专利名称：白藜芦醇印迹聚合物的制备及用于白藜芦醇的提取方法
技术领域：
本发明属于新型化学分离材料的合成领域，及其在虎杖中分离白藜芦醇的应用。
背景技术：
白藜芦醇(Resveratrol)是一种天然活性物质，研究认为，白藜芦醇具有明显抗癌、抗高血脂、抗菌、抗炎、心血管保护和防治骨质疏松等多方面的活性。天然白藜芦醇存在反式和顺式两种构型，其中反式异构体的生物活性高于顺式异构体。
虎杖是我国传统中草药，为蓼科植物虎杖的根茎。由于含有反式白藜芦醇，可以作为白藜芦醇的主要来源。目前，已经有多种从虎杖中提取白藜芦醇的方法。
虎杖含有多种成分，包括白藜芦醇、白藜芦醇甙；蒽醌类(大黄素、大黄酚等)；酚类；黄酮类及甙等；另外还含有多糖、单糖、有机酸、微量元素以及鞣质。由于成分复杂，目前使用传统方法(例如液-液萃取、键合硅胶固相吸附方法)进行虎杖中白藜芦醇的提取，所需步骤仍比较繁琐，导致溶剂及时间成本的增加。
分子印迹技术是以目标分子为模板，制备具有分子识别能力的聚合物的一种技术，分子印迹聚合物在临床药物分析、对映体和异构体的分离、固相萃取、膜分离技术等方面都具有良好的应用前景。应用分子印迹聚合物进行中药有效成分的分离提取，具有高选择性、高效的特点，可以减少分离步骤，降低成本，是具有应用价值及发展前景的技术。
发明内容本发明的目的是解决使用传统方法进行虎杖中白藜芦醇的提取步骤比较繁琐，导致溶剂及时间成本增加的问题，提供一种白藜芦醇分子印迹聚合物(下面称为白藜芦醇印迹聚合物)的制备及用于白藜芦醇的提取方法。
本发明提供的白藜芦醇印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤1)、将反式白藜芦醇作为模板分子，与功能单体4-乙烯基吡啶、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈溶解于丙酮中；其中，模板分子与功能单体的摩尔比为1∶4到1∶6之间，功能单体与交联剂的摩尔比为1∶5到1∶6之间；引发剂与功能单体和交联剂总量的摩尔比约为1∶100；按功能单体和交联剂总量每克溶于约1mL丙酮中(在印迹聚合物制备中，模板分子、功能单体与交联剂应用较多的摩尔比为1∶4∶20)；溶液除氧后，密封，在60℃水浴中聚合24h；2)、将上步中得到的聚合物粉碎，过筛，以10％醋酸-甲醇溶液和甲醇洗提，除去聚合物中的模板分子和未反应的试剂，制得粒径约为36μm的白藜芦醇印迹聚合物颗粒。
在研究过程中，比较了以不同的功能单体α-甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)和4-乙烯基吡啶(4-VP)，及不同的溶剂乙酸乙酯、丙酮为条件得到的印迹聚合物，其中以4-乙烯基吡啶为单体、丙酮为溶剂得到的聚合物具有最佳的选择性。将印迹聚合物与非印迹聚合物(以除不加印迹分子外，其它合成条件同印迹聚合物合成得到的聚合物)比较证明，印迹聚合物具有类似于免疫亲和柱的识别位点，对于白藜芦醇有很好的选择性。
一种用上述方法制备的白藜芦醇印迹聚合物从虎杖中分离提取白藜芦醇的方法，该方法的具体步骤如下1)、将虎杖粉碎后，以甲醇提取；2)、提取液浓缩后，加入装有上述方法制得的白藜芦醇印迹聚合物颗粒的150mm×4.6mm分子印迹色谱柱中(也可以用于半制备色谱柱)，以体积比80/20的甲醇-水作为流动相进行分离；3)、在上步分离中，除白藜芦醇和大黄素外，其他组分首先被冲出色谱柱，其次是白藜芦醇，最后是大黄素，依次收集流出的组分，分别得到白藜芦醇(纯度为80％)和大黄素(纯度为90％)。
本发明的优点及效果本发明提供了一种新型分离材料的合成方法及高效的白藜芦醇分离方法。该方法以反式白藜芦醇(trans-resveratrol)为模板分子，利用分子印迹技术制备了白藜芦醇印迹聚合物。并以白藜芦醇印迹聚合物为色谱固定相，建立了虎杖中白藜芦醇的提取分离方法，该分离方法可以在一步完成对于虎杖提取液中白藜芦醇的分离提取，回收率达到80％以上，同时可以分离虎杖中的大黄素(emodin)，回收率达到98％。
