酯或者HOBT酯)；并且，所述的作为F的酯基和作为Y的酯基可以相同或不同。
本发明还提供了一种制备如式(Ia)的化合物的方法，该方法包括采用PEG和溴代氰化物反应，然后水解氰基得到相应的酸性基团的步骤。
本发明进一步提供如下通式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物和药物连接的结合物 或 其中A为如上所述的基团；X和X’相同或不同，为O、NH或S；Drug为药物分子。
本发明优选提供如下通式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物和药物连接的结合物
其中PEG是聚乙二醇聚合物；l是4-18的整数；X为连接基团，包括O、NH、S等；Drug为药物分子。
根据本发明的另一个方面，其提供包含上述聚乙二醇(PEG)-脂肪酸活性衍生物作为活性成分的药物组合物。
根据本发明的再一个方面，其提供所述聚乙二醇(PEG)-脂肪酸活性衍生物在制备药物及药物组合物中的用途。
根据本发明的药物结合物可改善药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免某些毒副作用。
具体实施例方式
在本发明的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物中所用的聚乙二醇是一种亲水性聚合物，这种亲水性聚合物还可以是聚乙二醇与聚丙二醇、聚乙烯醇、或者聚丙烯吗啉的共聚物，其中特别优选是聚乙二醇。此等亲水性聚合物通过对游离端羟基的修饰，将脂肪酸等酸性基团结合到该聚合物的母体上，使该聚合物能够提供与药物分子的连接点，由此与蛋白质、多肽或者其他天然药物活性成分中的游离氨基、羟基等连接在一起。
本发明的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物与普通的PEG脂肪酸表面活性剂不同之处在于，采用的是醚键将脂肪酸和PEG连接起来，这种结构的水解稳定性明显高于普通的酯键和酰胺键；同时，在本发明的结合物中，游离的脂肪酸的羧基基团提供了与蛋白质、多肽或者其他天然药物活性成分的结合点。因此，这种结构将会显著改善药物前体在体液中的水解稳定性。由于诸如脂肪酸本身所含有的非亲水性基团，因此更有利于和一些非亲水性的药物分子，如一些天然药物活性成分结合，从而使该结合物在水溶液中形成以若干分子聚集组成分子团的微球结构。该结构保留了亲水性聚合物良好的亲水性、柔性、抗巨噬细胞吞噬性等优良特性，同时提供了对药物分子的缓释控释，可以极大的延长药物，尤其是天然药物分子，在体内的停留周期。
本发明的一个优点是除了保留有亲水性聚合物如聚乙二醇通常的溶解性、非免疫原性和无毒等特征外，醚键结构将有助于保持药物分子的稳定性，减低在到达靶器官的非正常损耗。同时微球结构也有助于改善在体内的分布，保证了药物分子的有效血药浓度和分步释放。
现在以聚乙二醇衍生物为例，说明本发明中亲水性聚合物与脂肪酸的连接。
聚乙二醇衍生物的结构中包括了聚合物支链部分和端基功能团部分，分别描述如下。
聚乙二醇(PEG)，其结构通式如I所示 其中R为H或C1-12烷基，n为任何整数，表征其聚合度。
当R为低级烷基时，R可以是含有1-6个碳原子的任何低级烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基或正己基。当R为环烷基时，R优选为含3-7个碳原子的环烷基，如环丙基、环丁基和环己基。优选的环烷基为环己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其他聚乙二醇类似物或聚乙二醇共聚物也可用于此发明应用，如聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉等。
对聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成结合物的聚乙二醇的分子量为300～60000道尔顿，这相当于n为大约6～1300。更优选的是，n为28、112和450，这分别相应于分子量为1325、5000和20000。由于通常由其平均分子量而非自重复单元限定的起始PEG化合物的潜在不均一性，优选用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整数n表示PEG聚合物中的自重复单元。各种分子量的起始PEG化合物可以通过本领域中的已知方法制备或者可以从商业来源得到。
本发明中聚乙二醇(PEG)-脂肪酸制备部分是采用PEG和溴代氰化物反应，然后水解氰基得到相应的酸性基团的方法。在实际应用中，需要对亲水性聚合物的端基部分予以活化，以保证其能够和溴代氰化物发生反应而将二者结合。常用的方法是用氢化物将PEG端基的羟基活化为醇钠或醇钾，以提高其和溴代物的反应性质。一个典型的反应如下
亲水性聚合物上如果有游离羟基，则该游离羟基可用C1-12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基封端，优选是甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基、环己氧基以及苄氧基。
另外，在该亲水性聚合物上还可连接靶向分子，如抗体等，以便定向转运本发明的结合物。
在目前使用的许多药物、尤其是天然药物成分中都含有氨基、羟基等官能团。亲水性聚合物的羧酸基团与药物分子可例如通过酯基合成反应而结合在一起，该过程可简单地如下所示 酯基在生物体中可以通过生物降解的方式除去，而释放出活性成分。
