专利名称：一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法
技术领域：
本发明涉及一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，涉及从透明质酸发酵液中制备高分子量、低蛋白质含量的透明质酸钠。
背景技术：
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一种大分子粘多糖，广泛存在于生物体的结缔组织中。在不同组织中HA的生理作用有所不同，如在皮肤中主要表现为保水作用；在关节滑液中主要为润滑作用；在血管壁中主要是调节通透性。另外，HA作为聚阴离子电解质，分子上所带的大量负电荷，可调节周围正负离子的浓度，抑制多种酶的活性，广泛应用于眼科粘性手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是在预防和减少外科手术后组织粘连中取得了较大的进展。
采用微生物发酵法生产透明质酸，大大拓宽了HA的来源，推动了HA的研究和应用。微生物发酵生产HA不仅降低了HA的生产成本，而且具有较高的质量和良好的品质。而从发酵液中提取HA的工艺过程会直接影响着HA的产量、质量和生产成本。
有机溶剂去除菌体法是国内外研究得比较深入的方法，尽管该法所得到的HA被解聚的程度很小。但此法存在的缺点有1)即使经多次反复提取，仍有一定量的菌体存在成品HA中，因而难以提高提取率；2)使用大量的有机溶剂，尽管溶剂可回收利用，但仍造成巨大的原料消耗，增加了提取成本；3)大量有毒、易爆、挥发性溶剂的使用，对环境造成了严重的污染，给操作带来了不便。
提取HA不但要求高的提取率和其分子不发生解聚，而且要求高的产品纯度。透明质酸发酵液中存在的蛋白质是影响HA产品纯度的主要杂质之一。提取液中存在的蛋白质可用普通的蛋白质沉淀剂如硫酸铝等使之沉淀，也可适当调pH和添加三氯乙酸等使之变性沉淀。但这些操作繁琐，不宜应用于工业化生产中。如能采用操作简便、价廉的物质去除蛋白质，既能提高产品质量又能降低生产成本，可广泛地应用于工业化生产。
在经乙醇沉淀的HA中还存在着部分的两价金属离子如Ca2+、Ba2+、Zn2+和有色物质，直接影响着HA的应用和感官品质。尽管用乙醇分级分离能有效地除去金属离子，但该法操作烦琐且成本较高，难以适应工业化生产；有色物质是常见于HA中的另一类杂质，常用的去除方法有氧化法和还原法，但这两种方法会引起HA未端醛基氧化、损害HA的活性、脱硫酸基和降解反应。
以往的HA提取方法普遍存在着成本高、提取率不高、质量低劣和品质不稳定、环境污染严重等缺点，难以适应工业化生产和实际应用的需要。从发酵液中提取HA的过程分为初提和精制两个阶段，初提为除去发酵液中的菌体并回收得到初级的HA，再经除蛋白质、核酸及重金属等步骤精制初提所得的HA。考虑到国内外市场对高品质HA需求的不断增长，因此，如何在工业规模上实现高品质HA的提取，具有重要的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用透明质酸发酵液制备高品质、高得率的透明质酸的方法，制备的透明质酸以透明质酸钠的形式作为产品。该法操作简便、高效、费用低廉、成品纯度高、环境污染小、易于工业化。
本发明的技术方案本发明采用发酵液加热、过滤去除菌体，添加蛋白酶去除蛋白质，使用超滤技术去除金属离子和小分子的有色物质，从发酵液中制备透明质酸钠，具体操作工序为将透明质酸发酵液经加热去除菌体、酶解、乙醇沉淀、络合、解离、乙醇沉淀、超滤、乙醇沉淀、洗涤脱水干燥、成品包装而制得分子量为1.8×106、蛋白质含量低于0.30％、提取收率98％的透明质酸钠。
具体操作步骤如下1、菌体的去除将发酵液用蒸馏水稀释一倍，采用高温蒸汽将发酵液迅速加热至75～80℃后离心或板框压滤，弃去菌体。
