专利名称：制备聚环氧烷羧酸的高效方法
技术领域：
本发明涉及制备高纯度的活化的聚环氧烷酸(polyalkylene oxide acid)和 酯的改良的和更有效的方法。
背景技术：
水溶性聚环氧烷(polyalkylene oxide) ("PAO")与治疗部分(如蛋白和多肽) 的结合是已知的。参见例如美国专利4,179,337,其公开内容在此引用作为参 考。'337专利公开了用PEG修饰的生理学活性的多肽延长了在体内循环的 周期，该多肽具有降^f氐的免疫原性和抗原性。
为了使PAO与其它化合物结合，首先必须将聚合物的羟基末端转化为 活性官能团。该过程通常称作"活化"，且产物称作活化的聚环氧烷或活化的 PAO。
对于大多数，研究已经涉及将PAO与蛋白质、酶和多肽的s氨基共价 连接。PAO与赖氨酸氨基的共价连接受连接基团的影响，如琥珀酰基-N-羟 基琥珀酰亚胺酯(如Abuchowski等人，Cancer Biochem. Biophys" 7， 175-86 (1984))、氮杂内酯、亚氨酸芳基酯(aryl imidates)和环状酰亚胺硫酮(cyclic imide thiones)。例如，参见美国专利5,298,643、 5,321,095和5,349,001。每 篇上述专利的内容在此引用作为参考。PAO也已经用肼基活化，从而将聚合 物偶联至活化的碳水化合物基团。
而且，已经报导了 PAO (如聚乙二醇("PEG"))的末端羟基向羧酸的转 化。PEG-酸至少可以用于两个方面。第一，羧酸衍生物可以直4妄用于通过可 用的羟基或氨基部分结合亲核物质。第二， PEG羧酸可以用作中间体以形成 其它类型的活化的聚合物。例如mPEG羧酸可以通过N-羟基琥珀酰亚胺和 缩合剂(如二异丙基碳二亚胺)转化为琥珀酰亚胺基酯衍生物。其它活化的 PAO可以通过活性酯与肼反应制备PAO-酰肼衍生物。
共有(co-owned)的美国专利5,605,976 ('976专利)在此引用作为参考，解 决了许多以前在制备聚环氧烷羧酸(polyalkylene oxide carboxylic acid)中的困
难。该'976专利教导了制备PAO羧酸的方法，该方法通过在;成存在下使 PAO(即PAO-OH)与卣代乙酸叔烷基酯反应，形成PAO的叔烷基酯，然后将 PAO叔烷基酯与酸反应形成所需的聚环氧烷羧酸。
开发了'976专利的方法后，需要进一步的改善。例如，随着NMR仪器 的改善，批量的PEG-酸仍含有 5。/。 PEG-OH杂质变得明显起来。而且，检 测到含原始PEG-OH的污染水平随聚合物分子量，且随二取代的和支链PEG 聚合物的使用趋于增加。而且，该'976专利所教导的方法需要至少18小时 的反应时间，以及需要反应溶剂的回流和旋转蒸发。
由于至少上述原因，本领域中仍然长期需求更快速的方法，且由此更经 济的制备PAO羧酸的方法，而且需要制备具有更高纯度的PAO酸和中间体 的方法，而不含任何可检测的PAO-OH污染物。本发明解决了这些需求。
发明概述
一方面，本发明包括以高纯度制备聚环氧烷羧酸和其相关中间体的方 法。所述方法包括首先制备聚环氧烷的叔烷基酯，然后转化为其羧酸衍生物。 聚环氧烷的叔烷基酯通过下述步骤制备
(a) 在第一溶剂体系中，使聚环氧烷与碱反应，反应时间约IO分钟至 约60分钟；和
(b) 在第二溶剂体系中，使步骤(a)的产物与卣代乙酸叔烷基酯反应， 反应时间小于约30分钟。步骤(a)和(b)的反应在约10 。C至约35 。C的温度下 进行。
然后通过聚环氧烷的叔烷基酯与酸反应，将所得的聚环氧烷的叔烷基酯 转化为相应的羧酸，形成聚环氧烷羧酸。该方法以高产率和高纯度有利地提 供了产物。
在本发明的范围内，优选的聚环氧烷包括聚乙二醇和co-曱氧基-聚乙二 醇。优选的卣代乙酸叔烷基酯包括溴代-或氯代-乙酸叔丁基酯以及其它卣代 乙酸的叔醇酯。该方法中所用的优选的碱包括，例如叔丁醇钾、丁基锂等。 该方法使用金属叔丁醇化物在醇(如叔丁醇或)或在其它惰性溶剂(如曱苯)中 进行。
本发明的方法可以使用大约等摩尔比的卤代乙酸叔烷基酯与聚环氧烷 进行。然而优选地，卣代乙酸7J5l烷基酯以大于聚环氧烷的摩尔量存在。本发明的另 一方面中，提供了制备高纯度CX和/或CO取代的聚环氧烷的
方法，所述a和/或co取代的聚环氧烷如PEG-肼、PEG-酰胺和PEG-酯，其 包括琥珀酰亚胺基、曱基和乙基酯。这些方面包括将上述聚环氧烷羧酸转化 为所需的末端被取代的聚合物。
