专利名称：用于血管栓塞材料的温敏性MPC－b－NIPAM二嵌段星型共聚物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于血管栓塞材料的温敏性MPC-b-NIPAM二嵌段星型共聚物及制备方法和应用，属于生物医学工程领域中的血管栓塞材料制备技术。
背景技术：
目前在血管内栓塞治疗领域最常用的栓塞剂是氰基丙烯酸正丁酯(N-butylcyanoacrylate，NBCA)，但由于它的粘附性，对浓度、注射速度和拔管时机要求较高，给操作带来很大不便，诸多缺点限制了它的广泛应用。非粘附性液体栓塞剂由于不粘管，可操作性强，应用前景乐观，而遗憾的是大多数非粘附性栓塞剂以二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，近来越来越多的研究发现DMSO有较强的血管毒性，可引起急性血管痉挛、损伤和坏死，尤其是剂量过大、注射速度过快和浓度过高的时候。另外DMSO对现在广泛使用的微导管都有不同程度的腐蚀作用，注射以DMSO为溶剂的栓塞材料需要特殊的微导管，这也限制了它们的临床应用。
可注射温敏性水凝胶材料是近年来备受人们广泛研究的生物医用材料。它可注射入体内，在不加有机交联剂的情况下，其水溶液在生理温度下原位凝胶，可负载多种治疗剂，且不受植入部位的几何形状限制，是理想的药物释放载体和组织工程支架材料。用于血管内栓塞剂的凝胶材料多采用化学交联，呈颗粒状，配制成悬浊液经微导管注射入体内，如明胶海绵颗粒等。而国内外关于可注射温敏性液体栓塞材料的研究鲜有报道。
Matsumaru等[1]合成了异丙基丙烯酰胺与正丙基丙烯酰胺的无规共聚物并实现了对兔肾脏动脉的血管栓塞，该材料克服了粘附性以及有机溶剂的毒性等缺点。最近，Liu等[2]制备了一种基于异丙基丙烯酰胺的三元共聚物血管栓塞材料，成功地栓塞了家猪脑动脉畸形网络，但是上述两种材料由于采用的是无规自由基共聚合，使得该共聚物材料的分子结构无法被预先设计，而且共聚物分子量及分布指数不可控。原子转移自由基聚合作为分子设计的有效手段，可用来制备具有特定结构的大分子。具有多于两个反应性的碳-卤键化合物可用作引发剂合成星型化合物，臂数由引发中心的数目决定，而臂长取决于初始的单体/引发剂浓度比。最近，Liu等[3]利用ATRP技术制备了HEMA-b-NIPAM二嵌段星型三臂共聚物，虽然实现了对分子结构的控制，但是该共聚物在相转变后脱水十分严重，而且其生物相容性需要进一步改进。
MPC单体中含有磷酰胆碱基团，而该基团为细胞膜的重要组成成分之一，MPC组分的引入有利于改善共聚物材料的生物相容性；聚异丙基丙烯酰胺水溶液在32℃附近可发生一个可逆的相转变，比较接近人体温度(37℃)，当温度低于32℃时呈现液体状态，而高于该温度时则转变为固态，因此可原位注射。由此，通过ATRP技术可以制备结构规整、生物相容性良好的血管栓塞材料。
涉及到本背景技术的参考文献如下[1]Matsumaru，et al.Application of thermosensitive polymers as a new embolic material forintravascular neurosurgery.J.Biomater.Sci.Polymer.Edn.1996，7，795-804[2]Li XW，et al.Thermosensitive N-isopropylacrylamide-N-propylacrylamide-vinylpyrrolidone terpolymersSynthesis.characterization and preliminary application as embolicagents.Biomaterials，2005，26(34)，7002-7011[3]Zhiqiang Cao，et al.N-Isopropylacrylamide/2-Hydroxyethyl Methacrylate Star DiblockCopolymersSynthesis and Thermoresponsive Behavior.Macromol.Chem.Phys.2006，207，2329-2335发明内容本发明的目的在于利用两步法原子转移自由基聚合技术制备MPC-b-NIPAM二嵌段星型共聚物，该共聚物被设计用来作为血管栓塞剂；以该方法制备的共聚物分子结构规整，该共聚物LCST接近人体温度，且具有快速响应性以及良好的保水性和生物相容性等特点。
本发明通过以下技术方案得以实现。一种用于血管栓塞材料的温敏性MPC-b-NIPAM二嵌段星型三臂共聚物，其特征在于结构式为式1所示。该共聚物每臂第一段为聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(PMPC)，第二段为聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，MPC与NIPAM物质的量的比为1∶(8～32)。
