专利名称：：聚羟基烷酸-羟基烷氧基烷酸酯及其生物合成制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种聚羟基酯，特别涉及聚-3-轻基烷酸-(3-羟基乙氧基乙酸酯及其生物合成制备方法。
背景技术：
：聚羟基烷酸酯(polyhtdroxyalkanoates，简称PHAs)通常是微生物在不平衡生长条件下在细胞内积累的用于存储碳源和能量的颗粒状物质，它是一种在物理性质上类似于聚乙烯、聚丙烯等化学合成塑料的热塑性聚酯材料，其具有一般合成塑料所不具备的特性生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性、透氧性低、抗紫外辐射、抗凝血性以及在生物合成过程中可利用再生原料的特性等，在食品、医药、农业、电子、包装材料等领域具有独特而广泛的应用前景，被认为是一种"新型生物可降解材料"而倍受重视。PHAs也有一些缺点，它具有较强的疏水性，从而影响其降解速率。聚对二氧环己酮(poly(2-p-dioxanone)，PPDO〕是一种脂肪族聚醚酯，其分子链上含有醚键，分子链柔顺性好。它不仅具有优异的生物降解性、生物相容性和生物可吸收性，还具有优异的柔韧性、抗张强度、打结强度，可广泛应用于制造具有良好韧性和打结强度的外科单丝缝合线，在临床上代替由聚乳酸和聚乙交酯生产的多丝缝合线，克服其摩擦系数大，易损伤伤口的缺点，同时还可应用于制造骨板和组织修复材料，如螺钉、钩、片和钳等外科器具，是一种应用极为广泛的完全生物降解材料。日本京都大学的Kawai等研究发现采用黄杆菌和假单孢菌混和发酵即可将聚乙二醇脱氢，研究同时还发现该脱氢酶的底物较宽，可以从乙二醇一直到聚乙二醇20000(PEG20000)。Kawai的研究还显示该混和培养模式可将PEG脱氢经醛到单羧酸(以及少量组分的二羧酸)。Obradors等人在Kawai的研究基础上，定向分离了PEG降解菌，从河水中分离得到目的菌株假单孢菌尸M"^w7o"ayWwte^7'，并从中分离得到了PEG降解酶。基于上述研究结果认为，采用与上述研究结果相似的途径，通过生物方法实现由二乙二醇到(3-羟基乙氧基乙酸的转化是可能的。
发明内容本发明的目的在于，根据上述现有技术的研究结果，构建出一种含有醚键的新型聚羟基烷酸酯，其结构式如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中R为H、CH3、C2H5、C3H7、......CnH2n+1(n为正整数)；m、p、q为正整数；x、y为正整数；当R-CH3，m=l，p=2，q=l，x、y为正整数时，上述聚羟基烷酸酯即为聚-3-羟基丁酸-p-羟基乙氧基乙酸酯，其结构式如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中x、y为正整数。聚-3-羟基丁酸-P-羟基乙氧基乙酸酯[poly(3HB-co-HEA)，P3HBHEA]是一种新型聚羟基酯共聚体，是3-羟基丁酸(3-hydroxybutyrate，3HB)与卩-羟基乙氧基乙酸((3-hydroxyethoxyaceticacid,HEA)的共聚体，具有良好的生物降解性、生物相容性、抗凝血性，使得其在医药、组织工程等领域存在较大的应用空间。目前采用化学合成方法制备该共聚物时，是由P-丁内酯(卩-butyrolactone)与对二氧环己酮(2-p-dioxanone)开环聚合而成，但是化学合成的共聚物其分子量低，机械性能差，难以满足要求高分子量的各种性能；且带有一定的催化剂残留，在组织工程中产生异体排斥作用；而且化学合成所需要的单体纯度高，催化剂活性强，且开环聚合的反应条件苛刻，其生产成本非常高。本发明的另一目的还在于，提供一种聚-3-羟基丁酸-P-羟基乙氧基乙酸酯的生物合成制备方法，包括以下步骤1).从相关微生物中克隆用于生物合成聚-3-羟基丁酸-p-羟基乙氧基乙酸酯的phaA酶、phaB酶、phaC酶以及PEG降解酶的编码基因；2).采用基因工程技术构建上述几种生物合成酶的表达载体并导入相应微生物中，得到重组菌株；3).将重组菌株进行发酵，收集菌体，提取出聚-3-羟基丁酸-p-羟基乙氧基乙酸酯共聚物。上述制备方法中，步骤l)中的编码基因来自自然分离的能够合成聚羟基脂肪酸酯及能够降解PEG的微生物。上述制备方法中，步骤1)中用于克隆所述P—酮硫解酶(phaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaB)、PHA合酶(phaC)所采用的微生物是假单包菌属(Pseudomonas)，用于克隆PEG降解酶编码基因所采用的微生物是鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)。