本发明的另 一个方面中，公开了制备聚环氧烷-生物学活性的亲核体结 合物的方法。本发明的该方面中，聚环氧烷羧酸与生物学活性的亲核体反应， 从而在聚合物和生物学活性亲核体之间形成酯连接。例如，在本发明的该方 面中，可以使用双-活化的PEG制备紫杉醇-2， PEG-单酯和20-喜树碱 (campthothecin) PEG-酉旨或二酯。
本发明的一个主要优点为即使与最近开发的技术相比，所得到的聚环 氧烷羧酸是以高纯度制备的。因此，没有发现可观察的量的产品污染，即起 始物质，如m-PEG-OH,即优选发现的量小于约2%，且优选小于1%,且最 优选小于0.5%。结果，不需要从起始醇分离所需的羧酸衍生物。而且，不 需要冗长的离子交换或反相HPLC技术以得到所需的羧酸衍生物。
图1为对应于实施例1的NMR图谱。
图2为对应于比较实施例4的NMR图镨。
发明详述
本发明提供了制备聚环氧烷羧酸和合成中间体(如聚环氧烷的叔烷基酉旨) 的改进的方法。总体来说，PAO羧酸通过在适合的碱中使PAO(即PAO-OH) 与适合的囟代乙酸叔烷基酯反应，得到PAO叔烷基酯，然后使PAO叔烷基 酯与酸反应得到PAO羧酸。上述方法在回流下反应，然后旋转干燥以从溶 剂体系中分离产物。现在发现这些方法步骤都使PAO叔烷基酯部分地恢复 为起始物料，即再形成PAO-醇。该逆反应产生不希望的杂质，如高分子量 的PEG杂质和具有不同连接的PEG-药物结合物(cojugate)，从而导致更慢和 效率更4氏的反应方法。
因此，与上述制备PAO酯和酸的方法相反，出人意料的发现当在碱存 在下，在最低实际温度范围和最低有效浓度的碱下进行反应时得到了改善。 反应温度的下限根据反应试剂和产物在所选溶剂体系中的沉淀点设定。下面
进一步详细说明本发明。
1.聚合物取代基和聚环氧烷
本发明的羧酸衍生物优选由室温下水溶性的聚(环氧烷)(PAO's)制备，例 如聚乙二醇。co-取代的聚环氧烷衍生物，如曱氧基聚(乙二醇)(mPEG-OH) 在这些基团的范围中。其它适合的烷基-取代的PAO衍生物包括含有那些单-末端d-C4基团的衍生物。在一个实施方案中，优选直链的非-抗原性 (non-antigenic)聚合物，如单曱基PEG均聚物。在其它实施方案中，优选使 用支链聚合物或"U-PEGs"，取决于与聚合物结合的试剂或药物的性质。或者， 也可使用聚环氧烷，如其它聚(乙二醇)均聚物、其它的烷基-聚(乙二醇)嵌段 共聚物，和聚(环氧烷)的嵌段共聚物的共聚物。本发明的聚合物的分子量为 约200至约100,000道尔顿，且优选为约2,000至约80,000道尔顿。然而最 优选为约4,000至约50,000道尔顿。
为了说明而不是为了限制，聚乙二醇(PEG)残基可以为下述基团的 一种
Me-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-0-
Me-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-S-
-0-CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CHrO-,和
-S-CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-S-。
聚合物的聚合度表示在聚合物链中重复单元的数目，且依赖于聚合物的 分子量。虽然，基本上非-抗原性聚合物，PAO's和PEG'S可以基本上在重均 分子量中变化，但优选在本发明的大多数方面中，R,的重均分子量为约200 至约100,000道尔顿。更优选地，基本上为非-抗原性聚合物的重均分子量为 约2,000至约48,000道尔顿。
PEG也可以为"星状-PEG"或多臂PEG，如在NOF Corp. Drug Delivery System catalog, 2005中所公开的那些，其公开内容在此引用作为参考。尤其 是，PEG可以为下式
<formula>formula see original document page 7</formula>
或
)、0、
CH2CH2_(0CH2CH2)「O
卜o、
CH2CH2—(OCH2CH2)j-
-0
Q—(CH2CH20)j—CH2CH
-"
、(CH2CH20)j—CH2CH2-0'
其中
j为约10至约340的整数，使得优选纟是供具有约12,000至约40，000总 分子量的聚合物；且该残基的至少l个但至多3个末端被甲基或其它低级烷 基封端(capped)。转化为C02H衍生物之前的这些化合物包括
H3c、(0CH2CH2)j\■0.