上述共聚物采用原子转移自由基聚合技术制备，其特征在于如下过程(1)引发剂三(2-溴代异丁酰氧基)乙胺(TrisE)的制备；反应前加入氢氧化钠于三乙醇胺中脱水。将脱水后的三乙醇胺与三乙胺按照物质的量的比为1∶(1～3)溶于四氢呋喃中，同时将溴代异丁酰溴化物按照与三乙醇胺物质的量的比为1∶(1～2)加入到四氢呋喃中，在0℃冰水浴搅拌。过滤除去铵盐，将反应物于30℃真空干燥，将干燥后的产物用0.1mol/L碳酸钠洗涤，再用二氯甲烷萃取三次，然后用硫酸镁干燥。真空下除溶剂，得到红棕色的最终产物三(2-溴代异丁酰氧基)乙胺(TrisE)。
(2)溴代聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱大分子引发剂(PMPC-Br)的合成将2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)、三(2-溴代异丁酰氧基)乙胺(TrisE)、氯化亚铜(CuCl)、联吡啶(bpy)按照物质的量比为(24～36)∶1∶3∶6溶于甲醇中，使用液氮(-180℃～-190℃)冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气，在20～30℃恒温水浴中反应2～6h，反应结束后，混合液置入截流分子量为3500～5000的透析袋中精制，每12h换一次水，透析7天后冷冻干燥制得PMPC-Br大分子引发剂。
(3)MPC-b-NIPAM嵌段共聚物的合成将异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、PMPC-Br大分子引发剂、催化剂CuCl、配体1，4，8，11-四甲基-1，4，8，11-四杂氮环十四烷(Me4cyclam)按照物质的量比为(240～960)∶1∶3∶3置于甲醇中，使用液氮(-180℃～-190℃)冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气，冰水浴(0℃)反应8～24h，反应结束后，混合液被置入截流分子量为3500～5000的透析袋中精制，12h换一次水，透析7天后冷冻干燥制得MPC-b-NIPAM二嵌段星型三臂共聚物。
上述方法制备的共聚物材料，其水溶液作为血管栓塞材料。
发明的优点在于，共聚物分子结构规整，该共聚物的LCST可控制在32～34℃，较接近人体温度，溶胶-凝胶转变时间可控制在20s以内，转变速度较快，且具有良好的保水性以及生物相容性。
图1为MPC-Br大分子引发剂核磁氢谱。
图2为共聚物样品核磁氢谱。
图3为共聚物样品红外谱图。
图4为本发明实施例一所制得共聚物DSC升温曲线图。
图5为本发明实施例一所制得共聚物样品模量-温度曲线图。
图6为本发明实施例二所制得共聚物样品模量-温度曲线图。
图7为不同浓度1∶32共聚物样品细胞存活率与空白细胞的对比图。
具体实施例方式
实施例一第一步，引发剂三(2-溴代异丁酰氧基)乙胺(TrisE)的制备，过程如下反应前加入氢氧化钠5.0g于三乙醇胺5.0g(33.5mmol)中，静置三天除水。将除水后的三乙醇胺5.0g(33.5mmol)和三乙胺60ml溶于200ml四氢呋喃于圆底烧瓶中，同时将溴代异丁酰溴化物45.98g(24.7ml，0.20mol)溶于100ml的四氢呋喃中，然后加入到滴液漏斗中，控制滴加速度在1h内滴加到上述圆底烧瓶中(0℃冰水浴)，继续搅拌2h。过滤除去铵盐，将反应物于30℃真空干燥，将干燥后的产物用0.1mol/L碳酸钠洗涤。再用二氯甲烷萃取三次，然后用硫酸镁干燥。真空下除溶剂，得到红棕色的最终产物三(2-溴代异丁酰氧基)乙胺(TrisE)10.36g。
第二步，合成溴代聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(PMPC-Br)大分子引发剂。首先将MPC 0.5347g(1.8mmol)，引发剂TrisE 0.0358g(0.06mmol)溶解于3ml甲醇中，转移至反应容器，称取催化剂CuCl 0.0178g(0.18mmol)直接置入反应器中，使用液氮(-180℃～-190℃)冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气；与此同时，配体bpy 0.0562g(0.36mmol)完全溶解于2ml甲醇后使用液氮(-180℃～-190℃)冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气，然后使用注射器将bpy转移至含有单体的反应体系中，使用液氮(-180℃～-190℃)冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气，其后将反应体系抽真空。水浴控制温度在30℃，反应6小时后使用液氮终止反应。所得产物使用四氢呋喃反复沉淀，待溶剂挥发后用蒸馏水溶解，然后置于Cellu SepH1透析袋(截流分子量为3500)，每12小时换水，透析7天后冷冻干燥，制得PMPC-Br 0.4637g。
