专利名称：用于基因治疗的树枝状聚赖氨酸衍生物载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种由氨基酸出发构建的用于基因治疗且生物可降解的树枝状聚合物方法，属于非病毒基因治疗载体的制备技术。
背景技术：
自上世纪九十年代发展起来的基因治疗技术从根本上改变了传统的药物治疗的观念，并为根治众多的单基因疾病、肿瘤和遗传病带来了希望。高效、安全的基因治疗载体是基因治疗方案中首要的环节。在过去相当长的一段时间内，以逆转录病毒、腺病毒为代表的病毒类载体一直在基因治疗中起着举足轻重的作用。1999年，美国发生了基因治疗过程中志愿者死亡的重大事件，当时使用的载体即为腺病毒载体；此后法国也发生了类似的情况。这一系列的事件的发生使人们对于病毒类载体的安全性产生了置疑，同时病毒类载体所表现出的容量小、制备难、费用高等缺陷也限制了其发展。在这种情况下，非病毒基因治疗载体的研究开始受到愈来愈多地重视。
非病毒类载体是一种药物的控制释放技术，利用合成或天然的化合物将视为药物的治疗基因导入靶细胞或组织并进行表达。常用的载体包括脂质体、聚合物、裸DNA等。作为研究中常用的一类非病毒基因运载手段，聚合物载体多以线性阳离子聚合物为主并通过其表面氨基所带的正电荷与DNA负电荷间的静电引力使DNA分子缩合成高稳定性、小粒径的复合物(polyplex)。这种由静电作用而引发的缩合一直被视为质粒跨膜运输的主要手段。线性聚合物载体虽多见于实验室研究中，其在临床上的应用仍鲜有报道。造成这种情况的主要原因之一在于其存在着一定的分子量分布，从而造成了代谢途径和毒性的差异及药理上的不确定性，从而限制了其在临床上的应用。而树枝状聚合物以其规则的支化单元、独有的合成方式避免了上述的问题，从而展现出巨大的医学应用潜力。Denkewalter等人率先从Nα，Nε-双叔丁氧羰基赖氨酸出发采用液相合成技术获得了树枝状聚赖氨酸(US4,410,688，)。不久，Dow化学公司也公开了树枝状聚氨基酰胺合成的专利(PCT/US83/02052)。Haensel等人首次尝试将其应用于细胞转染过程(Bioconjugate Chem，4372，1993)。此后，Szoka等人则公布了树枝状聚氨基酰胺末端修饰聚乙二醇、多糖、短肽促进核酸运输的方法(WO 95/02397)。近来，美国专利US2003/0096280公开了抗生物素蛋白与树枝状聚氨基酰胺偶联的方法。而有马英俊和本原史博则公布了环糊精与树枝状聚氨基酰胺偶联的制备工艺。Baidude亦报道了采用液相合成技术在树枝状聚赖氨酸表面偶联多糖的方法(Macromolecules，367100，2003)。通过上述的技术手段可以有效地提高聚合物/核酸复合物与靶细胞及其亚细胞器的亲和性，从而实现高通量的核酸转运。从根本上讲，高效率的核酸转运往往是在较小的核酸颗粒粒径下实现的。而病毒基因组的高效组装表明，上述过程是一个多种作用力驱动的结果(Annu Rev Biochem，671，1998)，而非单一的静电作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成由高度支化的多肽链构成的树枝状多聚赖氨酸衍生物的方法，以上述方法制备的、通过表层分枝单元的化学修饰制备的聚合物载体分子的单一性更高，且具有较好的生物相容性，其可作为在基因治疗过程中运载核酸物质的载体，也可作为抗原、诊断造影剂的载体加以应用。
本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种用于基因治疗的树枝状聚赖氨酸衍生物载体的制备方法，其特征在于包括以下过程，(1)用体积比为25～80％哌啶/二氯甲烷溶液与修饰密度为0.02～4.0mmol/g的芴甲氧羰基氨基酸的4-羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂在4～40℃下反应5～120分钟脱去芴甲氧羰基(Fmoc)保护基团，然后用二氯甲烷和乙醇洗涤至中性；(2)将脱保护的修饰氨基酸的4-羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂加入到按每克树脂加入下述物质量0.1～12mmol Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸、0.4～20ml二甲基甲酰胺(DMF)和10～530mg N-羟基苯并三唑(HOBt)混合溶液中，然后再加入0.1～5ml 