上述制备方法中，歩骤2)中所述的微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、假单包菌属(Pseudomonas)、气单包菌属(Aeromonas)，其中优选大肠杆菌(E.Coli)或嗜水气单包菌(Aeromonashydrophila)。上述制备方法中，步骤1)中的编码基因通过PCR获得。上述制备方法中，所述PCR的引物是Pegdhl:5，-CCATGGACAAATTCGACTTTGTCGTG-3'和Pegdh2:5，-GGTACCTAGGTGTAAGATTCGGCTTCATC-3，；phal:5,-TCTAGAAAGGGCCGTGCATGCGTGCTCACG-3'和pha2:5，-AAGCTTTTCCAGGCCGCGCGAGCCACCGC-3，。上述制备方法中，其中步骤3)中所述的发酵基质是4.72g/LKH2P03,4.62g/L(NH4)2S04，1.23g/LMgS04,2.04g/L(NH4)2HP04,1g/L柠檬酸，100mg/L氨苄青霉素和lml/L微量元素(lmol/LHCl中(g):0.05FeS04.7H20，0.011ZnS04.7H20，0.0025MnS02.4H20，0.005CuS04.5H20，0.0005(NH4)6Mo7O24.4H2O，0.000lNa2B407，0.01CaCl2)。上述制备方法中，其中步骤3)中所述的发酵温度为2545i:，发酵的pH值为6.08.0。上述制备方法中，其中步骤3)中所述的发酵方式为两步法流加分批发酵。本发明采用基因重组微生物发酵法生产出一种新型聚羟基垸酸酯一一聚-3-羟基丁酸+羟基乙氧基乙酸酯(P3HBHEA)。当PHB与HEA形成共聚物后，在组织工程中不再使机体产生排斥作用，且热稳定性好，可根据需要任意调节其含量，使其硬度、韧性可调；其优异的生物降解性、生物相容性、良好的加工性能使之在组织工程、医药等领域的应用更加广泛。图1是本发明中含有用于生物合成聚-3-羟基丁酸-p-羟基乙氧基乙酸酯相关基因的质粒图谱；图2是本发明中P3HBHEA的合成代谢流程图。具体实施例方式下面通过对本发明较佳实施例的描述，详细说明本发明。以下描述并不限制本发明。实施例1构建用于生产聚-3-羟基丁酸-(3-羟基乙氧基乙酸酯的工程菌株根据文献报道(Sugimotoetal.2001J.Bacteriol183，6694-6698),设计了一对引物Pegdhl:5，-CCATGGACAAATTCGACTTTGTCGTG-3，和Pegdh2:5,-GGTACCTAGGTGTAAGATTCGGCTTCATC-3，，在5，和3'端分别引入NcoI和KpnI酶切位点，利用PCR从Sphingomonasterrae基因组DNA中扩增得到1.6kb的聚乙二醇脱氢酶基因编码序列，PCR条件为94°C5分，94°Cl分，6(TC1分，72。C2分，35循环；72°C7分；4。C保存。将PCR产物用T4DNA连接酶(Promega公司)与pGEM-T载体(Promega公司)在16。C连接12小时，得到质粒pGEM-T/pegdh。测序结果表明，克隆产物与文献报道基本一致，只是由于引入酶切位点的需要，第二个氨基酸编码序列由CAC变为GAC(见序列表l)。pGEM-T/pegdh质粒用NcoI/KpnI双酶切后回收1.6kb片段，与经过同样酶切的大肠杆菌表达载体pTrc99A(Pharmacia公司)在16'C连接12小时，然后釆用CaCl2转化法转化大肠杆菌DH5a，筛选氨苄抗性的阳性克隆，从中提取得到pTrc/pegdh质粒。包括phaC、phaA和phaB编码基因的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶基因完整的操纵子同样利用PCR从假单胞菌基因组DNA中扩增得到。所用引物为phal5，-TCTAGAAAGGGCCGTGCATGCGTGCTCACG-3，禾口pha2:5，-AAGCTTTTCCAGGCCGCGCGAGCCACCGC-3，，在5，和3'端分别引入了Xbal和HindIII酶切位点。PCR条件为94°C，5分；94°C1分，60°C1分，72'C5分-30循环；72"C7分；4'C保存。PCR产物同样连接到pGEM-T载体，得到质粒pGEM-T/pha。经序列测定，结果见序列表2。pGEM-T/pha经XbaI/HindIII双酶切，回收4.4kb片段，pTrc/pegdh质粒经同样酶切，回收大片段。将两片段在16'C连接过夜，得到载体，定名为pDEPH(图一)。