第三步，将第二步中合成的大分子引发剂PMPC-Br 0.06mmol与NIPAM 6.5180g(57.6mmol)，溶于14ml甲醇后转移至反应容器，并称取CuCl 0.0178g(0.18mmol)，同样转移至反应容器，使用液氮(-180℃～-190℃)冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气；同时，将配体Me4cyclam 0.0462g(0.18mmol)溶解于2ml甲醇后使用液氮(-180℃～-190℃)冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气。随后，将配体Me4cyclam通过注射器注射入反应容器，再使用液氮(-180℃～-190℃)冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气，然后将反应体系抽真空后密闭反应容器，使用冰水浴(0℃)控制反应体系温度维持在0℃，反应24小时后使用液氮终止反应。反应后得到的产物用乙醚反复沉淀，待溶剂挥发后用蒸馏水溶解，置于透析袋(截流分子量5000)中透析以除去小分子物质，每12小时换水，透析7天冻干，制得P(I-(MPC10-b-NIPAM320)3)共聚物4.6197g。
核磁氢谱检测称取P(I-(MPC10-b-NIPAM320)3)样品15mg溶于氘代水(D2O)中，在核磁共振谱仪Varian UNITY plus 400上记录1H-NMR谱图，如图1和图2所示。
红外谱图检测应用仪器Bio-Rad FTS 6000傅立叶转换红外光谱仪测定共聚比为1∶32的P(I-(MPC10-b-NIPAM320)3)共聚物样品的红外谱图，如图3。
目测法测量凝胶速度首先使用质量浓度为5％和10％的P(I-(MPC10-b-NIPAM320)3)共聚物水溶液在20℃恒温水槽中恒温30min，然后迅速转移至37℃恒温水槽，记录其溶胶-凝胶转变时间；再把质量浓度为5％和10％的样品升温至37℃，待样品倒置不流动时瞬间转移至20℃恒温水浴槽中，记录其凝胶-溶胶转变时间。数据见下表
DSC检测配置质量浓度为10％的P(I-(MPC10-b-NIPAM320)3)共聚物水溶液，在示差扫描量热仪Perkin-Elmer DSC-7上记录升温曲线，温度范围设定在25℃-40℃，升温速度为1℃/min，测定CP值以及LCST值如图4所示。
流变性能测试所使用的仪器为旋转流变仪RELOGICA INSTRUMRENTS AB。对于质量百分比为5％的P(I-(MPC10-b-NIPAM320)3)共聚物样品采用Bob-Cup 25磨具测量储存模量(G’)和损耗模量(G”)在相转变前后随温度的变化趋势，样品用量为16ml，各流变参数的测定如图5所示。
细胞毒性检测在接种C2C12细胞含有10％PBS的DMEM培养液中加入50mg/ml以及10mg/ml的P(I-(MPC10-b-NIPAM320)3)共聚物水溶液，使得每组共聚物的终浓度分别为10mg/ml，5mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.01mg/ml，0.005mg/ml，选定560nm波长，在酶联免疫检测仪(∑960，Metertech)上测定每孔细胞的光吸收值，通过与空白细胞的对比讨论其结果如图7所示。
实施例二引发剂TrisE以及大分子引发剂PMPC-Br合成步骤同实施例一。
在第三步反应中仅改变NIPAM的加入量为3.2590(28.8mmol)，制得P(I-(MPC10-b-NIPAM160)3)共聚物。
核磁氢谱检测称取15mg P(I-(MPC10-b-NIPAM160)3)样品溶于氘代水(D2O)中，在核磁共振谱仪Varian UNITY plus 400上记录1H-NMR谱图，如图1和图2所示。
红外谱图检测应用仪器Bio-Rad FTS 6000傅立叶转换红外光谱仪测定MPC均聚物以及共聚比为1∶16的P(I-(MPC10-b-NIPAM160)3)共聚物样品的红外谱图，如图3。
流变性能测试所使用的仪器为旋转流变仪RELOGICA INSTRUMRENTS AB。对于5％P(I-(MPC10-b-NIPAM160)3)样品采用Bob-Cup 25磨具测量储存模量(G’)和损耗模量(G”)在相转变前后随温度的变化趋势，样品用量为16ml，各流变参数的测定如图6所示。
