专利名称:3-羟基链烷酸共聚物的精制方法
技术领域:
本发明涉及精制由微生物菌体产生的3-羟基链烷酸共聚物的方法。
背景技术:
聚-3-羟基链烷酸(以下称作PHA)是大多数微生物细胞中作为能量储备物质生成、蓄积的热塑性聚酯,具有生物分解性。现在,塑料废弃物通过焚烧、掩埋进行处理,但是这些处理方法存在地球温室化和掩埋地的土地松弛等问题。因此,随着对塑料循环利用的社会意识的提高,正在进行循环利用系统化。然而,可循环利用的用途有限,实际上,作为塑料废弃处理方法,仅仅焚烧、掩埋和循环利用还不能应付,所以目前原封不动地放置在自然界的塑料还很多。因此,像废弃后进入自然界的物质循环中、且分解产物又无害的PHA等生物分解性塑料受到关注,并热切希望其实用化。特别是,微生物在菌体内生成蓄积的PHA由于进入自然界的碳循环过程中,所以可以预想到对于生态系统几乎没有不良影响。另外,即使在医疗领域,也可以作为不需回收的医用生物材料、药物载体的利用的可能性。
微生物生成的PHA,通常形成颗粒体蓄积在该微生物菌体内,所以为了将PHA作为塑料利用时,则必须进行从微生物菌体内分离提取PHA的工序。而作为从微生物菌体分离精制PHA的已知方法,大致可分为采用可以溶解PHA的有机溶剂从菌体提取PHA的方法,和通过破碎或溶解除去PHA以外的菌体组成成分得到PHA的方法。
在利用由有机溶剂提取的PHA的分离精制方法中,例如有使用1,2-二氯乙烷或氯仿等含卤烃作为可溶解PHA的溶剂进行提取的方法(参照特开昭55-118394号公报、特开昭57-65193号公报)。然而,这些含卤烃是疏水性溶剂,所以在提取前必须预先进行菌体干燥等使溶剂能与菌体中的PHA接触的工序。另外,这些方法中,当将PHA溶解达到值得实用的浓度(例如5%)或更高时,提取液变得极粘稠,未溶解的菌体残渣与含PHA的溶剂层的分离非常困难。而且,为了以高回收率从溶剂层再沉淀出PHA,则必需溶剂层的4~5倍体积的甲醇或己烷等PHA的不溶性溶剂等,所以在再沉淀工序中必须要大容量的容器。而且由于溶剂的用量庞大,所以溶剂的回收成本和损失溶剂的成本增大。另外近年来,从环境保护的观点考虑,有机卤化合物的使用有受到限制的趋势,故对该方法而言其现状是工业化困难。
另外,也有人提出采用,例如二噁烷(参照特开昭63-198991号公报)或丙二醇(参照特开平02-69187号公报)或四氢呋喃(参照特开平07-79788号公报)等亲水性溶剂作为可溶解PHA且又与水混合的溶剂的提取方法。这些方法无论从干燥菌体或湿菌体提取PHA的可能性方面看,还是从仅冷却与菌体残渣分离的溶剂层获得PHA的沉淀物方面看都认为是优选的。然而,采用这些方法都没有解决PHA溶解了的溶剂层的粘稠性问题,另外还存在为了提高提取效率必需加热、和由于在水存在下进行加热而不可避免PHA的低分子化以及回收率差等缺点。
另一方面,作为通过溶解除去PHA以外的菌体构成成分而获得PHA的方法,有在J.Gen.Microbiology,19,198-209页(1958)中记载的用次氯酸钠处理菌体悬浮液使PHA以外的菌体构成成分溶解而获得PHA的方法。该方法,作为过程虽然简单,但是由于必须使用大量的次氯酸钠,所以成本提高。另外,从可能引起PHA的显著低分子化或在得到的PHA内残存有不可忽视量的氯的方面看,被认为不适于实际应用。
在特公平04-61638号公报中记载有通过在100℃或100℃以上热处理含PHA的微生物菌体悬浮液破坏菌体结构,然后组合进行蛋白质分解酶处理和磷脂分解酶处理或过氧化氢处理,使PHA以外的菌体构成成分溶解,从而获得PHA的方法。该方法存在的缺点是,由于热处理导致蛋白质变性·不溶,故在下面的蛋白质分解酶处理工序中的负荷增大,而且处理工序大多复杂,且酶的价格比较高昂而增加成本等问题。
