专利名称：微生物酶法制备低分子量岩藻多糖工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及以褐藻中的岩藻多糖为原料，利用微生物岩藻多糖酶微生物酶法制备低分子量岩藻多糖工艺。
背景技术：
岩藻多糖属于异多聚碳水化合物，其主要成分是L-岩藻糖，它的线性主链是岩藻吡喃环以α-1，3-糖苷键连接而成，其中还夹杂着其他糖类，如半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸等，因材料来源而异。该糖通常在4-0基发生硫酸化作用，也可在其他位点上，因此，该多糖属于含硫多糖。在早期的动物试验中发现岩藻多糖容易产生抗原性和明显的毒副作用，如果经过部分水解，溶液的粘度会降低，并且可以降低该糖在应用中可能产生的抗原性和毒副作用。分子量大小适度的低分子量岩藻多糖可以保持原多糖的生理活性，有些还具有特定的生理活性。低分子量岩藻多糖的生物学活性除与分子量大小有关外，还与含硫量及含硫基团位点及支链结构有关。
目前中低分子量岩藻多糖的获得多以化学降解方法(酸解法)为主，采用化学方法进行部分水解，生产条件要求苛刻(高温、高压、耗能)，产生糖的聚合度大小不一，纯化难度大，得率低。采用酶法降解，则可克服这些缺点，同时酶法降解还有利于保护一些含硫侧链基团和其它支链。岩藻多糖可以通过海洋微生物和贝类产生的岩藻多糖酶水解产生较低分子量的岩藻多糖，并进一步经过岩藻糖苷酶的水解，产生岩藻糖。日本从贝类肝胰腺中提取岩藻多糖酶来制备具有生理活性低分子量岩藻多糖获得成功，如日本学者采用扇贝肝胰腺中提取纯化的岩藻多糖酶，成功地从分子量为480000的岩藻多糖中生产出分子量在50000左右的活性岩藻多糖，但是，由于贝类加工过程中肝胰腺采集及贮存较为困难，从而造成该种酶的制备难度大，限制了其在工业化生产中的应用。
我国岩藻多糖的研究工作较少，目前仅有少数几篇文章涉及到其提取和分离过程。目前，国内外还未检索到用微生物岩藻多糖酶酶法制备低分子量岩藻多糖的报道。
技术内容本发明所要解决的技术课题是利用微生物生产岩藻多糖酶，利用该酶进一步水解作用生产低分子量岩藻多糖。
为解决上述技术课题，本发明采用了以下技术工艺a、以褐藻为原料，将原料粉碎、过筛后用水浸提，温度在40～100℃时，搅拌浸提6～10小时，离心去除固形物，收集滤液、浓缩，采用α-淀粉酶去除淀粉，乙醇分级沉淀，沉淀物冷冻干燥，得到岩藻多糖粉末；b、对上述岩藻多糖实施酶解反应，温度在30～50℃时，反应时间控制在2小时以内；c、酶解反应完毕后升温使酶活丧失；d、经凝胶色谱分子筛分离，冷冻干燥得到低分子量岩藻多糖。
上述的制备低分子量岩藻多糖的原料用水浸提时原料与水的浸提比为1∶7～15，浸提、过滤、浓缩后加α-淀粉酶，反应温度在40～60℃反应时间1～2hr，α-淀粉酶量控制在40Iu/ml浓缩液。
上述酶制剂是由微生物分别通过固态或液态发酵方法制得的以岩藻多糖酶为主的酶制剂；用于生产岩藻多糖酶的微生物培养基原料包括褐藻及其提取物和农业有机废料中的一种或几种。
制备岩藻多糖酶的微生物发酵温度控制在25～32℃之间，时间控制在12～48小时，再经过分离得到粗酶液。
用于生产岩藻多糖的褐藻包括多囊墨角藻、海带、羊栖菜等。
用于生产岩藻多糖的温度控制在70～90℃。
酶解反应的岩藻多糖浓度控制在≤10％。
所述的酶解反应温度在35～45℃，反应完毕后温度升至100℃使酶活丧失。
所述的酶解反应的pH值控制在pH6～pH8。所述的酶解反应中岩藻多糖酶量控制在≤40Iu/g底物。
由上述技术方案可以制备岩藻多糖分子量范围在900～50000道尔顿中的任意一段低分子量岩藻多糖，可以保持原多糖的生理活性，同时还具有特定的生理活性，本发明采用的是用微生物生产岩藻多糖酶制备岩藻多糖，即通过海洋微生物产生的岩藻多糖酶水解产生较低分子量的岩藻多糖。与现有技术相比，一方面解决了采用扇贝类制备岩藻多糖酶过程中肝胰腺难以采集及贮存、运输所遇到的困难，使得岩藻多糖酶的制备更加容易；另一方面，克服利用化学法需要高温、高压、耗能的苛刻制备条件，同时避免了化学法产生糖的聚合度大小不一、纯化难度大及得率低的缺陷；酶法降解还有利于保护一些含硫侧链基团和其它支链。
本发明公开的低分子量岩藻多糖的制备工艺中酶的生产易于控制，生产量大。
附图概述
图1是岩藻多糖酶的制备工艺流程图；图2是低分子量岩藻多糖的制备工艺流程图。
具体实施例方式
1、岩藻多糖酶的制备岩藻多糖酶的制备参见图1，具体工艺过程如下①岩藻多糖酶的生产原料用于生产岩藻多糖酶的微生物培养原料主要利用褐藻(多囊墨角藻、海带、羊栖菜等)及其抽提物和农业有机废料(麸皮)。培养基以单一或复合成分均可。
②岩藻多糖酶制剂制备用于生产低分子量岩藻多糖的酶制剂主要是岩藻多糖酶，它可以由微生物分别通过固态或液态发酵方法来生产。温度控制在25～32℃之间，时间控制在12～48小时，再经过分离得到粗酶液。
以海洋真菌为例，较为理想的是温度控制在28℃条件下进行培养24hr，再经过分离，得到粗酶液。
