微生物培养和检测的设备和方法

专利名称:微生物培养和检测的设备和方法
本发明是关于微生物培养和检测的设备和方法，更具体地说是适用于活动细菌，例如沙门氏菌、凯普勒菌属、李司忒氏菌属、弧菌属、气单胞菌属、埃希氏杆菌属的菌种、菌株和血清型的装置和方法。
上述这些活动细菌，由于其对人和动物的病原特性，在食品卫生，环境卫生和污染的监视，以及用作临床试样等方面，是特别重要的主体。
现有的方法，特别是对在食品试样中沙门氏菌污染所用的检测方法，既耗时又费力。
一种用于沙门氏细菌污染(如在食品试样中)的标准的检测方法，包括如下步骤(a)在225毫升含有如细菌学胨的“预浓缩”或“复苏”(resuscitation)介质中分散25克食品或其它物料的试样，培育多达一天的时间(如在37℃下，培育18-24小时);
(b)把原始培养液再培养在每一种由一种或多种不同形式(例如二种)构成的“选择性浓缩介质”中，以抑制与存在的沙门氏菌有关的其它微生物的生长，通过培育使这些浓缩培养液生长，以得到可以显示的沙门氏菌(如果存在);(最少的可显示的菌的含量可以在很大范围内变化，若不存在其它污染，则为大约每毫升1000个微生物，在有其它微生物严重污染的情况下，每毫升大约有一百万以上的微生物或者更多);
(c)用所得的浓缩培养液，在一组选择性不同的固体生长介质上接种，通常在琼脂上接种，在皿上识别出沙门氏菌落(如果在初始的试样中存在);
(d)对任意临时识别为沙门氏菌的菌落至少进行生物化学和/或免疫学(凝集)检测，以进一步证实或推翻这种识别。
整个过程大约一周。
近来，发展了一种改进的免疫学的检测方法，它可取代标准方法中的步骤(c)和(d)，稍微缩短了整个时间。
现有技术中还有一种办法，即通过一个选择性的移动系统用以隔绝沙门氏菌(PFStuart和HPivnick(1965)，应用微生物学13(3)PP365-372)，这种技术是利用u形管中“半固体”胶体介质，在u形管的一侧，接种后将得到细菌，在其另一侧，在半固体胶体的表面用一取自预浓缩培养液的样品作为接种体。
另一种依据待测微生物活动性的技术如美国专利USP 4563418(生物控制有限公司)所述，该专利描述了一种“活动免疫固定方法”(motilityimmunoimmobilisation)，用来检测活动的微生物，如沙门氏菌。它还公开了一移动容器，其每端开孔，一个盖子盖在每端的开孔上，它包含一种胶凝的移动介质。采用这种系统时，在(容器)一端通过置入抗血清来固定与胶凝介质相接触的沙门氏菌，在其另一端，置入含有趋药性诱引剂(如L-丝氨酸)的选择性浓缩介质和微生物接种体，所说的接种体来自先有的与胶体介质相接触的选择性浓缩培养液。培育之后阳性结果由靠近抗血清加入处的管子那端的一部分固定细菌来指示。
另外有关(包括移动浓缩的内容)沙门氏菌的检测的回顾与说明最近已经出版，可见JM De Smedt，RF Bolderdijk，HFRappld和DLautenschlaeger(1986)《食品保护》，卷49(7)PP510-514，其中提到，转移由预浓缩培养液得到的接种体，以便在含有Rappaport-Vassiliadis肉汤的半固体琼脂表面上形成斑点经过24小时培育之后，在迁移后的细菌显现生长的区域边缘采集试样，进行再培养，以检测沙门氏菌的存在。
美国专利USP3704204(Armour和CO)描述了一用于沙门氏菌的快速检测法，举例为用一个位于介质表面上方大约1吋或半吋的用乙酸铅饱和的棉墩，在营养基中培育肉骨样品，营养基中含有选择性抑制剂，如胆汁盐，脱氧胆酸盐，氧化锂和吖啶衍生物(吖啶黄素)在经过24小时培育之后，棉墩发黑，这视为阳性(可疑)结果。据报导，采用这种方法，尽管没有错误的阴性反应，但有许多错的阳性反应。
虽经这些努力，但如何以简便的方式，缩短活动细菌检测所需的时间，特别是在较早的培养阶段上，仍存在着问题。
本发明的目的之一，就是为活动细菌提供检测装置和方法，它能使由单个容器内的样品培养液所获得的检测结果，具有较高的可靠性。
本发明的另一个目的，是提供简便的活动细菌选择性浓缩培养和检测的装置和方法，以简化和/或减少操作者对样品和培养液的处理。
一方面，本发明提供了一种选择性培养活动细菌的方法，包括的步骤是(a)制备一种怀疑含有活动细菌的物料的细菌学培育样品;
(b)将上述物料放入含有适宜于活动细菌复苏和生长的液体营养基的培养容器中;
(c)提供一种载体，它部份地浸入上述的液体营养基中，并且凸出在上述液体营养基表面以上，上述载体含有支持营养介质，它们选自适合于活动细菌细菌学的选择性生长和指示的介质，上述载体在上述的液体营养基表面以下有一个开孔，以使在上述容器中的液体介质和上述载体中的支持介质之间保持接触，从而使得活动细菌在培养期间可以从上述的液体中迁移到上述的支持介质中。