2、酶解将上清液的pH调至8.0，然后按照滤液的体积，以质量体积比0.05％称取碱性蛋白酶，在37℃下酶解3小时。
3、乙醇沉淀将经酶解后的发酵清液pH调至7.0～7.2，加入与酶解液体积相等的95％乙醇，充分搅拌，静置沉淀HA。
4、沉淀的溶解将已经沉淀的HA用与初始发酵液等体积的蒸馏水搅拌溶解。
5、络合沉淀在上述充分溶解的HA水溶液中边搅拌边缓缓地加入发酵液体积0.1倍的5％的氯化十六烷基吡啶(CPC)水溶液(体积比为10∶1＝发酵液∶CPC)，从而使水溶液中的HA发生络合沉淀，静置使络合沉淀下沉，弃去上清液。
6、解离将络合沉淀置于与初始发酵液等体积的0.7～0.8mol/L的NaCl水溶液中充分搅拌解离过夜。
7、乙醇沉淀将充分解离的溶液过滤，滤去没有彻底解离的块状物，解离液再以2倍初始发酵液体积的95％乙醇沉淀，取出沉淀物HA洗涤。
8、超滤将沉淀物HA用与初始发酵液等体积的蒸馏水溶解，按照下列条件0.2MPa、截留分子量为5000的聚醚砜(PES)超滤膜进行超滤，去除金属离子和小分子的有色物质。
9、乙醇沉淀将超滤后的滤液加入1％的乙酸钠，再以2倍初始发酵液体积的95％乙醇沉淀，取出沉淀物HA-Na。
10、洗涤脱水干燥将HA-Na沉淀物用无水乙醇洗涤二次，再用丙酮洗涤一次后真空干燥，即得HA-Na成品。
本发明的有益效果本发明采用的加热去除菌体、添加蛋白酶去除蛋白质、使用超滤技术去除金属离子和小分子的有色物质，从发酵液中制备医药级透明质酸钠的操作工序，不仅可以在实验室中方便实施，而且极易在工业生产中运用。采用加热除去发酵液中菌体的工艺可减少透明质酸分子的解聚，提高HA的提取收率，同时赋予透明质酸良好的感官品质。碱性蛋白酶为大分子溶液，在提取工序中通过添加碱性蛋白酶，进行广泛的蛋白质水解，能很好的去除蛋白质，生产成本较低，适合工业化生产。使用适用于工业化规模的超滤技术可有效去除小分子的金属离子和有色物质，尤其是超滤技术适合大规模的工业化生产。
具体实施例方式
实施例1发酵得到的透明质酸发酵液，成分分析结果菌体4.0g/L；HA 4.83g/L；蛋白质3.35％；氨基葡萄糖38.64％；葡萄糖醛酸41.39％。将上述1L发酵液用1L蒸馏水稀释后迅速加热至75℃～80℃，将加热后的稀释液离心去除菌体，取上清液调节pH为8.0。然后加入1g的碱性蛋白酶，在37℃恒温下酶解反应3h，调pH7.0～7.2，加入2L 95％的乙醇沉淀HA，离心除去上清液，加入1L的蒸馏水溶解HA。待沉淀全部溶解后加入0.1L的5％氯化十六烷基吡啶溶液(CPC)来络合HA，静置沉淀后离心去上清液，将沉淀物放到1L0.7～0.8mol/L的氯化钠水溶液中解离24h。解离结束后加2L95％乙醇沉淀，离心，弃去上清液，所得沉淀即为HA。将所得的沉淀物HA用1L蒸馏水溶解，按照下列条件0.2MPa、截留分子量为5000的聚醚砜(PES)超滤膜进行超滤，去除金属离子和小分子的有色物质。将超滤后的滤液加入10g乙酸钠，再以2L的95％乙醇沉淀，取出沉淀物HA-Na。然后用无水乙醇洗涤两次，再用丙酮洗涤一次后烘干即为精制HA-Na。此时透明质酸钠分子量为1.8×106、蛋白质含量为0.30％、提取收率98％，特性粘度为43.7dl/g，透明质酸钠呈银白色絮状物质，具有良好的感官品质。
对比实施例2改用三氯乙酸去除菌体，其他操作如去除蛋白质，去除金属离子与有色物质同实施例1。结果透明质酸钠分子量为1.23×106、蛋白质含量为0.45％、提取收率90％，特性粘度为34.1dl/g。
对比实施例3改用硫酸铝沉淀蛋白质或适当调pH和添加三氯乙酸等使蛋白质变性沉淀，其他操作如去除菌体，去除金属离子与有色物质同实施例1。结果透明质酸钠分子量为1.65×106、蛋白质含量为0.76％、提取收率92％，特性粘度为40.5dl/g。
