专利名称：海藻酸钠硫酸酯及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新化合物—海藻酸钠硫酸酯及其制备方法和用途，它属于再生资源化学生物学领域，也属于有机化学领域。
背景技术：
肝素是一种抗凝血药物，已使用50多年(Crafoord，C.；Jorpes E.1941，JAMA 1162831)。它是一种线性多糖，主链主要是由α-D-氨基葡萄糖和α-L-艾杜糖醛酸组成的二糖重复单元构成，包含一些硫酸酯基和羧基(Paulo，A.S.M.；Mariana，S.P.，1999，TCM，9(8)，227～232)。但由于来源不足，价格非常昂贵。海藻酸钠是从褐藻里面提出的一种多糖，来源广，价格便宜，广泛用于药物缓释体系中微球，微囊及片剂等制备，具有长效缓释作用，并能减小某些药物的副作用(Kaneko，K.；Kanada，K.；Miyagi，M.；et al.，1998，Chem.Pharm.Bull Tokyo 46(2)，728)。海藻酸钠是唯一在每个糖单元中都包含羧基的天然多糖，由1，4-β-D-甘露糖醛和α-L-古洛糖醛酸组成的二糖重复单元构成(Ikeda，A.；Takemura，A.；Ono，H.，2000，Carbohydr.Polym.42，421)。经过硫酸酯化后，同肝素一样分子中既含有硫酸酯基，又含有羧基，具有与肝素非常相似的结构。因而具备抗凝血活性，有望取代肝素。
发明内容
本发明的目的是提供一种具备抗凝血活性的新化合物—海藻酸钠硫酸酯及其制备方法和用途。
为实现上述目的，本发明所采取的技术措施如下海藻酸钠硫酸酯，其结构式为 其中R1，R2，R3，R4为SO3Na或H，每糖醛酸单元SO3Na取代度为0.41～1.71；m，n，g，h为整数，15＜m+n+g+h＜40。
本发明还提供了上述海藻酸钠硫酸酯的制备方法将海藻酸钠加入硫酸酯化试剂中，在40～70℃搅拌反应，得到棕红色溶液，经过透析，浓缩即得海藻酸钠硫酸酯；所述的硫酸酯化试剂由体积比为75～85％的溶剂、5～30％的络合剂和10～30％的ClSO3H组成，溶剂为甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，络合剂为甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、吡啶等含烷基的有机胺类化合物。其中ClSO3H的用量最好为20～25％(体积比)。
硫酸酯化试剂按下法制备，在0～5℃，缓慢滴加ClSO3H于无水溶剂和络合剂的混合液中，得乳白色粘稠液体，即为硫酸酯化试剂。
将得到的海藻酸钠硫酸酯进行体外凝血实验，表现出很高的抗凝血活性。可作为抗凝血剂在制备抗凝血药物中应用。
本发明进行的体外凝血实验包括活化部分凝血活酶时间(APTT)测试，凝血酶时间(TT)测试，凝血酶原时间(PT)测试。测试时以贫血小板人血浆为底物，加入测试试剂和不同浓度的海藻酸钠硫酸酯，得到其对APTT，TT，PT的延长效果，即可知道其抗凝血活性的高低。
本发明有以下技术特点和优点1.为国内外首次提出海藻酸钠经硫酸酯制备硫酸酯化海藻酸钠的方法。
2.利用海藻酸钠硫酸酯作为抗凝血剂，进行体外凝血实验，表现出很高的抗凝血活性。
在相同浓度下其APTT值达到肝素的水平。据报导肝素在10μg/mL时，APTT为226s(Hirano，S.，Tanaka，Y.，Hasegawa，M.，et al.，1985，Carbohydr.Res.，137，205)。当海藻酸钠硫酸酯的浓度从33μg/mL上升到67μg/mL，APTT为455s上升到～24min。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明技术作进一步详述。
实施例110g海藻酸钠加入含有80ml甲酰胺和20mlClSO3H的硫酸酯化试剂中，60℃搅拌4小时，得到棕红色溶液，加入适量去离子水，透析3d，溶溶缩至干即得硫酸酯化海藻酸钠15g。样品S％为13.21％，C％，H％分别为21.05％和1.93％。计算硫酸酯基团取代度为1.41/糖醛酸单元(假设硫酸酯基和羧基均形成钠盐)。红外检测出现1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基团振动峰。渗透凝胶色谱测试其保留时间为7.51分钟，测试条件为凝胶柱TSKG3000-PW，流动相0.1mol/L NaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，折射率检出样品。样品浓度0.4％，通过TOSOH公司提供的Pullulan标样进行校正，所有数据均通过江申色谱工作站进行处理。
所用硫酸酯化试剂按下法制备(下同)，在0～5℃，缓慢滴加ClSO3H于无水溶剂和络合剂的混合液中，得乳白色粘稠液体，即为硫酸酯化试剂。
实施例210g海藻酸钠加入含有80ml甲酰胺和4mlClSO3H的硫酸酯化试剂中，40℃搅拌4小时，得到棕红色溶液，加入适量去离子水，透析3d，溶溶缩至干即得硫酸酯化海藻酸钠12g。样品S％为5.69％，C％，H％分别为30.78％和3.03％。计算硫酸酯基团取代度为0.41/糖醛酸单元(假设硫酸酯基和羧基均形成钠盐)。红外检测出现1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基团振动峰。渗透凝胶色谱测试其保留时间为7.21分钟，测试条件为凝胶柱TSKG3000-PW，流动相0.1mol/L NaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，折射率检出样品。样品浓度0.4％，通过TOSOH公司提供的Pullulan标样进行校正，所有数据均通过江申色谱工作站进行处理。