(d)培育上述的试样和上述的营养基，以使在上述液体介质中的试样里存在的任何活动细菌生长，并且使活动细菌在培养期间迁移入上述的支持介质中，并在其中使活动细菌生长。
在几个方法的实施例中，上述载体在上述液体营养基表面以上同样有一个开孔，上述支持营养介质可有一转移表面，以使在活动细菌迁移入支持介质、生长并通过以后，便于转移含上述细菌的试样。上述方法还可包括另一步骤，即在上述细菌生长之后，把它们从支持介质的转移表面转移入和转移过上述支持介质。
另一方面，本发明提供了一种选择性培养活动细菌的设备，它包括(a)一含有适合于活动细菌复苏和生长的液体营养基的培养容器;
(b)一种载体，它部份地浸入上述液体营养基中，又凸出在上述液体营养基的表面上，上述载体含有支持性营养介质，它们选自适合于活动细菌细菌学的选择性生长和指示的介质，上述载体在上述液体营养基表面以下有一个开孔，以便于在容器中的液体介质和在载体中的支持介质保持接触，从而使得活动细菌在培养期间可从上述液体迁移入上述支持介质中。
这样，本发明可以实现微生物，如活动细菌的培养、选择、浓缩，在许多实施例中，还包括了检测。发明可以利用已知类型的适合于待测的微生物复苏和生长的液体介质，它包括用干组分经水或用适宜的基本介质再水化以形成这种介质。类似地，也可以利用已知类型的适合于待测的微生物选择的支持性选择浓缩介质和/或适合于待测的微生物指示其存在和生长的指示剂，以及其它改进形式，还包括干制剂，它经水或用适宜的基本介质再水化后，即形成这种支持介质。
本发明还提供了一些支持介质载体，它们具有如下所述的特征，用在下面所述的培养步骤中。
在采用本发明时，培养容器和支持介质应这样设置，使得选择性浓缩和/或指示介质在与复苏和生长介质相接触的一个区域或容器中，从而在使用时，待测微生物在培养过程中，可以生长或选先移入浓缩介质，不要求通过人工接种转移。
在本说明书中，“支持介质”的含意是指一种与胶体或固体原料相伴(如分散)的液体生长介质，这种介质达到了这种程度，即它基本上不存在对流，但不能阻止活动微生物在其内的迁移，也不能阻止(在合适的情况下)非活动微生物生长通过。这种条件是能够提供的，例如通过含有凝固剂的介质，或依靠一种由固体网状物或骨架支撑的液体介质，达到基本没有对流的程度。非限制性的支持介质的实例如稀薄的明胶材料如“Sloppy”胶体，它是一种公知的用于浓缩活动细菌的材料，又如纤维状的传导材料，例如过滤纸、尼龙或聚酰胺或聚酯过滤器，特别如褶形过滤器，它具有很狭窄的含有液体或半固体胶体的轴向通道，在该通道内，微生物可以生长，或者微生物因它们自身的活动特性能够迁移，或一种多孔聚合物过滤器。
人们知道，选择性介质和浓缩介质可用作为培养基，它含有选择性的抑制剂，用以阻止或减少除待测微生物外的大部分其他微生物的生长，最差的情况是只有轻微的抑制，而较优选的是对所需微生物的生长呈中性或起刺激作用。这种试剂的实例和其剂量在现有技术中已属公知，不属于本发明的内容。在存在沙门氏菌的情况下，已知的选择性试剂包括胆汁盐，吖啶衍生物和如下文说明的其他特定介质组分，如，染料如钻石绿。
本发明所用的液体复苏/生长介质可以不含选择性抑制剂。对于沙门氏菌检测，用选择性抑制剂如孔雀绿是有益的。在大多数情况下，复苏/生长介质应不含趋药性诱引剂，从而如果需要，可有效地在支持介质中包含公知的趋药性诱引剂，例如L-丝氨酸，以增强活动微生物从液体复苏介质(自动)转移入支持性选择介质和/或指示介质的能力。
本发明能够使加到培养装置的食品或其它试样，在一个培育阶段后，得到一种待测微生物(如果存在)的浓缩培养液。
本发明的优点之一是它提供了一种培养装置，它能在与食品样品接种的单个培养装置内，获得适当稠密的和浓缩的活动细菌(如沙门氏菌)菌种的培养液。
按照本发明，还提供了一种用于微生物例如细菌，特别是活动细菌的选择性浓缩培养方法，包括把怀疑含有上述微生物的浸软食品或其它试样接种到适合待测微生物复苏和生长的液体介质中，然后使上述微生物(如果存在)在上述的液体介质中复苏和生长，其中上述的液体介质培育时又与上述微生物的支持选择性浓缩介质相接触，从而使得任何上述微生物(如果存在)在培育期间能生长和迁移入选择性介质中，在上述培育结束后，得到上述微生物(如果上述样品中存在)的浓缩培养液。
按照本发明，还提供了用于如上所述的选择性浓缩培养的物料，物料包括一系列成品试剂和包含干试剂的载体，载体用水或基本介质再水化，得到如上所述载有支持介质的装置和插入件。这些物料最好被分布在密封的干燥无菌袋中，使用时启封并再水化。