H3C、(OCH2CH2)f"
O
O、
,(CH2CH20)r
、CH,CH,
—OH
■(CH2CH20)
(OCH2CH2)j、0
H3C (OCH2CH2)fO
"CH2CH20)j O
O
、CH2CH2、oh
(C 、CH2CH2\
OH
-(OCH2CH2)j\0
<formula>formula see original document page 8</formula> <formula>formula see original document page 9</formula>
本发明的范围内也考虑了其它具有末端C02H的PEG-基化合物的形成， 包括共同转让(commonly assigned)的美国专利5,605,976、 5,643,575 、 5,919,455
和6,113,906中所述的支链聚合物残基，其公开内容在此引用作为参考。一 些对应于式I的具体聚合物的代表性例子包括 (2a)
<formula>formula see original document page 10</formula>(2b)
<formula>formula see original document page 10</formula>
和
(2c)
<formula>formula see original document page 10</formula>
其中
、L2和L3独立地选自双功能连接基且或者L2可以为支《连连接基基团， 如二氨基烷基或赖氨酸残基。参见，例如，上述美国专利6,113,906;且 z为1至约120的整数。
对于普通技术人员，双功能连接基团是已知的。因此，Lw部分可以独 立地选自双功能连接基团，如下述非限制性化合物中的一个
-NH(CH2CH20)y(CH2)qNR9-，
-NH(CH2CH20)yC(0)-,
-NH(CF^oRn)qOC(0)-,
-C(O)(CR10R")qNHC(O)(CR13R12)qNR9-,
-C(。)。(CH2)qO-，
-C(O)(CR10R")qNR9- -C(0)NH(CH2CH20)y(CH2)qNR9-, -C(0)CT(CH2CH20)yNR9-,
-C(O)O(CR10R")qO-， -C(0)NH(CH2CH20)y-,
隱MH(CF^n)q
<CR13R12)tOC(0)-
和
-NH(CR10R")q-^ >~~(CR13R12)tNR9C(0)-
其中
119.13独立地选自d.6烷基等，且优选为H或CH3;
Ri4选自与定义R^3的基团一样的基团，以及N02、 d，6卤代-烷基和卤
素；
q、 t和y每个独立地选自1至约12的正整lt。
本发明的方法还可以用下列物质进行其它的聚合物质如葡聚糖或其它 相似的能够被官能化或活化为单-或二-羧酸的非-免疫原性聚合物，如葡聚 糖、聚乙烯醇、糖-基的聚合物、羟基丙基-曱基丙烯酰胺(HPMA)、聚环氧 烷和/或其共聚物。也参见共同转让的美国专利6,153,655，其内容在此引用 作为参考。上述列表仅为说明性的，且不是为了限制适合在本文中使用的非 -抗原性聚合物的种类。
2.叔烷基酯衍生物的合成
本发明用于制备聚环氧烷羧酸的方法包括首先通过下述方法制备PAO 的叔烷基酯衍生物
(a) 在第一溶剂体系中，使聚环氧烷与石咸反应，反应时间为约IO分钟至 约60分钟，或更优选时间为约20分钟至约40分钟，
(b) 在第二溶剂体系中，使步骤(a)的产物与卣代乙酸叔烷基酯反应，反 应时间小于30分钟，如从约1分钟至约30分钟，或更优选时间为约1分钟
至约15分钟，得到PAO叔烷基酯。
所述溶剂体系优选从步骤(a)至步骤(b)保持相同，如同温度一样，温度 优选为约10。C至约35。C，或更优选为约20至约31 。C。因此第一和第二溶 剂体系通常是相同的。为了使PAO叔烷基酯的逆反应最小化，PAO在溶剂 体系中必须足够稀。PAO与溶剂体系的比例优选为约1 g的PAO比约10-25 ml或更多的溶剂体系。更优选地，PAO与溶剂体系的比例为约1 g的PAO 比约15 ml的溶剂体系。
可以使用任何合适的本领域已知的方法，如通过向溶剂体系加入可混溶 的溶剂，该溶剂对于反应产物是相对不溶的，和/或通过降低溶剂体系的温度， 从溶剂体系中沉淀PAO叔烷基酯反应产物。收集沉淀物，用适合的非溶解 性溶剂洗涤一次或多次，且进一步纯化，如通过重结晶。
溶剂体系可以为任何合适的本领域已知的溶剂或所选溶剂的混合物，从