对比实施例4采用乙醇分级分离和氧化法去除小分子金属离子和有色物质，其他操作如去除菌体，去除蛋白质同实施例1。结果透明质酸钠分子量为1.67×106、蛋白质含量为0.35％、提取收率91％，特性粘度为27.3dl/g。
权利要求
1一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，其特征是采用发酵液加热、过滤去除菌体，添加蛋白酶去除蛋白质，使用超滤技术去除金属离子和小分子的有色物质的方法，具体工艺为加热除菌体、酶解、乙醇沉淀、络合、解离、乙醇沉淀、超滤、乙醇沉淀、洗涤脱水干燥、成品包装而制得成品透明质酸钠，加热除菌体将发酵液用蒸馏水稀释一倍后将发酵液温度升到75℃～80℃经过滤去除菌体；酶解将上清液的pH调至8.0，然后按照滤液的体积，以质量体积比0.05％称取碱性蛋白酶，在37℃下酶解3小时；乙醇沉淀将经酶解后的发酵清液pH调至7.0～7.2，加入与酶解液体积相等的95％乙醇，充分搅拌，静置沉淀HA；沉淀的溶解将已经沉淀的HA用与初始发酵液等体积的蒸馏水搅拌溶解；络合沉淀在上述充分溶解的HA水溶液中边搅拌边缓缓地加入发酵液体积0.1倍的5％的氯化十六烷基吡啶水溶液，从而使水溶液中的HA发生络合沉淀，静置使络合沉淀下沉，弃去上清液；解离将络合沉淀置于与初始发酵液等体积的0.7～0.8mol/L的NaCl水溶液中充分搅拌解离过夜；乙醇沉淀将充分解离的溶液过滤，解离液再以2倍初始发酵液体积的95％乙醇沉淀，取出沉淀物HA洗涤；超滤将沉淀物HA用与初始发酵液等体积的蒸馏水溶解，按照下列条件0.2MPa、截留分子量为5000的聚醚砜超滤膜进行超滤，去除金属离子和小分子的有色物质；乙醇沉淀将超滤后的滤液加入1％的乙酸钠，再以2倍初始发酵液体积的95％乙醇沉淀，取出沉淀物HA-Na；洗涤脱水干燥将HA-Na沉淀物用无水乙醇洗涤二次，再用丙酮洗涤一次后真空干燥，即得HA-Na成品；成品包装将得到的感官品质良好的HA-Na成品进行包装。
2.根据权利要求1所述的一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，其特征是发酵液稀释一倍后采用高温蒸汽将发酵液温度升到80℃经过滤去除菌体。
3.根据权利要求1所述的一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，其特征是在除菌体后的滤液中加入0.05％的碱性蛋白酶于37℃下酶解3小时，使蛋白质水解。
4.根据权利要求1所述的一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，其特征是采用超滤去除成品中杂质金属离子和小分子的有色物质。
5.根据权利要求1所述的一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，其特征是溶剂沉淀所用溶剂为95％乙醇。
全文摘要
一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，涉及从透明质酸发酵液中制备高分子量、低蛋白质含量的透明质酸钠。本发明采用加热去除菌体、添加蛋白酶去除蛋白质、使用超滤技术去除金属离子小分子和有色物质的从发酵液中制备透明质酸钠。具体工艺为透明质酸发酵液经除菌体、酶解、乙醇沉淀、络合、解离、乙醇沉淀、超滤、乙醇沉淀、洗涤脱水干燥、成品包装而制得分子量为1.8×10
文档编号C08B37/08GK1597704SQ200410041680
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月10日 优先权日2004年8月10日
发明者陈坚, 堵国成, 王淼 申请人:江南大学