根据本发明装置的一个实施例，半固体或者其他支持选择性浓缩和/或指示介质，被支持在第二个容器，或培养容器的第二区域中，使得在选择性浓缩介质和/或指示介质中的浓缩培养试样，在培养周期结束时，可以方便地取出。
在第二容器中的选择浓缩介质和/或指示介质，如果需要，可以通过一支持隔板与第一容器的液体介质分开，所说的隔板例如筛网、过滤器或多孔膜，或者其它能使活动细菌通过的隔板。适宜的孔径至少大约5-10微米-大孔是容许的和有利的。适宜的多孔聚合物材料例如由Porex工业技术公司出售的“Porex”牌(商标)，目前这种材料优选的是“Porex”Cat·X4898高级亲水DBS多孔聚合物，孔的尺寸15-45微米，板厚1/8吋，并切割成适当大小的园盘。
在一种简便的实施例中，液体介质有一个区域同半固体选择浓缩介质或指示介质相接触，通过在半固体浓缩介质中所含胶体轻微的脱水收缩作用获得一方便的取样点，从而能够经由第二容器或第二容器区域取样孔取样。它能以液体形式引出浓缩培养试样，可优选用在半固体培养液的取样上。
如果需要，按照本发明的设备能提供二个以上的培养介质区域，串联设置，从而使得活动细菌在从液体介质的接种区域迁移到取样点时，必须跨过二个以上的培养介质区域。这种设置能集合在一起，例如采用一个含有支持选择性浓缩和/或指示介质的第二管。这种管可在它的顶部和底部开孔，浸入液体复苏培养介质中，在管的下端，使液体介质同在管内的支持介质之间经由大孔膜或者过滤器或其它可被微生物穿过的隔板实现液相接触，并含有一系列浓缩介质的胶体或其它支持层，其中设有一取样点，它同管子上部开孔或其他简便的取样点相邻近。
按照本发明，装置可这样使用(a)把一怀疑含有活动细菌的样品接种到液体培养介质区域中，但不能到浓缩介质区域，(这可以这样做到例如通过把样品粉碎或分散到液体培养介质中)(b)培育培养介质以使活动细菌(如果存在)繁殖并迁移入浓缩介质区域，(c)从一个或其中之一个浓缩介质区域取样，取出含有活动细菌(如果在接种体内存在)的浓缩培养液样品。
按照本发明设备的另一个实施例，它包括二个或二个以上并联设置的半固体或支持选择和/或指示介质的区域，从而使得微生物，如待测的活动细菌，可从液体介质的接种区域生长或迁移入每一个平行的区域，每个区域含一种或多种半固体或支持选择和/或指示介质。这可如下实现，例如将第二管浸入液体培养介质，在液体介质和支持介质之间经由大孔膜、过滤器和其它隔板在每个管下端保持接触，另设置一个取样点，它和每个管上部开孔相邻。
这些实施例带来的优点是，在单个培养容器中，可以同时载有适合于活动细菌的二种或二种以上的选择浓缩介质和/或指示介质，在许多情况下，经过初始接种后，就不再需要人工处理。
然后，浓缩培养的样品，可用适当的方法，来检测微生物如活动细菌的存在。这些方法例如微生物培养、生物化学、免疫学或者显微检测方法。
本发明优选的材料及其相应的设备包括一个管状载体，管状载体二端的每一端均开孔，装载支持选择性浓缩介质，或者经再水化后可形成上述介质的干物质。不论支持介质是呈胶体或液体形式，都可依靠适宜的多孔挡板把它们截留在管状载体内，以使微生物可以通过。当为液体介质时，挡板可以是纸或塑料材料的紧密褶形过滤器，这种过滤器有非常狭窄的轴向通道，可基本上阻止对流，但可使待测的微生物生长或移动通过。现已发现，可以使用如过滤嘴香烟的滤嘴那样的普通褶形过滤器。
管状载体较方便地是采用圆柱体，但这不是主要的，也能采用其它断面形状。管状载体包括任意的顶部或底部开孔，或顶部与其它设备材料相通的形式，活动细菌可在载体内迁移，以用于进一步检测。在一个合适的实施例中，管状材料是不透水的塑料制品，包含有一个或一组相类似的或不同的选择性浓缩区域，或选用对待测微生物有鉴别性的介质区域，串联设置，从而使微生物培养液必须从管状载体的一端，依次穿过每一个区域而到达另一端。
优选地，管状载体在其远离用作与复苏介质相接触的开孔端的另一开孔端处，载有游离液体或多孔材料，通过该端，游离液体样品可以很容易提取出来，作为浓缩培养液试样，用于附加的鉴别或培养步骤(如果需要)中(例如可通过挤压试管)。如果在管状载体中有一种以上支持介质，则为一个或多个其顶部不通孔的隔室提供一个通道是有用的，该通道可释放如代谢气体或再水化时的空气。
以下将非限制性地举例说明目前较优选的，用于本文所述设备的介质(a)介质1(用作在培育管中沙门氏菌的复苏和生长的适宜的介质)，由足够量的等分的干粉构成，它们在吸收无菌水后，可得225毫升如下的组合物酪蛋白胰酶解胨(Oxoid L42)10克/升;氯化钠5克/升;磷酸氢二钠3.5克/升;孔雀绿(Merck细菌学级)40毫克/升，形成这种介质后，pH值约7.2。
介质1优选用作检测这样的样品，即它们被怀疑除了与沙门氏菌有关外，很少或没有被其它微生物污染。如它可用于牛奶和鸡蛋产品如奶粉和蛋粉的检测。
