由印尼莪术分离的免疫增强用多糖类及其制造方法

专利名称：：由印尼莪术分离的免疫增强用多糖类及其制造方法
技术领域：
：本发明涉及由印尼莪术(O^cwwaxawAo/r/^a)分离的有效的多糖类、及其制造方法、以及被分离的多糖类的用途。
背景技术：
：当生物体受细菌、真菌及病毒的感染时，具有巨噬细胞活化功能的多糖类，拥有使在被诱发的生物体的防御机制中起重要作用的巨噬细胞活化的功能。此时，上述巨噬细胞被分类为免疫细胞(cellularimmunity)，通过巨噬细胞活化与补体、天然杀伤细胞(NKcdl)等的免疫细胞进行反应，成为免疫系统的中枢(Plafair,J,H，L:ImmunologyataGlance5thed.BlackwellScientificPublications.London,1992)。巨噬细胞在暴露于细菌或外部的剌激性物质中时被活化，成为被活化的巨噬细胞。被活化的巨噬细胞显示出吞噬细胞作用、前列腺素(prostaglandin)分泌增加等的多种酶的蛋白质合成机能增加的功能性变化，其细胞的大小和细胞分泌物会增加。特别是，在对癌细胞的细胞毒性作用机理中，己知，通过被活化的巨噬细胞分泌的细胞因子(IL-lp,IL-6,TNF-oO、过氧化氢(H202)、亚硝酸(NO)、细胞毒性蛋白分解酶(cytolyticprotease)等对癌细胞显示出细胞毒性(HibbsJ.B.etal.,祝oc/ze肌所o;/z".Cbwmw""157:87-94，1998)。虽然被活化的巨噬细胞具有抗微生物作用、抗癌作用，但实际上在癌患者的生物体内的抗癌作用不会单独有效，且通过以往的化学疗法、放射线疗法进行的抗癌疗法会诱发非常严重的高热、发汗、头痛以及呕吐等的全身副作用，因而，可以说通过免疫增强活性的抗癌治疗的开发具有极其重要的意义。已知有多种生物化学现象参与到免疫调节中，特别是，与作为产生氧化氮(nitricoxide:NO)的酶的一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase:NOS)禾口前列腺素的生物合成相关的酶等起到重要的作用。因此，作为由L-精氨酸(L-arginine)生成NO的酶的NOS或者作为有关由花生四烯酸(ArachidonicAcid)合成前列腺素类的环氧化酶(cyclooxygenase,COX)被视为免疫调节的重要的指标(ChiharaG.etal.，Immunology,34:695-711,1978)。NOS以及COX—2的表达是通过复杂的细胞传达过程而实现，有将外部信号传达至细胞内的多种激酶(kinase)等的参与，但在其中，主要是对细胞核因子-kb(nuclearfactorkappaB，NF-kB)、iNOS以及COX—2的表达产生影响。酪氨酸(tyrosine)或丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threoninekinases)通过LPS或TNF—a等的剌激被磷酸化及活化，而存在于细胞质的作为NF—kB复合体的抑制结构要素的抑制性蛋白(inhibitorkappaB,IkB)则通过I—kB激酶被磷酸化以及活化，并被蛋白分解，由此NF—kB被活化(D'AcquistoF.etal.，Mo/.Interv.2:22-35,2002)。转录因子(transcriptionfactor)NF—kB作为序列特异的DNA结合蛋白，是诱发参与到细胞生长、分化以及免疫反应中的多种基因转录的重要因子。因此，对在不显示副作用的同时能够活化巨噬细胞的天然物质的研究进行得非常活跃，并主要作为以高分子级分而非低分子级分而显示出其活性的物质而公知。来自天然物质的免疫增强剂，通过强化免疫反应或者恢复已降低的免疫功能，应用于癌症治疗、免疫缺乏症治疗、慢性感染等的治疗中。以往，为了从天然物质得到免疫活性调节物质，对担子菌类、真菌类以及药用植物类进行了研究，特别是，对作为这些物质的高分子级分成分的多糖类等已有了很多报告，己经发现了抗癌活性、抗补体活性以及淋巴细胞分裂诱导等的免疫调节活性。至今为止，主要是来自于蘑菇类的香菇多糖(Lentinan)、裂裥菌多糖(Schzophyllan)、百士欣(Bestatin)、云芝多糖k(krestin)以及肽PSK(peptidePSK)等葡聚糖(glucan)类多糖被应用于抗癌治疗中。另一方面，印尼莪术属于姜科植物，通常是作为大姜黄(temulawak)或者爪哇姜黄(Javaneseturmeric)而广为人知的印尼的传统药用植物，其主要成分含有芳香-姜黄酮(artumenone)、a-姜黄烯、卩-姜黄烯、莪术呋喃酮、吉马酮、P-倍半水芹烯、a-姜黄酮、卩-姜黄酮、黄根醇等的类萜系列化合物和7_30%的精油、30—40%的碳水化合物、以及0.02—2.0%的作为芳香性色素的类姜黄色素等(LinS.C.etal.，Am.J.Chin.Med"23:243-254,1995)。
发明内容因此，本发明的目的在于提供一种由天然物质分离出的具有安全性的同时免疫增强效果及/或抗癌效果优异的物质、其制造方法、以及该物质的用途b为了实现上述目的，本发明提供一种由印尼莪术分离的多糖类的制造方法，其特征在于，包括(51)准备印尼莪术根(CurcumaxanthorrhizaRoxb.)的粉末的工序；(52)用有机溶剂提取上述粉末后，进行过滤或离心分离而得到滤渣的工序；(53)提取上述滤渣，从而配制含有多糖类的溶液的工序；(54)往上述含有多糖类的溶液中添加淀粉水解酶，从而去除淀粉的工序；(55)在上述(S4)工序后对多糖类进行沉淀的工序；及(56)在上述(S5)工序后对多糖类进行精制的工序。本发明还提供一种由印尼莪术分离的多糖类以及免疫增强剂组合物，其特征在于，所述由印尼莪术分离的多糖类是通过上述制造方法而得到，所述免疫增强剂组合物含有该多糖类。本发明人等以多种天然物质为对象进行了寻求免疫增强活性剂的研究，其结果发现从印尼莪术的根分离出的多糖类显示免疫增强活性，从而完成了本发明。下面，对本发明的由印尼莪术分离出的免疫增强多糖类、其制造方法、及含有该多糖类的免疫增强组合物或者抗癌辅助剂组合物进行更加详细的说明。本发明提供一种由印尼莪术分离的多糖类的制造方法，其特征在于，包括(51)准备印尼莪术根的粉末的工序；(52)用有机溶剂提取上述粉末后，进行过滤或离心分离而得到滤渣的工序；(53)提取上述滤渣，从而配制含有多糖类的溶液的工序；(54)往上述含有多糖类的溶液中添加淀粉水解酶，从而去除淀粉的工序；(55)在上述(S4)工序后对多糖类进行沉淀的工序；及(56)在上述(S5)工序后对多糖类进行精制的工序。本发明的制造方法包括(Sl)准备印尼莪术根的粉末的工序。印尼莪术根的粉末可通过本