另外,作为破坏含PHA的微生物菌体的方法,曾有人提出,用表面活性剂处理之后,将从菌体释放的核酸进行过氧化氢处理和分解,然后分离PHA的方法(参照特表平08-502415号公报),但是含表面活性剂的废液激烈发泡,并且具有高的BOD负荷值。从这样的观点看,表面活性剂的使用在工业规模上是不理想的。
另外,一种提案是采用高压均化器破碎含PHA的微生物菌体来分离PHA的方法(参照特开平07-177894号公报、特开平07-31488号公报)。然而,这些方法的缺点在于至少对微生物菌体悬浮液进行3次、根据情况有时加热进行10次高压处理,也不能得到纯度高的PHA,得到的PHA的纯度仍然低至65~89%左右。
另外有一种提案是,向含PHA的微生物悬浮液中添加碱并加热来破碎细胞而分离PHA的方法(特开平07-31487号)。但是,该方法存在的缺点是,所得聚合物的纯度低至75.1~80.5%,而且为了提高收率而增加碱的添加量时,又引起聚合物的低分子化等。还有一些提案是添加碱后进行物理破碎的方法(Bioseparation,第2卷,第95-105项,1991年,特开平07-31489号),但是这些方法存在的缺点是,仅仅用碱处理,菌体构成成分只有少量被提取到菌体外,即使继续高压破碎处理之后菌体构成成分还是残存在PHA级分中,所以效果不好,因此如不对微生物菌体悬浮液进行至少5次高压处理,则得不到纯度高的PHA,而且所得PHA的纯度仍低至77~85%左右。还有,在添加碱的方法中,通常,从微生物菌体流出的菌体成分,特别是核酸,使菌体悬浮液的粘度上升,故有使其后的处理变难等问题。
另外一种方案是,将含PHA的微生物悬浮液调节到pH低于2的酸性并在50℃或50℃以上分离PHA的方法(特开平11-266891号)。然而,该方法存在的缺点是,由于该方法是在pH低于2的强酸性条件下进行处理,所以在工业规模上是不优选的,并且为了提高纯度还需要在酸处理后调节成碱性,从而产生大量的盐,另外,所得的PHA的分子量从247万下降到100万左右等。
特开平07-177894号公开了高压破碎处理菌体之后采用氧系漂白剂进行处理,由此分离精制聚-3-羟基丁酸酯(下面记作PHB)的方法。该方法虽然公开了用各种氧系漂白剂处理PHB的浆液的方法,但关于漂白处理时的pH没有记载。
发明概述本发明的目的在于,鉴于上述现状,提供一种精制方法,该方法以高效且较少的工序从由微生物菌体产生的3-羟基链烷酸共聚物中除去3-羟基链烷酸共聚物以外的菌体构成成分,即可高收率且不引起严重的分子量下降地获得高纯度且在熔融时无黄变或异臭的3-羟基链烷酸共聚物。
本发明人对3-羟基链烷酸共聚物与3-羟基链烷酸均聚物进行比较的结果发现,伴随过氧化氢处理的分子量下降显著的问题,为了解决该问题又进行了深入的研究。结果发现,进行过氧化氢处理时,通过用碱控制含3-羟基链烷酸共聚物的水悬浮液的pH则可防止严重的分子量下降。
即,本发明涉及的是精制微生物产生的3-羟基链烷酸共聚物的方法,该方法包括通过往含从微生物分离出的3-羟基链烷酸共聚物的水性悬浮液中连续或间歇性地添加碱,边进行控制上述水性悬浮液的pH边进行用过氧化氢的处理。
下面详细描述本发明。
附图的简述
图1示出为实施本发明的精制方法的装置之一例的简图。