1，3-二异丙基碳二亚胺(DIC)，在4-40℃反应2-96小时后用二氯甲烷、乙醇洗涤得到含一代聚赖氨酸的树脂；然后将含一代聚赖氨酸的树脂加入到重新配制的上述反应液中合成含有二代聚赖氨酸的树脂，其中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.2～25mmol；反应得到的含有二代聚赖氨酸的树脂经二氯甲烷、乙醇洗涤后加入到新配制的反应液中合成含有三代聚赖氨酸的树脂，其中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.3～50mmol；(3)用体积比为25～80％哌啶/二氯甲烷溶液与芴甲氧羰基团保护的三代聚赖氨酸树脂在4～40℃下反应5～120分钟脱去芴甲氧羰基保护基团，然后用二氯甲烷和乙醇洗涤至中性；将脱保护的树脂加入到按每克树脂加入下述物质量0.4～40mmol含羧基的化合物、1～20mlDMF和50～530mg HOBt混合溶液中，然后再加入0.3～6ml DIC，在4～40℃下反应2-120小时；
(4)体积比为0.5-5的三氟乙酸/二氯甲烷溶液与脱保护后的树脂在4～40℃下反应10-180min；(5)最后用二氯甲烷溶液冲洗树脂若干次，归并滤液，旋转蒸发至体积不再变化后加入大量无水乙醚并离心收集，所得到沉淀即为产物。
上述的合成过程中树脂上芴甲氧羰基氨基酸修饰密度为0.1～2.0mmol/g，Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸加入量为每克树脂0.4～10mmol，DMF的体积为每克树脂1.0～12ml，HOBt的用量为每克树脂50～300mg，DIC的加入量为每克树脂0.2～6ml；合成二、三代聚赖氨酸树脂过程中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.6～20mmol；脱保护试剂中哌啶和二氯甲烷体积比为30～70％，脱保护过程在15～30℃下进行20～80min；表面分枝单元层修饰中含羧基化合物加入量为每克树脂1～30mmol，DMF的体积为每克树脂2～14ml，HOBt的用量为每克树脂80～400mg，DIC的加入量为每克树脂0.5～5ml；产物切割过程中，三氟乙酸与二氯甲烷体积比为0.8～3，反应在15～30℃下持续30-120min。
通过上述方法得到聚合物载体生物降解性好、毒性小，具有非常广阔的实际应用前景。
下面对本发明进行详细说明。
本发明的关键技术有六点一是固相合成方法的选择。树枝状聚赖氨酸的合成均采用液相合成及其派生的合成方法，如以聚乙二醇为载体的液相合成方法。这些方法的显著特点是合成过程中由于无需载体(如液相合成)或者载体的空间位阻小(如线性聚乙二醇的使用)，因此合成速度较快；另一方面，这也造成了后续分离过程复杂以及产物的收率低。而本发明所采用的固相合成方法虽然在合成速度上略逊于液相合成，但其后续的处理步骤非常简单、迅速，从而部分弥补了合成速度的不足。二是合成原料树脂的确定。合成用树脂可以自主合成，也可采用市场化产品，如上海吉尔生化公司的100～200目、芴甲氧羰基氨基酸修饰密度为0.5mmol/g的Wang树脂或Sigma公司的芴甲氧羰基氨基酸修饰密度为0.8mmol/g的Wang树脂，所涉及的氨基酸可以是任意一种氨基酸。三是Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸的制备。高纯度的Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸是获得分子量单一产物的关键因素。目前市售的Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸纯度一般在80～90％之间。本发明采用自制的Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸进行合成，其制备过程如下溶于二氧六环水溶液中的赖氨酸在冰浴下用氢氧化钠调pH至10.0后，逐滴加入溶于二氧六环的芴甲氧羰基琥珀酰亚胺进行反应并控制溶液pH在10.0；随后调pH至8.0～8.5，反应过夜；反应粗产物经乙醚萃取后，在加入乙醚并于冰浴下调节pH至3，振荡萃取后收集醚层并于50℃下蒸出乙醚，得到的白色油状液体经乙酸乙酯和石油醚重结晶，冷冻干燥，可得产物。四是表面修饰试剂的选择。用于表层分枝单元修饰的试剂可以是有机酸，也可是芴甲氧羰基氨基酸等。五是氨基酸保护基团的选择。本发明合成过程中氨基酸的保护基团为Fmoc，其去保护步骤简单易行且不会使结合于树脂上的产物脱落。六是产物收集方法的确定。本发明采用酸性条件三氟乙酸切割产物，切割效率比较高。切割产物浓缩后直接经无水乙醚沉淀即得到产品。