将pDEPH转入具有合成PHA能力的微生物〔埃希氏菌属、假单包菌属、气单包菌属等，优选大肠杆菌(E.Coli)或嗜水气单包菌(Aeromonashydrophila))，如大肠杆菌JM109，得到用于P3HBHEA生产的基因工程菌。含有pDEPH质粒的大肠杆菌JM109接种于含100pg/ml氨节青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L)中37'C培养过夜，1:100转接到100mlLB培养基中于37"C，200rpm培养16小时，离心收集菌体，用于P3HBHEA的分析。实施例2重组菌产P3HBHEA菌体生长培养基(LB):酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaC110g/L,pH7.2。发酵培养基4.5g/LKH2P03，3.6g/L(NH4)2S04，1.23g/LMgS04，2.04g/LNH4Cl，lg/L拧檬酸，100mg/L氨苄青霉素和lml/L微量元素(lmol/LHCl中(g):0.05FeSO4'7H2O，0.011ZnS04.7H20，0.0025MnS02.4H20,0.005CuS04.5H20，0.05CoCl2'6H2O，0.1CrCl3.6H2O，0.01CaCl2)，pH6.92。葡萄糖40g/L，二乙二醇1%(V/V)。取实施例1中得到的含有pDEPH质粒的重组大肠杆菌，以lOOpl的接种量接入含5mlLB培养液的试管中，37°C，250rpm培养5h。将在试管中培养好的菌体分别接入含有125ml发酵培养基的500ml三角烧瓶中，30°C，250rpm培养40h。离心收集菌体，提取P3HBHEA共聚物干燥称重。共进行十批次试验，结果见表l。表l含有pDEPH质粒的重组大肠杆菌摇瓶发酵试验结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中细胞干重(CDW)为发酵菌体细胞干重;P3HBHEA干重/CDW(。/。)为P3HBHEA含量占细胞干重的百分比；HEA含量(°/。)为P3HBHEA中HEA摩尔数占3HB与HEA摩尔数总和的摩尔百分比。所得发酵细胞干重平均为4.80g/L，所得产物经分析验证为含9.95%HEA的P3HBHEA共聚物。检测方法称取10mg干细胞，加入2ml氯仿，然后加入1.7ml乙醇，再加入0.3ml35X浓盐酸，110。C酯化4小时，酯化后的液体加入lml水，振荡后取下层有机相用HewlettPackard6890进行气相色谱检测。气相色谱条件如下毛细血管柱SPB-1，设定柱头温度为140°C，进样器温度为22(TC，检测器温度为25(TC，以10°C/min升温至200。C，载气为N2。经检测计算得到P3HBHEA含量占细胞干重的37.98%，HEA摩尔百分含量为9.95%。实施例3生产P3HBHEA共聚物取实施例1中得到的含有pDEPH质粒的重组大肠杆菌，以100ml的接种量接入3L发酵罐中，发酵基质4.72g/LKH2P03，4.62g/L(NH4)2S04，1.23g/LMgS04，2.04g/L(NH4)2HPO4，1g/L柠檬酸，100mg/L氨苄青霉素和lml/L微量元素(lmol/LHCl中(g):0.05FeSO4.7H2O，0.011ZnS04-7H20,0.0025MnS02.4H20，0.005CuS04.5H20，0.0005(NH4)6Mo7O24.4H2O，0.000lNa2B407，0.01CaCl2)，pH6.92。采用两步法流加分批发酵第一步为种子生长阶段，在37"C培养8小时；第二步为高分子合成阶段，在30'C培养32小时，此时采用流加方式补入葡萄糖和二乙二醇，共补入葡萄糖600g，二乙二醇20g。发酵结束收集菌体，提取共聚物P3HBHEA。共得到发酵液2.1L，干菌体重210g，提取到P3HBHEA重126g。所得产物经分析验证为含5%HEA的P3HBHEA共聚物。整个P3HBHEA的合成代谢流程如图2所示。