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中通常使用的粉末化方法来进行准备。本发明的制造方法包括(S2)用有机溶剂提取上述粉末后，进行过滤或离心分离而得到滤渣的工序。作为有机溶剂，可以单独或混合使用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙醚，苯、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷，己烷、环己烷、石油醚等，但并不限于此。其中，可优选使用乙醇、甲醇，己烷或者它们的混合物。本发明的制造方法包括(S3)提取上述滤渣，从而配制含有多糖类的溶液的工序。其中，优选用热水、酸溶液或者碱溶液对滤渣进行提取而得到包含在上述滤渣中的多糖类成分。热水可以使用具有能够溶解多糖类程度的温度的纯水，优选可使用约70100。C的纯水。作为酸溶液，只要是本领域中公知的具有能够溶解多糖类程度的酸性的溶液，都可以使用，例如可以举出柠檬酸、富马酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、草酸、天冬氨酸、谷氨酸、棕榈酸、丙酸、抗坏血酸、壳聚糖(Chitosan)、马尿酸、藻酸、胆碱酸(cholineacid)、丁酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、葡萄糖酸、乙醇酸、扁桃酸、肉桂酸等有机酸溶液；以及盐酸、磷酸、醋酸、三氟醋酸、氢溴酸、硫酸等的无机酸溶液，但并不限于此，这些可以使用一种以上。但是，从制造成本等的多种角度考虑时，优选0.00510N的HC1溶液，更优选0.15N的HC1溶液。作为碱溶液，只要是本领域中公知的具有能够溶解多糖类程度的碱性的溶液，都可以使用，例如可以使用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺等，这些可以使用一种以上，但并不限于此。只是从制造成本等的多种角度考虑时，优选0.00510N的NaOH溶液，更优选0.15N的NaOH溶液。本发明的制造方法包括(S4)往上述含有多糖类的溶液中添加淀粉水解酶，从而去除淀粉的工序。淀粉水解酶优选使用a-淀粉酶(tx-amylase)、葡糖淀粉酶(Glucoamylase)等。本发明的制造方法包括(S5)在上述(S4)工序后对多糖类进行沉淀的工序。优选通过往去除了淀粉的含有多糖类的溶液中添加甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇，正丁醇、异丁醇、叔丁醇，乙二醇、丙撑二醇、丙三醇、三甲撑二醇等的低级醇，对溶液中含有的多糖类进行沉淀。本发明的制造方法包括(S6)在上述(S5)工序后对多糖类进行精制的工序。通过使用透析、超滤(ultrafiltration)等的分子量分级系统，去除被沉淀的多糖类级分中的低分子量成分，由此能够对多糖类进行精制。透析、超滤等中，优选使用分子量分离点标准为50010000，优选为5005000，更优选为10005000的膜。本发明还提供通过上述制造方法得到的由印尼莪术分离的多糖类，进一步，还提供作为有效成分含有该多糖类的药物组合物。对通过上述工序由印尼莪术分离精制而得到的多糖类实施了免疫增强活性试验，其结果是能够使作为免疫增强指标的NO、11202及PGE2的生成量、吞噬能力、iNOS、TNF-a、COX-2mRNA以及蛋白质表达增加。而且，还显示出癌细胞杀伤功能和抗癌效果。如此的活性意味着由印尼莪术分离精制的多糖类可有效地用作免疫增强剂组合物以及抗癌辅助剂组合物。即，本发明的多糖类能够活化巨噬细胞，可极其有效地用于包括癌症的有关免疫类疾病的预防、治疗以及治疗后的免疫增强用药品和功能性食品。进一步，本发明的免疫增强剂组合物在因免疫降低引起的疾病的治疗中，g卩，在临床免疫学上的疑难病症、慢性疾病、糖尿病、癌症、男性不孕症、后天免疫缺乏症(AIDS)、病理学上的病毒症、机会感染以及因放射线照射引起的疾病治疗中，可作为有效成分使用。含有用本发明的制造方法得到的多糖类的组合物，可通过本
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中公知的方法制造成医药品以及功能性食品的形式。该医药品以及功能性食品可含有药学上允许的赋形剂或添加剂。本发明的含多糖类的组合物可以单独或者与适当的运送体、赋形剂等加以混合的剂型给药，如此的给药剂型还可以是单次给药剂型或重复给药剂型。含有本发明的组合物的医药品或功能性食品，可以是固体制剂或液体制剂。固体制剂有散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、栓剂等，但并不限于此。固体制剂可含有赋形剂、香味剂、结合剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂、填充剂等，但并不限于此。液体制剂有如水、丙二醇的溶液制剂、悬浮剂、乳剂等，但并不限于此，还可以添加适当的着色剂、香味剂、稳定剂、粘合剂等而制成。例如，散剂可通过将本发明的多糖类与乳糖、淀粉、微结晶纤维等的药学上允许的适当的赋形剂进行简单混合而制成。颗粒剂可通过将本发明的多糖类与药学上允许的适当的赋形剂以及药学上允许的如聚乙烯吡咯垸酮、羟丙基纤维素等的适当的结合剂加以混合后，通过使用了水、乙醇、异丙醇等溶剂的湿式颗粒法或者通过利用了压縮力的干式颗粒法而制成。