本发明方法中的分子印迹分离固定相具有很好的选择性，能够分离反式和顺式白藜芦醇。
本发明提供的分子印迹聚合物同时也能够将其它结构类似物(包括虎杖中含有的虎杖甙等)与白藜芦醇分离。反式白藜芦醇和其他结构类似物在不同甲醇-水的流动相条件下均具有差别很大的保留因子(k)，因此都能够被分离。白藜芦醇印迹聚合物可以用于复杂体系(例如植物)中白藜芦醇的高效提取分离。
本发明应用于虎杖中白藜芦醇的提取，具有高效的分离、纯化结果。
图1是顺、反式白藜芦醇在印迹聚合物(以4-乙烯基吡啶为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，丙酮为溶剂制备)固定相上的色谱拆分图，其中，cis-表示顺式白藜芦醇，Trans-表示反式白藜芦醇；图2是流动相中水含量对白藜芦醇及其类似物在分子印迹柱上的保留(以保留因子k表示)的影响示意图，图中，■，表示反式白藜芦醇；，表示双酚A；●，表示白藜芦醇甙；△，表示顺式白藜芦醇；，表示儿茶酚；图3是以三种功能单体制备的印迹聚合物对于白藜芦醇的吸附曲线。图中，P1，P2，P3分别为以α-甲基丙烯酸、丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶为功能单体制备的白藜芦醇印迹聚合物，均以乙酸乙酯为溶剂；图4(a)、(b)、(c)是以三种功能单体制备的印迹聚合物对于顺式及反式白藜芦醇分离的色谱图。图中，P1，P2，P3分别为以α-甲基丙烯酸、丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶为功能单体制备的白藜芦醇印迹聚合物，均以乙酸乙酯为溶剂；图5是虎杖提取液的白藜芦醇和大黄素的分离色谱图；图6(a)、(b)是反相液相色谱法测定经印迹聚合物色谱柱分离后的白藜芦醇和大黄素的纯度的色谱图；图中，B为分离后的白藜芦醇组分(峰a为白藜芦醇)的色谱图，C为分离后的大黄素组分(峰b为大黄素)的色谱图。
具体实施方式
实施例1制备分子印迹聚合物将反式白藜芦醇(模板分子)、4-乙烯基吡啶(功能单体)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(交联剂)、偶氮二异丁腈(引发剂)溶解于丙酮中，称量0.45g(2.0mmol)反式白藜芦醇，溶解于约9mL丙酮中，依次加入4-乙烯基吡啶0.84g(8.0mmol)、乙二醇二甲基丙烯酸酯7.9g(40mmol)、偶氮二异丁腈0.094g(0.57mmol)，超声溶解15min，通氮气除氧10min，然后将混合液转入安培瓶中， 密封，60℃ 水浴中聚合24h。将聚合物粉碎，过筛，得到一定粒径的无定型颗粒。先后以10％醋酸-甲醇溶液和甲醇洗提，除去聚合物中的模板分子和未反应的试剂，将颗粒装入色谱柱(150mm×4.6mm)中，用于色谱分离。分子印迹分离固定相具有很好的选择性，能够分离反式和顺式白藜芦醇，见色谱图(图1，其中，cis-表示顺式白藜芦醇，Trans-表示反式白藜芦醇)。
研究证明，分子印迹聚合物也能够分离其它结构类似物(包括虎杖中含有的虎杖甙)。反式白藜芦醇和其他结构类似物在不同甲醇-水的流动相条件下均具有差别很大的保留因子(k)，即都能够被分离(见图2，图中，■，表示反式白藜芦醇；、表示双酚A；●、表示白藜芦醇甙；△、表示顺式白藜芦醇；、表示儿茶酚)。
实施例2以乙酸乙酯代替丙酮作为溶剂，其它条件同上，进行分子印迹聚合物的制备，得到用于白藜芦醇分离的印迹聚合物。
比较以不同的功能单体(α-甲基丙烯酸、丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶)得到的印迹聚合物，实验结果表明，以丙烯酰胺为单体得到的聚合物也有一定的选择性，但低于以4-乙烯基吡啶为单体得到的聚合物，三种聚合物的吸附性能的比较见图3(图中，P1，P2，P3分别为以α-甲基丙烯酸、丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶为功能单体制备的白藜芦醇印迹聚合物，均以乙酸乙酯为溶剂)。三种聚合物的对于顺式和反式白藜芦醇分离的色谱图见图4(图中，P1，P2，P3分别为以α-甲基丙烯酸、丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶为功能单体制备的白藜芦醇印迹聚合物，均以乙酸乙酯为溶剂)。