附号的说明1搅拌槽2搅拌装置3 pH检测控制装置4泵5管路6碱贮槽7 pH计发明的详述本发明中的微生物没有特别的限制,只要是细胞内蓄积有3-羟基链烷酸共聚物的微生物即可。可以列举出,例如产碱菌属(Alcaligenes)、ラルストニア属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、固氮菌属(Azotobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、气单胞菌属(Aeromonas)的菌等。特别是,脂解产碱菌(アルカリゲネス·リポリテイカ(A.lipolytica))、广泛产碱菌(アルカリゲネス·ラトウス(A.latus))、豚鼠气单胞菌(アエロモス·キヤビエ(A.caviae))、嗜水气单胞菌(アエロモス·ハイドロフイラ(A.hydrophila))、ラルストニア·ユ-トロフア(R.eutropha)等的菌株,尤其是,导入了来自豚鼠气单胞菌的3-羟基链烷酸共聚物合成酶组基因的菌株,特别是ラルストニア·ユ-トロフア(R.eutropha)(旧名是真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)AC32)(根据布达佩斯条约国际保藏,国际保藏局独立行政法人 产业技术综合研究所 特许生物保藏中心(日本国茨城县つくば市东1丁目1番地中央第6)、保藏日1997年8月7日、保藏号FERMBP-6038,从原保藏的FERM P-15786号转保藏)(J.Bacteriol.,179,4821-4830页(1997))等更为优选。在适当条件下培养这些微生物可以使用菌体内蓄积了3-羟基链烷酸共聚物的微生物菌体。对所述培养方法没有特别限制,可以使用例如在特开平05-93049等中列举的方法。
本发明中所说的3-羟基链烷酸共聚物,是含3-羟基链烷酸的共聚物的总称。对于3-羟基链烷酸成分没有特别限定,具体地,可以列举D-3-羟基丁酸(3HB)与其他的3-羟基链烷酸的共聚物、或者含D-3-羟基己酸(3HH)的3-羟基链烷酸的共聚物等。另外还可以举出,含有选自3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、3-羟基戊酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸和3-羟基辛酸中的2种或2种以上的单体的共聚物等。其中作为单体成分,从所得聚酯的物性方面考虑,更优选含3HH的共聚物,例如,3HB与3HH的二元共聚物(PHBH)(Macromolecules,28,4822-4828(1995))、或者3HB与D-3-羟基戊酸(3HV)以及3HH的三元共聚物(PHBVH)(特许第277757号、特开平08-289797号)。这里对于构成3HB与3HH的二元共聚物PHBH的各单体单元的组成比没有特别限制,但使3HH单元为1~99mol%的组成比是合适的。另外,对于构成3HB与3HV与3HH的三元共聚物PHBVH的各单体单元的组成比没有特别限制,但优选的范围是,例如,3HB单元的含量为1~95mol%、3HV单元的含量为1~96mol%、3HH单元的含量为1~30mol%。
本发明中所谓“从微生物分离的3-羟基链烷酸共聚物”,指的是通过破碎含3-羟基链烷酸共聚物的微生物菌体而从微生物游离出的3-羟基链烷酸的共聚物。作为微生物菌体的破碎方法,没有特别的限制,可以举出以往公知的物理破碎、或通过添加碱的破碎等。
本发明中所谓“含从微生物分离的3-羟基链烷酸共聚物的水性悬浮液”,只要是把从微生物分离出的3-羟基链烷酸共聚物悬浮在水中的悬浮液即可,没有特别的限定。另外,在没有不良影响的范围内还可以与有机溶剂共存。通常,在该悬浮液中,混有由微生物菌体的破碎而产生的菌体构成物质等。
上述水性悬浮液,优选的是通过边搅拌含3-羟基链烷酸共聚物菌体的悬浮液,边与物理破碎的同时添加碱而把3-羟基链烷酸共聚物以外的菌体构成物质全部或一部分溶解并分离出3-羟基链烷酸共聚物,然后把3-羟基链烷酸共聚物悬浮在水中的水性悬浮液。
本发明中的“含3-羟基链烷酸共聚物的水性悬浮液”的3-羟基链烷酸共聚物的浓度,从高效良好地进行精制的观点考虑,优选等于或低于500g/L,更优选等于或低于300g/L。
