专利名称：一种红豆杉枝叶中的提取物及提取方法
技术领域：
本发明涉及一种红豆杉枝叶中的提取物及提取方法。
因此，近年来人们开始研究红豆杉中存在的新组分，实际上红豆杉除存在紫杉醇外还有其他数百种二萜类物质(如巴卡亭-3等)以及木脂素酮类等物质，在红豆衫中，寻找新的抗肿瘤组分已经成为目前的工作重点。
本发明是一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。
所述的多糖组分经高效凝胶渗透色谱法分析，以分子量对其保留时间作图，经计算得平均分子量为160000～220000。
所述的多糖组分核磁共振分析结果为
多糖结构式 氢原子化学位移(峰强度) 氢原子个数H1 4.73725(0.9411)1H2 3.03592(1.000) 1H5 3.51608(1.2129)1H3,4,6,6 3.66585～3.76325(3.7320) 4Ha 1.19985～1.29622(3.5409) 3Hb 4.14336～4.16975(1.2697) 1所述的多糖组分的质谱图具有以下多糖吸收峰3412，2917，2845，1744，1629，1435，1075，1020，980，890cm，为β-D糖苷键连接的多糖结构，该多糖中某些糖环在C2或C3位有O-乙酰基少量存在。
所述的多糖组分色谱分析计算的结果其纯度为86.689％(w/v)。
所述的多糖组分还具有以下分析结果①经UV-240紫外光谱仪进行紫外光谱检测测定，具有199nm多糖特征吸收峰，经Sephadex G-200柱层析，该吸收峰为单一对称峰；②红外光谱仪采用日本Shimazu IR-435型，KBr压片，4000-400cm扫描，紫外光谱用UV-240紫外光谱仪测定，糖溶液浓度为0.5mg/ml；③用Ubbelohde粘度计按逐步稀释法在30℃测定多糖溶液的粘度，溶剂在粘度计毛细管中流出时间为180秒以上；④用Perkin-Elmer PE241型MC旋光仪，钠光Na589，1dm，温度20℃测定旋光度，得糖浓度为0.5；上述的一种红豆杉枝叶中的提取物的提取方法，包括以下工艺步骤①采用溶剂极性梯度法对不同种类的有效组分进行适当分离，得到多糖粗提取液，经冷冻干燥得粗多糖；②将得到的粗多糖进行脱蛋白后，经冷冻干燥，采用超滤、膨胀床离子交换色谱进行提纯，得初纯多糖；③将所述的初纯多糖经真空冷冻浓缩后，用非线性优化控制的模拟移动床分子筛色谱进行连续纯化，最后经冷冻干燥后得高纯度多糖。
④对得到的高纯度多糖成分分别用制备HPLC、质谱、核磁共振、红外光谱等仪器进行综合分析，进行结构鉴定，确认多糖成分。
所述的极性梯度法的技术路线为热水—极性—弱极性—非极性有机溶剂或相反顺序。
本发明是从红豆杉枝叶中提取的红豆杉多糖组分，它具有免疫调节和直接抑制肿瘤细胞等抗癌作用，由于其本身的毒副作用很小，因此在有效治疗肿瘤的同时，可以减少对机体组织的毒副作用，通过体内和体外实验研究其抗肿瘤效果，其对昆明鼠S180腹水癌具有很好的抑制作用，这使得该提取物在用于研制抗癌药物方面具有良好的应用前景。极性梯度法的优点在于能够在溶剂提取过程中就对组分进行适当分离，并且用此工艺还可以提取红豆杉中不同种类的有效组分，如紫杉烷类、黄酮类、甾类和木质素等物质。
实施例一如
图1～图2所示，一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。经高效凝胶渗透色谱法(GPC)分析，经计算得平均分子量为188048。
实施例二一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。经高效凝胶渗透色谱法(GPC)分析，经计算得平均分子量为150860。
实施例三一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。经高效凝胶渗透色谱法(GPC)分析，经计算得平均分子量为218980。
实施例四如图3～图4所示，一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。