进一步，片剂可通过将上述颗粒剂与硬脂酸镁等药学上允许的适当的润滑剂加以混合后，利用压片机进行压片而制成。本发明的组合物根据需要治疗的疾病以及患者个体的状态，能够以口服给药、注射给药、吸入给药、鼻腔给药、腔给药、直肠给药、舌下给药等方式给药，但并不限于此。根据给药途径，可制成本领域中通常使用的含有非毒性的且药学上允许的输送体、添加剂、传播媒介的适当的给药剂型单元。本发明的多糖类的每天给药量可约为0.2200mg/kg，优选为约250mg/kg，更优选为530mg/kg。但是，该投药量可根据患者的状况(年龄、性别、体重等)、病症的严重性、所使用的有效成分、饮食等多样化。可根据需要，也为了图方便，将一天的总给药量分成在一天内数次给药。本发明还提供抗癌补助方法以及免疫增强方法，其特征在于，将本发明的多糖类作为有效成分而给药。将本发明的多糖类向大鼠口服给药而进行毒性试验，其结果是口服毒性试验的50%致死量(LD5。)显示为2000mg/kg以上，由此能够确认本发明的多糖类非常安全。图1为从印尼莪术分离免疫增强多糖类的工序图。图2为用凝胶渗透色谱法测定从印尼莪术分离的多糖类的分子量的结果。A:作为标准物使用的普鲁兰多糖的凝胶渗透色谱图(分子量=788000,112000,22800,5900,360)。B:从印尼莪术分离的多糖类的凝胶渗透色谱图。图3表示用Bio-LC测定本发明的从印尼莪术分离的多糖类的糖含量的结果。A:作为标准物使用的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖的色谱图。B:从印尼莪术分离的多糖类的糖含量色谱图。图4为表示从印尼莪术分离的多糖类在NO生成的增加上的效果的图。图5为表示从印尼莪术分离的多糖类在H202生成的增加上的效果的图。图6为表示从印尼莪术分离的多糖类在吞噬能力的增加上的效果的图。A:无试样处理组B:用30ug/ml浓度试样处理的组图7为表示从印尼莪术分离的多糖类在TNF-a蛋白质表达增加上的效果的图。图8为表示从印尼莪术分离的多糖类在TNF-amRNA表达增加上的效果的图。图9为表示从印尼莪术分离的多糖类在iNOS蛋白质表达增加上的效果的图。图10为表示从印尼莪术分离的多糖类在iNOSmRNA表达增加上的效果的图。图11为表示从印尼莪术分离的多糖类在COX-2蛋白质表达增加上的效果的图。图12为表示从印尼莪术分离的多糖类在COX-2mRNA蛋白质表达增加上的效果的图。图13为表示从印尼莪术分离的多糖类的lKBa磷酸化的图。图14为表示从印尼莪术分离的多糖类在生物体内的NO生成增加上的效果的图。图15为表示从印尼莪术分离的多糖类在生物体内的吞噬作用增加上的效果的图。图16为表示从印尼莪术分离的多糖类在生物体内的癌细胞杀伤功能增加上的效果的图。图17为表示从印尼莪术分离的多糖类在生物体内的iNOSmRNA表达增加上的效果的图。图18为表示从印尼莪术分离的多糖类在生物体内的TNF-amRNA表达增加上的效果的图。图19为表示从印尼莪术分离的多糖类在生物体内的IL-lJ3mRNA表达增加上的效果的图。图20为表示从印尼莪术分离的多糖类在生物体内的IL-6mRNA表达增加上的效果的图。具体实施方式下面，通过举出下述实施例等，对本发明进行更加详细的说明。但是，本发明的实施例可变更为多种方式，不能解释为下面详细记载的实施例等限定了本发明的范围。本发明的实施例等只是为了更加具体地理解本发明而例示的。在下面的全部试验结果中，活性分析重复进行3次以上，并将其结果用平均士标准偏差来表示。统计分析则用邓肯检验(Duncantest)(SPSS12.0)来进行，并认为>值在0.05以下、》值在0.01以下的情况下为统计学上有效。实施例l:从印尼莪术分离多糖类在15g印尼莪术根的粉末中添加750ml的100X乙醇，在78。C、2小时的条件下提取两次。将所得到的提取物用沃特曼(Whatman)滤纸(No.2)分离为上清液和滤渣。作为提取溶剂在滤渣中添加750ml、O，IN的NaOH后，在97。C下、2小时内提取两次。为了对上述所得到的0.1N的NaOH提取物中含有的淀粉进行水解，在酶的最适宜条件下，用a-淀粉酶(Termamyl120L，NOVONordiskA/S，Denmark)和葡糖淀粉酶(AMG300L,NOVONordiskA/S，Denmark)进行处理后加以中和。在上述滤液中添加其4倍体积的异丙醇，在4"C下放置24小时而沉淀多糖类后，以6500rpm迸行15分钟的离心分离而分离上清液。将分离得到的沉淀物溶解在蒸馏水而制备1%溶液，并用分子量分离点为1000的膜进行超滤(细通道超滤(thinchannelultrafiltrationsystem),AmiconTCF-10;AmiconCo.,U.S.A.)。超滤后，收集分子量为1000以上的溶液，对其进行冷冻干燥，由此得到多糖类，收率为6%。将如此得到的多糖类命名为"姜黄素一X(Curcuman-X)"。将本发明的实施例1中的整个的提取及分离工序示于图1中。实验例l:分子量测定通过凝胶渗透色谱法测定上述实施例1中由印尼莪术分离的多糖类姜黄素—X的分子量。色谱柱使用色谱柱(型号Ultmhydrogd线性色谱柱)和色谱柱(型号Ultmhydrogd500色谱柱)，流动相使用0.1N的NaN02。在分析时，流动相的速度为lml/min，作为标准物质使用普鲁兰多糖。将实验结果示于图2中。如图2所示，确认姜黄素一X的数均分子量为33000Da。实验例2:糖成分的测定用生物液相色谱仪(Bio-LC)(DionexDX-500，USA)，对上述实施例1中由印尼莪术分离的多糖类姜黄素一X的糖成分的含量进行测定。在10mg多糖类中添加lOOpl、24N的硫酸反应一小时后，进行氮气填充，并在IOO。C下进行三小时的水解。冷却至室温后，将冷却后的反应物与12N的氢氧化铵反应而进行中和，用蒸馏水加以稀释。用滤纸过滤稀释液，通过Bio-LC测定糖含量。