一种选用的介质1a另含40毫克/升新生霉素和4克/升(无抗菌素)脱脂奶粉。在另一该选用介质的改进型中，主要从清晰度考虑，用3.0克/升酪蛋白代替奶粉。这种选用的介质优选用于怀疑有大量的非沙门氏菌污染的产品，如肉类产品中。
(b)介质2(LID)(适合于活动沙门氏菌的生长和传递的选择性支持介质和指示剂)为一种干粉组合物，经再水化后可得到一种高粘性的含下列组分的介质，称为“Wet”湿含量(克/升)细菌学胨(Oxoid L37) 10酵母提取液(Oxoid L21) 6葡萄糖 2L-赖氨酸 20柠檬酸铁铵 1硫代硫酸钠 0.08藻酸钠(工业藻酸盐/Kelco藻酸钠二甲基甲酰胺)(或者-优选地-用3.75克/升黄原酸树胶代替藻酸盐)10
湿含量(克/升)L-丝氨酸 1脱氧胆钠 5-(最终pH值为6.7)介质2可以干粉形式等分配入载体管下部腔室。
现有的一种优选的介质2(LID)的改进型，是用3.75克/升黄原酸树胶(Xanthan gum)和1.25克/升乳糖代替藻酸钠。
(c)介质3(改进的RV基于Rappaport-Vassiliadis介质)是选用的适合于活动的沙门氏菌的，带指示剂的选择性支持介质。它含有适当的干粉，再水化后得到高粘度的下列组分的介质、称为“Wet”湿含量(克/升)大豆胨，中性的(Oxoid L44) 5氯化钠 8磷酸二氢钾 1.6氯化镁(无水) 18.7藻酸钠(工业藻酸钠/Kelco藻酸钠二甲基甲酰胺) 12.5丝氨酸 1孔雀绿(细菌学级) 0.04-(最终pH值约为5.2)介质3同样可望用于管状载体的下部腔室。
(d)介质4(BGD)(钻石绿脱氧胆指示介质)
湿含量(克/升)凝乳酶粉(Oxoid) 5细菌学胨(Oxoid) 10酵母提取液(Oxoid L21) 3乳糖 10蔗糖 10磷酸氢二钠 1磷酸二氢钠 0.6酚红 0.09钻石绿 0.0047L-丝氨酸 1脱氧胆酸钠 5藻酸钠(藻酸钠二甲基甲酰胺)(或者-优选地-用3.75克/升黄原酸树胶代替藻酸盐)10-(最终pH值约6.9)介质4可望用于管状载体的上部。
(e)介质5(LICNR)(赖氨酸铁胱氨酸中性红指示介质)湿含量(克/升)L-单氢氯化赖氨酸 8L-二氢氯化赖氨酸 2胰酶解胨(Oxoid L42) 5酵母提取液(Oxoid L21) 3乳糖 5葡萄糖 1水杨苷 1
湿含量(克/升)柠檬酸铁胺 0.5硫代硫酸钠 0.1L-胱氨酸 0.1L-丝氨酸 1藻酸钠(藻酸钠二甲基甲酰胺) 7.5-10中性红 0.025-(最终pH值约6.2)这种介质也可望用于在管状载体的上部。
在使用这些介质的一种有效的方式中，第一选择指示管含有二个隔室，在下隔室中有介质LID，在上隔室中有介质BGD。第二个选择指示管和第一个平行设置，具有类似的结构，在其下隔室中，有改性的RV介质，在上隔室中有LICNR介质。
通常，这些介质的实施例的共性特征是一种或多种选择/指示介质被(较弱地)凝固，并含有一种趋药性的有效量的丝氨酸或者其它细菌学趋药性的诱引剂，而复苏/生长介质是液体，不含任何附加的丝氨酸或其它诱引剂。
本发明的实施例将参照附图作进一步的描述，而本发明并不仅仅限于这些实例。
提供的附图如下(不按比例)图1，2，3，4，5是按照本发明的优选的实施例。
图1是按照本发明的实施例之细菌学检测装置单元系统的透视图。
图2是图1系统检测装置的局部透视图。
图3是图2装置水平剖视的平面图。
图4是图2装置侧视图，图5是如图1所示的管状载体的结构示意图。
图6是按照本发明一个选择性实施例的培养设备剖视图。图7是另一个选择性培养设备的正视图。
图8是内含有待再水化的干燥的圆柱形支承体的无菌密封袋的剖面图，它可成为图6或图7所示设备的一部分。
图9和10是大致如前各图所示的安装在一浮动架中的管状载体的透视图和垂直剖视图。
图11是用于所述的培养方法的改进的管状载体的实施例之透视图。
除有特别指出者外，本说明书所涉及的培养介质及其组分均记载在Oxoid指南(Oxoid有限公司出版，Wade Road，Basingstoke，Hampshire，RG24OPW，UK(1982年第5版)和它修订的附录中。
参照图1，一呈金属线框状的托架1，支持检测装置2，检测装置2有一个顶盖，外表面由热成型塑料构成，托架1可以支持像检测装置2那样的一组装置，在本例中为一排。
图2表示如图1的检测装置2的局部透视图。检测装置2包括一个热成型塑料盆体3，它包括整体折缘4和一个内部可移动的塑料盖5，塑料盖5位于在盆体3中的凸缘6上，凸缘6用来支持盖5。在本实施例中，塑料体3具有基本上透明的侧壁，事实上，塑料体3全部是由基本上透明的塑料材料构成。装置体3的下部7(在盖5和凸缘6以下)作为以下所描述的微生物生长介质和检测样品的培育室，在一种有效的构形中，装置2的尺寸能在盖5以下容纳大约250毫升的液体和样品(同封头容积一起)。