在本发明的药物结合物中可使用合适的药物分子构成其中的药物部分，其包括氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱等。
上述的可以与本发明的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物结合的蛋白质选自促白细胞生成素(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)、白介素(IL)、干扰素、水蛭素、抗体中的一种。
在本发明的药物结合物中，药物分子部分优选是由天然植物中分离的药物活性成分，如华蟾酥毒基、甘草次酸、和东莨菪内酯。该药物分子部分特别优选于治疗肿瘤的天然药物，例如紫杉醇、喜树碱、依托泊苷以及它们的衍生物等。
本发明的药物结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合剂型式进行给药，可采用任何可接受的给药方式进行。组合剂形包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。
通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合剂型将包含约1至约99重量％的本发明药物结合物、以及99至1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量％的本发明药物结合物，其余为适宜的药用赋形剂。
优选的给药途径是注射给药，采用常规日剂量方案，该方案可根据疾病的严重程度进行调整。本发明的结合物或其药学上可接受的盐也可配制成注射用剂，例如使用约0.5至约50％的活性成分分散于可采用液体形式给药的药用辅剂中，实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。
如果需要的话，本发明的药物组合剂型还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员公知的或者显而易见的，例如可参见Remington的“制药学”(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，(MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。无论如何，按照本发明的技术，所使用的组合物剂型将含有治疗有效量的本发明结合物，以用于治疗相应的疾病。
实施例下面结合实例描述本发明的聚乙二醇-脂肪酸衍生物，其药物结合物及其制备方法，它不限制本发明，本发明的范围由权利要求限定。
实施例1甲氧基聚乙二醇己酸的制备
10克甲氧基聚乙二醇(分子量为10000)溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，加入0.1克氢化钠，搅拌30分钟。在溶液中添加1克6-溴己腈，35℃过夜搅拌。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率9.5克(95％)。
9克甲氧基聚乙二醇-己腈(mPEG-O-CH2CH2O-CH2CH2CH2CH2CH2CN，分子量为10000，由上步制得)溶解在50毫升37％的浓盐酸中，室温下搅拌三天，加入150毫升8％的氯化钠溶液稀释，用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，真空浓缩。中间产物溶解在50毫升10％的氢氧化钾溶液中，室温下搅拌一天，用盐酸调pH＝2.6，再加入8克氯化钠。用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。真空浓缩，加入100毫升异丙醇沉淀。过滤收集沉淀真空干燥，产率6.5克(72％)。
实施例2甲氧基聚乙二醇庚酸的制备
10克甲氧基聚乙二醇(分子量为10000)溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，加入0.1克氢化钠，搅拌30分钟。在溶液中添加1克6-溴庚腈，35℃过夜搅拌。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率9.5克(95％)。
9克甲氧基聚乙二醇-庚腈(分子量为10000，mPEG-O-CH2CH2O-CH2CH2CH2CH2CH2CN，由上步制得)溶解在50毫升37％的浓盐酸中，室温下搅拌三天，加入150毫升8％的氯化钠溶液稀释，用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，真空浓缩。中间产物溶解在50毫升10％的氢氧化钾溶液中，室温下搅拌一天，用盐酸调pH＝2.6，再加入8克氯化钠。用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。真空浓缩，加入100毫升异丙醇沉淀。过滤收集沉淀真空干燥，产率6.1克(68％)。
实施例3聚乙二醇二庚酸的制备
10克聚乙二醇(分子量为10000)溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，加入0.2克氢化钠，搅拌30分钟。在溶液中添加2克6-溴庚腈，35℃过夜搅拌。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率9.5克(95％)。