具体实施例方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
实施例1取100～200目、芴甲氧羰基甘氨酸修饰密度为0.5mmol/g的Wang树脂0.5g，在二氯甲烷中溶胀后，加入50％哌啶/二氯甲烷溶液反应40min；用乙醇2次，二氯甲烷4次洗涤树脂至中性。脱保护后的树脂加入1mmol的Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸、1ml DMF和34mg HOBt混合溶液中，再加入0.15ml DIC和1.85ml二氯甲烷，反应24小时；反应结束后的树脂经抽干和二氯甲烷洗涤，获得含有一代产物的树脂(Fmoc)2-Lys-Gly-Wang resin；重复上述合成过程可获得含有二代聚赖氨酸产物的树脂，合成过程中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸的加入量为2mmol的、DMF和HOBt的加入量分别为2ml和68mg，DIC和二氯甲烷的加入体积为0.3ml和3.7ml，反应48小时；同样含有三代聚赖氨酸产物的树脂的合成条件为Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸的加入量为4mmol、DMF和HOBt的加入量分别为4ml和136mg，DIC和二氯甲烷的加入体积为0.6ml和7.4ml，反应72小时。所得到的含有三代聚赖氨酸产物的树脂加入体积比为1的三氟乙酸/二氯甲烷溶液与脱保护后的树脂在15℃下反应60min，最后用二氯甲烷溶液冲洗树脂3次，归并滤液，旋转蒸发至体积不再变化后加入大量无水乙醚并离心收集，所得到沉淀即为产物(((Fmoc)2-Lys)2-Lys)2-Lys-Gly，收率为74.3％。用MALDI-TOF测定该产物的分子量[M+Na]+和[M+K]+分别为2776.7和2791.6；1H-NMR分析结果为1.0-1.7(γ-，δ-，β-H，Lys)，2.97(ε-H，Lys)，3.78(α-H，Gly)，3.9(α-H，Lys)，4.2-4.3及7.3-7.9(Fmoc-H)。
实施例2实施例1得到的含有三代聚赖氨酸产物的树脂加入50％哌啶/二氯甲烷溶液反应90min；用乙醇2次，二氯甲烷4次洗涤树脂至中性。脱保护后的树脂加入4mmol的芴甲氧羰基苯丙氨酸、4ml DMF和136mg HOBt混合溶液中，再加入0.6ml DIC和7.4ml二氯甲烷，反应72小时。反应结束后体系中的液相，然后加入50％哌啶/二氯甲烷溶液反应90min；用乙醇2次，二氯甲烷4次洗涤树脂至中性；脱保护后的树脂加入体积比为1的三氟乙酸/二氯甲烷溶液与脱保护后的树脂在15℃下反应60min，最后用二氯甲烷溶液冲洗树脂3次，归并滤液，旋转蒸发至体积不再变化后加入大量无水乙醚并离心收集，所得到沉淀即为产物(((Phe)2-Lys)2-Lys)2-Lys-Gly，单步收率为93％。用MALDI-TOF测定该产物的分子量[M+H]+和[M+Na]+分别为2150.4和2173.6；1H-NMR分析结果为1.0-1.7(γ-，δ-，β-，Lys)，2.97(ε-H，Lys)，3.21(β-H，Phe)，3.78(α-H，Gly)，3.9(α-H，Lys)，7.2-7.4(Benz-H，Phe)。
实施例3实施例1得到的含有三代聚赖氨酸产物的树脂加入50％哌啶/二氯甲烷溶液反应90min；用乙醇2次，二氯甲烷4次洗涤树脂至中性。脱保护后的树脂加入4mmol的乙酸、4ml DMF和136mg HOBt混合溶液中，再加入0.6ml DIC和7.4ml二氯甲烷，反应72小时。反应结束后弃去体系中的液相，然后加入体积比为1的三氟乙酸/二氯甲烷溶液与脱保护后的树脂在15℃下反应60min，最后用二氯甲烷溶液冲洗树脂3次，归并滤液，旋转蒸发至体积不再变化后加入大量无水乙醚并离心收集，所得到沉淀即为产物(((Ac)2-Lys)2-Lys)2-Lys-Gly，单步收率为97％。用MALDI-TOF测定该产物的分子量[M+H]+和[M+Na]+分别为1437.1和1460.6；1H-NMR分析结果为1.0-1.7(γ-，δ-，β-，Lys)，1.76-1.85(α-H，Ac)，2.97(ε-H，Lys)，3.78(α-H，Gly)，3.9(α-H，Lys)。