在装置体3的侧壁内设置定位槽8，接受和容纳支持微生物介质的载体。图2表示有4个定位槽8，这些槽8采用半圆形凹槽形状，用来支持和接受像图2所示载体9那样的管状载体。管状载体9配置在图2装置内，通过盆体3挠性的侧壁内的定位槽8和像内盖5中凹槽10那样的半圆形凹槽的联合作用而固定。盆体3和盖5由于轻微可挠，故可比较容易地插入和移动像9那样的管状载体，在每个盆体3里最多能容纳4个载体。
盆体3，折缘4，内盖5详细的结构如图3，4所示。
管状载体9的结构如图5所示。
每个管状载体9(例如聚苯乙烯制成，有些可挠性)有一个敞开的顶部和敞开底部11，至少有2个多孔隔板12，13(如在本文描述的由Porex DBS亲水多孔聚合物板)将其内部分隔成一组隔室14，15。最上部的隔室15可以敞开或用另一个多孔隔板盖上。当然这些隔板被设置成能使载体按本文所述方式使用，即当它们被浸入液体介质时，液体介质能同在载体内含有的介质相接触。为了这个目的，低部隔板通常设置在管子底部或者靠近管子底部。
聚苯乙烯管9和它的配件的合适尺寸如下内径约9mm下室容量(例如用于选择性介质)约1毫升，高度和上部介质容量约8mm和0.6毫升，管子全高约65mm。
每个上述的隔室内容纳的是对活动细菌有选择性的和/或能指示其中活动细菌的生长的培养介质。
合适的介质如上文所述。丝氨酸是一种特别有效的介质组分，因为它使介质对某些活动细菌，如沙门氏菌和埃希氏杆菌属表现为趋药性诱引。
作隔板的材料可用Porex技术有限公司的Porex(商标)多孔聚合物，特别是用大约1/8吋厚的亲水性的DBS聚合物板，切割成约1-3毫米，优选大于2毫米厚的圆盘。在使用干介质并由与水相接触再水化时，最好在聚合物圆盘的下侧提供一层薄薄的憎水材料涂层(例如“Repelcote”商标)。介质以干粉形态装入隔室里，经再水化后形成凝胶。现已发现，在某些特定情况下，上述介质中的乳糖和藻酸组分(或如目前优选的黄原酸和乳糖组分)，与多孔圆盘憎水的下表面一起，促进了水平滑地向上移动，从而得到连续的胶体介质，介质经管子内的充满含水液体的多孔隔板相互联结。
管子通常由干粉介质组分构成并且是无菌密封的，例如采用X射线照射铺箔密封。
设备可按下述使用。
培育用的样品的制备可方便地这样实现借助于-Stomacher(商标)均化装置(Seward，Surgical，VAC House，Blackfriars Road，伦敦SEI)(或其它如USP，3819158/GB1402538描述)，把样品分散到介质中。
使用的试样和介质的合适比例大约为25克比225毫升。(然而，在各种情况下，若使用大量的物料，把几种(如多到10种)样品组合和混合在一起，又如每种试样各25克，作为单个的有效试样，按本文所述方法检测，也在本发明的范围之内。当然，如果这一组合试样结果为阳性，则对每一种样品来源便均有怀疑，故需作进一步的检测)。
试样和液体营养基，可与一种或多种含有如上描述的合适介质的管状载体一起，放进培养容器中，支持介质同在培养容器中的介质相接触。管状载体最好这样放置;使它们的下端浸没在液体营养基液面以下，而它们的上端凸出在液面以上。
在培育之后，例如在37℃，或高达41.5℃，经过18-24小时，或按需要可延长至长达48小时，沙门氏菌的存在可通过如下途径指示如含有赖氨酸铁肉汤的任意区域黑化，和/或钻石绿指示剂肉汤颜色变红，或如在所选用的指示剂介质(如本文所选用的)的情况下，已知的相对应的颜色变化。
如果因证实培养和/或检测需要，浓缩的沙门氏菌培养试样可从开口的顶9移出，如果必要，可轻微地挤压含有支持介质的挠性管以从凝胶或其它形式的支持介质挤出培养液。如果需要，培养装置可以延长培育。
在一合适的培养周期之后，如果需要，可以移出在管状载体中支持介质上表面处的适宜的液体试样液滴，以作为活动细菌的浓缩试样。通常，当设立了一组培养容器来检测多个样品时，只是在那些指示剂阳性反应的试样才有必要移出样品进行进一步的测定。为进一步检测，采用某些装置，使它与含有选择性/指示介质管状载体顶部相通，这些也是在本发明所包括的范围之内。
参照图6，它表示一种选用的装置，包括一个培养瓶1，在培养瓶1内含有细菌学胨-水介质2作为复苏和生长介质，在复苏和生长介质内含分散的一定量的要检测微生物的食品和其它物料。该例是用于检测沙门氏菌污染的试样，在这种情况下，试样的制备和培养如图1-5所述。