作为Bio-LC的分析条件，色谱柱使用CarboPacTMPA1，溶出液(isocraticeluent)使用22.6mM的NaOH，缓冲溶液使用200mM的NaOH。溶出液的流速为0.3ml/min，试样注入量为50^1，并在氮气条件下进行。作为糖标准物，使用葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖，通过保留时间(retentiontime)来确认各糖。将多糖类的糖含量测定结果示于图3中，将糖成分的含量示于下述的表1中。如表1所示，从印尼莪术分离的多糖类的主要构成成分为葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、以及甘露糖。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实验例3:NO生成的测定为了探明上述实施例1中分离的多糖类的免疫调节效果和NO分泌之间的相关关系，用RAW264.7巨噬细胞观察NO生成功能力。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100ng/ml链霉素的达氏修正依氏培养基(Dulbecco'smodifiedeaglesmedium)(Gibco,USA)的完全培养基，在37。C的C02培养器中培养鼠的巨噬细胞株RAW264.7细胞。以2xl()S细胞/ml浓度分别取各RAW264.7巨噬细胞，在37。C的002培养器中培养4小时后，用姜黄素一X以(5，10,30,50^ig/ml)的浓度分别进行处理，作为对照组则用1(Vg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide)进行处理后培养24小时。培养结束后，用格式检验法(Griessassay)(Griess.P.，Chem.Ber.12:426-428,1897)，测定培养上清液中的亚硝酸盐(NO的稳定的水合物)的浓度。即，将NaN02作为标准物质，使用格里斯试剂(0.5%磺胺(sulfanilyamide)，0.05。/。N-(l-萘基)乙二胺二盐酸盐/2.5。/。H3PC)4)，在540nm下测定试样的吸光度。实验结果为如图4所示，相比于未用试样处理的组，在进行姜黄素一X处理的组中，显示出非常高的NO生成量，并确认了该数值依赖于浓度的增加而增加。这意味着从印尼莪术分离的多糖类能够大幅增加巨噬细胞的NO生成功能。实验例4:&02生成的測定为了探明上述实施例1中分离的多糖类的免疫调节效果和11202分泌之间的相关关系，用RAW264.7巨噬细胞观察H202的生成功能。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml链霉素的达氏修正依氏培养基(Gibco，USA)的完全培养基，在37。C的C02培养器中培养大鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞。通过用安普莱克司红色试剂(AmplexRedreagent)(10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪)测定酚红的依赖于辣根过氧化物酶(horseradishperoxcidase、HRP)的氧化过程的显色反应，由此测定过氧化氢的生成。以2xl(^细胞/ml浓度下分别取各RAW264.7巨噬细胞，用50mM的安普莱克司红色试剂和0.1U/mlHRP的葡萄糖磷酸缓冲液(Krebs-Ringerphosphate)(145mM的NaCl，5.7mM的磷酸钠，4.86mM的KC1,0.54mM的CaCl，1.22mM的MgS04，5.5mM的葡萄糖,pH值为7.35)进行处理后，用浓度为(5，10,30,50^g/ml)的姜黄素一X分别进行处理，作为对照组则用lOpg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide)进行处理后培养20小时。培养结束后，通过在5卯nm下测定吸光度来测定上清液中的11202浓度。实验结果为如图5所示，相比于未用试样处理的组，在进行姜黄素一X处理的组中，显示出非常高的H202生成量，并确认了该数值的增加依赖于浓度的增加而增加。当用50吗/ml的多糖类处理的情况下，相比于未用试样处理的组显示出12倍以上的H202生成量，该结果表明，多糖类相比于对照组使用的LPS更加优异。这确认了由印尼莪术分离的多糖类具有能够大幅增加巨噬细胞的11202生成量的作为有丝分裂原(mitogen)的活性，意味着因多糖类引起的巨噬细胞的H202增加效果，除了对从外部入侵的细菌具有破坏作用以外，对相邻的细胞也具有极其重要的作用。实验例5:巨噬细胞的吞噬功能测定通过RAW264.7巨噬细胞观察在上述实施例1中分离的多糖类的吞噬功能作用，并用热灭活的异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate、FITC)标记的大肠杆菌生物粒子(E化/^n'c/n'aco//)(K-12株，MolecularProbes,Eugene,OR,US)测定其吞噬功能。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100吗/ml链霉素的达氏修正依氏培养基的完全培养基，在37'C的C02培养器中培养大鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞。以2xl()S细胞/ml的浓度分别取各RAW264.7巨噬细胞至96-孔板中，用浓度为(5，10,30，50i!g/ml)的姜黄素一X分别进行处理，并在37'C的C02培养器中进行培养。4小时后，分别取lO(Hil的热灭活的异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate、FITC)标记的大肠杆菌生物粒子(Esc/zen'c/zz'aco/f)后，培养2小时。