而使反应物和反应产物含于溶液中。在某些优选实施方案中，选择溶剂体系 以避免在低温时反应物和反应产物沉淀。如下所示，所述溶剂体系包括曱苯， 如100%曱苯，且沉淀剂为乙醚。在替代实施方案中，所述溶剂体系任选包 括浓度范围99%至5%的曱苯，与一种或多种其它相容的溶剂(如二氯曱烷和 /或二氯乙烯)混合。
所述碱选自叔丁醇钾、叔丁醇钠、丁基锂、氨基钠、氢化钠及其组合。 适合的卣代乙酸-，又烷基酯为下式化合物
<formula>formula see original document page 12</formula>其中X为氯、溴或碘；
RL3独立地选自d.8烷基、被取代的烷基或支链烷基、芳基如苯基或取 代的苯基。
优选的卣代乙酸叔丁基酯包括溴代乙酸叔丁基酯、氯代乙酸叔丁基酯、 和碘代乙酸叔丁基酯。这些囟代乙酸叔丁基酯可购自，例如Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo。或者，可以使用三苯曱基酯或取代的芳基酯。
3.羧酸衍生物的合成 为了制备PAO羧酸，然后在适合的溶剂体系中，在合适的酸的存在下， 将所得PAO叔烷基酯进行反应，得到PAO羧酸。所述用于酸化反应的溶剂 体系示例性的如二氯曱烷，虽然也任选使用其它合适的本领域已知的溶剂， 如氯仿或二氯乙烷。所述酸为任何有效产生所需PAO羧酸的本领域已知的 酸，包括，例如三氟乙酸、硫酸、磷酸和盐酸。三氟乙酸为示例性的，且在 本发明的 一些方面中是优选的。
制备本发明PAO羧酸的第一步骤包括形成中间体聚环氧烷羧酸的叔丁 基酯。该中间体通过在石威存在下，使PAO与上述卣代乙酸4又丁基酯反应形 成。优选的碱为叔丁醇钾，虽然也可以使用例如丁基锂、氨基钠或氢化钠的 替代物。本文所述的方法中使用的这些碱可以为固体形式，或更优选溶解在 适合的溶剂中，如叔丁醇、苯、曱苯、四氢呋喃(THF)、 二曱基曱酰胺(DMF)、 二曱亚砜(DMSO)、己烷等。
为了形成中间体，聚环氧烷与卣代乙酸^k丁基酯反应，二者的量为大约 摩尔比为约1:1至约1:10。然而优选地，卣^乙酸^又丁基酯以摩尔比约1:8 存在。而且，碱与聚环氧烷的摩尔比范围为约1:1至约1:2。
一旦形成叔丁基酯中间体后，可以容易地得到聚环氧烷的羧酸衍生物， 且其纯度超过92%，优选超过97%,更优选超过99%，且最优选超过99.5% 的纯度。因此，污染物，尤其是对于起始物料，如mPEG-OH或PEG 二醇 仅是痕量的。在本发明优选的方面中，当制备单或二-聚乙二醇羧酸时，通 过"CNMR检测，在终产物中起始物料污染物的量小于1%。
在本发明的该方面中，叔丁基酯中间体与至少等量的酸(如三氟乙酸)反 应以提供PAO的末端被取代的羧酸。或者，可以使用稀盐酸(即约1N)、硫 酸、磷酸等。过量使技术人员将叔丁基酯中间体转化为所需羧酸衍生物，并 消除了 PEG或相关起始聚合物料的缓冲能力。与酸反应的温度不如与石成反 应的温度严格，且与酸的反应通常在环境温度，如约18至约30。C的温度下 进行。
在保证中间体向最终酸衍生物转化足够的时间后(可为约2-3小时)，得 到所需的单-或二-羧酸衍生物。然而反应时间在一定程度上将根据具体的反 应物和反应条件而改变。中间体转化为最终所需羧酸后，使用例如本领域普 通技术人员已知的技术(如旋转蒸发等)通过蒸馏除去溶剂，即二氯曱烷。所 得残余物从下述溶剂中重结晶得到最终产物，所述溶剂为二氯曱烷/乙醚、2-
丙醇、二曱基曱酰胺/2-丙醇、甲苯/乙醚或曱苯/己烷。
完成该新颖的方法后，因为本文所述的方法以非常高的纯度(即优选大
于99。/。)提供了所需的羧酸，所以不需要额外的通过常规方法的纯化，因此
当需要药物级聚合物时，对于技术人员本发明明显节约了时间、劳动力和物料。
4. 其它a和/或Q末端部分
本发明的其它方面，可以使用单-或二-羧酸衍生物以形成其它活化的聚 环氧烷。例如，末端羧S吏基团可以转化为
I. 能够与氨基反应的官能团，如
a) 琥珀酰亚胺基酯；
b) 羰基咪唑；
c) 氮杂内酯；
d) 环状酰亚胺石克酮(cyclic imide thiones);
e) 异氰酸或异錄b氰酸；或
f) 醛
II. 能够与羧酸基团和反应性的羰基反应的官能团，如肼或酰肼官能 团，如酰基酰肼(acyl hydrazide)、肼基曱酸酯(carbazates)、肼基 半曱酸酉旨(semicarbazates)、肼基硫代曱酸酯(thiocarbazates)等。
使用本领域技术普通人员已知的技术而不用过度的实验可以将 PEG-C02H转化为多种其它离去基团。在相关文献中已经报道了转化反应。