序列表SEQN01<110>深圳市奥贝尔科技有限公司<120>聚羟基烷酸-羟基垸氧基烷酸酯及其生物合成制备方法〈160>2<210>1<211>1615〈212>DNA(序列类型)<213>Sphingomonasterrae<220><223>聚乙二醇脱氢酶基因〈400>1CCATGGACMATTCGACTTTGTCGTGGTGGGAGCTGGATCTGCGGGATGCACAGTTGCCA60GTAGATTGTCAGAGAATGGAAAGTATCAAGTTGCTCTCCTCGAAGCTGGAGGATCTCATA120ATMTCCGCTGATTTCGATTCCATTCMCTTCGCCTTCACGGTCCCCMAGGCCCGCATA180ACTGGAGCTTCG嵐CCGTGCCACAGGAGGGGCTGAATGGTCGGCGCGGATATCMCCGC240GCGGCMGGTGTTGGGTGGTTCTTCTTCMTAAATGCGATGGTATACATACGCGGCGCCA300AGGAAGATTATGAGCACTGGGCGGCATTGGGGMTGAGGGTTGGTCATACGMGAGGTGC360TGCCATTCTTTMGMGGCGCAAAACAGGGTTMGGGTGCGAACGAATATCACGCGCAGG420GCGGCCCCCTAACCGTGTCCCCTCCGCGCAGCCCCAACCCGCTCMCGACATGTTCATTA480AGGCTGGCATGGATTGCCAGCTGCCTTACAATGAGGATTTCAACGGCGAAACTCAGGMG540GCATTGGCTATTATGAGTTGACGCAGGATCGCGGCAAGCGCTGCTCAGCCGCGCTCGCCT600ATGTTACGCCAGCTGAAAAGCGCAAGMTCTMCCATCTTCAAACAAGCATTTGTCGAGA660AGGTTCTGGTTGAAAACGGTCAGGCGACCGGCGTGATGGTCAAGTTAMCGGCMCTTGC720AGCTAATCAAAGCCAGGCGGGAGGTCATTCTTTCTTGCGGCGCGTTCCAAAGCCCACAGT780TGCrGTTGCTTTCGGGCATTGGCGCCAAGGACAAGTTGGATCCGCATAAAATCMGGTGG840TTCATGAACTTCCTGGTGTCGGAGAGAACCTCTACGACCATGTAGATTTCTGCTTAATGT900ACCAATCTGACAGCGAGCATGTTCTGGGCAAAAATGCGCGCTCGGTGTTTCGTGTTGCGT■GGMCCAATTCMATATTTTGCCGGMGGCGCGGTATTTTGACGACGMCTTCMTGMT1020CTGGTGCCTTCTATTTCACCMTCCGGATGAGCGTTCGCCGGATATTCAGCTGCATTTTG誦CCTTCACATTGGTCGATCAACACGGACTMAACGGCACGGCCGCGGCGGATTTAGCTGCC1140ACGTTTGTGTCCTCAGACCCAAGAGTCATGGTAATTTGACTTTAGCCGACGCAMCCCGG1200CMCGCCGCCGCTCATCGATCCAGCATTTCTAMGGATGAGCGTGACGTCGCAACGTTGC1260TTGCCGGAGTCMACGCGCGCMCMATCTTACAGGCTCCTGCATTCGATGAGATTAGAG1320GCAAGCCGGTATATGCGACCGCCAGCAATAATGATGATGAATTGATCGAGGACATTCGM1380ACCGTGCCGATACGATCTATCATCCGGTTGGCACCTGCAAGATGGGTCCGGACAGTGATC1440CGATGGCGGTTGTCGATTCATCACTTAGGGTGAGGGGCATCAGGAACCTACGCGTTATCG1500ATGCCTCGATCATGCCTTCTATTGTATCGGGAAACACAMTGCGCCTACCATCATGATCG1560GCGAAMAGGGGCGCMATGATACTCGATGMGCCGMTCTTACACCTAGGTACC1615〈210〉2<211>4418<212>隨〈213>Pseudomonas<220><223>聚羟基脂肪酸酯(raA)合成酶基因<400>2TCTAGMAGGGCCGTGCATGCGTGCTCACGGAAGATGAAATGATCGCATGGGGAAAACGA60TAAAMAATATCGCACTGCGGCTCGGGGCAMGCATTGACATGCCTGATCCT120CGGGAGCAAGMTGTTCCCGGAATGTCAMTATCGGGCACGACGTGGCAAGGTCACCTTC180CACCGCGCAGTATCGCGTCTCATTGCGCGCTGGTCTCGGCGAGCCCTACACAGCGCCTGC240AACAGCAATCAGTCTTTCGAGACTCACAGGTCMMGCGGGTATGGCTGCCTCCAMACT300TCTTCTTCATCTTCCCGCCCAGATACCGCCGACAGCACATCGGCCGGMCGCGTCCGCCG360ACACGGCCGGCGTGCAGCAAGTGTTCGAGCMTGGCTCMCGCATGGCGTTCGGTCGCCG420ATCCGTCACAGTGGACGACGCTCGCGCAGCAGGCGCAGCCGGGTCAGCCGAATGGCCCCG480ACGGCGGCMTGCCGCAGCGTCGGCAGCGGCATCGGCCMTCCGTTCGCCGCTTTCGCAG540CCGTTCCCGGAATGCCGGCGGCGCCGTTCGCGATGCCGACGGTGCCTGATTTCGCGMGC600TCGGCACGATGCCCGACTTCTCGAAGCTCGCGGGCAGCATGCCCGGCTTCGGCGCCGCGA660TGCCTGCCATGCCGGCGATGCCGCAGATTCCGGGCGCGGCCATCGCGCCGGAGCGTCTTC720AGCAGATTGCAGGGCGACTATTCGCGCGATGTGATCGACCTGCTCAAGCAGGCGAGCGCG780CAGAGCATCGACCCCGCAGCGCTGMGGACCGGCGCTTCAGCACGACGGCGTGGCAGTCC840ACGCCGGCTAACGCGTTCACGGCCGCGTGGTATCTGCTCAACGCGCGCTATCTCCAGGM900CTCGCCGACGCCGTCGAGGCCGATCCCAAGACGCGCGAGCGCATCCGCTTCACGGTGCAG960CAGTGGACGGCCGCGGCCTCGCCGAGCAACTTTCTCGCGTTCAATCCCGAAGCGCAGCAG1020ACGCTCATCGAGAGCMGGGGGAGAGTCTGCGCCAGGGCATGCTGAATCTGCTGCACGAC1080ATGCAGCGCGGCAAGATCTCGCAATCCGACGAGTCGCGTTTCGTGGTCGGCAAGMCATC1140GCGACGACGGMGGGTCGGTCGTGTTCGAGMCGACCTGCTGCMCTGATCCAGTACMG1080CCGCATACGGMGAAGTCTTCGAGCGGCCGCTCCTGATCGTGCCGCCGTGCATCMCMG1260TTGTACATCCTCGACCTGCAGCCGCAGAGCTCGCTCGTCGCCCATGCGCTCGATGCGGGC1320CATCAGGTGTTCATCCTGTCCTGGCGCAACGCGGATCAGTCGATCGCGCACAAGACCTGG1380GACGACTACGTGCAGGAAGGCGTGCTCGATCCGATCGAAGCCGTCAAGGCGATCACCGGG1440CGCGAGCAGATCAACACGCTCGGCTTTTGCATCGGCGGMCGATCCTCGCTACCGCGCTT1500TCGGTGGCGGCGGCGCGCGGCGAGCACCCGGCGGCGTCGATGACGCTCCTCACCGCGATG1560CTCGACTTCTCCGACACCGGCGTGCTCGACGTCTTCGTCGACGAGGCGCACGTGCAGATG1620CGCGAGCAGACGATCGGCGGCMGGGCGGCACGCCGACCGGGCTCATGCGCGGCTTCGAG1680TTCGCGAACACGTTCTCGTACCTGCGCCCGMCGATCTGGTGTGGMCTACGTCGTCGAC1740MCTACCTGAAGGGCGCMCGCCGCAGGCGTTCGATCTGCTCTTCTGGAACAGCGACTCG1800ACCMTCTGCCGGGGCCGATGTGCGTCTGGTACCTGCGCAACACGTATCTGGAAAACMG1860CTGCGCGAGCCGGGCMGGTCACGACGTGCGGCGMCCGGTCGATCTGTCGCGCATGGAC1920GTGCCCACTTTCATTTACGGTTCACGGGAGGACCATATCGTGCCCTGGACGTCGGCGTAC1980GCGTCGGCGCCGCTCCTTGCCGGGCCGCAGMATTCGTGCTCGGCGCTTCGGGGCACATT2040GCGGGCGTCATCAACCCGCCGGCGMGAACMGCGCAGCTTCTGGATTTTCGACACCGAC2100GACMGGCGTTGCCGGCGGACCCGGACGCCTGGCTCGAAGCCGCGACGGAGCATCCGGGA2160AGCTGGTGGCCCACCTGGACCGCTTGGCTCGACGGCTACGCGGGCAAGAAGACGMGGCG2220CCGGCGGCGCCCGGGTCGAAGCAGTACCCTGTCATCGAGCCGGCCCCCGGCCGCTATGTG2280CTGCAGCGTGACCAGTAACCGTTTCGTCGTCCGGCCGTGCGCGACGCGCGCGGCATGACG2340ACCCCGCTTTAACATTCGTTGCCAGAGGAAACTGMAATGACTGACGTAGTGATCGTATC2400GGCCGCACGTACCGCGGTCGGCAAATTCGGCGGGTCGCTCGCGMGATCGCAGCACCCGA2460<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage14</formula>权利要求1.聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯，其结构式如下id="icf0001"file="A2006101573450002C1.gif"wi="134"he="18"top="42"left="32"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中x、y为正整数。2.—种权利要求1所述的聚-3-羟基丁酸-|3-羟基乙氧基乙酸酯的生物合成制备方法，其特征在于，包括以下步骤1).采用分子生物学方法克隆用于生物合成聚-3-羟基丁酸-卩-羟基乙氧基乙酸酯的卩一酮硫解酶(phaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaB)、PHA合酶(phaC)以及PEG降解酶的编码基因；2).采用基因工程技术构建上述几种生物合成酶的表达载体并导入具有合成PHA能力的微生物中，得到重组菌株；3).将重组菌株进行发酵，收集菌体，提取出聚-3-羟基丁酸-P-羟基乙氧基乙酸酯共聚物。3.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤l)中的编码基因来自自然分离的能够合成聚羟基脂肪酸酯及能够降解PEG的微生物。4.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤l)中用于克隆所述卩一酮硫解酶(phaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaB)、PHA合酶(phaC)所采用的微生物是假单包菌属(Pseudomonas),，用于克隆PEG降解酶编码基因所采用的微生物是鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)。5.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、假单包菌属(Pseudomonas)、气单包菌属(Aeromonas)，其中优选大肠杆菌(E.Coli)或嗜水气单包菌(Aeromonashydrophila)。6.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤l)中的编码基因通过PCR获得。7.根据权利要求6所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述PCR的引物是Pegdhl:5'-CCATGGACAAATTCGACTTTGTCGTG誦3，，Pegdh2:5，-GGTACCTAGGTGTAAGATTCGGCTTCATC-3，；phal:5，-TCTAGAAAGGGCCGTGCATGCGTGCTCACG画3'，pha2:5，-AAGCTTTTCCAGGCCGCGCGAGCCACCGC-3，。8.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的发酵的温度为2545"C，发酵的pH值为6.08.0。9.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的发酵方式是两步法流加分批发酵。全文摘要本发明涉及一种结构式如图的聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯共聚体，其中x、y为正整数；并提供了该共聚体的生物合成制备方法。本发明采用基因重组微生物发酵法生产聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯，当PHB与HEA形成共聚物后，在组织工程中不再使机体产生排斥作用，且热稳定性好，可根据需要任意调节其含量，使其硬度、韧性可调；其优异的生物降解性、生物相容性、良好的加工性能使之在组织工程、医药等领域的应用更加广泛。文档编号C08G63/00GK101195677SQ20061015734公开日2008年6月11日申请日期2006年12月7日优先权日2006年12月7日发明者夏邦富,方曾,王富强申请人:深圳市奥贝尔科技有限公司