多糖组分核磁共振分析结果为多糖结构式 氢原子化学位移(峰强度) 氢原子个数H1 4.73725(0.9411)1H2 3.03592(1.000) 1H5 3.51608(1.2129)1H3,4,6,6 3.66585～3.76325(3.7320) 4Ha 1.19985～1.29622(3.5409) 3Hb 4.14336～4.16975(1.2697) 1分析结果显示，I(Ha)/I(Hb)＝3.5409/1.2697≈2.79符合结构式中COH(a)COCH3中Ha/Hb比例〔I(Ha)/3〕/I(H5)＝3.5409/3/1.2129≈95.5％。
分析结果显示，该多糖组分主要为葡萄糖和2‘-乙酰基葡萄糖组成。
实施例五如图5所示，一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。
多糖组分的质谱图具有以下多糖吸收峰3412，2917，2845，1744，1629，1435，1075，1020，980，890cm。具体如下3412(O-H伸缩振动)，2917(C-H伸缩振动)，1435(C-H变角振动或称弯曲振动)，1100～1010的三个吸收峰(C-OH伸缩振动)；在2845〔(O＝C)-H伸缩振动〕和1744(C＝O伸缩振动)有吸收峰表明有醛基；在1629(C＝O伸缩振动)和1240(C-O伸缩振动)有吸收峰表明有酯类结构；H-NMR谱中4.90±0.02ppm处有特征吸收峰表明某些糖环的C2或C3位有O-乙酰基；在1100～1010有三个吸收峰是吡喃糖苷的特征吸收；在890有明显吸收峰，这表明糖苷键是β-D型；此外，1140(C-N伸缩振动)和1629(C＝O伸缩振动)有吸收峰表明可能有酰胺结构(如乙酰胺基糖)；3412(O-H伸缩振动)和1629(C＝O伸缩振动)有吸收峰表明可能存在α-OH羧酸结构(如糖醛酸)。
总之，从质谱图中可以说明提取物具有明显的多糖吸收特征，为β-D糖苷键连接的多糖结构，该多糖中某些糖环在C2或C3位有O-乙酰基少量存在。
实施例六如图6和图7所示，一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。多糖组分色谱分析计算的结果waters200HPLC上用SB-804SHODEX凝胶柱，0.8l/min纯净水为流动相，以Amersham PHARMACIA T系列葡聚糖为标样进行实验，实验结果用N2000数据工作站软件进行计算，纯度大小以峰面积回归，根据优化计算其纯度为86.689％(w/v)。
实施例七一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。多糖组分具有以下分析结果①经UV-240紫外光谱仪进行紫外光谱检测测定，具有199nm多糖特征吸收峰，经Sephadex G-200柱层析，该吸收峰为单一对称峰；②红外光谱仪采用日本Shimazu IR-435型，KBr压片，4000-400cm扫描，紫外光谱用UV-240紫外光谱仪测定，糖溶液浓度为0.5mg/ml；③用Ubbelohde粘度计按逐步稀释法在30℃测定多糖溶液的粘度，溶剂在粘度计毛细管中流出时间为180秒以上；④用Perkin-ElmerPE241型MC旋光仪，钠光Na589，1dm，温度20℃测定旋光度，得糖浓度为0.5；实施例八南方红豆衫，产于浙江省桐庐地区，称取干枝条500g(枝条采用60℃烘干2天)，用植物粉碎机粉碎成40目以下，用乙酸乙脂浸泡过夜，以除去表面脂质，除去乙酸乙脂后，洗净晾干。多糖的分离过程主要是将红豆衫枝条粉末依次通过0.9％NaCl水溶液，85％乙醇，95％℃热水，1％草酸铵水溶液，5％NaOH水溶液(含0.05％NaBH4，N2保护)及20％NaOH水溶液(含0.05％NaBH4，N2保护)逐级提取，最后得到多糖粗提取液，经冷冻干燥得粗多糖.粗多糖经过H2O2法脱色，然后用稀HCl中和至pH＝7.用Savag方法(氯仿∶戊醇4∶1，混合震荡)萃取除蛋白质5次以后，紫外光谱检测无蛋白质(280nm)和核酸(260nm)等杂质等吸收峰，浓缩至小体积，用乙酸沉淀多糖，将多糖溶解于适量蒸馏水，置于透析袋中，用自来水透析3d，蒸馏水透析1d，除去无机盐及低分子杂质.浓缩，冷冻干燥得多糖各组分.将上述分离的红豆衫多糖各组分再溶于少量水，进行Sephadex G-200柱层析，水洗脱，苯酚-硫酸法检测，收集主要洗脱峰，透析，浓缩，冷冻干燥，得纯化多糖0.5312克。