培养结束后，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤巨噬细胞和细菌，然后，分别取出到100ul的台盼兰(TiypanBlue)中在常温下放置一分钟后加以去除，通过荧光发光器测定吞噬功能。进一步，通过共聚焦显微镜(xl890)观察姜黄素—X对被活化的巨噬细胞的巨噬活性的影响的效果。实验结果为如图6所示，相比于未用试样处理的组，在用姜黄素一X处理的组中显示出非常高的吞噬功能，且能够确认该数值依赖于浓度的增加而增加。在图6中，A表示未用试样处理的组，B表示浓度为30吗/ml的姜黄素一X处理的组。由于巨噬细胞具有能够辨认异物质的不同的受体(receptor)等，因此，食品或天然物质能够直接参与到巨噬细胞的活化，但是，也有时是依赖于通过补体或其他淋巴细胞的活性而进行的二次作用。因此，不能把握由印尼莪术分离的多糖类活化巨噬细胞的准确的机理，但是，可通过被活化的巨噬细胞大幅增加吞噬功能，能够强化包括先天性免疫、后天性免疫的整个免疫系统。实验例6:PGE2生成的测定通过RAW264.7巨噬细胞观察上述实施例1中分离的多糖类姜黄素一X对PGE2生成的影响，并用R&D试剂盒(R&Dsystems,USA)来定量PGE2的生成。使用含有10%的胎牛血清、100imits/ml的青霉素、100吗/ml链霉素的达氏修正依氏培养基的完全培养基，在37'C的C02培养器中培养大鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞。以2xl()S细胞/ml的浓度分别取各RAW264.7巨噬细胞至96-孔板中，使其在37'C的C02培养器中放置4小时稳定，用浓度为(5，10，30，50ng/ml)的姜黄素一X分别进行处理，作为对照组则用10ug/ml的脂多糖进行处理，并培养24小时。培养结束后，将上清液移至新的孔板中，并向各孔板添加lOOul的分析缓冲液(assaybuffer)、50P1的PGE2结合缓冲液(conjugatebuffe)以及PGE2抗体溶液(antibodysolution)。将如此处理过的孔板在常温下反应2小时。将孔板中的反应试剂全部去除，用洗涤液洗涤各孔板后，添加50"1的PGE2结合缓冲液和200y1的pNPP基质，使其在常温下反应1小时。将50u1反应终止液添加至各孔板而终止反应，并在405nm下测定吸光度。PGE2生成量测定结果如表2所示，相比于未用试样处理的组，用姜黄素一X处理时显示出非常高的PGE2生成量，且该数值依赖于浓度的增加而增加。当用50吗/ml的多糖类处理时，相对于未用试样处理的组显示出300%以上的PGE2生成量，其效果比作为对照组而使用的LPS优异。这意味着由印尼莪术分离的多糖类姜黄素一X能够大幅增加巨噬细胞的PGE2生成功能。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实验例7:对iNOS、TNF-a以及COX-2分泌的影响为了探明上述实施例1中分离的姜黄素一X对iNOS、TNF-a以及COX-2蛋白质和mRNA表达的影响，实施了免疫印迹(WestemBlot)及RT-PCR。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml链霉素的达氏修正依氏培养基的完全培养基，在37。C的C02培养器中培养大鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞(韩国细胞株银行)。将RAW264.7细胞数调整为2xl(^细胞/ml并移至60mm培养器中，培养6小时，由此准备用以免疫印迹的细胞。将该培养细胞用溶解在杜氏磷酸缓冲液DPBS(Dulbecco'sPhosphateBufferedSaline)中的浓度为(5,10,30,5(^g/ml)的姜黄素一X分别进行处理，作为对照组则用10pg/ml的脂多糖进行处理。对各试样处理24小时后，去掉培养器的培养基，用DPBS溶液洗涤两次后，添加lml的DPBS，集中细胞等进行离心分离(1500rpm,3分钟)，从而回收细胞。为了得到回收细胞的蛋白质，投入100ul的缓冲溶液(裂解缓冲液，200mM的tris,150mM的NaCl，lmM的EDTA，lmM的EGTA,1°/。的triton,lmM的PMSF，蛋白酶抑制剂混合物)而破坏细胞，由此回收蛋白质。被回收的蛋白质通过考马斯亮蓝染色法(BradfordAssay)来定量，此时，作为标准物使用牛血清蛋白(bovineserumalbumin)。使提取的蛋白质在10%的SDS-聚丙烯基酰胺凝胶中进行电泳，用硝酸纤维素细胞膜(nitmcellulosemembrane)转移凝胶的蛋白质。为了防止膜被其他未知的蛋白质污染，用5%脱脂奶粉(5%skimmilk)在常温下遮挡一小时，将iNOS、TNF-a和COX-2的一次抗体用封闭缓冲液(Blockingbuffer)稀释至1:1000的比例，使其在常温下反应2小时。一次抗体反应后，用TBST(Tris-bufferSalineTween20)每10分钟进行3次一边摇晃一边洗涤。将用以辨认iNOS、TNF-a和COX-2的一次抗体的二次抗体用5%脱脂萘奶粉稀释至1:2000的比例，使其在常温下反应一小时，并与一次抗体的情况相同地用TBST(Tris-bufferSalineTween20)每10分钟进行3次一边摇晃一边洗涤，并通过化学发光法(chemiluminescence)进行显影<>用于RT-PCR的RAW264.7细胞在60mm细胞培养皿中分株为2xl(^细胞/ml，并使其稳定一晚。用试样处理该细胞后，收集细胞用PBS洗涤，添加lml的三唑(Invitrogen,USA)并在室温下加以搅拌。投入200iU的氯仿再次进行搅拌，并以12000rpm、4。C的条件进行15分钟的离心分离，在其上清液中加异丙醇后，再次进行离心分离，从而得到RNA颗粒。通过MMLV逆转录酶(reversetranscriptase)将在此得到的RNA制作成cDNA。