权利要求
1.一种用于基因治疗的树枝状聚赖氨酸衍生物载体的制备方法，其特征在于包括以下过程，(1)用体积比为25～80％哌啶/二氯甲烷溶液与修饰密度为0.02～4.0mmol/g的芴甲氧羰基氨基酸的4-羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂在4～40℃下反应5～120分钟脱去芴甲氧羰基保护基团，然后用二氯甲烷和乙醇洗涤至中性；(2)将脱保护的修饰氨基酸的4-羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂加入到按每克树脂加入下述物质量0.1～12mmol Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸、0.4～20ml二甲基甲酰胺和10～530mg N-羟基苯并三唑混合溶液中，然后再加入0.1～5ml 1，3-二异丙基碳二亚胺，在4-40℃反应2-96小时后用二氯甲烷、乙醇洗涤得到含一代聚赖氨酸的树脂；然后将含一代聚赖氨酸的树脂加入到重新配制的上述反应液中合成含有二代聚赖氨酸的树脂，其中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.2～25mmol；反应得到的含有二代聚赖氨酸的树脂经二氯甲烷、乙醇洗涤后加入到新配制的反应液中合成含有三代聚赖氨酸的树脂，其中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.3～50mmol；(3)用体积比为25～80％哌啶/二氯甲烷溶液与芴甲氧羰基团保护的三代聚赖氨酸树脂在4～40℃下反应5～120分钟脱去芴甲氧羰基保护基团，然后用二氯甲烷和乙醇洗涤至中性；将脱保护的树脂加入到按每克树脂加入下述物质量0.4～40mmol含羧基的化合物、1～20ml二甲基甲酰胺和50～530mg N-羟基苯并三唑混合溶液中，然后再加入0.3～6ml 1，3-二异丙基碳二亚胺，在4～40℃下反应2-120小时；(4)体积比为0.5-5的三氟乙酸/二氯甲烷溶液与脱保护后的树脂在4～40℃下反应10-180min；(5)最后用二氯甲烷溶液冲洗树脂若干次，归并滤液，旋转蒸发至体积不再变化后加入大量无水乙醚并离心收集，所得到沉淀即为产物。
2.按权利要求1所述的用于基因治疗的树枝状聚赖氨酸衍生物载体的制备方法，其特征在于合成过程中树脂上芴甲氧羰基氨基酸修饰密度为0.1～2.0mmol/g，二甲基甲酰胺的体积为每克树脂1.0～12ml，N-羟基苯并三唑的用量为每克树脂50～300mg，1，3-二异丙基碳二亚胺的加入量为每克树脂0.2～6ml；合成一代聚赖氨酸树脂过程中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸加入量为每克树脂0.4～10mmol，合成二代聚赖氨酸树脂过程中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.4～16mmol；合成三代聚赖氨酸树脂过程中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.6～40mmol；脱保护试剂中哌啶和二氯甲烷体积比为30～70％，脱保护过程在15～30℃下进行20～80min；表面分枝单元层修饰中含羧基化合物加入量为每克树脂1～30mmol，二甲基甲酰胺的体积为每克树脂2～14ml，N-羟基苯并三唑的用量为每克树脂80～400mg，1，3-二异丙基碳二亚胺的加入量为每克树脂0.5～5ml；产物切割过程中，三氟乙酸与二氯甲烷体积比为0.8～3，反应在15～30℃下持续30-120min。
全文摘要
本发明公开了一种合成树枝状多聚赖氨酸衍生物的制备方法，采用修饰芴甲氧羰基氨基酸的4－羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂为固相合成介质，与N
文档编号C08G69/10GK1683014SQ200510016268
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月7日 优先权日2005年3月7日
发明者史清洪, 郝挥红, 董晓燕, 白姝, 孙彦 申请人:天津大学