实施例三引发剂TrisE以及大分子引发剂PMPC-Br合成步骤同实施例一。
在第三步反应中仅改变NIPAM的加入量为1.6295g(14.4mmol)制得P(I-(MPC10-b-NIPAM80)3)共聚物。
核磁氢谱检测称取15mg P(I-(MPC10-b-NIPAM80)3)样品溶于氘代水(D2O)中，在核磁共振谱仪Varian UNITY plus 400上记录1H-NMR谱图，如图1和图2所示。
红外谱图检测应用仪器Bio-Rad FTS 6000傅立叶转换红外光谱仪测定共聚比为1∶8的P(I-(MPC10-b-NIPAM80)3)共聚物样品的红外谱图，如图3。
权利要求
1.一种用于血管栓塞材料的温敏性MPC-b-NIPAM二嵌段星型三臂共聚物其特征在于结构式为式1所示，该共聚物每臂第一段为聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，第二段为聚异丙基丙烯酰胺，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱与聚异丙基丙烯酰胺物质的量的比为1∶(8～32)。
2.一种制备权利要求1所述的用于血管栓塞材料的温敏性MPC-b-NIPAM二嵌段星型三臂共聚物的方法，其特征在于包括以下过程(1)引发剂三(2-溴代异丁酰氧基)乙胺的制备反应前加入氢氧化钠于三乙醇胺中脱水，将脱水后的三乙醇胺与三乙胺按照物质的量的比为1∶(1～3)溶于四氢呋喃中，同时将溴代异丁酰溴化物按照与三乙醇胺物质的量的比为1∶(1～2)加入到四氢呋喃中，在0℃冰水浴搅拌，过滤除去铵盐，将反应物于30℃真空干燥，将干燥后的产物用0.1mol/L碳酸钠洗涤，再用二氯甲烷萃取三次，然后用硫酸镁干燥，真空下除溶剂，得到红棕色的最终产物三(2-溴代异丁酰氧基)乙胺；(2)溴代聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱大分子引发剂的合成将2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、三(2-溴代异丁酰氧基)乙胺、氯化亚铜、联吡啶按照物质的量比为(24～36)∶1∶3∶6溶于甲醇中，使用-180℃～-190℃的液氮冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气，在20～30℃恒温水浴中反应2～6小时，反应结束后，混合液置入截流分子量为3500～5000的透析袋中精制，每12小时换一次水，透析7天后冷冻干燥制得溴代聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱大分子引发剂；(3)2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-b-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚物的合成将异丙基丙烯酰胺、溴代聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱大分子引发剂、催化剂氯化亚铜、配体1，4，8，11-四甲基-1，4，8，11-四杂氮环十四烷按照物质的量比为(240～960)∶1∶3∶3置于甲醇中，使用-180℃～-190℃液氮冻实，抽真空后通入氮气，将反应体系中的氧气置换为99.99％氮气，0℃冰水浴反应8～24小时，反应结束后，混合液被置入截流分子量为3500～5000的透析袋中精制，12小时换一次水，透析7天后冷冻干燥制得2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-b-异丙基丙烯酰胺二嵌段星型三臂共聚物。
3.一种按权利要求2所制得的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱-b-异丙基丙烯酰胺二嵌段星型共聚物的水溶液应用为血管栓塞材料。
全文摘要
本发明公开了一种用于血管栓塞材料的温敏性MPC－b－NIPAM二嵌段星型共聚物及制备方法和应用，属于生物医学工程领域中血管栓塞材料的制备技术。该共聚物结构式为式1所示。其制备过程包括TrisE、PMPC－Br、MPC－b－NIPAM的合成。该共聚物水溶液用于血管栓塞材料。本发明的优点在于，以ATRP方法制得的聚合物分子结构规整，该共聚物LCST接近人体温度，且具有快速响应性以及良好的保水性和生物相容性等特点。
文档编号C08F230/02GK101053681SQ20071005711
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月10日 优先权日2007年4月10日
发明者刘文广, 高鹏, 赵晓丽 申请人:天津大学