在本发明中,与采用过氧化氢的上述水性悬浮液的处理的同时,通过连续或间断地往上述水性悬浮液中添加碱,则可控制上述水性悬浮液的pH。由此,在进行采用过氧化氢的蛋白质(残存在悬浮液中的菌体构成物质)分解的同时,还可以防止3-羟基链烷酸共聚物的分子量的严重下降。
作为用于本发明的碱,凡是能把pH调节至特定的范围的碱,则没有特别的限制。具体地可以举出,含氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙等的碱金属或碱土类金属的氢氧化物;碳酸钠、碳酸钾等碱金属碳酸盐;醋酸钠、醋酸钾等有机酸的碱金属盐;硼砂等碱金属的硼酸盐;磷酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸三钾、磷酸氢二钾等碱金属的磷酸盐;或氨水等。其中,从适于工业生产,且从价格方面考虑,优选氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾等。
在本发明中,通过加碱时控制的pH范围没有特别的限制,但从防止共聚物的分子量下降的观点考虑,优选控制pH为7或7以上,更优选控制pH为8或8以上,进一步优选控制pH上限为13或13以下,更优选控制pH上限为12或12以下。特别优选调节为pH8~11之间。
作为控制的pH的上下波动幅度设定值分别在1以内为优选,更优选上下波动幅度设定值分别在0.5以内。
在本发明中,碱的添加速度没有特别的限制,优选边测量上述水性悬浮液的pH推移,边以可将上述pH控制在所希望的范围那样的速度添加碱。
通常,用过氧化氢处理3-羟基链烷酸共聚物时,可以观察到,伴随精制的进行,上述水性悬浮液的pH出现慢慢下降的现象。本发明为了抑制该现象而进行连续或间断地添加碱则将上述水性悬浮液的pH控制在一定范围内。当添加使pH超过14那样的过量的碱时,不仅引起过氧化氢分解和精制效率下降,而且也容易导致3-羟基链烷酸共聚物分子量的下降,另外,若碱的加量不足则过氧化氢的活性下降不能获得充分的精制效果,另外,趋于酸性一侧时,3-羟基链烷酸共聚物的分子量也有大幅度下降的倾向。但通过连续或间断地添加合适量的碱来控制pH,就可以同时达到提高精制效率和抑制分子量下降的2个目的。
在本发明中,过氧化氢的添加量没有特别的限制,作为水性悬浮液中的浓度优选等于或低于10重量%,更优选等于或低于5重量%,进一步优选等于或低于1重量%。另外,为了得到合适的精制效果优选等于或大于0.01重量%,较优选等于或大于0.05重量%,更优选等于或大于0.1重量%。
特别是本发明的场合,通过采用添加碱的方法控制水性悬浮液的pH,即使降低过氧化氢的添加量,也可以得到优良的精制效果。过氧化氢添加量的减少,可以降低精制工序的成本或削减排放水的处理负担所以是非常好的。即在本发明中,例如,即使过氧化氢的添加量是1重量%或1重量%以下,甚至不到0.5重量%也可以得到优异的精制效果。而不进行采用添加碱来控制水性悬浮液的pH,只是进行过氧化氢的处理时,对于过氧化氢的添加量是这样的低浓度,则是不可能达到充分的精制效果的。
在本发明中,通过过氧化氢的处理,优选在从室温或室温以上的温度到水性悬浮液的沸点的范围进行。为了在短时间更好地提高精制效果,优选在50℃或50℃以上,更优选在70℃或70℃以上进行处理。另外,通常进行处理10分钟~10小时,优选30分钟~5小时,更优选1小时~3小时。
进行过氧化氢处理后,将进行离心分离得到的沉淀物用水或有机溶剂,优选亲水性溶剂,具体的是甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃等溶剂进行洗涤、干燥,由此可以分离出3-羟基链烷酸共聚物。