向其中添加iNOS(正义5'隱CAACCAGTATTATGGCTCCT-3'，反义5'-GTGACAGCCCGGTCTTTCCA-3')，TNF画a(正义5-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3，反义5-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3)，COX画2(正义5'-CCGTGGTAATGTATGAGCA，反义5'-CTCGCTTCTGATATGTCTT-3')及(3-肌动蛋白(卩-actin)(正义5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC画3',反义5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3')的引物，并通过Taq聚合酶(taqpolymerase)对各基因进行增幅。此时，基因增幅是以在95匸下30秒、55"C下1分钟、72'C下1分钟为一循环，共重复循环30次后，最后在72"C下反应5分钟而进行。将所得到的RNA用1%琼酯糖凝胶实施电泳，用UV检测器进行确认。实验结果为如图7、9、11所示，通过姜黄素一X能够确保iNOS、TNF-a和COX-2蛋白质的明显地增加，进一步，在图8、10、12中还可以确认mRNA以与蛋白质类似的倾向在增加。该结果意味着上述实施例中记载的NO及PGE2的增加起因于姜黄素一X对mRNA及蛋白质表达的调节。实验例8在测定lKBa的磷酸化为了探明上述实施例1中分离的姜黄素一X对lKBa的磷酸化的影响，实施了免疫印迹(Westernblot)。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、10(Hig/ml链霉素的达氏修正依氏培养基的完全培养基，在37"C的C02培养器中培养作为大鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞(韩国细胞株银行)。将RAW264.7细胞数调整为2xl()S细胞/ml并移至60mm培养器中培养6小时而准备用于免疫印迹的细胞。将该培养细胞用溶解在杜氏磷酸缓冲液DPBS中的浓度为(5,10，30，50pg/ml)的姜黄素一X分别进行处理，作为对照组则用10pg/ml的脂多糖进行处理。对各试样处理24小时后，去掉培养容器中的培养基，用DPBS溶液洗涤2次后，投入lml的DPBS,收集细胞等进行离心分离(1500rpm,3分钟)而回收细胞。为了得到回收细胞的蛋白质，投入100ul的缓冲溶液(裂解缓冲液，200mM的tris,150mM的NaCl,lmM的EDTA，lmM的EGTA，1%的triton，lmM的PMSF，蛋白酶抑制剂混合物)而破坏细胞，由此回收蛋白质。被回收的蛋白质通过考马斯亮蓝染色法(BradfordAssay)来定量，此时，作为标准物使用牛血清蛋白(bovineserumalbumin)。使提取的蛋白质在10%的SDS-聚丙烯基酰胺凝胶中进行电泳，用硝酸纤维素细胞膜(nitrocellulosemembrane)转移凝胶的蛋白质。为了防止膜被其他未知的蛋白质污染，用5%脱脂奶粉(5%skimmilk)在常温下遮挡一小时，将pMBa的一次抗体用封闭缓冲液(Blockingbuffer)稀释至1:1000的比例，使其在常温下反应2小时。一次抗体反应后，用TBST(Tris-bufferSalineTween20)每10分钟进行3次一边摇晃一边洗涤。将用以辨认一次抗体的二次抗体用5%脱脂奶粉稀释至1:2000的比例，使其在常温下反应一小时，并与一次抗体的情况相同地用TBST(Tris-bufferSalineTween20)每IO分钟进行3次一边摇晃一边洗涤，通过化学发光法(chemiluminescence)进行显影。实验结果为如图13所示，能够确认lKBa蛋白质由于姜黄素一X而明显磷酸化。该结果间接表明iNOS、TNF-a及COX-2的增加起因于NF-kB活性。实验例10:测定通过口服给药姜黄素一X时的NO的生成量(体内)为了探明上述实施例1中分离的姜黄素一X的免疫调节效果和NO分泌之间的相关关系，通过动物实验来观察NO生成功能。将小鼠分组，每组有12只C57BL/6小鼠(17-18g，雌性)，将姜黄素—X以10、50及100mg/kg浓度每天服用一次连续服用21天。将2ml的3%的硫乙醇酸盐培养基注入到小鼠的腹腔内，三天后用8ml的RPMI完全培养基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、lOOpg/ml链霉素)洗涤腹腔内膜，收集腹腔巨噬细胞，使其附着在用FBS涂层的器皿4小时，去除浮游细胞仅得到纯的巨噬细胞，并测定其细胞数量。以5xl()s细胞/ml浓度分别取各巨噬细胞，在37"C的<:02培养器中培养24小时。培养结束后，测定培养上清液中的亚硝酸盐，用格里斯试剂(0.5%的0.5%磺胺(sulfanilyamide)，0.05%的N-(l-萘基)乙二胺二盐酸盐/2.5。/o的H3P04)在540nm下通过酶标仪(MicroplateReader)测定试样的吸光度。实验结果为如图14所示，当服用实施例1中得到的姜黄素一X时，能够增加NO的生成，这意味着多糖类被小鼠吸收，显示出了免疫调节效果。实验例lh口服给药姜黄素一X对吞噬功能的影响(体内)将小鼠分组，每组有12只C57BL/6小鼠(17-18g，雌性)，将姜黄素一X以10、50及100mg/kg浓度每天服用一次连续服用21天。将2ml的3°/。的硫乙醇酸盐培养基注入到小鼠腹腔内，三天后用8ml的RPMI完全培养基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml链霉素)洗涤腹腔内膜，收集腹腔巨噬细胞，使其附着在以FBS涂层的器皿4小时，去除浮游细胞得到纯的巨噬细胞，并测定其细胞数量。以5xl()S细胞/ml浓度分别取各巨噬细胞，在37"C的002培养器中培养24小时。4小时后，分别取100pl的热灭活的异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate、FITC)标记的大肠杆菌生物粒子(E化/zen'cWa后，培养2小时。培养结束后，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤巨噬细胞和细菌，然后，分别取出到100ul的台盼兰(TrypanBlue)中在常温下放置一分钟后加以去除，通过荧光发光器测定吞噬功能。实验结果为如图15所示，当服用实施例1中得到的姜黄素一X时，能够大幅增加吞噬功能，且能够确认该数值依赖于浓度的增加而增加。这表明由印尼莪术分离的多糖类在生物体内能够使巨噬细胞的吞噬功能大幅增加。实验例12:口服给药姜黄素一X时的脾细胞增值诱导实验(体内)将小鼠分组，每组有12只C57BL/6小鼠(17-18g,雌性)，将姜黄素一X以IO、50及100mg/kg浓度每天服用一次连续服用21天。21天后，为了确认脾细胞的增殖，杀死小鼠，取出脾脏，在RPMI完全培养基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml链霉素)中通过盖片玻璃使细胞流出，将流出的细胞以2xl(f细胞/ml浓度分别取至37"C的C02培养器，培养72小时。培养结束后，添加MTT溶液(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)，然后培养4小时。MTT-甲臢(formazan)生成物则通过添加相同容量的溶解缓冲液(DMSO)而加以溶解。甲臢的量则利用酶标仪(microplatereader)测定570nm下被吸収的量。实验结果，以服用了姜黄素一X的小鼠的脾细胞对没有服用姜黄素一X的小鼠的脾细胞的比例的形式示于表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如表3所示，脾细胞数量的增加依赖于本发明的姜黄素一X，由于脾细胞的增加是免疫增强的指标，因此实验结果表明本发明的姜黄素一X具有免疫增强效果。实验例13:测定通过口服给药姜黄素一X的脾细胞的杀伤癌细胞的功能(体内)由于使用具有抗癌效果的抗癌剂的癌症治疗的副作用非常大，因此，最近多利用采用了免疫增强剂的癌症治疗疗法，并得到了持续的开发。免疫剂的使用能够减少抗癌剂的副作用，而且能够增加抗癌治疗效果。在上述实施例中证明了姜黄素一X在生物体内以及生物体外具有免疫增强效果。在本实施例中则验证姜黄素一X的免疫增强能否表现出抗癌效果。将小鼠分组，每组有12只C57BL/6小鼠(17-18g,雌性)，将多糖类以10、50及100mg/kg浓度每天服用一次连续服用21天。21天后，为了确认脾细胞的增殖，杀死小鼠，取出脾脏，在RPMI完全培养基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml链霉素)中通过盖片玻璃使细胞流出，将流出的细胞以2"07细胞/1111浓度分别取至37'C的C02培养器中培养72小时。将癌细胞YAC-1细胞用显示绿色蛍光的DiOC18(3，3'-双十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐(3,3'-dioctadecyloxacarbocyanineperchlorate),MolecularProbes,Eugene,U.S.A.)来标记。将培养的脾细胞和被标记的靶细胞(YAC-1细胞)以50:1比例进行24小时的培养，培养结束后，投入lOpl的碘化丙啶(propidiumiodide)(PI,Sigma,U.S.A.),利用FACScan流式细胞仪(BectonDickinson,Heidelberg,German)测定脾细胞的癌细胞杀伤功能。实验结果如图16所示，通过口服给药姜黄素一X而活化的脾细胞的癌细胞杀伤功能依赖于浓度的增加而增高，由此证明了姜黄素一X能够没有细胞毒性的增加生物体免疫，是显示抗癌效果的抗癌免疫增强剂。实验例14:口服给药姜黄素一X对细胞因子的分泌的影响(体内)将小鼠分组，每组有12只C57BL/6小鼠(17-18g，雌性)，将多糖类以10、50及100mg/kg浓度每天服用一次连续服用21天。将2ml的3。/。的硫乙醇酸盐培养基注入到小鼠腹腔内，三天后用8ml的RPMI完全培养基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、lOOpg/ml链霉素)洗涤腹腔内膜，收集腹腔巨噬细胞，使其附着在以FBS涂层的器皿4小时，去除浮游细胞得到纯的巨噬细胞，并测定其细胞数量。以5xl()S细胞/ml浓度分别取各巨噬细胞，在37"的C02培养器中培养24小时。培养结束后收集细胞用PBS加以洗涤，添加lml的三唑(Invitrogen,USA)并在室温下进行搅拌。加入20(^1的氯仿后，再次进行搅拌，在12000rpm、4'C的条件下进行15分钟的离心分离后，在上清液中加入异丙醇再次进行离心分离，从而得到RNA颗粒。通过MMLV逆转录酶(reversetranscriptase)将在此得到的RNA制作成cDNA。向其中添加iNOS(正义5'-CAACCAGTATTATGGCTCCT國3'，反义5'隱GTGACAGCCCGGTCTTTCCA画3')、TNF-a(正义5画CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3，反义5-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3，IL画1(正义5-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC-3，反义5-GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC-3，IL-6(正义5-GATGCTACCAAACTGGATATAATC-3，反义5画GGTCCTTAGCCACTCCTTCTGTG-3;)及(3-肌动蛋白(卩-actin)(正义5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3',反义5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3')的引物，并通过Taq聚合酶(taqpolymerase)对各基因进行增幅。