培养瓶1还包括一个载体插入件3，插入件3提供一个由瓶1形成的培养容器的第二区域，第二区域被固定到培养容器有关的瓶口上，在这个实施例中，插入件3载有一种或多种选择浓缩和/或指示介质，它对呈被支持形态的沙门氏菌有选择性，即微生物可以迁移入载体插入件3和其中的介质，并能通过其中的营养基被选择性浓缩和/或指示。与此同时，其它微生物的通过或生长则受到限制。
载体插入件3包括一个挠性的不透水的塑料管4，悬挂和安装于培养瓶1的瓶颈5上，用一个多孔的细菌柱塞6封住，管4有敞开的顶部和底端，同时在该实施例中，在液面以上有一组侧向孔以允许空气排出。
在管4内有三个介质区，每个区通过一种紧密的褶形过滤器支持，这种滤器类似于过滤咀香烟的滤咀形式。褶形过滤器有轴向的狭窄通道，它基本上与管4轴线相平行。三个褶形过滤器7，8，9的每一个在管4内形成一个支持柱塞。过滤器互相靠在一起或几乎靠在一起。过滤器7，9如下所述是用介质浸渍的纸过滤器。过滤器8是纸的或者塑料材料的，它所含有的液体，是在管4部件装备有用水或用营养基从干燥的浸渍状态经再水化的过滤器7，8，9时，在其内部所流动的介质组分。
在该例中，柱塞7可用组分从其干料浸渍态再水化形成赖氨酸铁肉汤(通常包括在这种肉汤中的琼脂，黄原酸或者其他凝固组分可以存在，也可以不要)。柱塞9可用组分从其干料再水化，得到钻石绿指示剂肉汤。凝固组分可以存在，也可以不要。
管4和在其中的过滤器柱塞7，8，9在使用之前可通过在无菌蒸馏水中浸湿5分钟而再水化。然后无菌转移并插入到图1所示的瓶1的位置。
采用本装置后，与采用了本发明的其他装置和方法的例子一样，意味着当有一系列可疑的样品时，一组显示阳性反应的瓶(可能较少所需要的再培养或附加检测操作可以减少。该装置像许多本发明的选用形式那样，同样可快速地获得培养检测结果。
参照图7(不按比例)，除了如下所述者外，与图1所示设置类似。
在瓶1的适当位置有一个挠性塑料袋21，主要由二层在它们的边缘22处热封而成，袋中含有适合于微生物的复苏和生长的培养介质。折边23盖在由袋的后片和前片23a的上边缘形成的孔上。在使用中，通过二个挂钩24，25以及一在二个挂钩之间延伸的刚性支座把袋挂住。一个热封接缝26把袋分成主隔室和安放及支持不能透液的挠性塑料管4的侧袋27，4的顶部和底部是敞开的，用以支持基本如图6所述的选择性浓缩和/或指示介质。对于培养介质，侧袋27在下部与主隔室相通，由于接缝26没有完全延伸到袋底，培养介质表面如图示28。
管4及其所含物料，除了它包括5个柱塞之外，类似于图6所述。柱塞是由压紧的褶形过滤材料构成的。
最下部的柱塞用组分从其干浸渍制剂再水化，以得到加倍的赖氨酸铁肉汤(不包括必要的凝固组分)，这样，即使一部分肉汤被滤到大量的生长和复苏介质中，仍可获得足够的颜色反应。中部柱塞含有的组分可得到原量的赖氨酸铁肉汤，最上部柱塞含有(在再水化之前)的组分能得到钻石绿指示剂肉汤。在一种适合的实施例中，五个柱塞的总长度大约是2吋，而它们的直径大约是1/4吋。
该装置的使用如图7所示，在细节上可以作必要修改。
参照图8，它表示本发明实施例的一种无菌密封的干燥容器。该容器是由一种塑料外壳31构成，包含有脱水材料构成的管4，管内含如上所述的支持介质。干燥的柱塞(例如纸)在其成褶和压紧之前的制备为根据柱塞材料的要求，干燥一定量的可形成如上介质的物料。例如在60℃的真空中。这种材料在干燥、成褶、装填于管4中，密封在外壳31内之后，可用伽玛射线以0.5Mrade(KGrays)照射进行灭菌处理。如果要求的话，在每个外壳31中能够装填多个插入件，如果适宜，同时可放入一定量的干燥剂。
图6-8所述管状插入件的一种较重要的变化形式是可采用以明胶支持的由多孔，如图1-5所述的大孔隔板限制的半固体介质。它们可按照图8描述的那样干燥装填。
一种适宜的插入件(在附图中没有表示)，含有凝胶物质，其组分为Oxoid(商标)的含有胆脂酸钠(0.2克%)，脱氢胆脂酸钠(0.6克%)，新生霉素(0.04克%)和黄原酸(0.4克%)的硫化铋肉汤。这种混合物可选择性培养沙门氏菌，在阳性结果下变黑。明胶依靠固定在管子下端断面上的多孔膜过滤器截留在管内。当然这种膜也可以用在褶形过滤器支持的实施例中。
在这种情况中的用于沙门氏菌又一选用的实施例为，一种装置，它含有呈凝胶状态的选择性浓缩介质，能同复苏和生长介质液相接触，包括一个敞开的热成型塑料管，在它下部开口处直径大约1吋，在它顶端开口处，直径逐渐变狭窄，大约1/4吋，整个高度大约1吋。
底部开孔边缘用粘合剂通过细密的尼龙筛网膜密封。用于该例和另外的实例的适宜筛网孔径是10微米，每厘米190目，由42微米直径的尼龙线编织而成的筛网，筛网透水率是80升/平方米/秒。(这种筛网可以商购，为Simonyl HD10商标)。该装置可被支撑或浮动在复苏/生长介质表面上，它包含有如前所述的选择性浓缩介质。上部孔可被用作取样点。