实施发明的最佳方案下面揭示实施例更详细地说明本发明,但是本发明并不仅限于这些实施例。
(聚合物纯度的测定方法)离心分离(2400rpm,15分钟)聚合物的水性悬浮液除去上清液,用甲醇(但实施例4和比较例3的场合只用乙醇)洗涤2次后,在加热·减压下进行干燥得到聚合物粉末。将10mg聚合物粉末溶解到1ml氯仿中之后,加入0.85ml甲醇和0.15ml浓硫酸在100℃下处理140分钟。将其冷却后,加入0.5ml硫酸铵饱和水溶液激烈搅拌后静置,对下层部分进行毛细管气体色谱分析,求出聚合物的纯度。
(聚合物分子量的测定方法)聚合物分子量,是将从菌体分离得到的沉淀物10mg溶解在1ml氯仿中之后,过滤除去不溶物。使用装有Shodex K805L(300×8mm,2根连接)的SHIMADZU社制的GPC系统,并以氯仿为流动相对该溶液进行分析。
(聚合物熔融时的YI值的测定方法)离心分离(2400rpm,15分钟)聚合物的水性悬浮液除去上清液,用甲醇(但只有实施例4和比较例3的场合是用乙醇)洗涤2次后,在加热·减压下进行干燥得到各试样。对于PHBH试样在加热到170℃,对于PHB试样在加热到190℃的铝片上熔融10分钟作成颗粒,使用日本电色工业(株)制的分光式色彩计SE-2000进行测定,求出黄色度指数(YI值)。
(聚合物中的残留氮量的测定方法)离心分离(2400rpm,15分钟)聚合物的水性悬浮液除去上清液,用甲醇洗涤2次后,在加热·减压下进行干燥得到各试样。关于各试样用对于使用ダイヤインスツルメンツ社制的微量氮分析装置TN-10测得的氮浓度乘以6.38进行蛋白质换算出的值表示。
(含有从微生物分离的PHBH的水性悬浮液的配制)PHBH的悬浮液,是将导入了来自豚鼠气单胞菌的3-羟基链烷酸共聚物合成酶组基因的ラルストニア·ユウトロフア(R.eutropha)(旧名是真养产碱菌(アルカリゲネス·ユウトロフアス(Alcaligenes eutrophus))AC32(上述的保藏号FERM BP-6038)),按照J.Bacteriol.,179,4821-4830页(1997)中记载的方法进行培养,得到了含PHBH约67重量%的菌体。往通过离心(5000rpm,10分钟)从培养液分离出的糊状菌体中加水,配制成758干菌体/L的水性悬浮液,添加作为碱的氢氧化钠的水溶液,边保持pH11.7边进行搅拌和进行物理破碎,由此溶解PHBH以外的菌体构成物质并进行离心分离(3000rpm,10分钟)得到沉淀物。进一步进行水洗沉淀物,分离出了平均分子量约为70万,3HH摩尔分率5%,纯度91%的PHBH。将得到的PHBH作成75g/L的水悬浮液,在下面的实施例1~2和比较例1~2中使用。
图1是实施本发明的3-羟基链烷酸共聚物精制方法用的装置之一例的简图。当然本发明并不限于所举例的该装置。
(实施例1)将PHBH的水性悬浮液50ml放入装有pH电极的100ml搅拌槽中并在70℃下保温。pH电极连接到丸菱バイオエンジン社制的MDL-6C型实验室控制器上,设定成为pH达到设定值或其以下时,蠕动移液泵开始工作,并向该悬浮液内添加氢氧化钠水溶液直至达到设定值时。把实验室控制器的pH设定为10,并向该悬浮液中以过氧化氢浓度相对于聚合物重量为5重量%(相对于悬浮液重量为0.375重量%)并进行搅拌1小时那样添加30%过氧化氢水并进行搅拌1小时。然后通过对该悬浮液离心分离并水洗2次,再用甲醇进行洗涤2次之后,进行干燥而获得粉末。
同样地把实验室控制器的pH设定为7和8并进行上述处理。这些结果示于表1中。
表1
从该结果可见,在过氧化氢处理时若添加碱控制pH,则可提高共聚物的纯度且减少氮的残留量,同时不改变共聚物的分子量,而且可以抑制共聚物熔融时的变黄现象。