此时，基因增幅是以在95。C下30秒、55"C下1分钟、72"C下1分钟为一循环，共重复循环30次后，最后在72'C下反应5分钟而进行。将所得到的RNA用琼酯糖凝胶实施电泳，用UV检测器进行确认。实验结果如图17、18、19及图20所示，能够确认通过多糖类iNOS、TNF-a、IL-l卩与IL-6的mRNA增加。该结果表明上述实验例中记载的通过姜黄素一X免疫增强效果起因于mRNA表达的调节。实施例213:根据不同的提取条件从印尼莪术提取的多糖类的分离作为多糖类提取溶剂使用热水、0.015N的NaOH、0.015N的HC1，采用与实施例l相同的方法从印尼莪术提取多糖类并进行分离精制。接着，以多糖类浓度为10吗/ml，用与上述实验例3和实验例5相同的方法测定NO生成功能和巨噬细胞的吞噬功能，并示于表4中。该结果是用相对于未用试样处理的组的百分比表示。如表5所示，根据提取条件不同能够得到提取收率为2.18.5%、数均分子量为1100082000的免疫增强多糖类，并在所有的提取条件下都显示出NO生成功能。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实验例15:姜黄素一X的抗癌效果(体内)将小鼠分组，每组有10只BDF1小鼠(17-18g，雌性)，将B16F10癌细胞(5><105)移植到小鼠腹腔而诱发癌症，从移植第二天起，将用生理盐水稀释成IO、50及100mg/kg浓度的多糖类每天口服投药一次。为了确认各自实验组等的毒性，在用试样处理期间对小鼠测量体重，没有发现体重的减少。这表明在所有的实验群中都没有毒性。实验结果为，用移植癌细胞后的第60天还存活的小鼠数量来求出存活率，用相对于未用姜黄素一X处理的小鼠的存活率的比例来计算。实验结果为如下表5所示，通过姜黄素一X的处理提高存活率，而该存活率的值依赖于浓度的增加而增加。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>实验例16:姜黄素一X对癌细胞的抗肿瘤效果(体内)将小鼠分组，每组有10只ICR小鼠(20-23g，雌性)，向小鼠腹腔皮下注射200pl的将癌细胞(sarcoma-180，肉瘤)稀释在生理盐水而得到的细胞溶液("106细胞)，利用该得到的固体癌模型来加以测定。24小时后，将姜黄素一X以10、50及100mg/kg的浓度每天口服给药一次。提取给药20天后所生成的固体癌，称其重量。从提取的固体癌重量计算出固体癌生成的抑制率，并将其结果整理在下表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表6所示，在未用试样处理的组中固体癌重量为449士98mg，当姜黄素—X为50禾B100mg的情况下，其固体癌重量分别为276土90mg和199士81mg，相对于对照组显示出38.6和62.1%的固体癌的生成抑制率。工业上实用性本发明提供由印尼莪术制造有效的多糖类的方法，根据该制造方法得到的多糖类以及作为有效成分含有该多糖类的药物组合物。本发明的多糖类及药物组合物具有优异的免疫增强效果以及抗癌效果。权利要求1.一种由印尼莪术分离的多糖类的制造方法，其特征在于，包括(S1)准备印尼莪术根的粉末的工序；(S2)用有机溶剂提取上述粉末后，进行过滤或离心分离而得到滤渣的工序；(S3)提取上述滤渣，从而配制含有多糖类的溶液的工序；(S4)往上述含有多糖类的溶液中添加淀粉水解酶，从而去除淀粉的工序；(S5)在上述(S4)工序后对多糖类进行沉淀的工序；及(S6)在上述(S5)工序后对多糖类进行精制的工序。2.根据权利要求1所述的由印尼莪术分离的多糖类的制造方法，其特征在于，上述(S3)工序的提取使用热水、酸溶液或者碱溶液。3.根据权利要求2所述的由印尼莪术分离的多糖类的制造方法，其特征在于，上述碱溶液为0.00510N的NaOH溶液。4.根据权利要求2所述的由印尼莪术分离的多糖类的制造方法，其特征在于，上述酸溶液为0.00510N的HC1溶液。5.根据权利要求1所述的由印尼莪术分离的多糖类的制造方法，其特征在于，上述(S5)工序为在(S4)工序后添加低级醇的工序。6.根据权利要求1所述的由印尼莪术分离的多糖类的制造方法，其特征在于，上述(S6)工序为通过透析或者超滤去除低分子成分的工序。7.—种由印尼莪术分离的多糖类，其是通过权利要求16中任意一项所述的制造方法得到。8.—种药物组合物，其特征在于，作为有效成分而含有权利要求7的多糖类。9.一种抗癌辅助剂组合物，其特征在于，作为有效成分而含有权利要求7的多糖类。10.—种免疫增强剂组合物，其特征在于，作为有效成分而含有权利要求7的多糖类。全文摘要本法明提供一种多糖类的制造方法、由该制造方法得到的多糖类、以及作为有效成分而含有该多糖类的药物组合物，所述多糖类的制造方法包括(S1)准备印尼莪术根的粉末的工序；(S2)用有机溶剂提取上述粉末后，进行过滤或离心分离而得到滤渣的工序；(S3)提取上述滤渣，从而配制含有多糖类的溶液的工序；(S4)往上述含有多糖类的溶液中添加淀粉水解酶，从而去除淀粉的工序；(S5)在上述(S4)工序后对多糖类进行沉淀的工序；及(S6)在上述(S5)工序后对多糖类进行精制的工序。本发明的多糖类能够活化巨噬细胞，可极其有效地应用于包括癌的有关免疫性疾病的预防、治疗以及用于治疗后的免疫增强的药品以及功能性食品中。文档编号C08B37/00GK101238152SQ200680029059公开日2008年8月6日申请日期2006年6月14日优先权日2005年6月14日发明者孙钟熙,李仙姬,秋政翰,金我真,韩奎利,黄在宽申请人:黄在宽