在图9和图10中表示的是另外一些把管状载体放入如前所述的复苏培养介质中适当位置的布置。在图9和图10布置中，二个管状载体91，(基本上如前述各图所示)，作为一可移动推力件，装配入浮动架92上的孔中。架92包括一个平台93，平台上有孔用来插入管91，优选平台93的材料是白色的塑料板(刚性)，以便很容易地观察在管91内的介质状况。固定在平台93周围和下方的是充满空气或泡沫或其它浮动材料的浮动裙座94。如果裙座依靠空气浮动则为气密式。每个载体管包含一个由多孔亲水聚合物制成的下隔板(95)和上隔板(96)，下部为选择性支持介质97，上部为指示剂支持介质98。在培养周期结束时，试样能从上部介质的上表面99移出。
在使用当中，在管子中介质能够通过与水接触再水化，管子用推力将其装配进浮动平台93的孔中。然后，该装置在检测和培育时，浮动在与样品接种的复苏介质中。这种布置使得可以很大地改变培养容器的外形和尺寸，以适应各种规模的复苏培养。
一种改进的用于本发明所述的培养方法的管状载体的实施例如图11所示。一种注射模成型塑料管111设有如上所述的多孔亲水聚合物制成的下隔板112和上隔板113，形成下隔室114和上隔室115。在使用中，上述隔室114和115分别含有选择性和指示介质。通常如前所述，管状载体在114和115中含有干组分，无菌密封包装分布。下隔室114与上方的隔板113相连，另与管111的壁内所形成的侧孔116-117相通。侧孔116-117向上延伸越过隔室115，并且再开孔进入管111的主孔道，形成隔室114的通道。管的通道在使用之前是闭塞的，这是由在隔室115以上活塞118同管111密合实现的。按照这个实施例，通过手柄119向上移动活塞118，使再水化的水能够通过下隔板112快速抽上，以水化在114和115中的凝胶介质。活塞18在使用之后，完全抽出并弃之。所形成的经再水化的管状载体能与如上所述的简单的管状载体相类似的方法采用，而通常，是简单地将载体浸入水中实现再水化。按照本发明的这种布置，能够快速地建立浓缩培养。在使用中，通道116-117因能排泄代谢气体，改善了微生物从下部到上部隔室转移的稳定性。
其它的微生物，只要用适当的替代介质，按照本发明所指出的使用支持浓缩和/或指示介质与复苏/生长介质保持接触的办法，也可以在培养中复苏和浓缩。例如弯曲杆菌属，可利用在图6和图8中表示的较新型的插入件柱塞7，其中含有“普雷斯顿”选择性介质组分(如果需要可以省去琼脂，或者由另一选用的凝固剂例如含有乳糖的黄原酸取代)以及柱塞9，其中含有一种适宜的已知指示介质，进行浓缩和检测。
对复苏/生长介质可作的一种有效的改进是加入少量的消泡剂，如在225毫升介质中加入0.2毫升的戊醇。
虽然不是必需，但在本发明的范围内，也可以分出一部分接种有样品如经过一段时间培育的复苏/生长介质，并仅用整个培养液的一部分与支持生长介质接触。这样，权利要求
1中的步骤(C)或可在分离出一部分培养液之后进行，然后使剩余物与支持介质接触，以便进行与之接触的进一步的培育和培养。步骤(D)可以修正以仅培育一部分的培养液，该培养液由样品和复苏/生长介质培育而得，从而使得活动细菌可以迁移入支持介质中。在该方法的改进型中，尽管不是必需，但可以用进一部的介质来稀释所分离出的那部分复苏/生长介质培养液。
目前，本发明人优选的用于沙门氏菌检测的支持介质，是如上所述的在一个管中的改进的RV介质(下部-直接与复苏/生长培养液接触)和LICNR介质(上部-与RV介质接触)的混合。如果需要，管子的下部可以被掩盖住以使管子上部的指示反应更加醒目。
在采用图11的改进柱塞的方法以再水化支持介质管的场合，就不需要再用上述在其他情况下有帮助的“防护涂覆”而成的防水涂层。再者，若在管状载体中的支持介质已被再水化，如用无菌水再水化，则有时剧烈搅拌它们将有帮助，如用“Whirlimxer”(商标)搅拌。
若把一组或多个类似管4的插入件及其所含的物料或其它选择性浓缩介质，插入一单个的接种有待测样品的复苏和生长介质的试样中，也属于本发明的范围。
按这种办法，几种可能的微生物能够同时例如在一个瓶中进行检测。
本发明容许专业人员在显而易见的地方作许多的改进和变化，现在所公开的内容，还包括本发明说明书、附图和权利要求
中描述的各个特征的组合及其二次组合。
权利要求
1.一种用于选择性地培养活动细菌的方法，包括如下步骤(a).制备一种怀疑含有活动细菌的物料之细菌学培育样品；(b).把上述物料放入含有适合于活动细菌复苏和生长的液体营养基的培养容器中；(c).提供至少一种载体，它部分浸入上述的液体营养基中，但凸出于上述液体营养基表面以上，上述载体内含有由适宜介质得来的支持营养基，所说的适宜介质适合于活动细菌的细菌学选择生长和指示，上述载体在上述液体营养基表面以下有一个开孔，以使在上述容器中的液体介质与由上述载体载有的支持介质保持接触，从而使得在培养期间上述的活动细菌可从上述的液体迁移入上述的支持介质中；(d).培育上述样品和上述的营养基，使得在上述液体介质中的上述试样里存在的任何活动细菌生长，在培养期间上述活动细菌迁移入上述的支持介质中，并在其中使上述活动细菌生长。