(实施例2)用与实施例1同样方法,把实验室控制器的pH设定为10,在50℃下进行搅拌3小时。然后通过离心分离该悬浮液进行2次水洗,再用甲醇进行洗涤2次后,进行干燥获得粉末。结果示于表2中。
表2
从该结果可见,若边添加碱控制pH边进行过氧化氢处理,则在提高共聚物纯度的同时,共聚物的分子量也不改变,而且还可以抑制共聚物熔融时的变黄现象。
(实施例3)如下地配制悬浮液将与上述同样进行处理得到的分子量148万、3HH摩尔分率7%、纯度99%的110g的PHBH悬浮在1000ml水中,并放入装有pH电极和シルバ-ソン混合器(SILVERSON MIXER)的2000ml搅拌槽中并在70℃下保温。pH电极连接到丸菱バイオエンジン社制的MDL-6C型实验室控制器上,并设定成为pH达到设定值或其以下时,蠕动移液泵开始工作且将氢氧化钠水溶液加到该悬浮液内直至达到pH为设定值10时。把シルバ-ソン混合器转数设定为5000转,并以过氧化氢浓度相对于聚合物重量为5重量%(相对于悬浮液重量为0.375重量%)那样将30%过氧化氢水添加到该悬浮液中并进行搅拌50分钟。然后通过对该悬浮液离心分离并水洗3次,再用甲醇进行洗涤2次之后,进行干燥而获得粉末。这些结果示于表3中。
表3
从该结果可见,若边添加碱控制pH边进行过氧化氢处理,则共聚物的分子量不改变,而且还可以抑制共聚物熔融时的变黄现象。
(比较例1)将与实施例1中所用相同的PHBH的水性悬浮液(pH7.19)(处理1)50ml,和其中添加氢氧化钠pH为9.16的悬浮液(处理2)50ml,各在100ml搅拌槽中70℃下保温。以过氧化氢浓度相对于聚合物重量为5重量%(相对于悬浮液重量为0.375重量%)那样将30%过氧化氢水添加到该悬浮液中,不进行pH调节地搅拌3小时。然后通过对该悬浮液离心分离并水洗2次,再用甲醇进行洗涤2次之后,进行干燥而获得粉末。其结果示于表3中。
表4
从该结果可知,不调节pH地进行过氧化氢处理时,共聚物的分子量下降到不足处理前的分子量的90%。
(比较例2)将实施例1中所用的PHBH的悬浮液50ml的pH用稀盐酸调至pH为5,放入装有与实施例1相同的pH电极的100ml搅拌槽中于70℃下保温。把实验室控制器的pH设定为5,以过氧化氢浓度相对于聚合物重量为5重量%(相对于悬浮液重量为0.375重量%)那样添加30%过氧化氢水,搅拌1小时。然后通过对该悬浮液离心分离并水洗2次,再用甲醇进行洗涤2次之后,进行干燥而获得粉末。其结果示于表5中。
表5
从以上结果可见,若边用酸控制pH边进行共聚物的过氧化氢处理,虽然可以提高共聚物的纯度,并抑制共聚物熔融时的变黄现象,但共聚物的分子量却大幅度地下降了。
(实施例4)对于进行与上述同样地处理得到的分子量80万,3HH摩尔分率5%,纯度>99%的PHBH的悬浮液50ml,与实施例1进行同样地处理。但实验室控制器设定为pH8。其结果示于表6中。
(比较例3)除了不添加过氧化氢以外,进行与实施例4同样的处理。其结果示于表6。
表6
从表6结果可见,若边加碱控制pH边进行过氧化氢处理,则可防止共聚物的分子量下降,并可抑制共聚物熔融时的变黄现象,但若不进行过氧化氢处理只由添加碱进行控制pH时,分子量下降,而且也几乎不能控制熔融时的变黄现象。
(参考例1)以过氧化氢浓度相对于聚合物重量为5重量%(相对于悬浮液重量为0.375重量%)那样将30%过氧化氢水添加到聚-3-羟基丁酸酯[アルドリツチ社制,纯度95%,分子量65万]的10%水性悬浮液中。不调节该水性悬浮液的pH,于70℃下加热搅拌3小时。然后通过对该悬浮液离心分离并水洗2次,再用甲醇进行洗涤2次之后,进行干燥而获得粉末。该粉末的结果示于表7中。
表7
对于均聚物,即使不调节pH地进行过氧化氢处理,分子量也不下降,而且还可以抑制熔融时的变黄现象。