末端活化基团也可以包括位于聚环氧烷附近的间隔部分。间隔部分可以 为杂烷基、烷氧基、含有最多18个碳原子的烷基或甚至其它聚合物链。可 以使用标准合成技术加入间隔部分。
5. 羧酸衍生物的转化
聚合物羧酸衍生物也作为高纯度的中间体，用于形成其它聚环氧烷衍生 物。例如，可以从PAO羧酸活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯使用标准技术通过 与适合的反应物(酰胺、肼等)缩合形成高纯度的酰胺、酰肼、其它酯等。
或者，通过使羧酸与二环己基碳二亚胺(DCC)或二异丙基碳二亚胺在碱 存在下反应，可以将羧酸衍生物转化为琥珀酰亚胺基酯。
这些随后的转化反应对于本领域技术普通人员来说基本上是已知的标
准技术。本发明特征的一个重要方面是中间体，如PEG-羧酸是基本上纯的 (99+%),且由此保证了基本上纯的最终产物。
6.适于结合的生物学活性物质
与羧酸衍生物结合的亲核体被称为"生物学活性"。然而，该术语并不限 于生理学或药理学活性。例如， 一些亲核体结合物，如那些含有酶的亲核体 结合物，能够在有机溶剂中催化反应。同样， 一些发明的聚合物结合物也可 用于实验室诊断。所有的结合物的关键特征是保持了至少部分的与未修饰的 生物学活性物质相关的活性。
关于本发明的一个方面，C02H-PEG书f生物与亲核体反应，该亲核体具 有可用的羟基部分能够经历取代反应而不损失生物学活性，其与聚合物的羧 酸衍生物，如高纯度的PEG-COOH，在足以引起形成两个取代基之间的酯
为限制，本发明的前药通常通过下述步骤制备
1) 如本文制备，提供活化的聚合物，如PEG-酸或PEG-二酸，和生物 学活性化合物，该化合物上具有形成可水解连接(linkage)的位置，和
2) 使2个取代基在惰性溶剂中，如二氯曱烷、氯仿、曱苯或DMF中， 在偶联试剂和碱存在下在0°C至高达22。C(室温)下进行反应，所述偶联试剂 如1,3-二异丙基-碳二亚胺(DIPC)、 1，(3-二曱基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺 (EDC)、任何适合的二烷基碳二亚胺、Mukaiyama试剂(如2-卣代-l-烷基-口比 咬错卣化物)或丙烷磷酸环酐(propane phosphonic acid cyclic anhydride) (PPACA)等，这些偶联试剂购自，例如Sigma Chemical,或使用已知技术合 成，且所述碱如二曱基氨基吡啶(优选的)、二异丙基乙基胺、吡啶、三乙胺 等。
可以与本文制备的聚合物结合的化合物的示例性例子如下所示 <formula>formula see original document page 16</formula>紫杉醇
<formula>formula see original document page 16</formula>7
<formula>formula see original document page 16</formula>-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)
托泊替康
和任何数量的本领域普通技术人员已知的小分子，所述小分子具有与本文所
述的活化的聚合物结合的-OH基团。当多于1个OH可用于结合时，需要使
用本领域已知的保护或去保护技术得到适合地净皮保护的化合物。
在本发明的另一方面中，当羧酸已经转化为其它末端官能团，如琥珀酰 亚胺基酯时，通过使聚合物与含有可用氨基的生物学活性亲核体反应实现活
化的聚合物与所需的亲核体的结合。也参见，例如美国专利5,122,614，其公 开内容在此引用作为参考。相似地，当使用其它连接基团(如部分3中所述 的那些基团)时，可以通过使所需的活化的聚合物与含有所需的目标连接基 团(即丽2、 COOH等)的生物学活性物质反应制备PAO-结合物。应该理解选 择用于完成这些结合反应的条件使得保持结合物的最佳的生物学活性。
所述结合物(conjugate)是生物学活性的且具有多种治疗应用。需要治疗 (包括生物学活性物质)的哺乳动物可以通过给药有效量的含有所需生物活 性物质的聚合物结合物治疗。例如，可以向需要酶替代疗法或血液因子的哺
乳动物给予含有所需物质的聚合物结合物。这些结合物的剂量为足以实现所 需治疗结果的量，且根据临床经验对于普通技术人员是显而易见的。
本发明关注的生物学活性亲核物质包括，但不限于，蛋白、肽、多肽、 酶、天然和合成的有机分子，如药物化学物等。