实施例3虎杖提取及色谱分离将虎杖粉碎后，过60目筛，加甲醇超声后，浸提24h。再经超声20min后过滤，得到提取液。提取液浓缩后，加入分子印迹色谱柱，以甲醇-水(体积比80/20)作为流动相进行分离。收集流出组分，蒸去溶剂，得到白藜芦醇(纯度为80％)和大黄素(纯度为90％)。虎杖提取液的分离色谱图见图5。在分离中，除了白藜芦醇和大黄素外，其他组分首先被冲出色谱柱，其次是白藜芦醇，最后是大黄素，具有高效的分离、纯化结果。
经测定证明，这种提取方法得到的白藜芦醇和大黄素的回收率分别约为82％和98％，五次分离(平行实验)得到的结果见下表。
表1以分子印迹聚合物进行虎杖中白藜芦醇和大黄素分离提取的回收率及组分纯度(5次平均值)
经白藜芦醇印迹聚合物提取分离后，以反相液相色谱方法测定得到的白藜芦醇和大黄素的纯度(色谱柱装有粒径为5μm的Inertsil ODS-2C18固定相，尺寸为150×4.6mm的不锈钢分析柱)，色谱图见图6(其中，图B为分离后的白藜芦醇组分(峰a为白藜芦醇)的色谱图，图C为分离后的大黄素组分(峰b为大黄素)的色谱图，计算得出的纯度见表1。
权利要求
1.一种白藜芦醇印迹聚合物的制备方法，其特征是该方法包括如下步骤1)、将反式白藜芦醇作为模板分子，与功能单体4-乙烯基吡啶、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈溶解于丙酮中；其中，模板分子与功能单体的摩尔比为1∶4到1∶6之间，功能单体与交联剂的摩尔比为1∶5到1∶6之间；引发剂与功能单体和交联剂总量的摩尔比为1∶100；按功能单体和交联剂总量每克溶于1mL丙酮中；溶液除氧后，密封，在60℃水浴中聚合24h；2)、将上步中得到的聚合物粉碎，过筛，洗提，除去聚合物中的模板分子和未反应的试剂，制得白藜芦醇印迹聚合物颗粒。
2.根据权利要求1所述的白藜芦醇印迹聚合物的制备方法，其特征是在印迹聚合物制备中，模板分子、功能单体与交联剂的较佳摩尔比为1∶4∶20。
3.一种用权利要求1制备的白藜芦醇印迹聚合物从虎杖中分离提取白藜芦醇的方法，其特征是该方法的具体步骤如下1)、将虎杖粉碎后，以甲醇提取；2)、提取液浓缩后，加入装有权利要求1中制得的白藜芦醇印迹聚合物颗粒的150mm×4.6mm分子印迹色谱柱或半制备色谱柱中，以体积比80/20的甲醇-水作为流动相进行分离；3)、在上步分离中，除白藜芦醇和大黄素外，其他组分首先被冲出色谱柱，其次是白藜芦醇，最后是大黄素，依次收集流出的组分，分别得到白藜芦醇和大黄素。
4.根据权利要求3所述的从虎杖中分离提取白藜芦醇的方法，其特征是得到的白藜芦醇的纯度为80％，大黄素的纯度为90％。
全文摘要
白藜芦醇印迹聚合物的制备及用于白藜芦醇的提取方法。印迹聚合物的制备包括将反式白藜芦醇作为模板分子，与功能单体4－乙烯基吡啶、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈溶解于丙酮中，水浴中聚合；聚合物粉碎，过筛，用醋酸－甲醇将模板分子及未反应试剂洗脱出来，制得白藜芦醇印迹聚合物颗粒。从虎杖中提取白藜芦醇的方法包括虎杖以甲醇提取后浓缩，加入分子印迹色谱柱中，以甲醇－水为流动相分离；收集流出组分，得到白藜芦醇(纯度80％)和大黄素(纯度90％)。本发明中的分子印迹固定相具有高选择性，可分离白藜芦醇顺反异构体，同时也能够分离其它结构类似物(包括虎杖中的虎杖甙等)。本发明具有高效的分离、纯化结果。
文档编号C08F2/44GK1978473SQ20061013041
公开日2007年6月13日 申请日期2006年12月20日 优先权日2006年12月20日
发明者董襄朝, 马淑娟, 庄晓磊 申请人:南开大学