9克聚乙二醇-二庚腈(分子量为10000，由上步制得)溶解在50毫升37％的浓盐酸中，室温下搅拌三天，加入150毫升8％的氯化钠溶液稀释，用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。真空浓缩。中间产物溶解在60毫升10％的氢氧化钾溶液中，室温下搅拌一天，用盐酸调pH＝2.6，再加入8克氯化钠。用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。真空浓缩，加入100毫升异丙醇沉淀。过滤收集沉淀真空干燥，产率6.3克(70％)。
实施例4甲氧基聚乙二醇庚酸N-羟基丁二酰亚胺酯的制备 1克甲氧基聚乙二醇庚酸(分子量为10000，由实施例2制备)溶解在200毫升无水二氯甲烷中，加入14.7毫克N-羟基丁二酰亚胺和23毫克DCC，35℃过夜搅拌。减压浓缩溶液，加入20毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率0.9克(90％)。
实施例5甲氧基聚乙二醇庚酸和紫杉醇结合物的制备
mPEG-O-CH2CH2-OCH2CH2CH2CH2CH2COOH 紫杉醇 其中，Paclitaxel紫杉醇0.6克甲氧基聚乙二醇庚酸(分子量为10000，由实施例2制备)，溶解在10毫升二氯甲烷中，溶液中滴加60毫克紫杉醇、8毫克DMAP和18毫克DCC，溶液搅拌6小时。减压蒸馏除去溶剂。剩余物加入20毫升异丙醇(IPA)。过滤收集沉淀再用乙醚洗涤后抽干，真空干燥。产率0.54克(90％)。
实施例6甲氧基聚乙二醇庚酸N-羟基丁二酰亚胺酯和促白细胞生成素(GCSF)结合物的制备6毫克甲氧基聚乙二醇庚酸N-羟基丁二酰亚胺酯(分子量为10000，由实施例4制备)，溶解在5毫升(pH7.4)的PBS缓冲盐溶液中，其中含有1毫克/毫升促白细胞生成素。该反应体系中聚乙二醇和促白细胞生成素(GCSF)的比例为3∶1，在4℃震摇一小时然后在室温震摇8小时。在稀释到促白细胞生成素的浓度为0.5mg/ml，通过离子交换树脂纯化，收集单取代、双取代的成分。SDS-PAGE显示其中没有游离的促白细胞生成素。
实施例7本实施例说明代表性非胃肠道给药的药物组合剂型的制备过程，所述药物组合剂型为实施例5的本发明结合物。
成分实施例5的药物结合物 2g0.9％盐水溶液 至100mL将本发明的药物结合物溶解于0.9％盐水溶液，得到100mL的静脉注射用溶液，将其通过0.2μ的膜过滤材料过滤，在无菌条件下包装。
权利要求
1.如下通式的化合物 或B′-(CH2)l-O-PEG-O-(CH2)l-B(II)其中，PEG是聚乙二醇聚合物；l是4-18的整数；并且A为C1-12的烷氧基、环烷氧基或烷氧芳基，或一个酯基；B和B’相同或不同，分别为选自羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺和吡啶并二硫化物之一的官能团。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物是通式(I)的化合物，并且，所述的A是甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丁氧基、环己氧基或苄氧基。
3.如权利要求2所述的化合物，其中，所述的A为甲氧基，B为羧基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物是通式(I)的化合物，并且，A为选自N-羟基琥珀酰胺酯或1-羟基苯并三唑酯的酯基，B不同与A。
5.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物是通式(II)的化合物，所述的B和B’相同。
6.如权利要求5所述的化合物，其中，所述的化合物是通式(II)的化合物，所述的B和B’都为羧基。
7.如权利要求1所述的化合物，其中，聚乙二醇的分子量为150～60,000，并且，所述的聚乙二醇可是直链、支链、星形或者树形结构。
8.如权利要求1所述的化合物，其中，l等于5或6。
9.一种制备权利要求3所述的化合物的方法，该方法包括采用PEG和溴代氰化物反应，然后水解氰基得到相应的酸性基团的步骤。
10.如权利要求1-8之一的化合物与药物按如下所示结构式的药物结合物 或 其中X与X’相同或不同，为O、NH或S；Drug为药物分子。
11.权利要求10所述的药物结合物，其中，所述的药物分子选自于以下类别中的一种蛋白质、酶、多肽、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱、心血管药、抗肿瘤药、抗传染药、抗真菌药、抗焦虑药、胃肠药、中枢神经系统用药、止疼药、促孕药、避孕药、类脂。
12.权利要求11所述的药物结合物，其中，所述的蛋白质选自促白细胞生成素，促红细胞生成素、白介素、干扰素、水蛭素、抗体中的一种。
13.权利要求11所述的药物结合物，其中，所述的抗肿瘤药选自紫杉醇、喜树碱、依托泊苷以及它们的衍生物。
全文摘要
本发明涉及一种对水解稳定的如下通式(I)或(II)的通过醚键连接的聚乙二醇－脂肪酸衍生物，其中，PEG是聚乙二醇聚合物；l是4－18的整数；并且，A为C
文档编号C08G65/00GK1511861SQ0215876
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月26日 优先权日2002年12月26日
发明者嵇世山, 朱德权 申请人:北京键凯科技有限公司