所关注的酶包括碳水化合物-特异性的酶、蛋白水解酶、氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。不限制在具体的酶中，所关注 的酶的实例包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、酰苦脱氨酶、超氧
化物歧化酶、内毒素酶(endotoxinases)、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂肪酶、 尿酸酶、酰苦二磷酸酶、酪氨酸酶和胆红素氧化酶。所关注的碳水化合物-特异性酶包括葡萄糖氧化酶、糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖脑苦脂酶、葡糖 芬酸酵(glucouronidases)等。
所关注的蛋白、多肽和肽包括，但不限于血红蛋白、血清蛋白，如血液 因子，包括因子VII、 VIII和IX;免疫球蛋白、细胞因子如白介素，a-、 (3-和y-干扰素、集落刺激因子包括粒细胞集落刺激因子、血小板衍生的生长因 子和磷脂酶-活化的蛋白(PLAP)。 一般生物学或治疗所关注的其它蛋白质包 括胰岛素、植物蛋白如外源凝集素和蓖麻毒素、肿瘤坏死因子、生长因子、 组织生长因子、TGFa's或TGF(3's和表皮生长因子、激素、生长调节素、促 红细胞生成素、色素激素(pigmentary hormones)、 下丘脑释放因子 (hypothalamic eleasing factors)、血管升压素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、 促卵泡成熟激素、促曱状腺激素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂等。所关注的 免疫球蛋白包括IgG、 IgE、 IgM、 IgA、 IgD及其片段。
一些蛋白质如白介素、干扰素和集落刺激因子通常由于使用重组技术也 以非糖基化(non-glycosylated)形式存在。非糖基化形式也在本发明的生物学 活性的亲核物质中。
的任何部分。其包括氨基酸序列、翻译部分等、抗体片段、单链抗原结合蛋 白(参见例如，美国专利4,946,778,其公开内容在此引用作为参考)、结合 分子，其包括抗体或片段的融合、多克隆抗体、单克隆抗体、催化抗体、核 香酸和寡核普酸。
蛋白质或其部分可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术制备或 分离，例如组织培养、从动物源提取或通过重组DNA方法。也考虑转基因
源的蛋白质、多肽、氨基酸序列等。这些物质从转基因动物(即，小鼠、猪、 牛等)得到，其中所述蛋白在奶、血或组织中表达。转基因昆虫和杆状病毒
表达体系也考虑作为来源。然而，突变体形式的蛋白质，如突变TNFs和突
变干扰素也在本领域的范围内。
所关注的其它蛋白为变应原蛋白，如豕草属、抗原E、蜜蜂毒液、螨变 应源等。
有用的生物学活性亲核物质不限于蛋白和肽。基本上任何生物学活性的 化合物都包括在本发明的领域中。包括化疗分子，如药物化合物，即抗肺瘤 剂、心血管试剂、抗瘤形成剂、抗感染药、抗焦虑药、胃肠试剂、中枢神经 系统-活化试剂、镇痛药、致育或避孕因子、抗炎因子、甾体试剂、anti-urecemic agents、心血管试剂、血管扩张剂、血管收缩剂等。在本发明的优选方面中， 在聚合物与化疗部分酯连接的条件下，使羧酸衍生物进行反应。尤其优选的 生物学活性亲核物质包括紫杉醇、紫杉烷、多西紫杉醇、喜树碱、鬼臼毒素、 血红蛋白、葡糖脑苷脂酶、半乳糖苷酶、精氨酸酶、天门冬酰胺酶、精氨酸 脱氨酶和超氧化物歧化酶。
上述是适合与本发明的聚合物结合的生物学活性亲核物质的示例。应该
也包括在本发明的范围内。 实施例
下述非限制性实施例说明了一些本发明的方面。除另有说明，所有份和 百分比均基于重量，且所有温度均为摄氏度。
30K m-PEG -OH
t-BuOK
曱苯
30K
m國PEG -0- K+
Brt-BuOAc
m-PEG 3吸-0—CH2,、0
CHATFA
<formula>formula see original document page 19</formula>
实施例1<formula>formula see original document page 20</formula>