实施例九南方红豆衫产于浙江省宁海地区，称取干枝条1000g(枝条采用60℃烘干2天)，用植物粉碎机粉碎成60目以下，用乙酸乙脂浸泡过夜，以除去表面脂质，除去乙酸乙脂后，洗净晾干。多糖的分离过程主要是将红豆衫枝条粉末依次通过0.9％NaCl水溶液，95％乙醇，85％℃热水，5％NaOH水溶液(含0.05％NaBH4，N2保护)及20％NaOH水溶液(含0.05％NaBH4，N2保护)逐级提取，最后得到多糖粗提取液，经冷冻干燥得粗多糖.粗多糖经过H2O2法脱色，然后用稀HCl中和至pH＝7。用Savag方法(氯仿∶戊醇4∶1，混合震荡)萃取除蛋白质5次以后，紫外光谱检测无蛋白质(280nm)和核酸(260nm)等杂质等吸收峰，浓缩至小体积，用乙酸沉淀多糖，将多糖溶解于适量蒸馏水，置于透析袋中，用自来水透析3d，蒸馏水透析1d，除去无机盐及低分子杂质.浓缩，冷冻干燥得多糖各组分.将上述分离的红豆衫多糖各组分再溶于少量水，进行Sephadex G-200柱层析，水洗脱，苯酚-硫酸法检测，收集主要洗脱峰，透析，浓缩，冷冻干燥，得纯化多糖1.1035克。
实施例十南方红豆衫产于浙江省宁海地区，称取干树叶500g(枝条采用60℃烘干2天)，用植物粉碎机粉碎成60目以下，用乙酸乙脂浸泡过夜，以除去表面脂质，除去乙酸乙脂后，洗净晾干。多糖的分离过程主要是将红豆衫枝条粉末依次通过0.9％NaCl水溶液，85％乙醇，85％℃热水，1％草酸铵水溶液，5％NaOH水溶液(含0.05％NaBH4，N2保护)及20％NaOH水溶液(含0.05％NaBH4，N2保护)逐级提取，最后得到多糖粗提取液，经冷冻干燥得粗多糖.粗多糖经过H2O2法脱色，然后用稀HCl中和至pH＝7。用Savag方法(氯仿..戊醇4..1，混合震荡)萃取除蛋白质5次以后，紫外光谱检测无蛋白质(280nm)和核酸(260nm)等杂质等吸收峰，浓缩至小体积，用乙酸沉淀多糖，将多糖溶解于适量蒸馏水，置于透析袋中，用自来水透析3d，蒸馏水透析1d，除去无机盐及低分子杂质.浓缩，冷冻干燥得多糖各组分.将上述分离的红豆衫多糖各组分再溶于少量水，进行Sephadex G-200柱层析，水洗脱，苯酚-硫酸法检测，收集主要洗脱峰，透析，浓缩，冷冻干燥，得纯化多糖0.7037克。
实施例十一南方红豆衫产于浙江省桐庐地区，称取干树叶500g(枝条采用60℃烘干2天)，用植物粉碎机粉碎成60目以下，用乙酸乙脂浸泡过夜，以除去表面脂质，除去乙酸乙脂后，洗净晾干。多糖的分离过程主要是将红豆衫枝条粉末依次通过0.9％NaCl水溶液，85％乙醇，85％℃热水，1％草酸铵水溶液，5％NaOH水溶液(含0.05％NaBH4，N2保护)及20％NaOH水溶液(含0.05％NaBH4，N2保护)逐级提取，最后得到多糖粗提取液，经冷冻干燥得粗多糖.粗多糖经过H2O2法脱色，然后用稀HCl中和至pH＝7。用Savag方法(氯仿∶戊醇4∶1，混合震荡)萃取除蛋白质5次以后，紫外光谱检测无蛋白质(280nm)和核酸(260nm)等杂质等吸收峰，浓缩至小体积，用乙酸沉淀多糖，将多糖溶解于适量蒸馏水，置于透析袋中，用自来水透析3d，蒸馏水透析1d，除去无机盐及低分子杂质.浓缩，冷冻干燥得多糖各组分.将上述分离的红豆衫多糖各组分再溶于少量水，进行Sephadex G-200柱层析，水洗脱，苯酚-硫酸法检测，收集主要洗脱峰，透析，浓缩，冷冻干燥，得纯化多糖0.6853克。
通过对上述的多糖组分的抗肿瘤动物实验，以S180瘤株复制昆明种小鼠荷瘤模型，以红豆杉多糖分别用35mg/kg、70mg/kg、100mg/kg分低、中、高剂量分三组灌胃，每组用鼠10只，并设空白对照组用药15天，抑瘤率分别为17.2％、39.2％、38.8％。
在临床应用疗效方面，经病理切片证实肿瘤患者61人，年龄30-78岁，男42人，女19人，其中肺癌患者20例，胃癌23例，胆管癌1例，子宫癌3例，间皮瘤1例，直肠癌4例，肝癌3例，肠癌6例。以上患者30例因无法手术，另31例手术后经化疗等其他方法治疗效果不理想，副反应过大，不能坚持或肿瘤再次发生，主动要求使用红豆杉，治疗3个月为一个疗程，停药一月后，继续服用1个疗程，共3～6个疗程。以上服药者最短服用1年，最长3年，其中死亡者8人，余53人，现仍在继续观察中。疗效按Karnofsky平分法评价疗效，治疗三个疗程后，90分以上者40人，80分以上12人，50分以上4人。