实施例310g海藻酸钠加入含有80ml甲酰胺和30mlClSO3H的硫酸酯化试剂中，60℃搅拌4小时，得到棕红色溶液，加入适量去离子水，透析3d，溶溶缩至干即得硫酸酯化海藻酸钠15g。样品S％为14.28％，C％，H％分别为19.75％和1.90％。计算硫酸酯基团取代度为1.63/糖醛酸单元(假设硫酸酯基和羧基均形成钠盐)。红外检测出现1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基团振动峰。渗透凝胶色谱测试其保留时间为7.71分钟，测试条件为凝胶柱TSKG3000-PW，流动相0.1mol/LNaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，折射率检出样品。样品浓度0.4％，通过TOSOH公司提供的Pullulan标样进行校正，所有数据均通过江申色谱工作站进行处理。
实施例410g海藻酸钠加入含有70ml N，N-二甲基甲酰胺，和20mlClSO3H的硫酸酯化试剂中，70℃搅拌4小时，得到棕红色溶液，加入适量去离子水，透析3d，溶溶缩至干即得硫酸酯化海藻酸钠13.89g。样品S％为14.86％，C％，H％分别为19.20％和1.90％。计算硫酸酯基团取代度为1.71/糖醛酸单元(假设硫酸酯基和羧基均形成钠盐)。红外检测出现1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基团振动峰。渗透凝胶色谱测试其保留时间为7.78分钟，测试条件为凝胶柱TSKG3000-PW，流动相0.1mol/L NaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，折射率检出样品。样品浓度0.4％，通过TOSOH公司提供的Pullulan标样进行校正，所有数据均通过江申色谱工作站进行处理。
实施例510g海藻酸钠加入含有90ml二甲基亚砜，8ml吡啶和10mlClSO3H的硫酸酯化试剂中，70℃搅拌4小时，得到红色溶液，加入适量去离子水，透析3d，溶溶缩至干即得硫酸酯化海藻酸钠12.99g。样品S％为8.57％，C％，H％分别为26.43％和2.57％。计算硫酸酯基团取代度为0.73/糖醛酸单元(假设硫酸酯基和羧基均形成钠盐)。红外检测出现1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基团振动峰。渗透凝胶色谱测试其保留时间为7.78分钟，测试条件为凝胶柱TSKG3000-PW，流动相0.1mol/L NaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，折射率检出样品。样品浓度0.4％，通过TOSOH公司提供的Pullulan标样进行校正，所有数据均通过江申色谱工作站进行处理。
采用实施例1提供的海藻酸钠硫酸酯样品进行体外凝血试验。测试活化部分凝血活酶时间APTT、凝血酶原时间PT、凝血酶时间TT，测试前血浆中加入不同浓度的样品。空白对照为不加样品组的APTT、TT、和PT分别为58s、1388s和16.13s。所有的数据均为四次测试的平均值，误差＜0.5s。海藻酸钠硫酸酯表现出明显的抗凝血活性特别是APTT活性，当浓度从16.7μg/mL上升到33μg/mL和67μg/mL，APTT为266s，455s和～24min，而相同浓度下TT、和PT分别为30s和19s。其APTT活性同文献报道的肝素水平相当。据报导肝素在10μg/mL时，APTT为226s(Hirano，S.，Tanaka，Y.，Hasegawa，M.，et al.， ，Carbohydr.Res.，137，205-215；)。
权利要求
1.海藻酸钠硫酸酯，其结构式为 其中R1，R2，R3，R4为SO3Na或H，每糖醛酸单元SO3Na取代度为0.41～1.71；m，n，g，h为整数，15＜m+n+g+h＜40。
2.权利要求1所述海藻酸钠硫酸酯的制备方法，其特征是将海藻酸钠加入硫酸酯化试剂中，在40～70℃搅拌反应，得到棕红色溶液，经过透析，浓缩即得海藻酸钠硫酸酯；所述的硫酸酯化试剂由体积比为60～85％的溶剂、5～30％络合剂的和10～30％的ClSO3H组成，溶剂为甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，络合剂为含烷基的有机胺类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是络合剂为甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺或吡啶。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是硫酸酯化试剂中ClSO3H的用量为体积比20～25％。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是硫酸酯化试剂按下法制备，在0～5℃，缓慢滴加ClSO3H于无水溶剂和络合剂的混合液中，得乳白色粘稠液体，即为硫酸酯化试剂。
6.权利要求1所述海藻酸钠硫酸酯作为抗凝血剂在制备抗凝血药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新化合物海藻酸钠硫酸酯，其结构式为上式，其中R
文档编号C08B37/00GK1542021SQ200310111330
公开日2004年11月3日 申请日期2003年11月4日 优先权日2003年11月4日
发明者杜予民, 黄荣华, 杨建红 申请人:武汉大学