(参考例2)用稀盐酸将PHB[纯度95%,分子量65万]的10%水性悬浮液的pH调节成pH5,于70℃下保温。以过氧化氢浓度相对于聚合物重量为5重量%(相对于悬浮液重量为0.375重量%)那样将30%过氧化氢水添加到该悬浮液中,进行搅拌3小时。然后通过对该悬浮液离心分离并水洗2次,再用甲醇进行洗涤2次之后,进行干燥而获得粉末的PHB。该粉末的分子量为65万,保持了过氧化氢处理前的分子量。即使添加酸进行过氧化氢处理PHB也能保持其分子量。
从参考例1和2的结果可知,均聚物的场合过氧化氢处理之际不用碱控制pH时分子量不下降。即,过氧化氢处理之际分子量下降是不同于共聚物的现象,按照本发明的精制方法可以防止该共聚物的分子量下降。
工业实用性按照本发明的3-羟基链烷酸共聚物的精制方法,则可以通过非常简便的方法,防止3-羟基链烷酸共聚物在过氧化氢处理时分子量的严重下降,而且,可以高收率地得到高纯度且没有熔融时的变黄或异臭的3-羟基链烷酸共聚物。
用该方法得到的极高纯度的3-羟基链烷酸共聚物可用于广泛的用途中,是工业上特别有用的。
权利要求
1.一种精制方法,该方法是精制微生物产生的3-羟基链烷酸共聚物的方法,其特征在于,通过连续或间断地向含有从微生物分离出的3-羟基链烷酸共聚物的水性悬浮液中添加碱,边进行控制上述水性悬浮液的pH边进行采用过氧化氢的处理。
2.权利要求1所述的精制方法,其特征在于,控制水性悬浮液的pH在7~13之间.
3.权利要求1或2所述的精制方法,其特征在于,水性悬浮液中的过氧化氢的浓度是0.01重量%~1重量%的范围。
4.权利要求1~3中的任一项所述的精制方法,其中3-羟基链烷酸共聚物,是D-3-羟基己酸与其他的D-3-羟基链烷酸的共聚物。
5.权利要求1~3中的任一项所述的精制方法,其中3-羟基链烷酸共聚物,是含有选自3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、3-羟基戊酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸和3-羟基辛酸中的2种或2种以上的单体构成的共聚物。
6.权利要求1~3中的任一项所述的精制方法,其中3-羟基链烷酸共聚物,是D-3羟基己酸与D-3羟基丁酸的二元共聚物,或D-3羟基己酸与D-3羟基丁酸与D-3羟基戊酸的三元共聚物。
7.权利要求1~6中的任一项所述的精制方法,其中产生3-羟基链烷酸共聚物的微生物是属于气单胞菌属的微生物。
8.权利要求7中所述的精制方法,其中产生3-羟基链烷酸共聚物的微生物是豚鼠气单胞菌或嗜水气单胞菌。
9.权利要求1~6中的任一项所述的精制方法,其中产生3-羟基链烷酸共聚物的微生物是导入了来自豚鼠气单胞菌的3-羟基链烷酸共聚物合成酶组基因的菌株。
10.权利要求1~9中的任一项所述的精制方法,其中3-羟基链烷酸共聚物的水性悬浮液,是边搅拌含3-羟基链烷酸共聚物菌体的悬浮液,边通过与物理破碎的同时添加碱而使3-羟基链烷酸共聚物以外的菌体构成物质全部或一部分溶解并分离3-羟基链烷酸共聚物,再将3-羟基链烷酸共聚物悬浮在水中制成的水性悬浮液。
全文摘要
本发明提供一种不显著引起分子量下降且高纯度地精制从含PHA的菌体分离出的PHA的方法。该方法是精制微生物产生的3-羟基链烷酸共聚物的方法,其包括通过连续或间断地将碱添加到含有从微生物分离出的3-羟基链烷酸共聚物的水性悬浮液中,且边控制上述水性悬浮液的pH边进行采用过氧化氢的处理。
文档编号C08G63/90GK1685048SQ0382343
公开日2005年10月19日 申请日期2003年9月30日 优先权日2002年9月30日
发明者小川典子, 官本宪二, 小坂田史雄, 松本圭司 申请人:株式会社钟化