权利要求
1.一种红豆杉枝叶中的提取物，为多糖组分，主要为由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β-1，3葡聚糖主链上，存在少量β-1，6糖苷键分支。
2.如权利要求1所述的一种红豆杉枝叶中的提取物，其特征在于所述的多糖组分经高效凝胶渗透色谱法分析，平均分子量为160000～220000。
3.如权利要求1所述的一种红豆杉枝叶中的提取物，其特征在于所述的多糖组分核磁共振分析结果为多糖结构式 氢原子化学位移(峰强度) 氢原子个数H14.73725(0.9411) 1H23.03592(1.000)1H53.51608(1.2129) 1H3,4,6,6 3.66585～3.76325(3.7320) 4Ha1.19985～1.29622(3.5409) 3Hb4.14336～4.16975(1.2697) 1
4.如权利要求1所述的一种红豆杉枝叶中的提取物，其特征在于所述的多糖组分的质谱图具有以下多糖吸收峰3412，2917，2845，1744，1629，1435，1075，1020，980，890cm，为β-D糖苷键连接的多糖结构，该多糖中某些糖环在C2或C3位有O-乙酰基少量存在。
5.如权利要求1所述的一种红豆杉枝叶中的提取物，其特征在于所述的多糖组分色谱分析计算的结果其纯度为86.689％(w/v)。
6.如权利要求1所述的一种红豆杉枝叶中的提取物，其特征在于所述的多糖组分还具有以下分析结果①经UV-240紫外光谱仪进行紫外光谱检测测定，具有199nm多糖特征吸收峰，经Sephadex G-200柱层析，该吸收峰为单一对称峰；②红外光谱仪采用日本Shimazu IR-435型，KBr压片，4000-400cm扫描，紫外光谱用UV-240紫外光谱仪测定，糖溶液浓度为0.5mg/ml；③用Ubbelohde粘度计按逐步稀释法在30℃测定多糖溶液的粘度，溶剂在粘度计毛细管中流出时间为180秒以上；④用Perkin-Elmer PE241型MC旋光仪，钠光Na589，1dm，温度20℃测定旋光度，得糖浓度为0.5；
7.一种红豆杉枝叶中的提取物的提取方法，包括以下工艺步骤①采用溶剂极性梯度法对不同种类的有效组分进行适当分离，得到多糖粗提取液，经冷冻干燥得粗多糖；②将得到的粗多糖进行脱蛋白后，经冷冻干燥，采用超滤、膨胀床离子交换色谱进行提纯，得初纯多糖；③将所述的初纯多糖经真空冷冻浓缩后，用非线性优化控制的模拟移动床分子筛色谱进行连续纯化，最后经冷冻干燥后得高纯度多糖。④对得到的高纯度多糖成分分别用制备HPLC、质谱、核磁共振、红外光谱等仪器进行综合分析，进行结构鉴定，确认多糖成分。
8.如权利要求7所述的一种红豆杉枝叶中的提取物的提取方法，其特征在于所述的极性梯度法的技术路线为热水—极性—弱极性—非极性有机溶剂。
9.如权利要求7所述的一种红豆杉枝叶中的提取物的提取方法，其特征在于所述的极性梯度法的技术路线为非极性有机溶剂—弱极性—极性—热水。
全文摘要
本发明公开了一种红豆杉枝叶中的提取物及提取方法，该提取物为多糖组分，主要为由D－葡萄糖及少量的D－木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β－1，3糖苷键组成的杂多糖，在其β－1，3葡聚糖主链上，存在少量β－1，6糖苷键分支；它具有免疫调节和直接抑制肿瘤细胞等抗癌作用，并且其本身的毒副作用很小，通过体内和体外实验研究其抗肿瘤效果，其对昆明鼠S180腹水癌具有很好的抑制作用，用于研制抗癌药物方面具有良好的应用前景，本发明采用极性梯度法能够在溶剂提取过程中就对组分进行适当分离，并且用此工艺还可以提取红豆杉中不同种类的有效组分，如紫杉烷类、黄酮类、甾类和木质素等物质。
文档编号C08B37/00GK1472226SQ0312942
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月20日 优先权日2003年6月20日
发明者吴绵斌, 孔繁智, 张朝晖 申请人:宁波泰康红豆杉生物工程有限公司