2.按照权利要求
1的方法，其特征是上述载体在上述营养基的表面以上还有一个开孔，上述支持营养基有一个转移表面以用于上述细菌在它们迁移入上述的支持介质、生长和移出之后试样的转移，上述的方法还包括把上述活动细菌在生长之后，从上述支持介质的转移表面，转移入和转移通过上述的支持介质。
3.按照权利要求
1的方法，其特征是采用一至少有二种支持介质串联的载体，第一种支持介质同上述的液体介质相接触，使第二种支持介质同第一种支持介质相接触，从而使得活动细菌在培养期间，可从液体介质连续地迁移通过上述的第一和第二支持介质。
4.按照权利要求
3的方法，其特征是采用一种载体，它含有与上述液体相接触的，适合于待培养细菌的选择性支持介质，并含有与上述选择性介质相串联接触的，适合于待培养细菌的指示介质。
5.按照权利要求
4的方法，其特征是采用选择从凝胶赖氨酸-铁介质和改进的凝胶Rappaport-Vassiliadis介质得来的选择性介质，选择从钻石绿脱氧胆介质和赖氨酸-铁-胱氨酸中性红介质得来的指示介质，以适用于选择性浓缩培养和指示沙门氏菌。
6.按照权利要求
1的方法，其特征是采用一种以上载体，每种载体都载有支持选择性和/或指示介质，它与上述的液体营养基相接触。
7.用于选择性地培养活动细菌的设备，包括(a).一含有液体营养基的培养容器，以用于活动细菌的复苏和生长;(b).一载体，它部分浸入上述的液体营养基中并凸出于上述液体营养基的表面以上，上述载体含有从适宜的介质得来的支持营养基，适宜的介质是指适合于细菌学地选择性生长和指示活动细菌的介质，上述载体在液体营养基的表面以下有一个开孔，以用于在上述容器中液体介质和在上述载体中的支持介质之间保持接触，从而使上述活动细菌在培养期间从上述液体迁移进入上述的支持介质。
8.按照权利要求
7的设备，其特征是上述载体包括由多孔支持物或打孔隔板隔开的二个隔室，上述的二个隔室含有第一种和第二种选择性和/或指示介质。
9.按照权利要求
8的设备，其特征是上述的隔板包括孔的尺寸大于10微米的多孔聚合物，以使活动细菌可从其中通过。
10.按照权利要求
7的设备，其特征是介质是一种凝胶介质。
11.按照权利要求
10的设备，其特征是上述介质呈无菌密封包装的干组分形式，它可经再水化形成适合于培养的介质状态。
12.按照权利要求
7的设备，其特征是上述的培养容器包括选自支座、固定件和浮台的装置，以便固定上述的载体，从而在使用中使载体部分地浸入上述的液体培养介质中。
13.按照权利要求
9和11的设备，其特征是上述的载体是管状，有一个活动的注射活塞，可在管内抽上含水液体用以上述干组分的再水化，在管上有一个通道，用以在培养期间释放出上述第一隔室(底部)的气体。
14.一种细菌学的载体，包含有至少一种适合于活动细菌选择性浓缩培养的营养物料，上述的载体包括一个管，有一个第一开孔和与第一开孔隔开的第二开孔，所含的物料在与上述的第一开孔相邻处形成一支持介质，上述的介质选自适合于活动细菌细菌学的选择性生长和指示的介质，上述的管和支持介质以这样设置，使得上述的载体能够部分地浸入液体营养基中，并且凸出在上述液体营养基的表面以上，液体营养基同载体内的支持介质保持接触，从而使得活动细菌在上述细菌的培养期间，可从上述的液体迁移进入上述的支持介质中。
15.按照权利要求
14的一种细菌学载体，其特征是上述的支持介质是与多孔的或打孔隔板保持接触的支持介质，所述的隔板邻近上述的第一开孔。
16.按照权利要求
15的一种细菌学载体，它包含至少二种支持介质物料，每一种选自适合于活动细菌细菌学地选择性生长和指示的介质，第一种上述介质是与上述的第一开孔相邻的多孔的或者打孔隔板保持接触的支持介质，第二种上述介质是一种与位于第一种介质和第二开孔之间的第二多孔或打孔隔板保持接触的支持介质。
17.用于活动微生物选择性浓缩培养和检测的方法和设备，其特征是由说明书，附图和权利要求
的几个特征中的一个或多个特征。
专利摘要
用于选择性地培养活动细菌，例如沙门氏菌、凯普勒菌属的方法，步骤如下
文档编号C12M1/28GK87106707SQ87106707
公开日1988年5月11日 申请日期1987年8月28日
发明者罗伊·霍尔布鲁克 申请人:尤尼利弗公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan