专利名称：一种以丙醛基为端基的聚烷基醚类聚合物的合成方法
技术领域：
本发明属于蛋白质化学领域，涉及蛋白质药物修饰剂的合成，更具体的说涉 及聚乙二醇醛类蛋白质修饰试剂的合成。
背景技术：
随着生物工程技术的发展，很多天然蛋白、重组蛋白以及抗体(或其片段) 陆续进入药用领域。但是蛋白质作为药物使用时却具有很多不利的缺陷，如免疫 源性，易遭受蛋白水解酶的降解以及水溶性差等。在过去的几十年中，生物制药 界在提高蛋白质药物的性能方面付出了很大的努力，其中一个重要的方面便是将 蛋白质药物与天然或合成的高分子共价连接。已有数种聚合物修饰的蛋白质药物
被FDA批准进入市场，此外还有多种聚合物修饰的蛋白类药物处于临床研究阶 段。应用聚合物修饰的主要目的是改变目标蛋白的血液半衰期和稳定性，降低潜 在的免疫源性和抗原性，以及改善蛋白药物的水溶性和可操作性。
在可用于蛋白质药物修饰的天然或合成聚合物中，聚垸基醚类聚合物聚乙二 醇(PEG)是应用最广泛的聚合物修饰剂之一。它具有一系列优点低毒性、良 好的水溶性和油溶性以及极低的免疫源性和抗原性。PEG还表现出优良的的药 代动力学和生物分布行为，当注入动物体内时，PEG表现出高的血液相容性和 在肝、脾内低的累积。PEG成为蛋白质药物领域最重要修饰剂的另外一个原因 是PEG链排斥周围环境中的蛋白质和其它大分子，可以有效地保护所修饰的蛋 白药物。为了避免蛋白修饰过程产生不必要的偶联，在蛋白质药物修饰领域中应 用较多的是一端封闭的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
要完成mPEG与蛋白质的连接，首先要将mPEG端羟基转化为反应性基团， 这一过程称之为mPEG的活化，所得的产品称之为活化mPEG。在为数众多的活 化mPEG中，端基为醛基的mPEG醛修饰剂是非常重要的一类。mPEG酸作为 蛋白修饰试剂有两个方面的优点其一是可以对蛋白质的N端具有一定的选择 性，这是因为蛋白质N端氨基比侧链胺基的PKa要低，当在一定的pH下，侧 链胺基质子化，失去亲核进攻醛基的能力时，N端胺基仍未质子化，还具有亲核 进攻的能力；其二是PEG醛与蛋白质N端胺基形成schiff碱经还原后得到稳定 的亚胺连接，并保持该胺基的正电荷，当N端胺基正电荷对蛋白质结构与活性
都有影响时，这一点便显的非常重要，而PEG活化酯类修饰剂与胺基反应形成 的是酰胺键或脲烷键，胺基上的孤对电子由于与羰基共轭，失去碱性。
常用于蛋白修饰的mPEG醛有mPEG乙醛和mPEG丙醛等。mPEG乙醛由 于其在水溶液中不稳定，容易通过羟醛縮合形成二聚体，而使其应用受到相当大 的限制。相反，mPEG丙醛在水溶液中稳定，不会发生羟醛縮合反应，从而作为 一种性质优良的修饰试剂得到了广泛应用。mPEG丙醛合成有许多种方法，其中 最简便、直接的一种合成方法为在碱性条件下，mPEG与l-氯-3，3-二乙氧基縮丙 醛进行Williamson縮合得到mPEG 二乙氧基縮丙醛，然后再在酸性条件下水解 得到mPEG丙醛，但是该方法由于l-氯-3，3-二乙氧基縮丙醛在进行Williamson 縮合反应的同时发生消除反应，使该方法得到的mPEG醛的收率不高，仅为50 %。并且由于未取代的mPEG会影响到后续的蛋白质修饰反应，因此还需要通 过分离得到纯度较高的mPEG丙醛，而分离不同中性端基的高分子量mPEG极 其困难甚至不可行。其它mPEG丙醛的合成方法，例如先将mPEG衍生为活化 酯，然后与l-氨基-3，3-二乙氧基縮丙醛反应得到酰胺或脲烷键联结的mPEG丙 醛，该方法虽然收率较高，但是衍生过程较复杂。
本发明提供了一种改进的Williamson縮合反应法合成mPEG丙醛，可以直 接通过合成得到高转化率的mPEG丙醛，不需要涉及复杂的高分子分离过程。 反应过程简单，易于实现，并且可以得到定量转化的PEG丙醛。
发明内容
本发明提供了一种以丙醛基为端基的聚烷基醚类聚合物的合成方法，尤其是 以丙醛基为端基的聚乙二醇类聚合物的合成方法。所述的聚烷基醚类聚合物为选 自聚乙二醇、聚环氧丙烷、聚四氢呋喃以及上述聚合物形成的嵌段和无规共聚物 中的一种。
所述聚垸基醚类聚合物优选直链并且不含抗原的聚合物，如聚乙二醇，更优 选单甲氧基聚乙二醇。所用聚垸基醚类聚合物优选在使用前进行除水。
本发明所述的聚烷基醚类聚合物分子量范围为200— 80000，优选的分子量 范围为2000—50000。
本发明所提出的合成方法依次包括如下步骤
1)在常见的有机溶剂中，在碱的存在下，将聚垸基醚类聚合物与良离去基
团取代的二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛反应，得到二甲氧基(或乙氧基) 縮丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物； 2)在酸性水溶液中水解縮丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物，得到丙醛基取
代的聚烷基醚类聚合物。 本发明合成方法中所述的良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛具 有以下结构(I):
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Y (I) X为选自氯、溴、对甲苯磺酸酯、苯磺酸酯、甲磺酸酯、对硝基苯磺酸酯和 溴苯磺酸酯中的一种，Y为选自甲氧基和乙氧基中的一种。
本发明的基本原理在于聚烷基醚类聚合物的端羟基在碱的作用下形成氧负 离子，氧负离子亲核进攻结构(I)中良离去基团的a碳，形成醚键使二甲氧基 (或乙氧基)縮丙醛共价连接到聚垸基醚类聚合物中，二甲氧基(或乙氧基)縮 丙醛进一步水解可得丙醛基。本发明所述合成方法的一个重要方面是在反应的第 一步选择良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛与聚烷基醚类聚合物中 羟基端基物质量的比例，本发明的研究者通过动力学分析与实验发现，在适当的 溶剂体系与温度下，丙醛基取代的聚垸基醚类聚合物的收率与上述比例成正比， 这意味着在一个相对较高的加料比下可以得到定量转化的丙醛基取代的聚垸基 醚类聚合物。为取得定量转化的醛基聚烷基醚类聚合物，本发明所述合成方法的 第一步中良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛的物质量与聚烷基醚类 聚合物中羟基端基的物质量比需大于6，优选为8—12。
本发明所述合成方法的第一步中所述的有机溶剂可以为甲苯、二氧六环、 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)，优选N，N-二甲基甲酰胺和二 甲基亚砜。所使用的溶剂优选在使用前干燥，干燥的方法无任何限制，如使用分 子筛进行干燥。
本发明所述合成方法的第一步中所使用的碱为选自叔丁基醇钾、丁基锂、氨 基钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钾和氢化钠中的一种，优选氢化钾和氢化钠。 所用碱的物质量为含良离去基团丙縮醛物质量的l倍以上，优选2—4倍。
本发明所述合成方法的第一步的反应温度为50—11(TC，优选70—9(TC。
为了使聚烷基醚类聚合物的羟基端基有效地转化为二甲氧基(或乙氧基)縮 丙醛，本发明所述合成方法的第一步反应时间为24—48h。
在第一步反应完成时，可以采用在聚烷基醚类聚合物领域熟知的一些工艺处 理反应体系得到二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛取代的聚垸基醚类聚合物产品。例 如聚乙二醇体系中，可以首先采用旋蒸除去反应使用的有机溶剂，所得固体溶于 水后，调节pH至中性，并加入氯化钠至饱和，使用二氯甲烷萃取后浓缩，然后 倾入冷乙醚中沉淀得到二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛基取代的聚乙二醇。
为了获得本发明所述的丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物，上述第一步所得的 二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物需要进一步水解。水解 的方法无任何限制，例如在pH-2的磷酸缓冲液中，于6(TC下水解2 3h。
在第二步反应完成时，可以采用在聚烷基醚类聚合物领域熟知的一些工艺处 理反应体系得到丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物产品。例如聚乙二醇体系中，可 以首先将水解体系调节pH至中性，并加入氯化钠至饱和，使用二氯甲烷萃取后 浓缩，然后倾入冷乙醚中沉淀得到丙醛基取代的聚乙二醇。
所述合成方法完成后所得酸基取代物的纯度超过95%，优选超过99%。上 述醛基取代物中只存在痕量的未取代的聚垸基醚类聚合物，这是产品中最主要的 杂质，在本发明优化的合成条件下，最终产品中未取代的聚烷基醚类聚合物含量 低于5%，优选低于1%.
上述合成过程完成后，由于所得醛基聚烷基醚类聚合物已具有很高的纯度， 例如超过99%，因此不再需要进行通常的分离步骤。大量节省了时间、劳动力 和其它材料，这点在制备高纯度的药用级聚合物时尤其重要。
下面以单甲氧基聚乙二醇和l-氯-3,3-二乙氧基縮丙醛为例以具体化的形式 阐述本发明的实施方式，但本发明并不限制于该实施方式中。
具体实施例方式
l)称取定量的mPEG，使用甲苯或二氧六环共沸除水后，溶于所选溶剂中。 在反应体系中加入并加入l-氯-3,3-二乙氧基缩丙醛(PEG羟基含量的8—10倍) 和选用的碱(2—4倍于所加氯代縮丙醛)，在60-10(TC间反应24h-48h。反应完 毕后蒸干有机溶剂，溶于一定体积的水，调pH至中性，并加入氯化钠至饱和， 使用二氯甲烷萃取，乙醚沉淀，得白色固体。2)将第一步所得白色固体溶于pH=2的磷酸缓冲液中，于6(TC下水解2 3h。调pH至中性，并加入氯化钠至饱和，使用二氯甲烷萃取，乙醚沉淀，得白 色固体。
实施例
实施例一
A以二氧六环为溶剂合成mPEG10K丙缩醛
取mPEG10K原料2g (0.2mmo1)，在40ml 二氧六环中共沸除水6h，冷却后 在Ar气保护下，加入360 u L(2mmol)的l-氯-3，3-二乙氧基缩丙醛160mg(4mmo1) NaOH， 9(TC加热反应24h。旋转蒸发二氧六环后得固体，水溶后调节pH至中性， 加NaCl饱和，使用二氯甲垸萃取后浓縮，然后倾入冷乙醚中沉淀得到二乙氧基 縮丙醛基取代的聚乙二醇。
工HNMR分析结果S =3.238,单甲氧基0730-， 3H; 5=3.5， PEG主链， 981H; S=1.10，縮醛甲基质子C273CH20-， 6H; 5=1.75，縮醛亚甲基质子 OC//2C//2CH(OCH2CH3)2 ，2H ; S = 4.5 ，縮醛次甲基质子 OCH2CH20/(OCH2CH3)2， 1H。 B合成mPEG10K丙醛
将上述得到的縮醛溶于50ml的pH=2的PBS缓冲液，在Ar气保护下加热 到50。C水解3h。冷却后用5%碳酸氢钠调节pH至6，加入NaCl至饱和，使用 二氯甲烷萃取后浓縮，然后倾入冷乙醚中沉淀得到丙酵基取代的聚乙二醇。
丄HNMR分析结果S =3.238，单甲氧基0^30-， 3H (积分基准)；S =3.5， PEG主链，976H; 5=9.64，醛基氢OCH2CH2C//0， 1H; S 二2.6，丙醛亚甲 基氢OCH2C//2CHO， 2H。 实施例二
A以二氧六环为溶剂合成mPEG20K丙醛
取mPEG20K原料2g (O.lmmol)，在40ml 二氧六环中共沸除水6h，冷却后 在Ar气保护下，加入180^L(lmmol)氯代丙縮醛和80mg (2mmo1) NaOH，加 热回流24h。加热蒸干二氧六环，水溶后调节pH至中性，加NaCl饱和，二氯甲 烷萃取后，乙醚沉淀，得白色固体，真空干燥。
'HNMR分析结果5=3.238，单甲氧基O/30-， 3H (积分基准)；5=3.5，
PEG主链，1992H; 5=1.10，縮醛甲基质子0/3CH20-， 6H; S =1.75，縮醛 亚甲基质子OCH2CH2CH(OC/f2CH3)2 ， 2H ; S = 4.5 ，缩醛次甲基质子 OCH2CH20/(OCH2CH3)2， 1H。 B合成mPEG20K丙醛
将上述得到的縮醛溶于50ml的pH为2的PBS缓冲液，在Ar气保护下加 热到50'C水解3h。冷却后用5X碳酸氢钠调节pH至6，加NaCl饱和，二氯甲 垸萃取后，乙醚沉淀，得白色固体，真空干燥。
1H NMR分析结果S =3.238,单甲氧基CH3O-， 3H(积分基准)；5=3.5， PEG主链，1982H; 6=9.64，醛基氢OCH2CH2CM)， 1H; S =2.6,丙醛亚甲 基氢OCH2C//2CHO， 2H。上述结果显示mPEG丙醛接近定量转化。 实施例三
A以DMF为溶剂合成mPEG10K丙縮醛
取mPEG10K原料2g (0.2mmol)，在40ml甲苯中共沸除水6h，旋蒸出甲苯 后，溶于干燥的DMF，在Ar气保护下，加入288^L(1.6mmol)的l-氯-3,3-二乙 氧基縮丙醛128mg (3.2mmo1) NaH (60%), 9(TC加热反应24h。旋转蒸发DMF 后得固体，水溶后调节pH至中性，加NaCl饱和，使用二氯甲烷萃取后浓缩， 然后倾入冷乙醚中沉淀得到二乙氧基縮丙醛基取代的聚乙二醇。
1H NMR分析结果S =3.238，单甲氧基0/30-, 3H(积分基准)；5=3.5， PEG主链，991H; S =1.10，縮醛甲基质子C//3CH20-， 6H; S =1.75，缩醛亚 甲基质子OCH2CH2CH(OC//2CH3)2 ， 2H ;5 = 4.5 ,縮醛次甲基质子 OCH2CH2C//(OCH2CH3)2， 1H。 B合成mPEG10K丙醛
将上述得到的縮醛溶于50ml的pH为2的PBS缓冲液，在Ar气保护下加 热到50℃水解3h。冷却后用5%碳酸氢钠调节pH至6，加NaCl饱和，使用二 氯甲烷萃取后浓縮，然后倾入冷乙醚中沉淀得到丙醛基取代的聚乙二醇。
1H NMR分析结果5 =3.238，单甲氧基CH3O-， 3H(积分基准)；5=3.5， PEG主链，978H; 5=9.64，醛基氢OCH2CH2C//0， 1H; S=2.6,丙醛亚甲 基氢OCH2CH2CHO, 2H。上述结果显示mPEG丙醛接近定量转化。 实施例四
A以DMF为溶剂合成mPEG20K丙缩醛
取mPEG20K原料2g (O.lmmol)，在40ml甲苯中共沸除水6h，旋蒸出甲苯 后，溶于干燥的DMF，在Ar气保护下，加入144yL(0.8mmol)氯代丙缩醛64mg 和(1.6mmo1) NaH (60%)，加热回流24h。减压蒸干DMF，加水溶解后调节 pH至中性，加NaCl饱和，使用二氯甲垸萃取三次，浓縮后倾入冷乙醚沉淀，得 白色固体，真空干燥。
^NMR分析结果S =3.238，单甲氧基C^O-， 3H (积分基准)；S =3.5， PEG主链，1983H; 5=1.10，縮醛甲基质子C//3CH20-， 6H; S =1.75，縮醛 亚甲基质子OCH2CH2CH(OC//2CH3)2 ， 2H ; 5 = 4.5 ，縮醛次甲基质子 OCH2CH20/(OCH2CH3)2, 1H。 B合成mPEG20K丙醛
将上述得到的縮醛溶于50ml的pH=2的PBS缓冲液，在Ar气保护下加热 到5(TC水解3h。冷却后用5%碳酸氢钠调节pH至6，加NaCl饱和，二氯甲烷 萃取后，乙醚沉淀，得白色固体，真空干燥。
^NMR分析结果S =3.238，单甲氧基0/30-， 3H(积分基准)；5=3.5， PEG主链，1976H; S =9.64，醛基氢0CH2CH2O/0， 1H; S =2.6，丙醛亚甲 基氢0CH2O/2CH0， 2H。上述结果显示mPEG丙醛接近定量转化。 实施例五
A以甲苯为溶剂合成mPEG30K丙縮醛
取mPEG30K原料3g (O.lmmol)，在60ml甲苯中回流6h，蒸出20ml甲苯 后，在Ar气保护下，加入144 n L(0.8mmol)氯代丙縮醛和64mg (1.6mmo1) NaH
(60%),加热回流24h。减压蒸干甲苯，加水溶解后调节pH至中性，加NaCl 饱和，使用二氯甲烷萃取三次，萃取液浓縮后倾入冷乙醚沉淀，得白色固体，真
空干燥。
^NMR分析结果S =3.238，单甲氧基<:/{30-， 3H (积分基准)；S =3.5， PEG主链，2974H; S =1.10,縮醛甲基质子O/3CH20-， 6H; S =1.75，縮醛 亚甲基质子OCH2CH2CH(Oa/2CH3)2 ， 2H ; S = 4.5 ,縮醛次甲基质子 0CH2CH2O/(0CH2CH3)2， 1H。 B合成mPEG30K丙醛
将上述得到的縮醛溶于50ml的pH=2的PBS缓冲液，在Ar气保护下加热 到50。C水解3h。冷却后用5%碳酸氢钠调节pH至6，加NaCl饱和，二氯甲烷萃取后，乙醚沉淀，得白色固体，真空干燥。
iHNMR分析结果S =3.238，单甲氧基O^0-， 3H (积分基准)；S =3.5， PEG主链，2960H; 5=9.64，醛基氢OCH2CH2a/0， 1H; S =2.6，丙醛亚甲 基氢OCH2CH2CHO， 2H。上述结果显示mPEG丙醛接近定量转化。 实施例六
A以DMF为溶剂合成PEG2K 二丙縮醛
取PEG2K原料2g (lmmol)，在60ml甲苯中回流6h，减压蒸干甲苯后，溶 于干燥DMF，在Ar气保护下，加入3mL(16mmol)氯代丙缩醛和1.28g (32mmo1) NaH (60%)，加热回流24h。减压蒸干甲苯，加水溶解后调节pH至中性，加 NaCl饱和，使用二氯甲烷萃取三次，萃取液浓縮后倾入冷乙醚沉淀，得白色固 体，真空干燥。
^NMR分析结果S=3.5， PEG主链，188H; S =1.10，縮醛甲基质子 0/3CH20-， 12H; S =1.75，縮醛亚甲基质子OCH2CH2CH(00/2CH3)2， 4H; S 二4.5，縮醛次甲基质子0CH2CH2O/(0CH2CH3)2， 2H。 B合成PEG2K二丙醛
将上述得到的縮酸溶于50ml的pH=2的PBS缓冲液，在Ar气保护下加热 到50'C水解3h。冷却后用5X碳酸氢钠调节pH至6，加NaCl饱和，二氯甲垸 萃取后，乙醚沉淀，得白色固体，真空干燥。
力NMR分析结果S =3.5， PEG主链，191H; S =9.64，醛基氢 OCH2CH2OfO， 2H; S=2.6，丙醛亚甲基氨0CH2O/2CH0， 4H。
权利要求
1. 一种以丙醛基为端基的聚烷基醚类聚合物的合成方法，依次包括以下步骤1)在有机溶剂中，在碱的存在下，将聚烷基醚类聚合物与良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)缩丙醛反应，得到二甲氧基(或乙氧基)缩丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物；2)在酸性水溶液中水解二甲氧基(或乙氧基)缩丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物，得到丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物；其中所述的聚烷基醚类聚合物为选自聚乙二醇、聚环氧丙烷、聚四氢呋喃以及上述聚合物形成的嵌段和无规共聚物中的一种；所述聚烷基醚聚合物的分子量为200—80000，优选2000—50000；其中所述的良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)缩丙醛具有如下结构X为选自氯、溴、对甲苯磺酸酯、苯磺酸酯、甲磺酸酯、对硝基苯磺酸酯和溴苯磺酸酯的一种，Y为选自甲氧基和乙氧基的一种；所述良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)缩丙醛的物质量与聚烷基醚类聚合物中羟基端基的物质量的比大于6。
2. 按权利l所述的一种以丙醛基为端基的聚垸基醚类聚合物的合成方法，所述 的聚烷基醚类聚合物为聚乙二醇，优选单甲氧基聚乙二醇。
3. 按权利l所述的一种以丙醛基为端基的聚烷基醚类聚合物的合成方法，所述 的良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛为l-氯-3,3-二乙氧基縮丙 醛。
4. 按权利l所述的一种以丙醛基为端基的聚垸基醚类聚合物的合成方法，所述 良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)缩丙醛的物质量与聚烷基醚类聚合 物中羟基端基的物质量的比为8—12。
5. 按权利l所述的一种以丙醛基为端基的聚垸基醚类聚合物的合成方法，所述 有机溶剂包括甲苯、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺以及二甲基亚砜，优选N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。
6. 按权利l所述的一种以丙醛基为端基的聚垸基醚类聚合物的合成方法，所述 的碱为选自叔丁基醇钾、丁基锂、氨基钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钾和 氢化钠中的一种，优选氢化钾和氢化钠，所述碱的物质量为良离去基团取代 的二甲氧基(或乙氧基)縮丙醛物质量的l倍以上，优选2—4倍。
7. 按权利l所述的一种以丙醛基为端基的聚垸基醚类聚合物的合成方法，所述 第一步反应的温度为50-ll(TC，优选70-90°C。
8. 按权利l所述的一种以丙醛基为端基的聚烷基醚类聚合物的合成方法，所述 第一步反应的延续时间为24—48h。
9. 按权利要求1所述的一种以丙醛基为端基的聚烷基醚类聚合物的合成方法， 所述的端基为丙醛基的聚垸基醚类聚合物纯度超过95%，优选超过99%。
全文摘要
本发明提供了一种以丙醛基为端基的聚烷基醚类聚合物的合成方法，尤其是以丙醛基为端基的聚乙二醇类聚合物的合成方法。本发明所提出的合成方法包括(1)在有机溶剂中，在碱的存在下，将聚烷基醚类聚合物与良离去基团取代的二甲氧基(或乙氧基)缩丙醛反应，得到二甲氧基(或乙氧基)缩丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物；(2)在酸性水溶液中水解缩丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物，得到丙醛基取代的聚烷基醚类聚合物。本方法的优点是操作简单、条件温和并且转化率高，可直接用于蛋白质药物的修饰。
文档编号C08G65/48GK101376708SQ20071012122
公开日2009年3月4日 申请日期2007年8月31日 优先权日2007年8月31日
发明者苏志国, 赵永江, 雷建都, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所