各种温度和时间条件下测得的数据如下表一、二表一温度时间(hr)酶活力(单位Iu/g干培养基)25℃24 24.528℃24 32.530℃24 2732℃24 17.5表二温度时间(hr)酶活力(单位Iu/g干培养基)28℃12 17.528℃24 3328℃36 24.328℃48 182、岩藻多糖的制备岩藻多糖的制备参见图2，具体工艺过程如下①原料的加工上述的生产原料，首先应筛选去除霉变成份，并干燥保存，再经分级粉碎后，过360目筛备用。
②岩藻多糖制备将粉碎并过筛的原料，用水浸提，温度70～90℃时，搅拌浸提6～10小时。离心去除固形物，收集滤液，浓缩，加α-淀粉酶，反应温度在40～60℃反应时间1～2hr，α-淀粉酶量控制在40Iu/ml浓缩液，淀粉酶去除淀粉，乙醇分级沉淀。沉淀物冷冻干燥，得到岩藻多糖粉末。
上述制备岩藻多糖的原料用水浸提，温度70～90℃时，搅拌浸提6～10小时的具体实施例如表三
表三温度提取时间(hr)糖的得率40℃10 0.5698g/20g海带≈2.8％60℃8 0.5892g/20g海带≈2.9％80℃10 0.6823g/20g海带≈3.4％100℃ 10 0.6845g/20g海带≈3.4％3、酶法制备低分子量岩藻多糖，参见图2。
①酶解反应酶解反应条件为温度40℃，pH6.5，反应时间控制在2小时内，以产物聚合度为依据。反应完毕后升温至100℃，使酶活丧失。
②低分子量岩藻多糖的制备经凝胶色谱分子筛分离，得到不同级别的低分子量岩藻多糖，冷冻干燥得到粉末。
权利要求
1.一种酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，该工艺包括以下步骤a、以褐藻为原料，将原料粉碎、过筛后用水浸提，温度在40～100℃时，搅拌浸提6～10小时，离心去除固形物，收集滤液、浓缩，乙醇分级沉淀，沉淀物冷冻干燥，得到岩藻多糖粉末；b、对上述岩藻多糖实施酶解反应，温度在30～50℃时，反应时间控制在2小时以内；c、酶解反应完毕后升温使酶活丧失；d、酶解液经凝胶色谱分子筛分离、冷冻干燥得到低分子量岩藻多糖。
2.根据权利要求1所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于所述的制备低分子量岩藻多糖的原料用水浸提时原料与水的浸提比为1∶7～15，浸提、过滤、浓缩后加α-淀粉酶，反应温度在40～60℃反应时间1～2hr，α-淀粉酶量控制在40Iu/ml浓缩液。
3.根据权利要求1所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于上述酶制剂是由微生物分别通过固态或液态发酵方法制得的以岩藻多糖酶为主的酶制剂；用于生产岩藻多糖酶的微生物培养基原料包括褐藻及其提取物和农业有机废料中的一种或几种。
4.根据权利要求1或3所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于制备岩藻多糖酶的微生物发酵温度控制在25～32℃之间，时间控制在12～48小时，再经过分离得到粗酶液。
5.根据权利要求1或2所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于用于生产岩藻多糖的褐藻包括多囊墨角藻、海带、羊栖菜等。
6.根据权利要求1所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于在生产岩藻多糖过程中用水浸提褐藻时的温度控制在70～90℃。
7.根据权利要求1所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于酶解反应的岩藻多糖浓度控制在≤10％。
8.根据权利要求1所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于所述的酶解反应温度在35～45℃，反应完毕后温度升至100℃使酶活丧失。
9.根据权利要求1或8所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于所述的酶解反应的pH值控制在pH6～pH8。
10.根据权利要求1或3或4所述的酶法制备低分子量岩藻多糖工艺，其特征在于所述的酶解反应中岩藻多糖酶量控制在≤40Iu/g底物。
全文摘要
本发明是利用微生物生产岩藻多糖酶，利用该酶进一步水解生产低分子量岩藻多糖，其工艺包括a、以褐藻为原料，将原料粉碎、过筛后用水浸提，温度在40～100℃时，搅拌浸提6～10小时，离心去除固形物，收集滤液、浓缩，去除淀粉，乙醇分级沉淀，沉淀物冷冻干燥，得到岩藻多糖粉末；b、对上述岩藻多糖实施酶解反应；c、完毕后升温使酶活丧失；d、经凝胶色谱分子筛分离，冷冻干燥得到低分子量岩藻多糖，使得岩藻多糖酶的制备更加容易，克服了利用化学法需要高温、高压、耗能的苛刻制备条件，同时避免了化学法产生糖的聚合度大小不一、纯化难度大及得率低的缺陷；酶法降解还有利于保护一些含硫侧链基团和其它支链。
文档编号C08B37/00GK1515592SQ03112609
公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月2日 优先权日2003年1月2日
发明者蔡敬民, 秦松, 吴克, 吴茜茜, 刘斌, 杨本宏, 潘仁瑞 申请人:合肥学院