参见图1，将31g(1.03摩尔)的m-PEG"K-OH(化合物l)在600 ml曱苯 中的溶液共沸移除130ml馏出物。然后将反应混合物冷却至30°C,然后加 入2.1 ml (2.07毫摩尔)的1.0摩尔叔丁醇钾的叔丁醇溶液。所得混合物在 30° C下搅拌10-60分钟(得到化合物2),然后加入1.6g(8.3摩尔)的溴代乙 酸叔丁基酯。在30。C下，搅拌所得混浊混合物1小时。用乙醚将产物(化 合物3)从反应混合物中沉淀，然后通过过滤收集，并用额外的乙醚洗涤。从 12%的DMF/IPA中重结晶得到27.8g (产率90%)粗产物。通过"CNMR确证 产物，纯度>99°/。，因为在60.5ppm处没有发现PEG-OH的峰。参见图1。
13C画R (75.4 MHz, CDC13) 5 169.07, 81.01, 71.54-68.62(PEG), 58.65， 27.82。
实施例2 m-PEG 3QK酸4
将8.7g (0.13毫摩尔)的m-PEG皿酉旨(化合物3)在90 ml 二氯曱烷和45 ml的TFA中的溶液在室温下搅拌3小时，然后通过旋转蒸发除去部分溶剂， 并用乙醚沉淀产物。通过过滤收集固体，然后用乙醚洗涤几次，从12%的 DMF/IPA中重结晶，然后干燥到8.2g(产率94。/。)产物(化合物4)。通过13C NMR确证产物，纯度>99%。
13C薩R (75.4 MHz, CDC13) S 170.卯，71.54-68.18(PEG), 58.65。
实施例3
紫杉醇-2，mPEG皿单酯制备
共沸来自实施例2的mPEG 30,000 S交(3750 mg， 0.125 mmol,化合物4)， 然后在室温下溶解于20 ml无水二氯曱烷中。在0。 C下，用1,3-二异丙基-碳二亚胺(26pl， 0.17 mmol), 4-二曱基氨基。比咬(32 mg， 0.26 mmol)和紫杉醇 (146 mg， 0.17 mmol)处理上述溶液。30分钟后，将反应溶液温热至室温，并 在该温度下保持16小时。然用用0.1N的HC1洗涤反应混合物，干燥并蒸发 得到白色固体，将该固体从2-丙醇中结晶得到3000 mg (产率80%)的纯产物
5。
比專交实施例4
对于制备m-PEG"K酯的实施例1的方法，在一部分合成中进行如下改 变。形成化合物2后，力口入1.6g(8.3摩尔)溴代乙酸叔丁基酯，加热所得的 混浊混合物6至回流，然后除去加热，然后在室温下搅拌18小时(制备化合 物7)。这是为了与在30° C下搅拌所得混浊混合物1小时相对比。通过13C NMR确证产物，纯度仅为约60%，而不是上述的纯度>99%，因为所用检测 峰的仪器明显更灵敏且在61.18 ppm处有明显的PEG-OH峰。见图2。注意， 在200.26未知峰处发现杂质。
13C NMR (75,4mHz, CDC13) 5 200.26， 169.00, 80.95, 74.00-68.00 (PEG), 63.00,未知杂质，61.18 (起始物质-PEG-OH)， 58.60， 27.77。
实施例5
m一PEG孤RNL 8a醛9
m-PEG30K RNL 8a连接基方案
m-PEG30K RNL 8a连接基
<formula>formula see original document page 21</formula>
在冰浴中，将10.0g(0.33毫摩尔)的m-PEG 3ok酸8、 0.15g (1.0毫摩 尔)的3，5-二曱基-4-羟基苯曱醛和0.15g (1.24毫摩尔)的DMAP在90 ml无水 二氯曱烷中的溶液冷却至0。C,然后加入0.19g(1.0毫摩尔)的EDC盐酸盐。 将混合物温热至室温，过夜。这时，通过旋转蒸发除去部分溶剂，用乙醚沉 淀产物，然后收集并用乙醚洗涤。粗产物从12%的DMF/IPA中重结晶得到 9.4g (产率94%)。
13C画R (75.4 MHz, CDC13) S 190.80， 167.26， 152.01, 133.74, 131.02， 129.74， 71.57画67.83(PEG), 58.68， 16.19。
实施例6
m-PEG皿RNL 8a醇10
将4.8g(0.16毫摩尔)的m-PEG3吸RNL8a醛9在63ml无水曱醇中的 溶液冷却至15°C,然后加入O.Olg (0.25毫摩尔)硼氢化钠。在15-20。C下搅 拌混合物2小时，然后用1N的HC1调节pH至6.5。通过旋转蒸发移除曱醇， 然后残余物溶于水中。用0.5N的HCl将pH降低至2.0,并用二氯曱烷从水 中萃取产物。萃取物用无水硫酸钠干燥，过滤，然后通过旋转蒸发除去部分 溶剂。产物用乙醚沉淀，通过过滤收集，然后用乙醚洗涤得到4.6g (产率96%) 的产物。
13C丽R (75.4 MHz, CDC13) S 167.76， 146.25, 138,68, 129.42, 126.67， 71.55-67.87(PEG), 63.86， 58.65， 16.11。
实施例7
m-PEG 3QK RNL 8a连接剂11
将1.8g (0.06毫摩尔)的m-PEG 3°K RNL 8a醇10在18ml二氯曱烷和 l.8ml的DMF的混合物中的溶液冷却至0°C,然后加入O.Ug (0.48毫摩尔) 的DSC和0.33g (0.43毫摩尔)吡啶。将混合物温热至室温过夜。这时，通过 旋转蒸发除去部分溶剂，用乙醚沉淀产物，然后收集并用乙醚洗涤。从12% 的DMF/IPA中重结晶得到1.6 (产率88%)粗产物。
13C画R (75.4 MHz， CDC13) S 168.14， 167.59， 151.03， 147.76， 130.53, 130.27, 128.50, 72.97-67.83(PEG), 58.67， 25.17, 16.11。
最终产物能用于与任何多种生物学活性多肽、酶、蛋白、小分子等结合, 所述生物学活性多肽、酶、蛋白、小分子等具有用于结合的可用的胺或羟基。
对于这些结合反应的方法描述于例如在共同转让的美国专利6,180,095或 Greenwald等人J. Med. Chem. 1999 Vol. 42, No. 18, 3657-3667中所述的方 法，每篇内容在此引用作为参考。
权利要求
1.制备聚环氧烷的叔烷基酯的方法，该方法包括(a)在第一溶剂体系中，使聚环氧烷与碱反应，反应时间为约10分钟至约60分钟；和(b)在第二溶剂体系中，使步骤(a)的产物与卤代乙酸叔烷基酯反应，反应时间小于约30分钟；其中在约10℃至约35℃的温度下进行步骤(a)和(b)的反应。
2. 制备聚环氧烷羧酸的方法，该方法包括将权利要求1的聚环氧烷的 叔烷基酯与S吏反应形成聚环氧烷羧酸。
3. 权利要求l的方法，其中所述聚环氧烷为聚乙二醇。
4. 权利要求1的方法，该方法还包括从第二溶剂体系中分离所得的聚 环氧烷的叔烷基酯。
5. 权利要求3的方法，其中所述聚乙二醇为co-曱氧基聚乙二醇。
6. 权利要求l的方法，其中所述卤代乙酸叔烷基酯包括下式物质<formula>formula see original document page 2</formula>其中X为氯、溴或碘；RL3独立地选自d.8烷基、被取代的CL8烷基或CL8支链烷基和芳基。
7. 权利要求6的方法，其中所述卤代乙酸叔烷基酯为卤代乙酸叔丁基酯。
8. 权利要求1的方法，其中所述卤代乙酸叔丁基酯为溴代乙酸叔丁基 酯或氯代乙酸叔丁基酯。
9. 权利要求1的方法，其中所述聚环氧烷与碱的摩尔比的范围为1:1至 约1:2。
10. 权利要求l的方法，其中所述碱选自叔丁醇钾、丁基锂、氨基钠、 氢化钠及其组合。
11. 权利要求10的方法，其中所述碱为叔丁醇钾。
12. 权利要求2的方法，其中所述酸选自三氟乙酸、硫酸、磷酸和盐酸。
13. 权利要求2的方法，其中所述酸为三氟乙酸。
14. 权利要求1的方法，其中所述步骤(a)的反应进行约20分钟至40 分钟。
15. 权利要求1的方法，其中所述溶剂体系包括甲苯，且步骤(a)和(b) 的反应在约25至约31 。C的温度下进行。
16. 权利要求l的方法，其中所述溶剂体系包括曱苯和二氯曱烷，且步 骤(a)和(b)的反应在约20至约31 。C温度下进行。
17. 权利要求2的方法，其中所述反应在约18至约30。C温度下进行。
18. 权利要求l的方法，其中聚环氧烷与溶剂体系的比例为lg聚环氧 烷比约15至约25 ml的溶剂体系。
19. 权利要求1的方法，其中所述聚环氧烷的分子量为约200至约 100,000。
20. 权利要求19的方法，其中所述聚环氧烷的分子量为约2,000至约 80,000。
21. 权利要求19的方法，其中所述聚环氧烷的分子量为约4,000至约 50,000。
22. 权利要求2的方法，其中通过"C NMR检测，制备的聚环氧烷羧 酸的纯度大于99%。
23. 权利要求l的方法，其中所述聚环氧烷为直链或支链。
全文摘要
本发明提供了制备聚环氧烷的叔烷基酯的新颖的方法。所述新方法使用更温和的条件，从而避免了至起始的聚环氧烷的逆反应。然后聚环氧烷的叔烷基酯与适合的酸反应，得到聚环氧烷酸。
文档编号C08F255/06GK101356203SQ200680050851
公开日2009年1月28日 申请日期2006年12月28日 优先权日2006年1月10日
发明者安东尼·J·马丁内斯, 洪 赵 申请人:安佐制药股份有限公司